Tüm klinik prosedürler Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yürütüldü ve Şanghay Changhai Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylandı (Onay No. CHEC2022-156). Tüm katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Hayvan deneyleri, Changhai Tıp Fakültesi Etik Kurulu tarafından onaylandı (Onay No. CHEC2022-156) ve ulusal laboratuvar hayvanı bakım standartlarına uygundur.
Klinik özellikler
Hasta alımı ve gruplandırma
Ağustos 2022'den Mart 2023'e kadar, böbrek-yin eksikliği 78 sendromu teşhisi konan ve ART arayan10 kısırlık hastası, Deniz Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Üreme Tıbbı Merkezi'nden ve Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Yueyang Hastanesi'nin ayakta tedavi bölümünden işe alındı. Katılımcılar, SPSS 23.0 rastgele sayı üretimi kullanılarak rastgele bir kontrol grubuna veya bir tedavi grubuna (her biri 39 vaka) atandı.
Tanı kriterleri
Batı tıbbı teşhisi, Amerikan Üreme Tıbbı Derneği'nin (ASRM) yumurtalık rezervi göstergelerine ilişkin 2020 Komite Görüşünü takip etti11. Kriterler arasında FSH ≥ 10 IU/L, östradiol ≥ 80 pg/mL, Antral Folikül Sayısı (AFC) 7 < ve AMH < 0,5-1,1 ng/mL idi. Böbrek-yin eksikliği sendromu, Geleneksel Çin Tıbbı Jinekolojisi12 ve TCM Sendromlarının Tanısal Etkinlik Kriterleri13'e göre teşhis edildi.
Dahil etme ve hariç tutma kriterleri
Dahil edilme kriterleri antagonist protokol kullanılarak IVF/ICSI-ET olarak planlandı; zayıf yumurtalık yanıtı öyküsü (< 5 alınan oosit); 20-40 yaş arası; hem DOR hem de TCM sendromu kriterlerini karşılayan; ve bilgilendirilmiş onam imzaladı. Dışlama kriterleri arasında endometriyal patoloji (polipler, tüberküloz, displazi, kanser), uterus malformasyonu, komorbiditeler (diyabet, lupus), yakın zamanda hormon tedavisi (< 3 ay), pelvik cerrahi öyküsü, kromozomal anormallikler veya ilaç alerjisi yer aldı. Kayıttan sonraki 2 hafta içinde protokol sapması, advers olaylar, geri çekilme veya spontan gebe kalma için eliminasyon kriterleri uygulandı.
İlaç yöntemi
Her iki gruba da menstrüel 2-3. günlerde transvajinal ultrason ve hormon testi ile başlangıç değerlendirmesi yapıldı. Kontrol grubuna antagonist rejim uygulandı: rekombinant FSH veya insan menopozal gonadotropini, başlangıç dozu 5 gün boyunca kas içinden 225 IU/gün, ardından folikül büyümesine göre doz ayarlaması. Önde gelen folikül çapı 12 mm'yi geçtiğinde GnRH antagonisti (0,125 mg/gün subkutan) başlandı ve tetiklenene kadar devam edildi. ≥ 1 folikül 18 mm'ye, ≥ 2 17 mm'ye ulaştığında veya ≥ 3 16 mm'ye ulaştığında 250 μg rekombinant hCG ile yumurtlama tetiklendi ve ardından 34-36 saat sonra oosit alımı yapıldı.
Tedavi grubu, adet döngüsünün 2-3. günlerinden başlayarak tetikleyici güne kadar günde 2 kez (sabah ve akşam) günde bir kaynatma olmak üzere ağızdan uygulanan Yangjing Zhongyu Kaynatma (YZD) ilavesiyle aynı protokolü izledi. Klinik formül Rehmannia 12 g, Paeonia lactiflora 12 g, Cornus officinalis 10 g ve Angelica sinensis 12 g içeriyordu.
Gözlem göstergeleri
Klinik sonuçlar arasında yaş, BMI (ağırlık (kg)/boy² (m²) olarak hesaplanır), kısırlık süresi, FSH, gonadotropin dozu/süresi, böbrek-yin eksikliği sendromu skorları, antral folikül sayısı (transvajinal ultrason ile değerlendirilir, 2-9 mm çapında), alınan oositler, Metafaz II (MII) oositler (oosit alımında tanımlanır), döllenmiş embriyolar, bölünmeler, yüksek kaliteli embriyolar (standart embriyoloji laboratuvar kriterleri ile tanımlanır), ve 6-7. gebelik haftalarında ultrasonda gebelik kesesi varlığı olarak tanımlanan klinik gebelik oranı.
