Yöntem makalesi

Hava-Sıvı Arayüz Kültür Sistemi Kullanılarak İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Düzlemsel Saç Taşıyan Cilt Organoidlerinin Üretimi

3.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69088

⸱

17 Ekim 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center, 3CEA, Inserm, IRIG, UA13 BGE, Biomics, University of Grenoble Alpes

Bu makalede

Özet

Bu protokol, cilt mimarisini ve işlevini çoğaltmak için düzlemsel, fizyolojik olarak ilgili bir hava-sıvı arayüz kültür sistemi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden saç folikülleri içeren cilt organoidleri üretmek için bir yöntemin ana hatlarını çizmektedir.

Özet

Saç folikülleri içeren insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) türevli cilt organoidleri (SO'lar), cilt mikroçevresindeki hücreler arası etkileşimleri araştırmak için karmaşık bir in vitro model sağlar. Başlangıçta dermisin çevreye maruz kaldığı ve epidermisin organoid merkeze doğru içe doğru baktığı ters kistik bir konfigürasyonda geliştirilen SO'lar, daha sonra insan derisi fizyolojisine daha çok benzeyen bir hava-sıvı arayüzü (ALI) kültür sisteminde düzlemsel bir konfigürasyona aktarılabilir. Bu makale, düzlemsel SO'lara ayrılabilen ve bir ALI kültür sisteminde daha da geliştirilebilen kistik SO'ların üretilmesi ve seçilmesi için kapsamlı bir protokol sunmaktadır. Protokol, organoid gelişiminin kritik aşamalarında makroskopik kalitatif değerlendirme için tanımlanmış kontrol noktaları içerir, kistik SO'ları düzlemsel cilde düzleştirmek için gereken teknik adımları detaylandırır, ALI kültürü için en uygun koşulları belirtir ve moleküler analiz yoluyla sonuçları gösterir. 27. Günde, soya özgü belirteçlerle immünofloresan boyama, saç folikülleri ve yağ bezi benzeri yapılar dahil olmak üzere cilt uzantıları olan çok katlı pigmentli bir epitel ortaya çıkardı. Bu protokol, fizyolojik olarak ilgili bir in vitro model sunarak, uzantıları olan düzlemsel SO'lar oluşturmak için sağlam bir yöntem sağlar. Bu sistem, cilt araştırmalarındaki çeşitli uygulamaları destekler ve patojen enfeksiyonunu, ultraviyole radyasyonun neden olduğu doku hasarını ve ilaç yanıtlarını modellemek için halihazırda başarıyla kullanılmıştır.

Giriş

Deri, organizmalar ve çevreleri arasında çok önemli bir koruyucu bariyer oluştururken aynı zamanda vücut ısısını, su dengesini ve duyusal girdiyi de düzenler. Üç ana katmandan oluşur: epidermis, kornifiye bir yüzeye sahip tabakalı bir keratinosit epiteli; hücre dışı matris, fibroblastlar, sinirler, kan damarları ve bağışıklık hücreleri açısından zengin bir bağ dokusu olan dermis; ve esas olarak deri altı adipositlerden oluşan hipodermis. İnsan derisinin işlevi ayrıca saç kökleri (HF'ler), yağ bezleri ve ter bezleri gibi özel uzantılara da bağlıdır1.

Cilt bozuklukları dünya çapında en yaygın tıbbi durumlar arasındadır 2,3. Tarihsel olarak, cilt odaklı çalışmaların çoğu, organın fizyolojik karmaşıklığını sistemik bir bağlamda kopyalayan hayvan modelleri4 kullanılarak yürütülmüştür. Bununla birlikte, türler arası önemli farklılıklar4, artan etik kaygılarla birlikte, fizyolojik olarak ilgili insan derisi modellerinin geliştirilmesine yol açmıştır.

Geleneksel insan derisi modelleri iki kategoriye ayrılır: tabakalı keratinositlerden oluşan yeniden yapılandırılmış insan epidermisi ve ek olarak bir kollajen matrisine gömülü fibroblastlardan oluşan altta yatan bir dermal bölmeyi içeren yeniden yapılandırılmış insan derisi5. Her iki model türü de cilt fizyolojisi anlayışımızı önemli ölçüde geliştirmiş olsa da, doğal insan derisinin tam mimari doğruluğundan ve hücresel çeşitliliğinden yoksundurlar. Bu modellerin önemli bir sınırlaması, HF'ler gibi cilt uzantılarının olmamasıdır, bu da onları saç büyümesi ve yenilenmesini içeren cilt bozuklukları ile ilgili araştırma ve ilaç testleri için uygun hale getirmez6. HF'leri içeren daha gelişmiş sistemler rapor edilmiş olsa da, ya HF yapısının ve mikro çevrenin karmaşıklığını tam olarak özetlemekte başarısız olurlar ya da biyobaskı veya mikro kalıplama 7,8,9,10 gibi karmaşık teknolojilere dayanırlar.

