Fare Oküler Lens Epitelinden ve Fiber Hücre Yığın Kitlelerinden RNA İzolasyonu

Oküler lens, net bir görüntü elde etmek için ışığı retinaya ince bir şekilde odaklayan şeffaf bir organdır. Lens iki ana hücre tipinden oluşur: ön hemisferi kaplayan tek katmanlı epitel hücreleri ve dokunun toplu kütlesini oluşturan lif hücreleri (Şekil 1). Lens, epitel hücrelerinin sıkıca yapıştığı lens kapsülü olarak bilinen kollajen bir bazal membran ile çevrilidir. Lens büyüdükçe, ekvatordaki epitel hücreleri çoğalır ve lens üzerine eşmerkezli bir şekilde katmanlanan yeni oluşan lif hücre kabuklarına farklılaşır ^1,2,3. Yaşam boyu lens büyümesi, çimlenme bölgesini⁴ oluşturan bu küçük ekvator epitel hücresi popülasyonunun sürekli çoğalmasına bağlıdır. Lif hücreleri olgunlaştıkça, tüm hücresel organeller, ışık saçan nesneleri 5,6,7,8,9,10,11 ortadan kaldırmak ve doku şeffaflığını korumak için bozulur ve en içteki lif hücreleri sonunda sıkıştırılır, bu da sert bir mercek merkezi ^9,12 ile sonuçlanır. Çevreleyen lens kapsülü nedeniyle lenste hücre döngüsü olmaz ve doku çevresine veya kortekse yeni lifler eklendikçe seminal lifler yaşam boyunca lensin merkezinde kalır. Merceğin fiber hücreleri, yaşlarına bağlı olarak farklı optik özelliklere sahiptir ve verilen her aşamada değişen biyolojik özelliklerin zamansal bir anlık görüntüsünü sağlayabilir¹³.

Mevcut cerrahi seçeneklere rağmen, normalde şeffaf olan lensteki herhangi bir opaklık olarak tanımlanan katarakt, dünyada körlüğün önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir¹⁴. Katarakt, lens epitelinde, kortekste veya çekirdekte farklı patofizyolojilerle ortaya çıkabilir¹⁵. Bununla birlikte, katarakt oluşumunun hücresel ve moleküler mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır^16,17. Bu farklı katarakt türlerinin nasıl önleneceğini daha iyi anlamak ve cerrahiye alternatifler geliştirmek için, bu farklı hücre tiplerinin lenste homeostazlarını nasıl koruduklarını daha iyi anlamalıyız.

Epitel ve lif hücreleri lenste farklı fizyolojik roller oynar. Örneğin hücre proliferasyonu lens epiteli¹⁸ ile sınırlıdır. Bu arada, lens lifleri, lensin büyük kütlesini oluşturur ve lense yapı ve kırılma özellikleri sağlar⁹. Lensin farklı bölümlerinde yer alan biyolojik süreçlere ilişkin daha incelikli bir bakış açısı elde etmek için epitel ve lif hücreleri ayrı ayrı araştırılmalıdır. Burada, epiteli lif hücre yığın kütlesinden izole etmek, her fraksiyondan mRNA'yı çıkarmak ve bu transkriptleri ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) kullanarak analiz etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Şekil 1: Lens anatomisi diyagramı. Lens, ön hemisferi kaplayan tek katmanlı bir epitel hücresi (mavi ve turuncu) ve bir yığın lens lifi kütlesi (beyaz) olmak üzere iki hücre tipinden oluşur. Doku, lens kapsülü (bronzluk) olarak bilinen ince bir kollajen zarla çevrilidir. Ön epitel hücreleri (mavi) hareketsizken, ekvator epitel hücreleri (turuncu) çoğalır, farklılaşır ve lens çevresinde yeni lif hücresi katmanları (beyaz) olmak üzere uzar. Yeni nesil lif hücreleri, eşmerkezli kabuklarda önceki nesil liflerin üzerine bindirilir. En eski lens lifi hücreleri dokunun merkezine sıkıştırılır. Bu rakam Cheng'den (2024)³⁸ değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tüm hayvan deneyleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu" ve Indiana Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) onaylı bir protokolüne uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Çalışma alanı, ekipman ve reaktif hazırlama

