Bu protokol, IAV'nin intranazal uygulaması ve fare akciğer hasarının aşağı akış analizi ve akciğer hücre tiplerinde ilişkili transkripsiyonel değişiklikler için talimatlar sağlar.
Yöntem makalesi
İnfluenza Enfeksiyonu Sonrası Displastik ve Fonksiyonel Akciğer Alveoler Onarımının Modellenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Viral enfeksiyon, kardiyovasküler sistem ile dış ortam arasındaki gaz değişiminden sorumlu özel doku yapısı olan akciğer alveolünde hem akut hem de uzun süreli hasara neden olur. Farelerde influenza A virüsü (IAV) enfeksiyonu, insan akciğerinin viral enfeksiyona tepkisi için translasyonel bir modeli temsil eder ve alveolde hem geçici hem de kalıcı hücre durumu değişikliklerine neden olur. Bazı durumlarda, viral hasarın neden olduğu ve zamanla çözülmeyen anormal hücre durumları, akciğerin kritik gaz değişim fonksiyonunu kalıcı olarak bozabilir. Bu makale, A/PR/8/34 IAV'li farelerin intranazal enfeksiyonu için yöntemleri ve hasarlı akciğerlerin hücresel bileşimi ve doku yapısındaki geçici ve uzun süreli değişikliklerin karakterizasyonunu göstermektedir. Bu model, akciğer onarımı ve kronik fonksiyon bozukluğunun altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaların ayrıntılı bir şekilde araştırılmasını sağlar. Bu yaklaşım aynı zamanda etkili akciğer rejenerasyonunu teşvik etmeyi ve viral hasardan sonra solunum fonksiyonunu eski haline getirmeyi amaçlayan terapötik müdahaleleri değerlendirmek için bir platform sunar.
Giriş
Akciğerler, yerel dokulara oksijen ve besin sağlamada çok önemli bir rol oynar. Akciğerlerin küçük kılcal kan damarlarını dolduran endotel hücreleri (EC'ler), akciğer dokusunun düzgün çalışması, vasküler bütünlüğün korunması ve verimli gaz değişimi için gereklidir1. EC'ler vasküler nişi oluşturur ve epitel hücreleri, bağışıklık hücreleri ve mezenkimal hücreler gibi diğer hücrelerle karşılıklı olarak karışır. Bu, yaralanma veya hastalığa yanıt olarak akciğer gelişiminin ve doku onarımının düzenlenmesine katkıda bulunur2.
H1N1 İnfluenza A virüsü enfeksiyonu dünya çapında bir sorundur3. H1N1 enfeksiyonu olan hastalara sıklıkla eksüdatif diffüz alveoler hasar (DAD) tanısı konur4. H1N1 enfeksiyonu ciddi akciğer hasarına ve pnömoni, ciddi akut akciğer hasarı (ALI) ve akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) dahil olmak üzere ciddi sonuçlara yol açabilir5. Hasar esas olarak virüsün akciğer epitel hücrelerini enfekte etmesinden kaynaklanır ve bu da akciğerlerde iltihaplanma, doku hasarı ve sıvı birikmesine neden olan aşırı bir bağışıklık tepkisine neden olur. Gaz değişiminden sorumlu olan hava yollarını ve alveolleri kaplayan epitel hücreleri bu nedenle H1N1 virüsü tarafından doğrudan zarar görür ve akciğerin normal yapısının bozulmasına yol açar 6,7. Diğer hücre tiplerinin, doğrudan IAV ile enfekte olmasalar da, enfeksiyona yanıt olarak hasar görebileceği ortaya çıkmıştır 8,9. Bu nedenle, influenza enfeksiyonu sonrası doku hasarı, akciğerin tüm hücresel bölmelerini etkiler ve son zamanlarda IAV enfeksiyonunun çoklu hücresel bölmelerde hücre durumunda hem geçici hem de kalıcı değişikliklere neden olduğu gösterilmiştir9. Hastalığa yanıt olarak bu hücre plastisitesi, başarılı doku onarımı için yararlı veya zararlı olabilir ve daha fazla çalışmayı garanti eder.
İnfluenza ve patogenezini incelemek için en çok benimsenen deneysel model, farelerin influenza virüsü A/PR/8/3410 ile intranazal enfeksiyonudur. Hastalık şiddeti, mortalite ve viral enfektivitenin incelenmesine izin veren önemli bir tekniktir. Farelerin intranazal enfeksiyonu, insanlardaki doğal enfeksiyon yolunu taklit eder ve virüse karşı hem adaptif hem de doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin incelenmesine izin verir. 1934'te, Porto Riko'daki bir hastadan İnfluenza A virüsü "A/PR/8/34"ün spesifik bir suşu izole edildi11. Bu influenza virüsü türü artık farelere uyarlanmıştır ve artık insanları verimli bir şekilde enfekte etmemektedir. Fare ve insan bağışıklık sistemlerindeki benzerlikler nedeniyle, fareler IAV araştırmaları için en popüler hayvan modelidir12. Bu yöntemde, A/PR/8/34 H1N1 suşu, doğal bir enfeksiyonu taklit ederek burun deliklerinden doğrudan farelere uygulanır13. Viral enfeksiyonun konakçı akciğer dokusu üzerindeki etkilerini vahşi tip (WT) ve nakavt (KO) koşullarında incelemek için kolay, uygun maliyetli ve kullanışlı bir yöntemdir. Alternatif tekniklerin intranazal modele göre avantaj ve dezavantajları vardır. İntratrakeal (IT) aşılama, virüsün akciğerlere doğru bir şekilde verilmesini sağlar, ancak bu teknik, inhalasyon yoluyla enfeksiyonu tam olarak taklit etmez ve üst solunum yollarındaki toksisite hakkında bilgi sağlamaz. BT aşılaması ayrıca trakeal yaralanma riskini azaltmak için büyük beceri gerektirir13,14. Aerosol inhalasyon (AR) aşılaması, enfeksiyonun doğal yolunu taklit eder ve intranazal enfeksiyona kıyasla daha düzgün bir akciğer patolojisi oluşturur, ancak aerosolde tek tip virüs konsantrasyonunu korumak ve viral aerosolün doğru şekilde verilmesini sağlamak zor olabilir. Güvenlik de AR aşılama yönteminin10 önemli bir endişesidir. Bu nedenle, IAV uygulamasının intranazal aşılama tekniği, viral enfeksiyonun doku hasarı ve onarımındaki aşağı yönlü etkileri üzerine akciğer odaklı araştırmalar için çok önemli bir yaklaşımdır. Kimyasal veya mekanik modellerden farklı olarak, influenza kaynaklı akciğer hasarını ve konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için daha gerçekçi ve daha az invaziv bir yol sağlar.
