Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare Oküler Lens Epitelinden ve Fiber Hücre Yığın Kitlelerinden RNA İzolasyonu

912 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69079

⸱

10 Ekim 2025

 ,  , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, fare oküler lens epiteli ile fiber hücre yığın kütlesinin ayrılmasını, ardından RNA izolasyonunu ve qPCR analizini detaylandırır. Bu yöntem, epitel hücrelerinde ve farklılaşmış lif hücrelerinde transkriptom ve biyolojik süreçlerin daha ayrıntılı bir analizi için lens hücresi bölmelerinin ayrılmasına izin verir.

Özet

Lens, gözün ön kamarasında bulunan ve epitel hücreleri ve lif hücreleri olmak üzere iki ana hücre tipinden oluşan özel, şeffaf bir dokudur. Tek katmanlı bir lens epitel hücresi, lensin ön yarım küresini kaplarken, lensin çoğu bir lens lifi hücresi kütlesinden oluşur. Kapsül olarak bilinen kollajen bir bazal membran, tüm dokuyu çevreler ve kapsüller. Lens epitel hücreleri, lens kapsülüne güçlü bir şekilde yapışır ve kapsülü dokudan soyarak toplu lif kütlesinden kolayca ayrılabilir. Lens tek tabakasındaki düşük sayıda epitel hücresinden yeterli RNA konsantrasyonu elde etmedeki zorluklar, daha önce epitel hücresi ve lif hücresi transkriptomlarının incelenmesini engellemişti. Bu protokol, tek bir çift fare merceğinden epitel hücre örnekleri üzerinde müteakip transkriptomik deneylere izin vermek için epitel ve lif hücre bölmelerini ve RNA konsantrasyon adımlarını temiz bir şekilde ayırmak ve izole etmek için bir yöntem sunar. Lensin ana hücre tiplerini ayrı ayrı araştırma yeteneği, lens bakımı ve düzensizliğinin biyolojik mekanizmalarının araştırılmasına yardımcı olur ve yaşa bağlı lens patolojilerinden sorumlu hücre tipine özgü bozulmaların karakterizasyonunu sağlar.

Giriş

Oküler lens, net bir görüntü elde etmek için ışığı retinaya ince bir şekilde odaklayan şeffaf bir organdır. Lens iki ana hücre tipinden oluşur: ön hemisferi kaplayan tek katmanlı epitel hücreleri ve dokunun toplu kütlesini oluşturan lif hücreleri (Şekil 1). Lens, epitel hücrelerinin sıkıca yapıştığı lens kapsülü olarak bilinen kollajen bir bazal membran ile çevrilidir. Lens büyüdükçe, ekvatordaki epitel hücreleri çoğalır ve lens üzerine eşmerkezli bir şekilde katmanlanan yeni oluşan lif hücre kabuklarına farklılaşır 1,2,3. Yaşam boyu lens büyümesi, çimlenme bölgesini4 oluşturan bu küçük ekvator epitel hücresi popülasyonunun sürekli çoğalmasına bağlıdır. Lif hücreleri olgunlaştıkça, tüm hücresel organeller, ışık saçan nesneleri 5,6,7,8,9,10,11 ortadan kaldırmak ve doku şeffaflığını korumak için bozulur ve en içteki lif hücreleri sonunda sıkıştırılır, bu da sert bir mercek merkezi 9,12 ile sonuçlanır. Çevreleyen lens kapsülü nedeniyle lenste hücre döngüsü olmaz ve doku çevresine veya kortekse yeni lifler eklendikçe seminal lifler yaşam boyunca lensin merkezinde kalır. Merceğin fiber hücreleri, yaşlarına bağlı olarak farklı optik özelliklere sahiptir ve verilen her aşamada değişen biyolojik özelliklerin zamansal bir anlık görüntüsünü sağlayabilir13.

Mevcut cerrahi seçeneklere rağmen, normalde şeffaf olan lensteki herhangi bir opaklık olarak tanımlanan katarakt, dünyada körlüğün önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir14. Katarakt, lens epitelinde, kortekste veya çekirdekte farklı patofizyolojilerle ortaya çıkabilir15. Bununla birlikte, katarakt oluşumunun hücresel ve moleküler mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır16,17. Bu farklı katarakt türlerinin nasıl önleneceğini daha iyi anlamak ve cerrahiye alternatifler geliştirmek için, bu farklı hücre tiplerinin lenste homeostazlarını nasıl koruduklarını daha iyi anlamalıyız.