1. Kullanmadan önce pipet uçlarını otoklavlayın ve RNaz kontaminasyonunu önlemek için RNA deneyleri için otoklavlanmış uç kutuları belirleyin.
2. Çeker ocak ve doku homojenizasyon tokmaklarındaki çalışma yüzeyi alanını RNase dekontaminasyon solüsyonu ile işlemden geçirin, deiyonize su ile iyice durulayın ve kurulayın.
3. Diseksiyon aletlerini (kavisli forseps, düz forseps ve mikrodiseksiyon makası) 5 dakika boyunca p etanolde bekletin ve kullanmadan önce hassas bir görev mendili ile kurulayın.
4. Diseksiyon ve doku izolasyon adımları için yepyeni diseksiyon tepsileri ve Petri kapları kullanın.
5. Çeker ocaktaki DNAse- ve RNAse-içermeyen 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine 400 μL soğuk TRIzol asit-guanidinyum-fenol reaktifini ayırın.

2. Fare merceği diseksiyonu

1. Yetişkin farelere CO kullanarak ötenazi_yapın2 doz aşımı ve ardından ikincil önlem olarak servikal çıkık.
2. Kavisli forseps kullanarak gözleri enüklee edin.
   1. Gözü çevreleyen dokuya forseps ile hafifçe bastırarak gözün yuvadan dışarı çıkmasına neden olun. Gözün altındaki forsepsleri kapatın ve sabit bir şekilde yukarı doğru çekerek çıkarın.
   2. Gözleri 750-1000 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
3. Diseksiyon için, gözleri taze 1x PBS içeren bir diseksiyon tepsisindeki kuyucuklara aktarın.
4. Diseksiyon mikroskobu altında, optik sinirin tabanını tutmak için düz forseps kullanın ve keskin mikrodiseksiyon makası ile siniri göze mümkün olduğunca yakın kesin.
5. Optik sinirin bağlandığı açıklığa dikkatlice ince düz forseps yerleştirin ve dokuyu yerinde tutmak için sıkıştırın.
6. Mikrodiseksiyon makasının ucunu aynı açıklığa sokun ve gözün arka kutbundan kornea-skleral bileşkeye doğru dikkatlice kesin. Lense zarar vermemek için aletleri çok derine sokmayın.
   NOT: Kemirgen merceği gözde büyük bir hacim kaplar ve bu nedenle merceğin delinmesini önlemek için sığ kesimler önerilir.
7. Mikrodiseksiyon makası kullanarak kornea-skleral bileşke boyunca kesin ve göz çevresinin en az yarısını ayırın.
8. Korneayı iterken göz dokularını nazikçe ters çevirmek için düz forsepsleri kullanın ve lensi kornea-skleral insizyondan ekstrüde edin.
9. İnce düz forseps kullanarak büyük, yapışık dokuları lensten dikkatlice çıkarın.
10. Gerekirse, kalan yapışık ekstralentiküler dokuyu çıkarmak için lensi kavisli forseps kullanarak temiz, hassas bir görev mendili üzerinde yavaşça yuvarlayın.
    NOT: Mendili görev mendili boyunca hızlı bir şekilde yuvarlayın ve mendilin aşırı kurumasına izin vermeyin. Lens kapsülü üzerindeki kuru noktalar nedeniyle lens yüzeyinde küçük opaklıklar olabilir. Bu opaklıklar, lens 1x PBS'ye geri yerleştirildiğinde genellikle tersine çevrilebilir ve sonraki adımları etkilemez.
11. Temizlenmiş lensi 1x PBS ile 6 cm'lik bir Petri kabına aktarın.
12. İnce düz forseps kullanarak, lens kapsülünü ekvatorun yakınında sığ bir şekilde delin ve lens kapsülünü lif yığın kütlesinden nazikçe soyun. Lens epitel hücreleri kapsüle bağlı kalacaktır. Dekapsülasyonla çıkmış olabilecek büyük lif parçalarını kapsülden yavaşça çıkarın.
13. Kapsülü ince düz forseps ile nazikçe kavrayın ve kalan lifleri çıkarmak için 1x PBS'de döndürün. Gevşek bir şekilde bağlanmış herhangi bir lif hücresi, kapsül ve epitel hücrelerinden ayrılacaktır.