Bu zorlukların birçoğunu ele alan yeni bir cilt modeli, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) üretilen cilt organoididir (SO)11. Embriyonik gelişimi taklit eden hiPSC'ler, insan derisine çok benzeyen kistik yapılar halinde kendi kendini organize ederek, kraniyal yüzey ektoderm ve kraniyal nöral krest soylarına yönlendirilebilir. Bu SO'lar, tabakalı bir epidermis ve hücre dışı matris açısından zengin bir dermis halinde organize edilmiş, neredeyse tüm bağışıklık dışı cilt hücresi tiplerini içerir. Daha da önemlisi, SO'lar cilt uzantılarının gelişimini destekler: HF'ler ve yağ bezleri. hiPSC'lerin neredeyse sınırsız ölçeklenebilirliği göz önüne alındığında, SO'lar karmaşık genetik mühendisliğine ve yeni işlevsel araçların geliştirilmesine olanak tanır. Bu nedenle, SO'lar bu alanda büyük bir ilerlemeyi temsil ediyor ve gelişimsel biyoloji, hastalık modelleme, ilaç testi ve rejeneratif tıp alanlarındaki uygulamalar için umut vaat ediyor.

Bununla birlikte, önemli bir sınırlama devam etmektedir: SO'lar, epidermisin dermal kistin içinde yer aldığı, mekanik kuvvetlerden korunduğu ve sulu ortama batırıldığı ters kistik yapılar oluşturur. Bu konfigürasyon sadece fizyolojik olarak hatalı olmakla kalmaz, aynı zamanda hava-sıvı arayüzünün (ALI) kurulmasını da engeller. Sonuç olarak, kistik SO'ların epidermal bariyer, mekanik kuvvetler veya doğrudan apikal tedavileri içeren çalışmalar için sınırlı uygulaması vardır. Bu sorunu çözmek için, kistik SO'ları mekanik olarak düzleştirmek ve daha sonra bunları bir ALI koşulu altında düzlemsel cilt olarak kültürlemek için tekrarlanabilir bir yöntem aşağıda sunulmuştur. İlk olarak Jung ve arkadaşları tarafından bildirilen bu yaklaşım, doku mimarisini apikal epidermisin havaya maruz kalması için yeniden düzenler, böylece daha fazla tabakalaşma ve bariyer fonksiyonunu teşvik eder12. Ortaya çıkan düzlemsel, saç taşıyan organoidler, insan derisinin karmaşık mimarisini korurken aynı zamanda fizyolojik olarak doğru doku oryantasyonunu yansıtarak apikal yüzeye deneysel erişim sağlar. Prosedür uzun olmasına (~100 gün) ve özellikle kistik SO'ları düzlemsel SO'lara parçalara ayırırken teknik olarak bazı zorlu adımlar içermesine rağmen, halihazırda SO'lar veya diğer insan derisi eşdeğerleri ile çalışan araştırmacılar için özellikle ilgi çekici olabilir.

Protokol

Şekil 1 , bir ALI kültür sistemi kullanarak düzlemsel SO'lar oluşturmak için iş akışını göstermektedir. İlk bölüm, küçük değişikliklerle Karl R. Koehler11'in öncülüğünü yaptığı metodolojiye dayalı olarak hiPSC'lerden kistik SO'ların oluşumunu özetlemektedir (Şekil 2). İkinci bölüm, daha önce tarif edildiği gibi bir ALI kültür sistemi kullanarak kistik SO'ları düzlemsel SO'lara daha da geliştirme prosedürünü12 modifikasyonlarla detaylandırmaktadır (Şekil 3). Tüm kimyasallar ve malzemeler, malzemeler tablosunda listelenmiştir. SO'ları (https://hpscreg.eu/)13 üretmek için daha önce tarif edilen üç hiPSC hattı (LUMCi001-A, LUMCi004-A ve WT2) kullanıldı.

1. Kistik SO'ların oluşumu

Şekil 2 , temel adımlarda beklenen ve anormal morfolojileri sunmaktadır.