Epitel ve lif hücreleri lenste farklı fizyolojik roller oynar. Örneğin hücre proliferasyonu lens epiteli18 ile sınırlıdır. Bu arada, lens lifleri, lensin büyük kütlesini oluşturur ve lense yapı ve kırılma özellikleri sağlar9. Lensin farklı bölümlerinde yer alan biyolojik süreçlere ilişkin daha incelikli bir bakış açısı elde etmek için epitel ve lif hücreleri ayrı ayrı araştırılmalıdır. Burada, epiteli lif hücre yığın kütlesinden izole etmek, her fraksiyondan mRNA'yı çıkarmak ve bu transkriptleri ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) kullanarak analiz etmek için bir yöntem sunuyoruz.

figure-introduction-1
Şekil 1: Lens anatomisi diyagramı. Lens, ön hemisferi kaplayan tek katmanlı bir epitel hücresi (mavi ve turuncu) ve bir yığın lens lifi kütlesi (beyaz) olmak üzere iki hücre tipinden oluşur. Doku, lens kapsülü (bronzluk) olarak bilinen ince bir kollajen zarla çevrilidir. Ön epitel hücreleri (mavi) hareketsizken, ekvator epitel hücreleri (turuncu) çoğalır, farklılaşır ve lens çevresinde yeni lif hücresi katmanları (beyaz) olmak üzere uzar. Yeni nesil lif hücreleri, eşmerkezli kabuklarda önceki nesil liflerin üzerine bindirilir. En eski lens lifi hücreleri dokunun merkezine sıkıştırılır. Bu rakam Cheng'den (2024)38 değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu" ve Indiana Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) onaylı bir protokolüne uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Çalışma alanı, ekipman ve reaktif hazırlama

  1. Kullanmadan önce pipet uçlarını otoklavlayın ve RNaz kontaminasyonunu önlemek için RNA deneyleri için otoklavlanmış uç kutuları belirleyin.
  2. Çeker ocak ve doku homojenizasyon tokmaklarındaki çalışma yüzeyi alanını RNase dekontaminasyon solüsyonu ile işlemden geçirin, deiyonize su ile iyice durulayın ve kurulayın.
  3. Diseksiyon aletlerini (kavisli forseps, düz forseps ve mikrodiseksiyon makası) 5 dakika boyunca p etanolde bekletin ve kullanmadan önce hassas bir görev mendili ile kurulayın.
  4. Diseksiyon ve doku izolasyon adımları için yepyeni diseksiyon tepsileri ve Petri kapları kullanın.
  5. Çeker ocaktaki DNAse- ve RNAse-içermeyen 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine 400 μL soğuk TRIzol asit-guanidinyum-fenol reaktifini ayırın.

2. Fare merceği diseksiyonu

  1. Yetişkin farelere CO kullanarak ötenaziyapın2 doz aşımı ve ardından ikincil önlem olarak servikal çıkık.
  2. Kavisli forseps kullanarak gözleri enüklee edin.
    1. Gözü çevreleyen dokuya forseps ile hafifçe bastırarak gözün yuvadan dışarı çıkmasına neden olun. Gözün altındaki forsepsleri kapatın ve sabit bir şekilde yukarı doğru çekerek çıkarın.
    2. Gözleri 750-1000 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  3. Diseksiyon için, gözleri taze 1x PBS içeren bir diseksiyon tepsisindeki kuyucuklara aktarın.
  4. Diseksiyon mikroskobu altında, optik sinirin tabanını tutmak için düz forseps kullanın ve keskin mikrodiseksiyon makası ile siniri göze mümkün olduğunca yakın kesin.
  5. Optik sinirin bağlandığı açıklığa dikkatlice ince düz forseps yerleştirin ve dokuyu yerinde tutmak için sıkıştırın.
  6. Mikrodiseksiyon makasının ucunu aynı açıklığa sokun ve gözün arka kutbundan kornea-skleral bileşkeye doğru dikkatlice kesin. Lense zarar vermemek için aletleri çok derine sokmayın.
    NOT: Kemirgen merceği gözde büyük bir hacim kaplar ve bu nedenle merceğin delinmesini önlemek için sığ kesimler önerilir.
  7. Mikrodiseksiyon makası kullanarak kornea-skleral bileşke boyunca kesin ve göz çevresinin en az yarısını ayırın.
  8. Korneayı iterken göz dokularını nazikçe ters çevirmek için düz forsepsleri kullanın ve lensi kornea-skleral insizyondan ekstrüde edin.
  9. İnce düz forseps kullanarak büyük, yapışık dokuları lensten dikkatlice çıkarın.
  10. Gerekirse, kalan yapışık ekstralentiküler dokuyu çıkarmak için lensi kavisli forseps kullanarak temiz, hassas bir görev mendili üzerinde yavaşça yuvarlayın.
    NOT: Mendili görev mendili boyunca hızlı bir şekilde yuvarlayın ve mendilin aşırı kurumasına izin vermeyin. Lens kapsülü üzerindeki kuru noktalar nedeniyle lens yüzeyinde küçük opaklıklar olabilir. Bu opaklıklar, lens 1x PBS'ye geri yerleştirildiğinde genellikle tersine çevrilebilir ve sonraki adımları etkilemez.
  11. Temizlenmiş lensi 1x PBS ile 6 cm'lik bir Petri kabına aktarın.
  12. İnce düz forseps kullanarak, lens kapsülünü ekvatorun yakınında sığ bir şekilde delin ve lens kapsülünü lif yığın kütlesinden nazikçe soyun. Lens epitel hücreleri kapsüle bağlı kalacaktır. Dekapsülasyonla çıkmış olabilecek büyük lif parçalarını kapsülden yavaşça çıkarın.
  13. Kapsülü ince düz forseps ile nazikçe kavrayın ve kalan lifleri çıkarmak için 1x PBS'de döndürün. Gevşek bir şekilde bağlanmış herhangi bir lif hücresi, kapsül ve epitel hücrelerinden ayrılacaktır.