3. RNA izolasyonu

NOT: RNA izolasyonu için özetlenmiş bir iş akışı Şekil 2'de gösterilmektedir.

1. 2 lens kapsülü veya 2 fiber yığın kütlesini, 400 μL soğuk TRIzol reaktifi içeren ilgili 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin.
   NOT: Lif kütleleri, dokuyu toplamak için kavisli forseps kullanılarak tabaktan tüpe taşınmalıdır.
2. Sonraki adımlar için tüpleri sıkıca kapatın ve kimyasal çeker ocaklara taşıyın.
3. Temiz bir pelet tokmağı kullanarak lens lifi yığın kütlelerini nazikçe homojenize edin.
   NOT: Lif kütlesini tamamen parçaladığınızdan emin olun.
4. Numuneleri (lens kapsülleri veya homojenize fiber yığın kütleleri) çeker ocakta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca TRIzol içinde inkübe edin.
5. Çeker ocakta, her tüpe 400 μL TRIzol reaktifi başına 200 μL kloroform ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın ve başparmağınızı tüpün altında ve işaret parmağınızı kapağın üzerinde tutarak 15 saniye boyunca elinizle kuvvetlice sallayın.
   NOT: Malzeme listesinde belirtilen 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüpleri, sıkı sızdırmazlık nedeniyle kullanılır. Diğer marka mikrosantrifüj tüpleri kullanıyorsanız, TRIzol ve kloroform çözeltisi sıkı bir contaya sahip olmayan tüplerin kapağının altından sızabileceğinden, çalkalamadan önce tüpün kapanmasını ve sızdırmazlığını test edin.
6. Faz ayrımına izin vermek için numuneleri oda sıcaklığında 10-15 dakika inkübe edin.
   NOT: Tüpün dibinde lipitler ve protein içeren pembe bir TRIzol reaktif tabakası, DNA içeren fazlar arasında beyaz bir tabaka ve üstte RNA içeren berrak bir sulu faz bulunmalıdır. Epitel hücre örneklerinde beyaz DNA tabakasının görülmesi daha zor olabilir.
7. Numuneleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin.
   NOT: Transfer sırasındaki fazları bozmamaya dikkat ederek tüpleri dikkatlice santrifüjün içine ve dışına hareket ettirin.
8. Bir RNA Temizleme ve Konsantratör kitinden tüpleri ve reaktifleri birleştirin. Döndürme kolonu boruları, kitten bir toplama borusuna takılır.
9. Çeker ocakta, berrak sulu fazı (üst katman) hacmi not ederek temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice aktarın.
   NOT: Sulu fazın altındaki beyaz DNA tabakasını rahatsız etmekten, dokunmaktan veya çizmekten kaçının. Beyaz tabakayı bozmamak için sulu fazı aktarırken tüpü eğin. Numuneyi kirletmek yerine tüpte az miktarda sulu faz bırakılması tercih edilir. Tipik olarak, 200 μL ilave kloroform için 180-190 μL sulu faz geri kazanılabilir.
10. Sulu faza 1:1 hacimsel oranda 200 derecelik etanol ekleyin.
    NOT: Konsantratör kitinden RNA Bağlayıcı Tampon, etanol eklenmeden önce sulu faza 2:1 hacimsel oranda eklenebilir. RNA verimini artırmak ve RNA'nın izolasyondan sonra yeterli saflığa sahip olması nedeniyle bu adım atlanır.
11. Tüpü birkaç kez ters çevirerek veya çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın. Karışık çözeltiyi bir pipetleyici kullanarak bir RNA döndürme kolonuna aktarın.
    NOT: Pipet ucuyla filtreye dokunmamaya dikkat edin.
12. Döndürme kolonlarını 4 °C'de 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Tüp setlerini düzenli tutmak ve sonraki santrifüjleme adımında kapağın kırılması durumunda kolonun kapağının ve toplama tüpünün yan tarafının etiketlenmesi önerilir.
13. Akışı atın ve döndürme kolonuna 400 μL RNA Hazırlama Tamponu ekleyin.
14. Döndürme kolonlarını 4 °C'de 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
15. Akışı atın ve döndürme kolonuna 700 μL RNA Yıkama Tamponu ekleyin.
16. Döndürme kolonlarını 4 °C'de 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
17. Akışı atın ve döndürme kolonuna 400 μL RNA Yıkama Tamponu ekleyin.
18. Döndürme kolonlarını 4 °C'de 1 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
19. Döndürme kolonunun kuru olduğundan emin olmak için akışı atın ve 4°C'de 30 saniye boyunca 16.000 x g'da bir kez daha santrifüjleyin.
20. Döndürme kolonunu yeni etiketli 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne taşıyın.
21. Membran filtreye 15 μL RNaz içermeyen su ekleyin. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
    NOT: Pipet ucuyla filtreye dokunmamaya dikkat edin.
22. Saflaştırılmış RNA'yı ayrıştırmak için döndürme kolonunu 4 °C'de 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünün kapağı santrifüjleme sırasında açık kalacaktır. Döndürme kolonlarını ve mikrosantrifüj tüplerini, santrifüjleme sırasında sallanmaması ve kırılmaması için açık kapaklar rotor kapağına dayanacak şekilde dikkatlice yerleştirin. Kapaklar, rotorun dönüş yönünü takip etmelidir.
23. Döndürme sütunlarını çıkarın ve atın. RNA, 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerinde toplanan sıvıda olacaktır.
24. 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerini sıkıca kapatın ve yeniden çözünürlüğü teşvik etmek için RNA örneklerini 55-65 derecede 10 dakika inkübe edin.
25. Isıtma adımından sonra numuneleri hemen buzun üzerine yerleştirin.
26. Numuneleri -80 °C'de saklayın veya uzun süreli saklama için cDNA'ya ters kopyalayın.
    NOT: RNA örnekleri, gözle görülür bir konsantrasyon kaybı olmadan 3 aya kadar saklandı. Donma-çözülme döngülerini en aza indirmek ve bozulmayı önlemek için RNA örneklerini depolama için daha küçük hacimlere ayırın.