Burada, farelerin İnfluenza A virüsü (A/PR/8/34) ile intranazal enfeksiyonu için ve akciğer alveolünde viral hasardan kaynaklanan hem kısa vadeli hem de uzun vadeli hücresel ve yapısal değişiklikleri karakterize etmek için tekrarlanabilir bir yöntem oluşturuyoruz. Bu yöntemi kullanan çalışmalar, akciğer hastalıkları için yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi amacıyla akciğer dokusu hasarı ve onarım mekanizmalarının keşfedilmesine yardımcı olabilir.
Protokol
Bir hayvan modelinde influenza A virüsü ile çalışmak, biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL2) ve hayvan biyogüvenlik seviyesi 2 (ABSL2) olarak kabul edilir. Bu verileri oluşturmak için kullanılan tüm hayvan prosedürleri, Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Kanser Araştırma Merkezi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (Protokol #24-452). Bu protokol aynı zamanda Kanser Araştırma Merkezi, Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından da onaylanmıştır. Bu protokole başlamadan önce, kullanıcıların kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitelerinden ve kurumsal biyogüvenlik komitelerinden onay almaları önerilir.
1. Çalışma stoğunun hazırlanması
NOT: İnfluenza virüsü ile yapılan tüm çalışmalar bir biyogüvenlik kabininde buz üzerinde yapılmalıdır. Uçları ve virüsle temas eden diğer her şeyi %10 çamaşır suyu içeren bir kaba atın. Buz kovaları, pipetler ve uç kutularına daldırılmak yerine %10 çamaşır suyu solüsyonu püskürtülmelidir. Oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin. Katı atıkları biyolojik tehlike içeren bir atık kabına atın ve sıvı atıkları suyla yıkayarak lavaboya atın.
- Dondurulmuş virüs stoğunu (0,5 mL) bir biyogüvenlik kabininde buz üzerinde çözdürün.
- Musluk suyunda %10 çamaşır suyu içeren bir atık kabı kurun. Ön soğutma için -80 °C'lik bir dondurucuya 100 adede kadar numune tüpü alabilen iki plastik veya karton dondurucu kutusu yerleştirin.
- Virüs alikotları için 160 1.5 mL'lik tüpleri önceden etiketleyin. Viral stok tüplerini kullanım için açarken aerosol oluşumunu önlemek için vidalı kapaklı tüpler açılır kapanır tüplere tercih edilir. Virüs alikotları yapmadan önce önceden soğutmak için tüpleri buzun üzerine yerleştirin.
- Kalibre edilmiş bir P20 pipet ve uçları kullanarak 3 μL'lik virüs alikotları yapın, virüsü yalnızca önceden soğutulmuş tüplere yerleştirin ve alikotları her zaman buz üzerinde tutun.
- Alikotları hazırladıktan sonra, bunları "A/PR/8/34 İnfluenza Virüsü (IAV)", katalog numarası, lot numarası ve son kullanma tarihi ile etiketlenmiş önceden soğutulmuş bir dondurucu kutusunda saklayın.
NOT: Farklı virüs gruplarının farklı bulaşıcılıkları vardır ve karıştırılmamalıdır. - Kutuyu -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin. Her donma/çözülme döngüsünde viral titre azalacağından her şeyi mümkün olduğunca soğuk tuttuğunuzdan emin olun.
2. Burun içi enfeksiyon deneylerinde kullanılmak üzere virüs alikotlarının seyreltilmesi
- Biyogüvenlik kabininde buz üzerinde bir adet 3 μL'lik viral stok alikotunu çözün.
- 3 μL alikotun 2 μL'sini 198 μL soğuk D-PBS içeren önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik bir tüpe aktararak 1:100 seyreltme (seyreltme A) yapın.
- Kullanılan farelerin suş arka planında 0.5-1 LD50 için uygun konsantrasyona ulaşana kadar viral stoğu seyreltmeye devam edin. Her şeyi buz üzerinde tutun ve virüsün aşırı ısınmasını önlemek için önceden soğutulmuş tüpler kullanın.
NOT: Örneğin, VR-95PQ için, lot 70063082, farelere 1:500.000 seyreltmede 12.600 ila 31.500 CEID50 / μL virüsü (vücut ağırlığına göre ölçeklendirilmiş) bulaştırın. - Seyreltme A'dan (1:100), önceden soğutulmuş 15 mL'lik bir tüpte 10 μL seyreltme A'yı 4990 μL soğuk D-PBS'ye ekleyerek 1:50.000'lik bir seyreltme (seyreltme B) yapın. 5 mL'lik serolojik pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
- Seyreltme B'den, önceden soğutulmuş 5 mL'lik bir tüpte 1.8 mL D-PBS'ye 200 μL seyreltme B ekleyerek 1:500.000'lik bir seyreltme (seyreltme C) yapın. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
NOT: Yeni bir parti satın alırken hayvanları enfekte etmede kullanılacak ideal virüs seyreltmesini belirlemek için, ürün sayfasında belirtilen virüs titresini kullanarak ve seyreltmeyi önceki partinin titresine göre ayarlayarak tahmin etmek mümkündür. İdeal seyreltmeyi belirlemenin en iyi yolu, vahşi tip C57BL/6 fareleri kullanarak yeni virüs partisini ampirik olarak titretmektir. 