3. RNA izolasyonu

NOT: RNA izolasyonu için özetlenmiş bir iş akışı Şekil 2'de gösterilmektedir.

  1. 2 lens kapsülü veya 2 fiber yığın kütlesini, 400 μL soğuk TRIzol reaktifi içeren ilgili 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin.
    NOT: Lif kütleleri, dokuyu toplamak için kavisli forseps kullanılarak tabaktan tüpe taşınmalıdır.
  2. Sonraki adımlar için tüpleri sıkıca kapatın ve kimyasal çeker ocaklara taşıyın.
  3. Temiz bir pelet tokmağı kullanarak lens lifi yığın kütlelerini nazikçe homojenize edin.
    NOT: Lif kütlesini tamamen parçaladığınızdan emin olun.
  4. Numuneleri (lens kapsülleri veya homojenize fiber yığın kütleleri) çeker ocakta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca TRIzol içinde inkübe edin.
  5. Çeker ocakta, her tüpe 400 μL TRIzol reaktifi başına 200 μL kloroform ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın ve başparmağınızı tüpün altında ve işaret parmağınızı kapağın üzerinde tutarak 15 saniye boyunca elinizle kuvvetlice sallayın.
    NOT: Malzeme listesinde belirtilen 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüpleri, sıkı sızdırmazlık nedeniyle kullanılır. Diğer marka mikrosantrifüj tüpleri kullanıyorsanız, TRIzol ve kloroform çözeltisi sıkı bir contaya sahip olmayan tüplerin kapağının altından sızabileceğinden, çalkalamadan önce tüpün kapanmasını ve sızdırmazlığını test edin.
  6. Faz ayrımına izin vermek için numuneleri oda sıcaklığında 10-15 dakika inkübe edin.
    NOT: Tüpün dibinde lipitler ve protein içeren pembe bir TRIzol reaktif tabakası, DNA içeren fazlar arasında beyaz bir tabaka ve üstte RNA içeren berrak bir sulu faz bulunmalıdır. Epitel hücre örneklerinde beyaz DNA tabakasının görülmesi daha zor olabilir.
  7. Numuneleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Transfer sırasındaki fazları bozmamaya dikkat ederek tüpleri dikkatlice santrifüjün içine ve dışına hareket ettirin.
  8. Bir RNA Temizleme ve Konsantratör kitinden tüpleri ve reaktifleri birleştirin. Döndürme kolonu boruları, kitten bir toplama borusuna takılır.
  9. Çeker ocakta, berrak sulu fazı (üst katman) hacmi not ederek temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice aktarın.
    NOT: Sulu fazın altındaki beyaz DNA tabakasını rahatsız etmekten, dokunmaktan veya çizmekten kaçının. Beyaz tabakayı bozmamak için sulu fazı aktarırken tüpü eğin. Numuneyi kirletmek yerine tüpte az miktarda sulu faz bırakılması tercih edilir. Tipik olarak, 200 μL ilave kloroform için 180-190 μL sulu faz geri kazanılabilir.
  10. Sulu faza 1:1 hacimsel oranda 200 derecelik etanol ekleyin.
    NOT: Konsantratör kitinden RNA Bağlayıcı Tampon, etanol eklenmeden önce sulu faza 2:1 hacimsel oranda eklenebilir. RNA verimini artırmak ve RNA'nın izolasyondan sonra yeterli saflığa sahip olması nedeniyle bu adım atlanır.
  11. Tüpü birkaç kez ters çevirerek veya çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın. Karışık çözeltiyi bir pipetleyici kullanarak bir RNA döndürme kolonuna aktarın.
    NOT: Pipet ucuyla filtreye dokunmamaya dikkat edin.
  12. Döndürme kolonlarını 4 °C'de 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Tüp setlerini düzenli tutmak ve sonraki santrifüjleme adımında kapağın kırılması durumunda kolonun kapağının ve toplama tüpünün yan tarafının etiketlenmesi önerilir.
  13. Akışı atın ve döndürme kolonuna 400 μL RNA Hazırlama Tamponu ekleyin.
  14. Döndürme kolonlarını 4 °C'de 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
  15. Akışı atın ve döndürme kolonuna 700 μL RNA Yıkama Tamponu ekleyin.
  16. Döndürme kolonlarını 4 °C'de 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
  17. Akışı atın ve döndürme kolonuna 400 μL RNA Yıkama Tamponu ekleyin.
  18. Döndürme kolonlarını 4 °C'de 1 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
  19. Döndürme kolonunun kuru olduğundan emin olmak için akışı atın ve 4°C'de 30 saniye boyunca 16.000 x g'da bir kez daha santrifüjleyin.
  20. Döndürme kolonunu yeni etiketli 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne taşıyın.
  21. Membran filtreye 15 μL RNaz içermeyen su ekleyin. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
    NOT: Pipet ucuyla filtreye dokunmamaya dikkat edin.
  22. Saflaştırılmış RNA'yı ayrıştırmak için döndürme kolonunu 4 °C'de 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünün kapağı santrifüjleme sırasında açık kalacaktır. Döndürme kolonlarını ve mikrosantrifüj tüplerini, santrifüjleme sırasında sallanmaması ve kırılmaması için açık kapaklar rotor kapağına dayanacak şekilde dikkatlice yerleştirin. Kapaklar, rotorun dönüş yönünü takip etmelidir.
  23. Döndürme sütunlarını çıkarın ve atın. RNA, 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerinde toplanan sıvıda olacaktır.
  24. 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerini sıkıca kapatın ve yeniden çözünürlüğü teşvik etmek için RNA örneklerini 55-65 derecede 10 dakika inkübe edin.
  25. Isıtma adımından sonra numuneleri hemen buzun üzerine yerleştirin.
  26. Numuneleri -80 °C'de saklayın veya uzun süreli saklama için cDNA'ya ters kopyalayın.
    NOT: RNA örnekleri, gözle görülür bir konsantrasyon kaybı olmadan 3 aya kadar saklandı. Donma-çözülme döngülerini en aza indirmek ve bozulmayı önlemek için RNA örneklerini depolama için daha küçük hacimlere ayırın.