4. UV-Vis Spektrofotometresi kullanarak RNA konsantrasyonu ölçümü

1. RNA örneklerini buz üzerinde tutun, NanoDrop'u (UV-Vis Spektrofotometre) açın ve cihazın başlatılmasına izin verin.
2. Nükleik Asitler menüsü altında, RNA kantitasyon modülünü seçin.
3. RNA konsantrasyon adımından 2.0 μL eluent'i kaide, bu durumda moleküler dereceli su üzerine pipetleyerek UV-Vis Spektrofotometresini boşaltın. Alet kolunu indirin ve boş numuneyi okuyun.
4. Alet kolunu kaldırın, sensör kaidesini temiz, kuru, hassas bir görev mendili kullanarak temizleyin ve ardından deiyonize suyla ıslatılmış başka bir mendil ve ardından bir kez daha kuru mendil kullanın.
5. İstenirse, numune ayrıntılarını UV-Vis spektrofotometre arayüzüne girin.
6. 2.0 μL RNA örneğini kaide üzerine yükleyin, kolu indirin ve nicelleştirin.
7. Numuneler arasındaki kaideyi temizlemek için 4.4 ila 4.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
8. Bittiğinde, gerekirse daha fazla ölçüm için deneyi kaydedin ve dışa aktarın.

5. Ters transkripsiyon

1. Yüksek oranda işlemsel ve termostabil bir ters transkriptaz kullanarak, üreticinin önerdiği protokolü kullanarak 2.0 μg lens lifi RNA'sını ve ekstrakte edilen tüm epitelyal RNA'yı ters kopyalayın. Temiz bir PCR tüpünde her numune için reaktifleri ve RNA'yı karıştırın. Tüm çözeltileri ve RNA örneklerini buz üzerinde tutun.
   NOT: Bu transkriptaz, reaksiyon başına 2.5 μg'a kadar RNA'yı ters kopyalayabilir. RNA'dan cDNA'ya tam bir dönüşüm varsayılır, bu nedenle RNA başlangıç konsantrasyonu, varsayımsal cDNA konsantrasyonu olarak kullanılır.
2. Tablo 1'de listelenen koşulları kullanarak reaksiyonu termal döngüleyicide çalıştırın.
3. Ters kopyalanmış cDNA'yı -80 °C'de saklayın veya qPCR adımına geçin.
   NOT: cDNA örnekleri, cDNA, RNA'dan daha kararlı olduğundan, gözle görülür bir bozulma olmadan 4 aya kadar saklandı. Donma-çözülme döngülerinin en aza indirilmesi koşuluyla numuneler muhtemelen daha uzun süre saklanabilir.