Deney hayvanları
Burada, 30 SPF dereceli dişi Sprague-Dawley sıçanı (8 haftalık, 160-200 g) kontrollü koşullar altında (23 ± 2 °C, %40-%45 nem, 12 saat aydınlık/karanlık döngüsü) ad libitum yiyecek ve su ile iklimlendirildi.
İlaç hazırlama
YZD, Rehmannia 30 gr, Angelica 15 gr, Paeonia lactiflora 15 gr ve Cornus officinalis 15 gr ile hazırlandı. Otlar suda kaynatıldı, 200 gözenekli bir filtreden süzüldü ve 70 °C'de düşük basınç altında konsantre edildi. Düşük, orta ve yüksek dozlar için nihai çözeltiler 0.34 g/mL, 0.68 g/mL ve 1.35 g/mL olup, YZD'nin klinik dozunun 0.5x, 1.0x ve 1.2x'ine karşılık gelmektedir. Kaynatma 4 °C'de saklandı.
Modelleme ve gruplama
Tripterygium glikozitlerin intraperitoneal enjeksiyonu (15 gün boyunca günde 40 mg/kg) ile bir DOR modeli indüklendi. Sıçanlar rastgele boş (n = 6), model (n = 6) ve YZD tedavi gruplarına (düşük, orta ve yüksek dozlar; n = 6 her biri) atandı. Gavaj uygulaması (10 mL/kg canlı ağırlık) günde 1 kez yapıldı, tripterygium glikozit enjeksiyonunun ilk gününden itibaren 15 gün devam etti.
Vajinal sitoloji
Östrus döngüsü evreleri vajinal eksfolyatif sitoloji ile değerlendirildi. Vajinal smearler günde bir kez (08:00-10:00) steril pamuklu çubuklarla toplandı, 30 μL salin ile seyreltildi ve ışık mikroskobu altında 100x büyütmede incelendi. Gözlem süresi art arda 15 gün sürdü. Normal östrus döngüsü indeksi, bu süre boyunca düzenli 4-5 günlük kızgınlık döngüleri sergileyen sıçanların oranı olarak tanımlandı.
Hormon tahlilleri
Tam kan 15 günlük tedavi süresi sonunda anestezi altında kardiyak ponksiyon ile alındı, oda sıcaklığında 30 dakika pıhtılaşmaya bırakıldı ve serum elde etmek için 4 °C'de 15 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüj edildi. E2 ve FSH seviyeleri, üreticinin talimatlarına göre ELISA ile ölçüldü.
Yumurtalık histolojisi
Yumurtalık dokusu, ötenaziden hemen sonra her iki yumurtalığın cerrahi olarak çıkarılmasıyla toplandı, kanı çıkarmak için soğuk tuzlu su ile durulandı ve daha sonra 24-48 saat boyunca 4 °C'de %4 paraformaldehit içinde sabitlendi. Dokular dereceli etanol içinde dehidre edildi, ksilen içinde temizlendi, parafine gömüldü ve 4-5 μm'de kesitlendi. Kesitler hematoksilen ve eozin ile boyandı, kurutuldu, temizlendi ve monte edildi.
İstatistiksel analiz
Veriler SPSS 26.0 kullanılarak analiz edilmiştir. Normal değişkenler ortalama ± SD olarak ifade edildi ve t-testi ile karşılaştırıldı; normal olmayan değişkenler medyan (IQR) olarak değerlendirildi ve Mann-Whitney U testi ile karşılaştırıldı. Kategorik değişkenler % olarak ifade edildi ve ki-kare testi ile karşılaştırıldı. p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Tutarlılık için, şekil analizlerine aynı istatistiksel yöntemler uygulandı (ayrı bir Student's t-testi açıklaması yok).
Güvenlik ve atık bertarafı
Paraformaldehit, ksilen ve tripterygium glikozitler, eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü ile sertifikalı çeker ocaklarda işlendi; dökülmeler ve kontamine tek kullanımlık malzemeler etiketli tehlikeli atık konteynerlerinde toplandı ve kurumsal biyogüvenlik SOP'sine göre bertaraf edildi. Paraformaldehit, ksilen ve tripterygium glikozitleri içeren tüm işlemler, uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla (eldiven, laboratuvar önlüğü, gözlük) çeker ocaklarda gerçekleştirildi. Kimyasal atıklar ve hayvan leşleri kurumsal biyogüvenlik yönergelerine göre bertaraf edildi.