4. UV-Vis Spektrofotometresi kullanarak RNA konsantrasyonu ölçümü

  1. RNA örneklerini buz üzerinde tutun, NanoDrop'u (UV-Vis Spektrofotometre) açın ve cihazın başlatılmasına izin verin.
  2. Nükleik Asitler menüsü altında, RNA kantitasyon modülünü seçin.
  3. RNA konsantrasyon adımından 2.0 μL eluent'i kaide, bu durumda moleküler dereceli su üzerine pipetleyerek UV-Vis Spektrofotometresini boşaltın. Alet kolunu indirin ve boş numuneyi okuyun.
  4. Alet kolunu kaldırın, sensör kaidesini temiz, kuru, hassas bir görev mendili kullanarak temizleyin ve ardından deiyonize suyla ıslatılmış başka bir mendil ve ardından bir kez daha kuru mendil kullanın.
  5. İstenirse, numune ayrıntılarını UV-Vis spektrofotometre arayüzüne girin.
  6. 2.0 μL RNA örneğini kaide üzerine yükleyin, kolu indirin ve nicelleştirin.
  7. Numuneler arasındaki kaideyi temizlemek için 4.4 ila 4.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
  8. Bittiğinde, gerekirse daha fazla ölçüm için deneyi kaydedin ve dışa aktarın.