Tablo 1: Ters transkripsiyon için termocycler koşulları. Bu koşullar, spesifik, yüksek oranda işlemsel ve termostabil bir ters transkriptaza uyarlanmıştır. Çalışma koşulları, kullanılan enzime ve kite bağlı olarak değişebilir.

6. Kantitatif gerçek zamanlı PCR

1. Reaksiyonlara başlamadan önce, moleküler dereceli su ile seyrelterek cDNA stok çözeltilerini istenen konsantrasyona hazırlayın. Bu deneylerde, 5 ng/kuyu reaksiyonları için 5 ng/μL'de 1 μL cDNA kullanılacaktır. Tüm çözeltileri ve cDNA örneklerini buz üzerinde tutun.
   NOT: Kuyu başına 5-50 ng cDNA reaksiyonlarını barındırmak için TaqMan dizi plakaları (0.1 mL formatı) önerilir. cDNA'nın alikotlarını yapmak, donma-çözülme döngülerini sınırlamak için yararlıdır. Bu çalışmada numuneler maksimum 5 donma-çözülme döngüsü ile sınırlandırılmıştır.
2. Advanced Master Mix ve ticari önerilere yönelik problardan oluşan çalışan bir ana karışım hazırlayın. Örnek bir hazırlık için bölüm 7'ye bakın. Tüm çözeltileri ve cDNA örneklerini buz üzerinde tutun.
   NOT: Kuyu başına genellikle iki farklı boyaya sahip bir çift prob kullanılır. Örneğin, bu çalışmada, ilgilenilen gen probu olarak Crygs-FAM-MGB ve iç kontrol olarak Ppia-VIC-MGB kullanılmıştır. Nihai prob ve primer konsantrasyonları için ticari öneriler sırasıyla 250 nM ve 900 nM'dir. Bir hedef çok yüksek oranda eksprese edilirse, reaksiyon reaktiflerinin tükenmesini önlemek için primerle sınırlı bir prob gerekebilir.
3. cDNA stoğunu (1 μL) qPCR plakası üzerindeki uygun kuyucuklara yükleyin, ardından çalışan ana karışımı (9 μL) yükleyin. Ana karışımı eklerken yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek çözeltileri karıştırın. cDNA damlasının çözeltiye karıştırıldığından emin olun ve kabarcıklardan kaçının.
   NOT: Hedefin hassasiyetine bağlı olarak, plakanın buz üzerine yüklenmesi gerekebilir.
4. Optik yapışkan bir kapak uygulayarak qPCR plakasını kapatın. Kapağı düzeltmek ve her kuyucuğun etrafında sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için yapışkan film aplikatörü kullanın.
5. Karıştırmak için 10 saniye boyunca 1000 RPM'de girdap plakaları.
6. Kuyucukların dibinde hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için plakaları oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleyin.
7. Plakayı kantitatif bir PCR termal döngüleyiciye yükleyin ve Tablo 2'de listelenen döngüleri kullanarak çalıştırın.
   NOT: Geleneksel qPCR protokolleri tipik olarak 40 döngü ile sınırlıdır. Döngü sayısını artırmanın anlamlı sonuçlar üretmesi olası değildir, çünkü 40 döngüye kadar tek bir hedef kopya teorik olarak yaklaşık 1 trilyon amplikon¹⁹ verebilir.

Tablo 2: Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu için termocycler koşulları. Bu koşullar, belirli bir dizi ticari gen ekspresyonu tahliline uyarlanmıştır. Amplifikasyon döngülerinin 40'tan 45'e çıkarılması dışında varsayılan parametreler kullanılır.

7. qPCR için örnek hacim hesaplaması

NOT: Aşağıda açıklanan denklemler için bir hacim hesaplayıcı için bir R kaynak kodu Ek Dosya 1'de mevcuttur. Bu hesap makinesi, Malzeme Tablosunda listelenen Taqman probları ve ana karışım içindir.