1:50.000 ila 1:500.000 arasında değişen bir dizi seyreltme planlayın ve test etmek için seyreltme başına 1-2 kafes C57BL / 6 dişi fare sipariş edin. Fareleri farklı konsantrasyonlarda enfekte edin ve kilo kayıplarını izleyin. Viral titreleri test etmek için çalışma, fareler arasındaki cinsiyet veya ağırlık farklılıklarından kaynaklanabilecek değişkenliği azaltmak için yalnızca dişi farelerin kullanılmasını önermektedir. Dişi fareler, muhtemelen daha küçük boyutlarından dolayı veya diğer fare akciğer hasarı formlarında olduğu gibi influenza enfeksiyonuna yanıtta cinsiyete özgü farklılıklar nedeniyle genellikle erkek farelerden daha hasta olurlar15. Bu ayrıntılı olarak çalışılmamış olsa da, titre deneylerinde dişi fareler kullanıldı çünkü titre erkek fareler kullanılarak belirlenirse, dişi fareler belirlenen dozda ölebilir. Bununla birlikte, erkek farelerin, yalnızca dişi fareler kullanılarak belirlenen viral bir titre ile enfekte olduklarında önemli ölçüde hastalandıkları ve gözle görülür akciğer hasarlarına sahip oldukları bulundu. Karışık arka planlı veya soylu fareler kullanılıyorsa ideal bir seyreltme, vahşi tipC57BL/6 farelerin %50'sinin öldüğü seyreltme olan "1 LD 50" olacaktır. Outbred fareler enfeksiyona16 karşı daha dirençlidir ve bu seyreltmede yaralanır ve iyileşir. Deney için fareler kendilenmiş bir C57BL/6 arka planında olacaksa, ideal doz bu "0.5 LD50"nin yarısı olacaktır. Bu deneylerin amacı yaralanma ve onarımı incelemek olduğundan, farelerin hastalandığı ve vücut ağırlığının %20-25'ini kaybettiği, ancak çoğu farenin nihayetinde iyileştiği bir doz tanımlamak idealdir (Şekil 1). Çalışmadaki tüm fareler yaklaşık olarak aynı ağırlıktaysa (~25 g), influenza virüsünü her fareye uygun seyreltmenin 50 μL'sinde uygulamak mümkündür. Bununla birlikte, farelerin ağırlığı 15-35 g arasında değişmektedir. Bu nedenle, vücut ağırlığının gramı başına 2 μL viral seyreltme uygulayın (örneğin, 15 g'lık bir fare 30 μL grip alırken, 35 g'lık bir fare 70 μL alır). Bu, farklı büyüklükteki hayvanlarda daha tutarlı bir enfeksiyon ve doku hasarı seviyesi ile sonuçlanır. Bu bilgi, C seyreltme hacmini planlamak için gereklidir.
3. Viral alikotların hayvan tesislerine taşınması
- Son viral seyreltme ile 5 mL'lik tüpü buza yerleştirin ve kabı bir biyolojik tehlike etiketi ile etiketleyin. Olası dökülmeleri emmek için plastik bir numune taşıma kutusunu kağıt havluyla kaplayın.
- Burun içi enfeksiyon için gerekli malzemeleri biyolojik tehlike etiketli kutunun içine yerleştirin: bir P200 pipeti, açılmamış bir kutu filtrelenmiş P200 pipet ucu, bir kalem ve viral atıklar için taze %10 ağartıcı ile doldurulmuş 50 mL'lik konik bir tüp. Enfeksiyon kontrolü olarak, 1.5 mL'lik bir tüpü IAV'yi seyreltmek için kullanılan aynı soğuk D-PBS ile doldurun.
4. IAV'nin farelere uygulanması
NOT: Hayvan tesisinde influenza virüsü ile çalışmak, bir ABSL2 güvenlik seviyesi tesisi gerektirir. Standart KKD, önlük, tek kullanımlık laboratuvar önlüğü, iki saç bonesi, çift nitril eldiven, çift galoş, koruyucu gözlük (koruyucu gözlük) ve bir maske içerir. Seyreltilmiş influenza virüsü, enfektivite kaybını önlemek için uygulama protokolü boyunca buz üzerinde tutulmalıdır.
- Virüslerle yapılan tüm çalışmalar bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilmelidir. A/PR/8/34 influenza virüsü fareye uyarlanmış bir suş olmasına rağmen, influenza virüsleri mutasyona eğilimlidir ve bu nedenle virüsü insanlara potansiyel olarak bulaşıcıymış gibi tedavi eder.
- İzofluran anestezisini buharlaştırıcı makinede %2,5-3 akış hızında hayvanlara teker teker uygulayın. Grip uygulamadan önce hayvanları anestezi kutusundan burun konisine taşıyın.
- Bir fare anestezi altındayken, nefesini kontrol edin ve tepki verip vermediğini görmek için ayak parmağını çimdikleyin. Fareler, bir ayak parmağı sıkışmasına küçük bir kasılma veya "zıplama" ile tepki verdiklerinde IAV enfeksiyonuna hazırdır - ancak başlarını hareket ettirecek kadar uyanıklarsa değil.
- 50 μL'ye (veya 2 μL/g vücut ağırlığına; aşağıdaki NOT'a bakın) ayarlanmış bir P200 pipet kullanarak, seyreltilmiş IAV'yi (veya PBS kontrolünü) şişeden buz üzerinde aspire edin ve pipeti, ucun eldivenlere veya biyogüvenlik kabininin yüzeyine temas etmeyeceği uç kutusuna veya kağıt havluya koyun.
- Anestezi uygulanmış fareyi tırnatarak kaldırın ve fareyi 45° açıyla dik bakacak şekilde tutun. Fareyi, daha iyi nefes almak için trakea uzayacak, ancak nefes almayı engelleyecek kadar sıkı olmayacak kadar sıkı bir şekilde tırnağın. Farenin nefesinin sığ ama tutarlı olduğundan ve nefes nefese kalmadığından emin olun.
- IAV seyreltmesini farenin burun deliklerine yavaşça pipetleyin. Bu, 4.6.1 ve 4.6.2 adımlarında açıklandığı gibi iki yöntemden biri kullanılarak başarıyla yapılabilir.
- Viral seyreltmeyi, virüsün burnun her iki tarafına girmesi için burun delikleri arasında dönüşümlü olarak burun deliklerine damla bırakın.
- Her iki burun deliğini de kapsayan, fare sıvıyı solurken tutarlı ve yavaş bir şekilde pipetleme ile sürdürülen bir virüs "balonu" oluşturun.
NOT: Bu çalışmada sürekli olarak daha kontrollü ve tekrarlanabilir olan kabarcık damlatma yöntemi kullanılmıştır. Bu yöntem, anestezi altında virüs süspansiyonunun burun deliklerine kolayca iletilmesini sağlar ve doğal nefes almayı kolaylaştırır. Damla yöntemi eşit derecede geçerlidir, ancak hangi yöntem kullanılırsa kullanılsın, sonuçlarda daha az değişkenlik sağlamak için deneyler arasında yöntemde tutarlılık uygulanmalıdır.