5. Ters transkripsiyon

  1. Yüksek oranda işlemsel ve termostabil bir ters transkriptaz kullanarak, üreticinin önerdiği protokolü kullanarak 2.0 μg lens lifi RNA'sını ve ekstrakte edilen tüm epitelyal RNA'yı ters kopyalayın. Temiz bir PCR tüpünde her numune için reaktifleri ve RNA'yı karıştırın. Tüm çözeltileri ve RNA örneklerini buz üzerinde tutun.
    NOT: Bu transkriptaz, reaksiyon başına 2.5 μg'a kadar RNA'yı ters kopyalayabilir. RNA'dan cDNA'ya tam bir dönüşüm varsayılır, bu nedenle RNA başlangıç konsantrasyonu, varsayımsal cDNA konsantrasyonu olarak kullanılır.
  2. Tablo 1'de listelenen koşulları kullanarak reaksiyonu termal döngüleyicide çalıştırın.
  3. Ters kopyalanmış cDNA'yı -80 °C'de saklayın veya qPCR adımına geçin.
    NOT: cDNA örnekleri, cDNA, RNA'dan daha kararlı olduğundan, gözle görülür bir bozulma olmadan 4 aya kadar saklandı. Donma-çözülme döngülerinin en aza indirilmesi koşuluyla numuneler muhtemelen daha uzun süre saklanabilir.
AdımSıcaklık (°C)Süre (dk)Döngü
Tavlama25101
Ters Transkripsiyon50101
Enzim İnaktivasyonu8551
Tutmak4∞1

Tablo 1: Ters transkripsiyon için termocycler koşulları. Bu koşullar, spesifik, yüksek oranda işlemsel ve termostabil bir ters transkriptaza uyarlanmıştır. Çalışma koşulları, kullanılan enzime ve kite bağlı olarak değişebilir.

6. Kantitatif gerçek zamanlı PCR

  1. Reaksiyonlara başlamadan önce, moleküler dereceli su ile seyrelterek cDNA stok çözeltilerini istenen konsantrasyona hazırlayın. Bu deneylerde, 5 ng/kuyu reaksiyonları için 5 ng/μL'de 1 μL cDNA kullanılacaktır. Tüm çözeltileri ve cDNA örneklerini buz üzerinde tutun.
    NOT: Kuyu başına 5-50 ng cDNA reaksiyonlarını barındırmak için TaqMan dizi plakaları (0.1 mL formatı) önerilir. cDNA'nın alikotlarını yapmak, donma-çözülme döngülerini sınırlamak için yararlıdır. Bu çalışmada numuneler maksimum 5 donma-çözülme döngüsü ile sınırlandırılmıştır.
  2. Advanced Master Mix ve ticari önerilere yönelik problardan oluşan çalışan bir ana karışım hazırlayın. Örnek bir hazırlık için bölüm 7'ye bakın. Tüm çözeltileri ve cDNA örneklerini buz üzerinde tutun.
    NOT: Kuyu başına genellikle iki farklı boyaya sahip bir çift prob kullanılır. Örneğin, bu çalışmada, ilgilenilen gen probu olarak Crygs-FAM-MGB ve iç kontrol olarak Ppia-VIC-MGB kullanılmıştır. Nihai prob ve primer konsantrasyonları için ticari öneriler sırasıyla 250 nM ve 900 nM'dir. Bir hedef çok yüksek oranda eksprese edilirse, reaksiyon reaktiflerinin tükenmesini önlemek için primerle sınırlı bir prob gerekebilir.
  3. cDNA stoğunu (1 μL) qPCR plakası üzerindeki uygun kuyucuklara yükleyin, ardından çalışan ana karışımı (9 μL) yükleyin. Ana karışımı eklerken yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek çözeltileri karıştırın. cDNA damlasının çözeltiye karıştırıldığından emin olun ve kabarcıklardan kaçının.
    NOT: Hedefin hassasiyetine bağlı olarak, plakanın buz üzerine yüklenmesi gerekebilir.
  4. Optik yapışkan bir kapak uygulayarak qPCR plakasını kapatın. Kapağı düzeltmek ve her kuyucuğun etrafında sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için yapışkan film aplikatörü kullanın.
  5. Karıştırmak için 10 saniye boyunca 1000 RPM'de girdap plakaları.
  6. Kuyucukların dibinde hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için plakaları oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleyin.
  7. Plakayı kantitatif bir PCR termal döngüleyiciye yükleyin ve Tablo 2'de listelenen döngüleri kullanarak çalıştırın.
    NOT: Geleneksel qPCR protokolleri tipik olarak 40 döngü ile sınırlıdır. Döngü sayısını artırmanın anlamlı sonuçlar üretmesi olası değildir, çünkü 40 döngüye kadar tek bir hedef kopya teorik olarak yaklaşık 1 trilyon amplikon19 verebilir.
AdımSıcaklık (°C)Süre(ler)Döngü
Urasil-N-Glikozilaz (UNG) İnaktivasyonu501201
Denatürasyon951201
Denatürasyon95145
Tavlama6020
Tutmak4∞1

Tablo 2: Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu için termocycler koşulları. Bu koşullar, belirli bir dizi ticari gen ekspresyonu tahliline uyarlanmıştır. Amplifikasyon döngülerinin 40'tan 45'e çıkarılması dışında varsayılan parametreler kullanılır.