  1. Hücre toplama (Gün -2)
    1. HiPSC'leri standart 6 oyuklu bir plakada %70-80 birleşme noktasına ulaşana kadar kültürleyin.
    2. Hücreleri 1 mL Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile yıkayın. 1 mL Hücre Ayrışma Reaktifi (CDR) ekleyin ve hiPSC'leri matristen ayırmadan gevşetmekiçin ~ 6 dakika boyunca %5 CO 2 ile 37 °C'de inkübe edin (aşırı sindirimden kaçının).
    3. CDR'yi aspire edin ve 10 μM ROCK inhibitörü içeren 1 mL hiPSC bakım ortamı (hiMM) ekleyin. Bir P1000 pipetle yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri nazikçe ayırın ve 3,5 × 103 hücre/mL'de bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
    4. Çok kanallı bir pipet kullanarak 100 μL hücre süspansiyonunu 96 oyuklu U tabanlı, ultra düşük bağlantı plakasının her bir oyuğuna dağıtın. Plakayı oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 110 × g'da santrifüjleyin ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
  2. ROCK inhibitörünün seyreltilmesi (Gün -1)
    1. 100 μg/mL antibiyotik-antimikotik takviyesi (AAS) içeren hiMM'yi hazırlayın.
    2. Kuyu başına 100 μL dağıtın ve 37 °C'de %5CO2 ile inkübe edin .
  3. Yüzey ektoderminin indüksiyonu (0.
    1. Bir sonraki adıma geçmeden önce uygun hacimdeki bazal membran matrisini buz üzerinde çözün. Buz üzerinde bazal membran matrisi (%2), BMP4 (2.5 ng/mL), SB431542 (10 μM) ve bFGF (4 ng/mL) (hiMinM+SFB olarak anılır) ile desteklenmiş hiPSC minimal ortamını (hiMinM) hazırlayın.
      NOT: BMP4 konsantrasyonunun, kullanılan hücre hattına bağlı olarak ayarlanması gerekebilir (tartışmaya bakınız).
    2. Geniş delikli bir P200 pipet ucu kullanarak hücre agregalarını 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpte toplayın.
      NOT: Piyasada bulunan geniş delikli uçları kullanın. Agregalara verilen zararı en aza indirmek için iç çapı en az 2 mm olan bir delik seçin. Alternatif olarak, bir neşteri Kızılötesi Döngü Sterilizatörü ile ısıtın ve bunu geleneksel bir pipet ucundan geniş bir delik oluşturmak için kullanın.
    3. Agregaların tüpün dibine yerleşmesine izin verin. Ortamı dikkatlice aspire edin ve agregaları yıkamak için 2 mL hiMinM ekleyin. Yıkamayı toplam 3 kez tekrarlayın.
    4. Hücre agregalarını soğuk hiMinM+SFB'de geniş delikli bir P1000 pipet ucu kullanarak önceden soğutulmuş 6 oyuklu bir plakanın kuyucuğuna aktarın. Ardından, 100 μL hiMinM+SFB içindeki her bir agregayı, geniş delikli bir P200 pipet ucu kullanarak 96 oyuklu U tabanlı ultra düşük bağlantı plakasına aktarın. Plakayı %5CO2 ile 37 °C'de inkübatöre geri yerleştirin.
      NOT: Bu adım için laminer hava akımı (LAF) başlığının altına yerleştirilmiş bir stereomikroskop kullanın.
  4. Epitel dışı hücre popülasyonlarının indüksiyonu (3.
    1. LDN193189 (1 μM), bFGF (250 ng/mL) ve AAS (100 μg/mL) içeren hiMinM'yi hazırlayın. Çok kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa 25 μL dağıtın.