- Pipet ucunu buruna yakın tutun, ancak buruna dokunmayın. Fare uyanıyorsa, dozun yarısını uygulayın ve dozun ikinci yarısını uygulamadan önce fareyi izofluran burun konisine geri koyun.
- Fare başını sallayacak, öksürecek veya virüsü tükürecek kadar uyanıksa, aerosol haline getirilmiş virüse neden olmamak ve iyi bir enfeksiyon sağlamak için daha fazla anestezi gerekir. Fare uyanık değilse, dozun tamamını uygulayın. Fare tekrar burun konisine yerleştirildiyse, kalan IAV'yi uygulamak için 4.6 adımını tekrarlayın.
- Ucu taze %10 çamaşır suyu içeren bir atık kabına boşaltın. Her fare kafesi için yeni bir uç kullanın.
- Her IAV uygulamasından sonra, hava yolunu açık tutmak ve gribin akciğerlere yeterince iletildiğinden emin olmak için fareyi 1-2 dakika dik tutun. Grip virüsü fare akciğerlerine başarılı bir şekilde iletildiyse, farenin göğsünün her iki yanına birer parmak yerleştirilerek çatırtılar hissedilebilir.
- Fare iyileşmeye başladıktan sonra, tamamen iyileşmek için fareyi kafese geri yerleştirin. Fareler izoflurandan hızla iyileşir, ancak ayaktan olana kadar izlenmeleri gerekir.
- IAV'nin iyi solunduğunu gösteren göğüste çatırtılar ve derin nefes alma gibi olayları veya bir kısmının farenin burun deliklerinden atıldığını gösteren kabarcıklar ve burun spreyi gibi olayları kaydedin. Bu bilgileri bir yaralanma günlüğü elektronik tablosunda (Ek Dosya 1) ve laboratuvar defterinde takip edin.
- Virüs bulaşacak her fare için 4.2-4.12 arasındaki adımları tekrarlayın.
5. Laboratuvara geri dönüş
- 50 mL'lik konik ağartıcı ve uçları, kalan IAV seyreltmesi (varsa) ve grip enfeksiyonu için kullanılan laboratuvar malzemeleriyle birlikte plastik numune taşıma kutusuna geri koyun.
- Laboratuvara geri döndüğünüzde, virüsle temas eden her şeyi %10 çamaşır suyu ile inkübe edin. Buz kovalarına, pipetlere ve uç kutularına daldırmak yerine %10 çamaşır suyu solüsyonu püskürtün. Oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin. Katı atıkları biyolojik tehlike atık kabına atın ve sıvı atıkları suyla yıkayarak lavaboya atın.
6. Farelerin izlenmesi ve ek deneysel prosedürler
- Enfeksiyondan sonraki gün (1. gün) veya enfeksiyondan 3 gün sonra (4. gün) başlayarak, influenza enfeksiyonundan sonra günlük olarak tüm kontrol (PBS) ve IAV ile enfekte farelerin vücut kondisyon skorunu (BCS)17 ve vücut ağırlığını izleyin. IAV ile enfekte olmuş farelerin enfeksiyonu takip eden 4. güne kadar önemli ölçüde kilo vermesi olası değildir (Şekil 1).
NOT: Vücut ağırlığının %30'undan fazlasını kaybeden veya vücut kondisyon skoru 1'e ulaşan farelere ötenazi yapılmalıdır. - İstenirse, influenza enfeksiyonundan sonra hücre proliferasyonunu izlemek için EdU'yu farelere intraperitoneal (ip) enjeksiyon yoluyla veya içme suyunda uygulayın.
NOT: Fare akciğerindeki birçok hücre tipi, IAV kaynaklı hasardan sonra çoğalır9. Belirli deneysel amaçlar için istenildiği gibi başka ilaçlar, özel yiyecekler veya özel su vermek mümkündür. Farelerin gripten kurtulmaları sırasında her zamanki kadar yemediklerini veya içmediklerini unutmayın, bu nedenle enjeksiyona dayalı bir uygulama yöntemi daha arzu edilebilir; Öte yandan, BCS'si 2-2.5 olan farelere enjekte etmek zor olabilir.
7. Aşağı akış yaklaşımları için akciğer dokusunun toplanması
- İmmünofloresan analizi, akış sitometrisi veya fare tesisinde veya laboratuvarda bir biyogüvenlik kabininde tek hücreli RNA dizilimi dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları için akciğer dokusunu toplayın.
- CO2 kullanarak fareleri birer birer ötenazi yapın. Trakeanın yerinden çıkmasını önlemek için servikal olarak çıkık yapmayın. Bilateral torakotomi genellikle onaylanmış bir sekonder ötenazi yöntemidir.
NOT: Bu çalışma, kurumun onaylı hayvan bakım kılavuzlarını ve CO2 ötenazi protokolünü takip etmektedir ve bu yöntemi, akciğer hasarı veya histopatolojik sonuçlarda önemli değişkenlik getirmeden önceki influenza çalışmalarında tutarlı bir şekilde kullanmıştır. Ketamin/ksilazin, CO2 solunmasının neden olduğu hasarı önlemek için farelere ötenazi yapmak için de kullanılabilir. Bununla birlikte, ketamin/ksilazin alımı çok maliyetliyse veya DEA lisansı almak çok zorsa, CO2 inhalasyonu kabul edilebilir bir yöntemdir. - Göğüs boşluğunu inceleyin ve göğüs kafesini ve soluk borusunu ortaya çıkarın.
- Diyaframı kesin ve akciğerleri delmemek için dikkatlice göğüs kafesinden ayırın. Göğüs kafesinin kenarlarından kesin ve üstteki göğüs kafesini çıkarın. Köprücük kemiklerini kesin ve kemiği ve yumuşak dokuyu trakeanın önünden ayırın.
- Kıkırdak halkaları görünene kadar trakeayı çevreleyen kas ve dokuyu inceleyin, ancak trakeayı delmeyin. Kavisli forseps kullanarak yemek borusunu trakeanın arkasından dışarı doğru itin ve trakeadan uzağa doğru inceleyin.
- Trakeanın arkasına bir parça dikiş geçirin ve gevşek bir dikiş düğümü bağlayın (bir ucunu bir forsepsin etrafına diğeriyle çift ilmek yapın, dikişin gevşek ucunu tutun ve gevşek ucu ilmeklerin arasından çekin).