7. qPCR için örnek hacim hesaplaması

NOT: Aşağıda açıklanan denklemler için bir hacim hesaplayıcı için bir R kaynak kodu Ek Dosya 1'de mevcuttur. Bu hesap makinesi, Malzeme Tablosunda listelenen Taqman probları ve ana karışım içindir.

  1. Pipetlenecek kuyucuk sayısını belirleyin ve minimum ,5 fazlalığı hesaplayın. Bu fazlalık sabiti (kFazlalık) pipetleme hatasını telafi eder ve yeterli çözüm olmasını sağlar. Bu örnekte, numune hazırlama hedefi olarak 96 kuyu kullanılacaktır.
    Denklem:
    figure-protocol-1
    Örnek:
    figure-protocol-2
    NOT: ,5 fazlalık bir tam sayı değilse, sonraki adımlarda "güzel" sayılar sağlamanın kolay bir yolu, en yakın kuyuya yuvarlamak ve kFazlalığı buna göre ayarlamaktır.
  2. Çalışan ana karışım hacmini hesaplayın. Bu deneylerde, kuyu başına 1 μL cDNA ve 9 μL çalışan ana karışım kullanılır. cDNA ve ana karışım hacimleri gerektiği gibi ayarlanabilir.
    Denklem:
    figure-protocol-3
    Örnek:
    figure-protocol-4
  3. Konsantrasyon değiştiriciyi (kConc) hesaplayın. Bu değiştirici, cDNA ile karıştırıldığında 1x'e kadar seyrelecek daha konsantre bir çalışma ana karışımı oluşturmak için kullanılır.
    Denklem:
    figure-protocol-5
    Örnek:
    figure-protocol-6
  4. Prob (20x) hacmini hesaplayın.
    Denklem:
    figure-protocol-7
    Örnek:
    figure-protocol-8
  5. Ana karışım stoğu (2x) hacmini hesaplayın.
    Denklem:
    figure-protocol-9
    Örnek:
    figure-protocol-10
  6. Moleküler dereceliH2Okullanarak çalışan ana karışımı hesaplanan hacme getirin.
    Denklem:
    figure-protocol-11
    figure-protocol-12
    figure-protocol-13
    figure-protocol-14
    figure-protocol-15
    Örnek:
    figure-protocol-16
    figure-protocol-17
    figure-protocol-18
    figure-protocol-19
    figure-protocol-20