    2. Ortamın eşit dağılımını sağlamak için plakayı hafifçe çalkalayın. Plakayı %5CO2 ile 37 °C'de inkübatöre geri yerleştirin.
  5. Besin sağlama (6.
    1. AAS (100 μg/mL) içeren hiMinM'yi hazırlayın. Çok kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa 75 μL dağıtın.
    2. Ortamın eşit dağılımını sağlamak için plakayı hafifçe çalkalayın. Plakayı %5CO2 ile 37 °C'de inkübatöre geri yerleştirin.
  6. Orta ferahlık (8. ve 10.
    1. AAS (100 μg/mL) içeren hiMinM'yi hazırlayın. Çok kanallı bir pipet kullanarak her bir kuyucuktan 100 μL ortamı dikkatlice çıkarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak her bir kuyucuğa 100 μL taze ortam dağıtın.
    2. Ortamın eşit dağılımını sağlamak için plakayı hafifçe çalkalayın. Plakayı %5CO2 ile 37 °C'de inkübatöre geri yerleştirin.
  7. Düşük ataşmanlı 24 oyuklu plakalara geçiş (12.
    1. Bir sonraki adıma geçmeden önce uygun hacimdeki Bazal membran matrisini buz üzerinde çözün. Gelişmiş ortam (%49 v/v), Nöral bazal ortam (%49 v/v), Glutamin takviyesi (1x), B-27 takviyesi eksi A vitamini (0.5x), N2 takviyesi (0.5x), 2-Merkaptoetanol (0.1 mM) ve AAS (100 μg/mL) kullanarak organoid olgunlaşma ortamı (OMM) hazırlayın. %1 bazal membran matrisi (OMM1%M) içeren uygun hacimde soğuk OMM hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
      NOT: 2-merkaptoetanolü manipüle ederken kişisel koruyucu ekipman kullanın ve iyi havalandırılan bir alanda çalışın.
    2. Geniş ağızlı bir P1000 pipet ucu kullanarak hücre agregalarını 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpte toplayın.
    3. Agregaların tüpün dibine yerleşmesine izin verin. Ortamı dikkatlice aspire edin. Agregaları yıkamak için 1,5 mL Gelişmiş ortam ekleyin. Yıkamayı toplam 3 kez tekrarlayın.
    4. Soğuk OMM1%M'deki hücre agregalarını, geniş delikli bir P1000 pipet ucu kullanarak önceden soğutulmuş 6 oyuklu bir plakanın kuyusuna aktarın. Ardından, 500 μL OMM1%M içindeki her bir agregayı, geniş delikli bir P1000 pipet ucu kullanarak 24 oyuklu, düşük ataşmanlı bir plakaya aktarın. Plakayı %5CO2 ile 37 °C'de inkübatöre geri yerleştirin.
      NOT: Bu adım için LAF başlığının altına yerleştirilmiş bir stereomikroskop kullanın.
  8. Orta ferahlık (15.
    1. Bir sonraki adıma geçmeden önce uygun hacimdeki Bazal membran matrisini buz üzerinde çözün. Uygun hacimde soğuk OMM1%M hazırlayın. Buz üzerinde tutun.
    2. P1000 uçlarını kullanarak, her bir kuyucuktan 250 μL ortamı dikkatlice çıkarın. Ardından, her kuyucuğa 250 μL OMM1%M ekleyin. Plakayı 37 °C'de %5CO2 ile 65 rpm'ye ayarlanmış bir yörünge çalkalayıcıya geri yerleştirin.
  9. 18. Gün ile 45. Gün arasında Pazartesi, Çarşamba ve Cuma günleri OMM ile yarım orta değişim (250 μL) yapın.
  10. 45. Gün ile 90. Gün arasında Pazartesi ve Çarşamba günleri OMM ile yarım orta değişim (250 μL), Cuma günleri ise tam orta değişim yapın.