- Dolaşım sistemini D-PBS ile perfüze edin. Büyük bir damarı (ön ayağın altında veya diyaframın altında) klipsleyin ve şırınganın ucunu yavaşça iterek D-PBS'yi sağ ventrikülden (kalbin alt kısmı, yukarı bakacak şekilde) perfüze edin. İğne kalp duvarından görünmüyorsa, muhtemelen sol ventriküldedir. Bu, akciğerlerdeki kanı uzaklaştırır.
NOT: Baloncukları itmeyin. Hatta herhangi bir kabarcık varsa, D-PBS'yi şırıngayla itmeden önce bunları dışarı atın. Endotel hücre ölümü bir endişe kaynağıysa, PBS'yi elle itmek yerine yerçekimi perfüzyonu kullanmak daha naziktir. - Yalnızca histoloji veya immünofloresan için doku topluyorsanız, adım 7.9'a geçin; yalnızca tek hücreli süspansiyon için topluyorsanız, tüm akciğer loblarını kesin ve buz üzerinde PBS'ye yerleştirin, ardından adım 7.11'e geçin.
- Aşağı akış immünofloresan veya histoloji için akciğer şişmesi:
- Akciğerleri %2 paraformaldehit (PFA) içinde şişirin ve parafin gömmek için etanol ile dehidre edin veya %2 PFA ile şişirin ve kriyoseksiyon için sakaroz ile dehidre edin.
- RNAskop veya hibridizasyon zincir reaksiyonu (HCR) gibi RNA tespit teknikleri için akciğerleri %4 PFA'ya sabitleyin. En iyi fiksasyon için, akciğerleri %2 ultra düşük erime noktalı agaroz içinde şişirin ve aşağı akış immünofloresan için bir doku kültürü plakasında titreşimli bir mikrotom üzerinde hemen %2 veya %4 PFA'ya bölün.
- Elle akciğer şişirme:
- Akciğerleri bir şırınga ve 21-23 G iğne ile tüplü veya tüpsüz elle veya yerçekimi kullanarak tezgah yüzeyinden 30 cm yükseklikteki bir halka standına bir PFA tüpü yapıştırarak şişirin.
- Trakeayı izole ettikten sonra, iğneyi trakeanın üst kısmına sokun, trakeanın altını delmeden yukarı doğru eğim verin ve sıvı yerleştirmeden önce trakea ve iğne etrafındaki dikişi sıkın.
NOT: Keskin bir iğne kullanmak, künt uçlu bir iğneye kıyasla hafif bir trakeal pontasyon riski taşır ve araştırmacılar herhangi bir hasarı önlemek için işlem sırasında çok dikkatli olmalıdır. Keskin bir iğne soluk borusunu deliyorsa, künt uçlu bir iğne kullanılmalıdır.
- Aşağı akış sitometrisi veya tek hücreli dizileme analizi için tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için, akciğer dokusunu D-PBS'den çıkarın ve akciğer dokusunu makasla kıyın, ardından daha da ince doku parçaları elde etmek için bir tıraş bıçağıyla 2-3 dakika doğrayın.
- D-PBS'de 480 U/mL kollajenaz I, 100 μL/mL dispaz ve 2 μL/mL DNaz içeren sindirim tamponunda 37 °C'de 30-35 dakika ayrıştırın. 100 μm ve 40 μm filtrelerden süzün, kalan kırmızı kan hücrelerini Amonyum-Klorür-Potasyum (ACK) lizis tamponu kullanarak parçalayın ve sonraki işleme ve analiz için PBS'de %1 BSA'da yeniden süspanse edin.
NOT: Akciğerlerde enfeksiyon sonrası viral enfeksiyonu ve klirensi tespit etmek için, viral replikasyonu ölçmek için akciğer homojenatlarında qRT-PCR veya TCID50 testi kullanarak viral yükü değerlendirmek mümkündür. Nöraminidaz ve kapsid boyama, viral enfeksiyonu tespit etmek için de kullanılabilir. Viral klirens, enfeksiyonu takiben 8-9. günlerde gerçekleşmelidir18,19, akciğer dokusunun onarımı ve yenilenmesi birkaç hafta devam eder 9.
Sonuçlar
Enfekte olmamış, PBS ile tedavi edilen farelerle karşılaştırıldığında, IAV ile enfekte olmuş fareler heterojen doku hasarı gösterecektir (Şekil 1A). Doku hasarı, MATLAB20'de bir k-ortalama kümeleme algoritması kullanılarak ölçülebilir (Şekil 1B). IAV ile enfekte fareler, enfeksiyonu takip eden 3-4 gün arasında kilo vermeye başlayacaktır. İdeal bir titrede, fareler ilk vücut ağırlıklarının %20-30'unu kaybederler ve maksimum kilo kaybı enfeksiyondan (dpi) 8-10 gün sonra gerçekleşir (Şekil 1C). 11-12 dpi'ye kadar, fareler kilo almaya başlamalı ve 14 dpi ile ilk vücut ağırlıklarının %10-15'ine geri dönmelidir. Rejenerasyon çalışmaları için, deneydeki farelerin çoğunun kilo vermesi ve doku hasarı yaşaması ancak ölmemesi yararlıdır. Bununla birlikte, doku hasarındaki heterojenlik (Şekil 1A, B) ve intranazal uygulamadaki olası değişkenlik nedeniyle, bir deneydeki birkaç farenin kilo vermemesi veya doku hasarı yaşamaması ve birkaç farenin vücut ağırlığının% >30'unu kaybetmesi normaldir, bu da ötenazi ile sonuçlanır (Şekil 1D). Örneğin, belirli bir genin KO'su olan fareler ile WT kontrolleri arasında hayatta kalma ve kilo kaybındaki farkı belirlemeye çalışan deneylerin, IAV'nin titresini ve dozajını ayarlaması gerekebilir ve bu iki parametrede böyle bir farkı tespit etmek için gereken örneklem boyutunu belirlemek için bir güç hesaplaması yapması gerekecektir.