Ek Dosya 1: Hacim hesaplayıcı için bir R kaynak kodu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Lens epiteli ve lifleri, 6 ila 7 haftalık vahşi tip farelerden izole edildi. Bu deneyler için üç fare kullanıldı ve her fareden 2 lens kapsülü veya 2 fiber hücre kütlesi, bir biyolojik kopya için bir araya toplandı. Protokolde açıklandığı gibi, RNA, TRIzol reaktif faz ayrımı kullanılarak ekstrakte edildi. Ortalama olarak, bir çift lens epiteli ve lif yığın kütlesi sırasıyla 0.8 μg (SD ± 0.2) ve 9.7 μg (SD ± 2.3) RNA verdi. 15 μL'lik bir elüsyondaki ortalama konsantrasyon, epitel ve lif numuneleri için sırasıyla 55.4 ng/μ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sunulan adımlar, moleküler biyoloji yöntemleri için cDNA'ya başarılı bir şekilde ters kopyalanabilen ayrı lens bölmelerinden RNA'yı izole etme yeteneğini göstermektedir. Analiz yöntemlerinin hassas doğası nedeniyle, diseksiyon aşamasında lensin yapışık dokulardan temiz olması esastır. Bu, yeterli temizliği elde etmek için merceğin Kimwipe üzerinde birkaç kez yuvarlanmasını gerektirebilir. Epitel hücre örneklerinin önemli miktarda lif hücresi ile kontamine olmasını önlemek için kol...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Göz Enstitüsü'nden R01 EY032056 (CC'ye) hibesi ile finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Santrifüj ve RotorFisher Bilimsel14285554PM
Kloroform, HPLC sınıfıAlfa Aesar22920
Etanol (190 geçirmez)Decon Laboratuvarları2801
Etanol (200 geçirmez)Fisher BiyoreaktifleriBP2818 Serisi
Fisherbrand Pelet HavaneliFisher Bilimsel12-141-363
Forseps, kavisli; Öğrenci Cımbızı #7Dünya Hassas Aletler501981
Forseps, düz; Dumont #5Güzel Bilim Araçları11252-40
Forseps, düz; Öğrenci Cımbızı #4Dünya Hassas Aletler501978
Kimwipes, küçükKimberly-Clark Hakkında34155Hassas görev silme
MicroAmp Yapışkan Film AplikatörüUygulamalı Biyosistemler4333183
MicroAmp EnduraPlate Optik 96-Kuyucuklu Hızlı Şeffaf Reaksiyon Plakası BarkodluUygulamalı Biyosistemler4483485
MikropipetleyicilerEppendorf Belediyesi  01-671-120
Mikroskop, DiseksiyonCarl ZeissSteREO Keşfi.V8
MiniAmp Optik Yapışkanlı KapakUygulamalı Biyosistemler4360954
MiniAmp Termal DöngüleyiciUygulamalı BiyosistemlerA37834
MixMate Plakalı Vorteks MikserEppendorf Belediyesi5353000529
Moleküler Sınıf SuFisher BilimselBP28191
Nanodrop One Mikro Hacimli UV-Vis SpektrofotometreTermo BilimselND-BİR-W
Nunc MicroWell Mini TepsilerFisher Bilimsel12-565-154Diseksiyon Tepsisi
PCR TüpleriVWR201007-012
Petri Kabı, 60 mm x 15 mmFisher BilimselFB0875713A
Fosfat Tamponlu Salin, 1x Dulbecco'sGibco14190-136
Pipet Uçları, 10 µ L MezunABD Bilimsel1161-3700
Pipet Uçları, 1250 µ L XL MezunABD Bilimsel1161-1720
Pipet Uçları, 200 µ L Profil MezunABD Bilimsel1163-1700
QuantStudio 3 Gerçek Zamanlı PCR SistemiUygulamalı BiyosistemlerA28567 Serisi
Ters Transkriptaz, SuperScript IV VILO Davetli11756050Yüksek oranda işlemsel ve termostabil ters transkriptaz
RNA Temizleme ve Konsantratör 5 KitiZimoZR1013 Serisi
RNaz İçermeyen SuFisher BiyoreaktifleriBP2819 Serisi
RNaseZapSigmaR2020RNaz dekontaminasyon solüsyonu
SealRite Mikrosantrifüj 1,5 mL TüplerABD Bilimsel1615-5500
Süper İnce Vannas 8 cmDünya Hassas Aletler501778Makas
qPCR için TaqMan FAST Gelişmiş Ana KarışımUygulamalı Biyosistemler4444557
TaqMan Gen Ekspresyon Testi (FAM) Probu (MTO)ThermoFisher Bilimsel4448892
TRIzolDavetli15596026Asit-guanidinyum-fenol çözeltisi
Vorteks KarıştırıcıTermo Bilimsel88880017