2. Kistik SO'lardan düzlemsel SO'lara geçiş

NOT: Kistik SO'lar, epidermisin organoidin merkezine doğru içe baktığı ve dermisin dış ortamla temas halinde olduğu ters bir morfoloji sergiler. 70. Gün ile 90. Gün arasında, hücre hattına ve farklılaşma etkinliğine bağlı olarak, epidermisin erken suprabazal farklılaşması oldukça ilerlemiştir ve saç mandalları gelişir. Bu, kistik SO'ların, doğal insan derisine daha çok benzeyen doku elde etmek için bir ALI kültür sistemine geçirildiği aşamadır.

  1. Düzlemsel SO'lara geçiş için 70. gün ile 90. gün arasında kistik SO'ların seçimi
    1. En az 5 mm çapında ve minimum yan ürün içeriğine sahip kistik SO'ları seçin (kistin bir kutbunda biriken ve ayrıca kıkırdak içerebilen mezenkimal hücreler). Cilt organoid gelişiminin kalite göstergesi olarak saç plakodlarının / mandallarının varlığını kullanın (Şekil 1A ve Şekil 2B).
      NOT: Boyutlarına bağlı olarak her kistik SO'dan 2-4 düzlemsel SO'yu düzleştirin.
  2. Kollajen kaplı ek parçanın hazırlanması (12 oyuklu format)
    1. Uygun miktarda NaOH peletini damıtılmış suda çözerek bir NaOH çözeltisi (1 M) hazırlayın. NaOH çözeltisini 0,2 μm gözenek boyutunda bir membran filtre kullanarak filtreyle sterilize edin.
      NOT: NaOH solüsyonunu (1 M) manipüle ederken kişisel koruyucu ekipman kullanın ve iyi havalandırılan bir alanda çalışın.
    2. Buz üzerinde, kolajen tip I çözeltisini 10x PBS (son 1x konsantrasyona kadar), NaOH (5 mM) ve son hacmi ayarlamak için damıtılmış su kullanarak 2 mg/mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Standart 12 oyuklu bir plakaya yerleştirilen her bir ek parçaya 150 μL kollajen çözeltisi dağıtın. Kollajen jelin polimerize olmasını sağlamak için plakayı 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  3. Kistik SO'nun düzleşmesi (Şekil 3)
    NOT: Bu adım için bir LAF başlığının altına yerleştirilmiş bir stereomikroskop kullanın.
    1. Seçilen kistik SO'yu az miktarda ortamla birlikte geniş ağızlı bir P1000 pipet kullanarak 10 cm'lik bir Petri kabının kapağına yerleştirin. SO'nun yan ürünlerini steril bir neşter kullanarak dikkatlice çıkarın. Eksizyon sırasında organoidi stabilize etmek için karşı tarafta steril forseps kullanın (Şekil 3A).
      NOT: Bu aşamada, kistik SO, üst üste yerleştirilmiş iki deri tabakası ile sönük bir balonu andırır.
    2. Bir neşter kullanarak ilk insizyona bitişik organoidin uçlarından yaklaşık 1 mm çıkarın (Şekil 3B, F). Steril forseps kullanarak cildin üst tabakasını nazikçe açın (Şekil 3C, G).
    3. Doku parçasını boyutuna bağlı olarak 2-4 parçaya kesin. Her bir doku parçasını hassas bir şekilde aktarın ve steril forseps kullanarak epidermis yukarı bakacak şekilde kollajen kaplı bir ek parçaya yerleştirin (Şekil 3D, H).
      NOT: Doğru epidermis oryantasyonunu sağlamak için mandalları stereomikroskop altında değerlendirin.
    4. Ek parçayı 600 μL OMM içeren standart 12 oyuklu bir plakaya geri aktarın. Plakayı %5CO2 ile 37 °C'de inkübatöre geri yerleştirin (Şekil 3E).
  4. Uzun süreli hava-sıvı arayüz kültürü bakımı
    1. Düzleştirme sonrası 1. gün ile 21. gün arasında Pazartesi, Çarşamba ve Cuma günleri OMM ile tam bir orta değişim (600 μL) gerçekleştirin. Plakayı %5CO2 ve %95 bağıl nem ile 37 °C'de inkübatöre geri yerleştirin.
    2. Düzleştirmeden sonraki 21. gün ile 27. gün arasında, cilt bariyerini güçlendirmek için plakayı nemsiz %5CO2 ile 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin. OMM ile her gün tam bir orta değişim (800 μL) gerçekleştirin.

Sonuçlar

Kistik SO'ların oluşumu için optimizasyon ve kontrol noktaları kapsamlı bir şekilde açıklanmıştır14. Bu nedenle burada sunulan yöntem, kistik organoidlerin gelişimi sırasında değerlendirilecek temel kontrol noktalarına (Şekil 2A), düzlemsel SO'lara geçiş için uygun olanların seçimine (Şekil 2B) ve ortaya çıkan düzlemsel SO'ların kalitesini değerlendirmek için kullanılan kriterlere odaklanmaktadır (Şekil 1B-D ve Şekil 4).