Genel doku yapısındaki ve fare sağlığındaki değişikliklere ek olarak, dokunun hasara tepkisi boyunca tüm akciğer hücresel bölmelerinde transkripsiyonel değişiklikler meydana gelir. Bu, hem geçiş veya ara epitel hücre durumları ve miyeloid bağışıklık hücresi durumları dahil olmak üzere doku onarıldıkça nihai olarak çözülen geçici hücre durumlarını hem de Krt5+ epitel hücreleri ve TrkB+ endotel hücreleri9 dahil olmak üzere fonksiyonel onarıma katkıda bulunmayan kalıcı hücre durumlarını içerir. Örneğin, fare akciğerinin kılcal endotelinde, interferonla uyarılan genlerin yüksek ekspresyonu ile karakterize edilen 6 dpi'de geçici interferonla uyarılan bir endotel hücre durumu ortaya çıkar (Şekil 2A). Bu durum 11-19 dpi ile çözülür (Şekil 2A). Ntrk2 (TRKB), Sparcl1 ve Bnip3'ün yüksek ekspresyonu ile karakterize edilen 11 dpi'de yaralanmaya bağlı bir kapiller endotelyal (iCAP) durumu ortaya çıkar (Şekil 2B). İnterferonla uyarılan endotel hücre durumundan farklı olarak, iCAP endotel hücre durumu daha sonra ciddi şekilde hasar görmüş doku bölgelerinde devam eder ve enfeksiyondan bir yıl sonra hala mevcuttur (Şekil 2C). Alveolar geçiş hücreleri ve olgunlaşmamış alveolar tip I epitelyal (AT1) hücre durumları dahil olmak üzere geçici alveolar epitel hücre durumları da enfeksiyondan sonra ortaya çıkar (Şekil 2D). Son olarak, enfeksiyon birçok endojen alveolar makrofajın (aMAC_a) kaybına ve bunların hem inflamatuar monositlerden (iMON) hem de endojen aMAC'lerden yeniden oluşturulmasına neden olur. Enfeksiyondan 1 yıl sonra alveolar makrofajlar, kökenlerine bağlı olarak farklı transkripsiyonel durumlara (aMAC_a ve aMAC_b) sahiptir (Şekil 2E)9. Akut akciğer hasarını takiben ortaya çıkan geçici ve kalıcı hücre durumları, niş içindeki anormal davranışları, başarılı doku onarımına ve sonraki doku fonksiyonuna üretken veya olumsuz olarak katkıda bulunabileceğinden, daha fazla çalışmayı garanti eder. Tek hücreli RNA dizileme verileri daha önceyayınlanmıştır 9 ve Gen Ekspresyonu Omnibus'ta GEO: GSE262927 olarak depolanmıştır.
Şekil 1: Akciğer hasarının ve hayvan sağlığının izlenmesi. (A) Solda sahte enfekte (PBS ile tedavi edilmiş) bir akciğerden ve sağda IAV ile enfekte bir akciğerden akciğer dokusu kesitlerinin hematoksilen ve eozin (HE) boyaması. Yaralanmamış akciğerle karşılaştırıldığında, IAV ile enfekte akciğer, heterojen doku hasarı gösterir. Ölçek çubukları, 1 mm. (B) MATLAB20'de bir k-ortalama kümeleme algoritması kullanılarak, doku hasarı şiddetli (kırmızı), hasarlı (yeşil) veya normal (mavi) olarak karakterize edilebilir. Soldaki PBS ile tedavi edilen akciğer lobunda, hava yolu epitel hücrelerinin yoğunluğu ve boyanma yoğunluğu nedeniyle hava yolu yapılarının "şiddetli" olarak sınıflandırıldığına dikkat etmek önemlidir. Bununla birlikte, bu taban çizgisi göz önüne alındığında, PBS ile tedavi edilen ve influenza ile enfekte akciğerler arasındaki farkı kolayca ayırt etmek hala mümkündür. Ölçek çubukları, 1 mm. (C) Fare akciğerlerinin enfeksiyondan 13 gün sonra (dpi) toplandığı temsili bir IAV enfeksiyonu deneyinden örnek kilo kaybı eğrisi. Eğri, altı vahşi tip fareden alınan verileri içerir ve noktalar ortalamayı temsil ederken, hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil eder. (D) Fare akciğerlerinin enfeksiyondan 14 gün sonra (dpi) toplandığı temsili bir IAV enfeksiyonu deneyinden örnek hayatta kalma eğrisi. Eğri, yedi vahşi tip fareden elde edilen verileri içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: IAV enfeksiyonundan sonra kapiller endotel hücre durumu değişikliklerinin izlenmesi. (A) 11-19 dpi arasında çözülen 6 dpi'de interferon ile uyarılan bir EC durumu ortaya çıkar. İnfluenza enfeksiyonunu takiben birkaç farklı zaman noktasında fare akciğerlerinden yayınlanan tek hücreli RNA dizileme verilerinin yeniden analizi, tüm kılcal endotel hücre tiplerinde interferon modül skorunun 6 dpi'de en yüksek olduğunu göstermektedir. Veriler R kullanılarak yeniden analiz edildi ve interferon modülü skoru, her hücre tipinde interferonla uyarılan 87 genin ekspresyonuna dayanıyor. CAP1, kapiller tip 1 endotel hücresi; iCAP, yaralanmaya bağlı endotel hücresi; CAP2, kapiller tip 2 endotel hücresi; EC, endotel hücresi. (B) Buna karşılık, Ntrk2 (TRKB) ekspresyonu ile karakterize edilen yaralanmaya bağlı bir EC durumu 11 dpi'de ortaya çıkar ve enfeksiyondan bir yıl sonrasına kadar devam eder. Ölçek çubuğu, 500 μm. (C) İnfluenza enfeksiyonundan sonra akciğer kılcal endotel hücrelerinin tek hücreli RNA diziliminden elde edilen transkripsiyonel veriler, doku onarımı sırasında kılcal endotel hücre durumunun dinamik doğasını göstermektedir. (D) Alveolar epitel hücreleri de influenza enfeksiyonundan sonra hücre plastisitesi yaşarlar. Bir alveolar geçiş hücre tipi 6-11 dpi arasında ortaya çıkar ve 19 dpi ile çözülür. Olgunlaşmamış bir AT1 hücre durumu (AT1_c) 11 dpi'de ortaya çıkar ve 90 dpi'ye kadar devam eder. (E) Enfeksiyondan sonra, mevcut birçok alveolar makrofaj (aMAC_a) kaybolur ve 6 dpi'de bir inflamatuar monosit (iMON) akışı görülür. Alveolar makrofaj popülasyonu, hem aMAC_a popülasyonu yenilemek için mevcut aMAC'ler hem de aMAC_b popülasyonu oluşturan inflamatuar monositler tarafından yeniden oluşturulur. Her ikisi de bir alveolar makrofaj durumunu temsil etse de, ortaya çıkan aMAC'ler