Kaynaklar

  1. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2004).
  2. Bassnett, S., Winzenburger, P. A. Morphometric analysis of fibre cell growth in the developing chicken lens. Exp Eye Res. 76 (3), 291-302 (2003).
  3. Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. Int Rev Cytol. 163, 305-350 (1995).
  4. Yamamoto, N., Majima, K., Marunouchi, T. A study of the proliferating activity in lens epithelium and the identification of tissue-type stem cells. Med Mol Morphol. 41 (2), 83-91 (2008).
  5. Bassnett, S. On the mechanism of organelle degradation in the vertebrate lens. Exp Eye Res. 88 (2), 133-139 (2009).
  6. Bassnett, S. The fate of the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum during lens fiber cell differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (9), 1793-1803 (1995).
  7. Bassnett, S. Lens organelle degradation. Exp Eye Res. 74 (1), 1-6 (2002).
  8. Bassnett, S., Beebe, D. C. Coincident loss of mitochondria and nuclei during lens fiber cell differentiation. Dev Dyn. 194 (2), 85-93 (1992).
  9. Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: Structural determinants of eye lens transparency. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
  10. Vrensen, G. F., Graw, J., De Wolf, A. Nuclear breakdown during terminal differentiation of primary lens fibres in mice: A transmission electron microscopic study. Exp Eye Res. 52 (6), 647-659 (1991).
  11. Counis, M. F., et al. Analysis of nuclear degradation during lens cell differentiation. Cell Death Differ. 5 (4), 251-261 (1998).
  12. Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
  13. Al-Khudari, S., Donohue, S. T., Al-Ghoul, W. M., Al-Ghoul, K. J. Age-related compaction of lens fibers affects the structure and optical properties of rabbit lenses. BMC Ophthalmol. 7, 19(2007).
  14. World Report on Vision. , World Health Organization. Geneva. (2019).
  15. Hashemi, H., et al. Global and regional prevalence of age-related cataract: A comprehensive systematic review and meta-analysis. Eye (Lond). 34 (8), 1357-1370 (2020).
  16. Cheng, C., Gong, X. Diverse roles of eph/ephrin signaling in the mouse lens. PLoS One. 6 (11), e28147(2011).
  17. Ibaraki, N. A brighter future for cataract surgery. Nat Med. 3 (9), 958-960 (1997).
  18. Scullica, L., Grimes, P., Mcelvain, N. Further autoradiographic studies of the lens epithelium. Normal and x-irradiated rat eyes. Arch Ophthalmol. 70, 659-665 (1963).
  19. Caraguel, C. G., Stryhn, H., Gagne, N., Dohoo, I. R., Hammell, K. L. Selection of a cutoff value for real-time polymerase chain reaction results to fit a diagnostic purpose: Analytical and epidemiologic approaches. J Vet Diagn Invest. 23 (1), 2-15 (2011).
  20. 60/280 and 260/230 ratios. , Thermo Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Product-Bulletins/T123-NanoDrop-Lite-Interpretation-of-Nucleic-Acid-260-280-Ratios.pdf (2009).
  21. Beyer, E. C., Kistler, J., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Antisera directed against connexin43 peptides react with a 43-kd protein localized to gap junctions in myocardium and other tissues. J Cell Biol. 108 (2), 595-605 (1989).
  22. Gong, X., Cheng, C., Xia, C. H. Connexins in lens development and cataractogenesis. J Membr Biol. 218 (1-3), 9-12 (2007).
  23. Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. Distinct roles for n-cadherin linked c-src and fyn kinases in lens development. Dev Dyn. 242 (5), 469-484 (2013).
  24. Leonard, M., et al. Modulation of n-cadherin junctions and their role as epicenters of differentiation-specific actin regulation in the developing lens. Dev Biol. 349 (2), 363-377 (2011).
  25. Logan, C. M., et al. N-cadherin regulates signaling mechanisms required for lens fiber cell elongation and lens morphogenesis. Dev Biol. 428 (1), 118-134 (2017).
  26. Maddala, R., Nagendran, T., Lang, R. A., Morozov, A., Rao, P. V. Rap1 gtpase is required for mouse lens epithelial maintenance and morphogenesis. Dev Biol. 406 (1), 74-91 (2015).
  27. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178(2022).
  28. Paul, D. L., Ebihara, L., Takemoto, L. J., Swenson, K. I., Goodenough, D. A. Connexin46, a novel lens gap junction protein, induces voltage-gated currents in nonjunctional plasma membrane of xenopus oocytes. J Cell Biol. 115 (4), 1077-1089 (1991).
  29. Rong, P., et al. Disruption of gja8 (alpha8 connexin) in mice leads to microphthalmia associated with retardation of lens growth and lens fiber maturation. Development. 129 (1), 167-174 (2002).
  30. Terrell, A. M., et al. Molecular characterization of mouse lens epithelial cell lines and their suitability to study RNA granules and cataract associated genes. Exp Eye Res. 131, 42-55 (2015).
  31. White, T. W., Bruzzone, R., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Mouse cx50, a functional member of the connexin family of gap junction proteins, is the lens fiber protein mp70. Molecular Biology of the Cell. 3 (7), 711-720 (1992).
  32. Xia, C. H., et al. Altered cell clusters and upregulated Aqp1 in connexin 50 knockout lens epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (11), 27(2024).
  33. Beyer, E. C., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Connexin43: A protein from rat heart homologous to a gap junction protein from liver. J Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2621-2629 (1987).
  34. Gong, X., et al. Disruption of Alpha3 connexin gene leads to proteolysis and cataractogenesis in mice. Cell. 91 (6), 833-843 (1997).
  35. Xu, L., Overbeek, P. A., Reneker, L. W. Systematic analysis of E-, N- and P-cadherin expression in mouse eye development. Exp Eye Res. 74 (6), 753-760 (2002).
  36. Nishina, S., et al. Pax6 expression in the developing human eye. Br J Ophthalmol. 83 (6), 723-727 (1999).
  37. Wistow, G., et al. Gamman-crystallin and the evolution of the betagamma-crystallin superfamily in vertebrates. FEBS J. 272 (9), 2276-2291 (2005).
  38. Cheng, C. Tissue, cellular, and molecular level determinants for eye lens stiffness and elasticity. Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1456474(2024).
  39. Huynh, P. N., Cheng, C. Spatial-temporal comparison of eph/ephrin gene expression in ocular lenses from aging and knockout mice. Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1410860(2024).
  40. Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. J Vis Exp. (31), e1519(2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fiber H cre K tlesiFare LensiLens Epitel H creleriLens Fiber H creleriMikrodissectionSpin Kolon Safla t rmasDiferansiyel Gen EkspresyonuKonneksin Ekspresyonu
Fare Oküler Lens Epitelinden ve Fiber Hücre Yığın Kitlelerinden RNA İzolasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.