1. Pipetlenecek kuyucuk sayısını belirleyin ve minimum ,5 fazlalığı hesaplayın. Bu fazlalık sabiti (k_Fazlalık) pipetleme hatasını telafi eder ve yeterli çözüm olmasını sağlar. Bu örnekte, numune hazırlama hedefi olarak 96 kuyu kullanılacaktır.
   Denklem:
   
   Örnek:
   
   NOT: ,5 fazlalık bir tam sayı değilse, sonraki adımlarda "güzel" sayılar sağlamanın kolay bir yolu, en yakın kuyuya yuvarlamak ve k_Fazlalığı buna göre ayarlamaktır.
2. Çalışan ana karışım hacmini hesaplayın. Bu deneylerde, kuyu başına 1 μL cDNA ve 9 μL çalışan ana karışım kullanılır. cDNA ve ana karışım hacimleri gerektiği gibi ayarlanabilir.
   Denklem:
   
   Örnek:
   
3. Konsantrasyon değiştiriciyi (k_Conc) hesaplayın. Bu değiştirici, cDNA ile karıştırıldığında 1x'e kadar seyrelecek daha konsantre bir çalışma ana karışımı oluşturmak için kullanılır.
   Denklem:
   
   Örnek:
   
4. Prob (20x) hacmini hesaplayın.
   Denklem:
   
   Örnek:
   
5. Ana karışım stoğu (2x) hacmini hesaplayın.
   Denklem:
   
   Örnek:
   
6. Moleküler dereceli_H2Okullanarak çalışan ana karışımı hesaplanan hacme getirin.
   Denklem:
   
   
   
   
   
   Örnek:
   
   
   
   
   

Ek Dosya 1: Hacim hesaplayıcı için bir R kaynak kodu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Lens epiteli ve lifleri, 6 ila 7 haftalık vahşi tip farelerden izole edildi. Bu deneyler için üç fare kullanıldı ve her fareden 2 lens kapsülü veya 2 fiber hücre kütlesi, bir biyolojik kopya için bir araya toplandı. Protokolde açıklandığı gibi, RNA, TRIzol reaktif faz ayrımı kullanılarak ekstrakte edildi. Ortalama olarak, bir çift lens epiteli ve lif yığın kütlesi sırasıyla 0.8 μg (SD ± 0.2) ve 9.7 μg (SD ± 2.3) RNA verdi. 15 μL'lik bir elüsyondaki ortalama konsantrasyon, epitel ve lif numuneleri için sırasıyla 55.4 ng/μL (SD ± 16.3) ve 650.0 ng/μL (SD ± 152.2) idi. 5 ng/kuyu reaksiyonları kullanılarak, bu teorik olarak bu protokol kullanılarak izole edilen tek bir lens epitelinden ortalama 160 reaksiyona izin verir. A260/280 oranlarıyla ölçülen ortalama RNA saflıkları, epitel için 1.92 (SD ± 0.05) ve lifler için 2.05 (SD ± 0.01) idi, bu da minimum protein kontaminasyonunu gösterir. Genel olarak, ~2.0'lık bir A260/280 oranı, RNA20 için saf olarak kabul edilir. Genel olarak, bu izolasyon, cDNA'ya ters transkripsiyon yapmak ve tekrarlanan qPCR deneyleri gerçekleştirmek için yeterli konsantrasyonda yüksek saflıkta RNA verdi.

Protokolde açıklandığı gibi ters transkripsiyon ve qPCR gerçekleştirdik. 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 doku bölmeleri arasındaki diferansiyel ekspresyonu ortaya çıkarmak için gerçek zamanlı qPCR analizi için lenste bilinen yüksek transkript veya protein ekspresyonuna sahip 7 gen seçtik. Göreceli ekspresyon, epitel hücrelerine normalize edilmiş 2-ΔΔCq değerleri olarak gösterilmiştir (Şekil 3). Ortalama bağıl ifade, standart sapmalarla geometrik ortalamalar olarak gösterilir. Bilinen diferansiyel ekspresyon nedeniyle, epitel ve lif hücrelerinin başarılı bir şekilde ayrılmasını belirlemek için konneksinler kullanıldı. Connexin 43 (Cx43; boşluk bağlantı proteini alfa 1; Gja1) lens epitel hücrelerinde33, Cx46 (Gja3) lens lifi hücrelerinde34 ve Cx50 (Gja8) hem epitel hem de lif hücrelerinde25,29 eksprese edilir. Lens liflerinin Gja1 ve Gja8'i lens epitelinden sırasıyla yaklaşık 200 ve 7,5 kat daha düşük seviyelerde eksprese ettiği gözlenmiştir. Bu arada, Gja3, önceki raporlarla28 tutarlı olarak, lens liflerinde yaklaşık 1,5 kat daha yüksek oranda eksprese edilir.