transkripsiyonel olarak ayırt edilebilir. (C-E)'deki grafikler, uzunlamasına influenza enfeksiyonu veri setindeki her zaman noktasında her popülasyondaki hücrelerin yüzdesini gösterir ve R kullanılarak oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: İnfluenza enfeksiyonundan sonra hayvanları izlemek için örnek yaralanma günlüğü, ağırlık günlüğü ve vücut kondisyon skoru (BCS) günlüğü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Burada, fare akciğerlerinde hızlı ve etkili hasar başlatmak ve hem başarılı rejenerasyon hem de displastik onarım mekanizmalarını incelemek için influenza virüsünü farelere aktarmanın uygun bir yöntemini bildirdik. A/PR/8/34 IAV'nin intranazal aşılamasının stressiz bir teknik olabileceğini gösterdik. İzofluran anestezisinden sonra aşılamanın tamamlanması fare başına 2 dakikadan az sürer. Doğal enfeksiyon yolunu izleyen ve hem doku hem de bağışıklık sisteminin tepkisinin fizyolojik olarak daha uygun bir şekilde incelenmesine izin veren basit ve invaziv olmayan bir viral aşılama tekniğidir. Fare burun deliklerinden aşılanan virüs hem mukozal hem de sistemik bağışıklığı indükleyebilir21. Daha da önemlisi, viral enfeksiyonun neden olduğu hasar, hematoksilen ve eozin (HE) boyaması22 ile boyanmış akciğer dokusu dilimlerinde açıkça görülmektedir (Şekil 1). Akciğerin her bölmesindeki akciğer hücre tiplerinde beklenen transkripsiyonel değişikliklerin tam bir zaman çizelgesi daha önce yayınlanmıştır9. Burada, fare akciğerlerinin kılcal endotelyal, alveolar epitelyal ve miyeloid immün kompartmanlarında, enfeksiyondan bir yıl sonrasına kadar enfekte olmamış farelerden influenza enfeksiyonuna verilen yanıt boyunca geçici ve kalıcı transkripsiyonel değişikliklerin meydana geldiğini göstermek için bu verilerin bir alt kümesini yeniden analiz ettik (Şekil 2).
Bu protokolde birkaç kritik adım vardır ve bu adımların uygun şekilde giderilmesi başarılı bir deney üretecektir. A/PR/8/34 influenza virüsü, insanları verimli bir şekilde enfekte etmeyen, fareye uyarlanmış bir influenza türüdür23, ancak laboratuvar personelinin enfeksiyon kapma olasılığını önlemek için deney sırasında belirtilen tüm güvenlik prosedürlerini takip etmek her zaman önemlidir. İzofluran anestezi uygulaması, fareler uyanık olduklarında virüsü iyi solumayacakları için virüsün başarılı bir şekilde verilmesini sağlamak için kritik bir adımdır. Virüsün her iki burun deliğine de aşılandığından emin olmak için işlem sırasında nefes almayı kontrol edin ve fare kafası hareketini izleyin. Fareler tam olarak uyuşturulmazsa, hem virüsün solunmasını sınırlayan hem de aerosoller üreten kabarcıklar oluşabilir. Her iki sonuçtan da kaçınılmalı ve burun deliklerinde herhangi bir hapşırma veya kabarcık gözlenirse fareler izofluran burun konisine geri yerleştirilmelidir. Kilo kaybının, vücut kondisyon puanının ve sağlık durumunun ölçülmesinin yanı sıra iyileştirici gıda takviyesi sağlanması gibi enfeksiyon sonrası izleme de bu deneyin önemli bir bileşenidir. Farelerin yeterli kilo vermediği veya beklenen miktarda doku hasarına sahip olmadığı gözlemlenirse (Şekil 1), dozun çok düşük olması mümkündür; Öte yandan, birçok fare %30 vücut ağırlığı kaybı son noktasına ulaşırsa, dozun çok yüksek olması mümkündür. Her iki durumda da, burada açıkladığımız gibi bir C57BL/6 fare kohortu kullanarak virüs partisinin ampirik bir titresi yoluyla uygun dozu belirlemek en iyisidir.
İnfluenza enfeksiyonu dünya çapında yaygın olmaya devam ettiğinden, ciddi solunum yolu hastalıklarına neden olduğundan ve ölümcül olabileceğinden, viral enfektivite sürecini ve akciğerdeki enfeksiyon ve doku hasarına hücresel yanıtı anlamak birincil öneme sahiptir. Bu çalışmada açıklanan intranazal enfeksiyon yöntemi, bu nedenle, önemli düzenleyici mekanizmaların tanımlanmasına ve akciğer hastalıkları için yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesine yardımcı olabilir. Ek olarak, tekniğin gelecekteki uygulamaları, tekrarlayan solunum yolu enfeksiyonları durumunda akciğer dokusu yapısı ve işlevi üzerindeki etkileri belirlemek için X31 gibi fareye uyarlanmış farklı bir influenza virüsü türü kullanabilir. Pek çok insan yaşamları boyunca birden fazla solunum yolu enfeksiyonuna maruz kaldığından, bu modelin böyle bir uzantısının akciğer dokusu rejenerasyonu çalışmaları ve dolayısıyla halk sağlığı için önemli etkileri olabilir.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu araştırma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), Ulusal Kanser Enstitüsü, Kanser Araştırma Merkezi'nin İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL tüp | Fisher Scientific | 02-682-557 | |
| 100 & mikro; M hücre süzgeci | Falcon | 352360 | |
| 15 mL konik tüp | Falcon | 352196 | |
| 1x PBS | Gibc0 | 10010-023 | |
| 40 µ M hücre süzgeci | Falcon | 352340 | |
| 5 mL tüp | Globe | 6101C | |
| 50 mL konik tüp | Falcon | 352098 | |
| A/PR/8/34 Grip Virüsü stoku | ATCC | VR-95PQ | Farklı partilerde farklı viral titer bulunur |
| ACK Liz Tamponu | Kaliteli Biyolojik | 118-156-101 | |
| Anti-TRKB Antikor | R& D Sistemleri | AF1494 | |
| Çamaşır suyu | Clorox | %10 Çamaşır Açıcı | |
| Sığır Serum Albümini | Sigma Aldrich | A8022 | |
| CO2 Anestezi Indüksiyon Odası | Herhangi bir | Yok | |
| Kollagenaz Tip I | Gibco | 17100017 | |
| DAPI | Milipore Sigma | 28718-90-3 | |
| Dağıtmak | Corning | CB-40235 | |
| Diseksiyon araçları: makas, kavisli forseps, düz forseps | Herhangi bir | Yok | |
| Dnase | Sigma Aldrich | 4716728001 | |
| D-PBS | Corning | 21-031-CM | |
| Etanol | Pharmco | 111000200 | |
| Cam şişeler | DWK Yaşam Bilimleri | 986562 | |
| Buz kovası | Herhangi bir | Yok | |
| İzofluran | Covetrus | 29404 | |
| İğneler, 21– 23 G | Herhangi bir | Yok | |
| P20/P200 pipet | Pipetman | F144056M/F144058M, | |
| P20/P200 pipet uçları | Thomas Scientific | 1159M43/1159M40 | |
| Paraformaldehit (PFA) | Termo Bilimsel | J19943-k2 | %2PFA |
| Pipetman | Herhangi bir | Yok | |
| Plastik veya karton dondurucu kutuları | Herhangi bir | Yok | |
| Jilet bıçağı | Herhangi bir | Yok | |
| Ring Stand | Herhangi bir | Yok | |
| Serolojik pipetler, 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Slide Top Indüksiyon Fare İzofluran Odası | Somni Scientific | ||
| Dikiş | Fisher Scientific | NC9422522 | |
| Şırınga boru ve luer kilitleri | Herhangi bir | Yok | |
| Şırınga, 10 mL | Herhangi bir | Yok | |
| Masa Üstü Anestezi Makinesi İzofluran | Ohmeda | Ohmeda İzotec- 4 | Akış hızı 2.5&nNdash olmalıdır; 3% |
| Ultra düşük eriyen agaroz | Sigma Aldrich | A5030-1G | |
| Tartı dengesi | OHAUS | CS200 |
Kaynaklar
- Mammoto, A., Mammoto, T. Vascular niche in lung alveolar development, homeostasis, and regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 7, 318(2019).
- Tsikis, S. T., Hirsch, T. I., Fligor, S. C., Quigley, M., Puder, M. Targeting the lung endothelial niche to promote angiogenesis and regeneration: a review of applications. Front Mol Biosci. 9, 1093369(2022).
- Torrego, A., Pajares, V., Mola, A., Lerma, E., Franquet, T. Influenza A (H1N1) organising pneumonia: figure 1. BMJ Case Rep. 2010, bcr1220092531(2010).
- Murota, M., et al. Influenza H1N1 virus-associated pneumonia often resembles rapidly progressive interstitial lung disease seen in collagen vascular diseases and COVID-19 pneumonia; CT-pathologic correlation in 24 patients. Eur J Radiol Open. 7, 100297(2020).
- Niethamer, T. K., et al. Defining the role of pulmonary endothelial cell heterogeneity in the response to acute lung injury. eLife. 9, e53072(2020).
- Klomp, M., Ghosh, S., Mohammed, S., Khan, M. N. From virus to inflammation, how influenza promotes lung damage. J Leukoc Biol. 110 (1), 115-122 (2021).
- Newton, A. H., Cardani, A., Braciale, T. J. The host immune response in respiratory virus infection: balancing virus clearance and immunopathology. Semin Immunopathol. 38 (4), 471-482 (2016).
- Jones, D. L., et al. An injury-induced mesenchymal-epithelial cell niche coordinates regenerative responses in the lung. Science. 386 (6727), eado5561(2024).
- Niethamer, T. K., et al. Longitudinal single-cell profiles of lung regeneration after viral infection reveal persistent injury-associated cell states. Cell Stem Cell. 32 (2), 302-321.e6 (2025).
- Belser, J. A., Gustin, K. M., Katz, J. M., Maines, T. R., Tumpey, T. M. Comparison of traditional intranasal and aerosol inhalation inoculation of mice with influenza A viruses. Virology. 481, 107-112 (2015).
- Oltean, T., Maelfait, J., Saelens, X., Vandenabeele, P. Need for standardization of influenza A virus-induced cell death in vivo to improve consistency of inter-laboratory research findings. Cell Death Discov. 10 (1), 247(2024).
- Nguyen, T. -Q., Rollon, R., Choi, Y. -K. Animal models for influenza research: strengths and weaknesses. Viruses. 13 (6), 1011(2021).
- Jin, X. -Y., et al. Comparative pathogenicity of influenza virus-induced pneumonia mouse model following intranasal and aerosolized intratracheal inoculation. Virol J. 21 (1), 240(2024).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164(2012).
- Cantu, A., Gutierrez, M. C., Dong, X., Leek, C., Anguera, M., Lingappan, K. Modulation of recovery from neonatal hyperoxic lung injury by sex as a biological variable. Redox Biol. 68, 102933(2023).
- Sunagar, R., Kumar, S., Namjoshi, P., Rosa, S. J., Hazlett, K. R. O., Gosselin, E. J. Evaluation of an outbred mouse model for Francisella tularensis vaccine development and testing. PLoS One. 13 (12), e0207587(2018).
- Cowley, P. M., Roberts, C. R., Baker, A. J. Monitoring the health status of mice with bleomycin-induced lung injury by using body condition scoring. Comp Med. 69 (2), 95-102 (2019).
- Gonzalez, A. J., Ijezie, E. C., Balemba, O. B., Miura, T. A. Attenuation of influenza A virus disease severity by viral coinfection in a mouse model. J Virol. 92 (23), e00881-e00918 (2018).
- Lv, J., et al. Kinetics of pulmonary immune cells, antibody responses and their correlations with the viral clearance of influenza A fatal infection in mice. Virol J. 11, 57(2014).
- Liberti, D. C., et al. Alveolar epithelial cell fate is maintained in a spatially restricted manner to promote lung regeneration after acute injury. Cell Rep. 35 (6), 109092(2021).
- Cipolla, D., et al. Inhalable and nasal biologics: analytical, formulation, development, and regulatory considerations. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 2024, (2025).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal models for influenza virus pathogenesis and transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
Yeniden basım ve izinler