Benzer şekilde, kaderinlerde, yani E-kaderin (Cdh1) ve N-kaderin (Cdh2) ile diferansiyel ekspresyon gözlendi. E-kaderin protein ekspresyonu lens epiteli ile sınırlıyken, N-kaderin hem epitelde hem de liflerde eksprese edilir35. Burada Cdh1 ve Cdh2 ekspresyonunun epitele kıyasla liflerde yaklaşık 330 kat ve 2.4 kat daha düşük olduğunu gösteriyoruz.

Lens bölmelerinin36,37 başarılı bir şekilde ayrıldığını göstermek için sırasıyla eşleştirilmiş kutu 6 (Pax6) ve γS-kristalin (Crygs) olmak üzere iki ek epitel ve fiber hücre belirteci de kullanıldı. Daha önce gözlemlenen ekspresyon paternleriyle tutarlı olarak, Pax6 epitel hücreleriyle sınırlıdır ve liflerde 8 kat daha düşük ekspresyon sergiler. Gama-kristalin proteinleri esas olarak lens lifi hücrelerinde eksprese edilir ve Crygs'in epitel1'e kıyasla liflerde yaklaşık 3 kat daha yüksek olduğunu gözlemliyoruz. Bu veriler, lens epiteli ve lif kütlesinin temiz bir şekilde ayrıldığını gösterir ve karşılaştırma için her doku bölmesinin transkriptomik analizine izin verir.

Şekil 2: Adım adım RNA izolasyon iş akışı şeması. (A) Faz ayrımı: 3.1-3.11 adımları. Bu adımlar, birincil dokuyu homojenleştirme, RNA'yı çıkarma ve asit-guanidinyum-fenol faz ayrımı yoluyla RNA'yı izole etme sürecini gösterir. (B) RNA konsantrasyonu: 3.12-3.19 adımları. Bu adımlar, temiz ve yoğunlaştırıcı kolonlar kullanılarak izole edilmiş RNA'nın yıkanmasını ve konsantrasyonunu gösterir. (C) Elüsyon: 3.20-3.26 adımları. Bu adımlar, çözündürmeyi teşvik etmek için RNaz içermeyen su ve ısıtma kullanılarak RNA'nın temiz ve yoğunlaştırıcı kolonlardan ayrıştırılmasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İzole lens epitelini fiber hücre yığın kütlesi ile karşılaştıran nispi gen ekspresyonu. RNA seviyeleri epitel bölmesine normalleştirilir. Epitel hücre belirteçleri Gja1 [connexin 43 (Cx43) için kodlar], Chd1 (E-cadherin için kodlar) ve Pax6 (transkripsiyon faktörü Pax6 için kodlar), lif hücrelerine kıyasla epitel hücrelerinde yüksek ekspresyon gösterir. Fiber hücre belirteçleri Gja3 (Cx46'yı kodlar) ve Crygs (γS-kristalini kodlar) epitele kıyasla yüksek ekspresyon gösterir. Hem epitelde hem de lif hücrelerinde eksprese edilen belirteçler, Gja8 (Cx50'yi kodlar) ve Chd2 (N-kaderini kodlar), her iki bölmede de saptanabilir sinyal gösterir. Grafikler, 2-ΔΔCq yöntemini kullanarak standart sapmalara sahip geometrik ortalamaları gösterir. İstatistiksel anlamlılık, iki yönlü ANOVA ve ardından Šidák çoklu karşılaştırma testi kullanılarak belirlendi. * p ≤ 0.05; ** s≤ 0.01; s≤ 0.001; s≤ 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.