Kistik SO'ların gelişimindeki ilk önemli adım, 0. günde kuyuda bulunan hücrelerin çoğunu içeren tek, yoğun bir hücresel agreganın oluşumudur (Şekil 2A). Bu, hiPSC'lerin dikkatli ve hızlı bir şekilde işlenmesi, verimli santrifüjleme ile birlikte elde edilir ve kuyunun merkezinde hücrelerin homojen bir dağılımı ile sonuçlanır (Şekil 2A, Gün -2). Yüzey ektoderminin uygun şekilde indüksiyonu, 3. günde agreganın en dış tabakasında ince, berrak bir epitel oluşumuna yol açar (Şekil 2A), daha sonra mezenkimal hücre indüksiyonunu takiben, 8. günde mezenkimal hücrelerin koyu bir çekirdeğini içeren şeffaf kistik agregalara dönüşür. 12. ve 20. günler arasında epitel kisti, kistin bir kutbunda biriken ince bir mezenkimal hücre tabakası ile kaplanır (Şekil 2A, Gün 12). Epitelyal ve mezenkimal hücrelerin başarılı bir şekilde birlikte indüksiyonu, sonuçta 50. ve 80. günler arasında görünür hale gelen saç plakodlarının ve mandalların oluşumunu sağlayan tabakalı bir epitel ile sonuçlanır (Şekil 2A,B). Bu gelişimsel kontrol noktalarına dayalı olarak uygun SO'lar seçilerek, düzlemsel SO'lara geçiş sırasında morfolojik ve boyut değişkenliği en aza indirilebilir.

Saç plakodlarının veya mandallarının varlığı, düzlemsel SO'lara daha fazla gelişme için kistik SO'ların seçilmesinde birincil dahil etme kriteridir. Görünür plakodların yokluğu genellikle epidermal tabakalaşmadaki bir kusurdan kaynaklanır ve bu daha sonra aşırı derecede ince görünür (Şekil 2B, Gün 50, orta panel). Düzleştirme için, sadece yan ürünleri bir kutupta yoğunlaşan ve genel olarak minimum yan ürünleri olan büyük kistler (en az 5 mm çapında) kullanılırken, polarize olmayan yan ürünlere sahip olanlar hariç tutulur (Şekil 2B).

Düzlemsel konfigürasyonlarına girdikten sonra, SO'ların birincil kalite kontrolü, bir stereomikroskop altında HF büyümesinin makroskopik olarak izlenmesine dayanır. HF'ler, ALI kültürünün 27 günü boyunca aşamalı olarak uzar, yağ bezleri 14. gün civarında görünür hale gelir ve pigmentasyon zamanla kademeli olarak artar (Şekil 1B, C). İnce kollajen jelin hemen altında yer alan ek membran tarafından uygulanan uzamsal kısıtlamalar nedeniyle, yalnızca düzlemsel SO'nun çevresinde bulunan HF'ler tamamen büyüyebilir ve bunu eke paralel bir oryantasyonda yaparlar (Şekil 1C). Özellikle, kıl gövdesi nadiren cilt yüzeyinin dışına taşar. Geliştirilen düzlemsel SO'ların kalitesini daha fazla değerlendirmek için, bileşimlerini ve morfolojilerini incelemek için parafin veya OCT'ye gömülebilir, kesitlenebilir ve boyanabilirler. H&E boyama, yapılarının insan derisine (Şekil 4A) çok benzediğini, tamamen tabakalı bir epitel ve bir dermisin bir bazal membran ile ayrıldığını ortaya koymaktadır. Farklı epidermal katmanlar, yağ bezleri ve melanositler için spesifik belirteçler kullanan immünofloresan boyama, düzlemsel SO'ların insan derisi benzeri doku mimarisini daha da doğrular (Şekil 1D ve Şekil 4B).

figure-results-1
Şekil 1: Bir ALI kültür sistemi kullanarak hiPSC'lerden HF'ler içeren düzlemsel SO'lar oluşturmak için iş akışı. Anahtar adımların şematik gösterimi ve temsili görüntüleri gösterilir. (A) Esasen daha önce tarif edildiği gibi kistik SO'ların oluşumu10. Gün civarında görünür saç plakodları/mandalları oluşana kadar. (B) Kistik SO'lar, tip I kollajen kaplı bir hücre kültürü eki üzerinde epidermis tarafı yukarı bakacak şekilde kesilir ve düzleştirilir. ALI kültürleri nemlendirilmiş koşullarda 21 gün, ardından kuru koşullarda 6 gün muhafaza edilir. (C) (B)'de gösterilen, saç folikülü büyümesini, yağ bezi benzeri yapı gelişimini (ok uçları) ve zaman içinde ilerleyici pigmentasyonu gösteren bir bölgenin yüksek büyütmeli görünümü. (D) Düzleştirme sonrası 27. günde düzlemsel SO kesitlerinin konfokal görüntüleri, yağ bezi benzeri yapıları işaretleyen Nil kırmızısı veya melanositleri boyayan anti-PMEL antikoru ile birlikte anti-tip IV kollajen antikoru ile etiketlenmiştir. Çekirdekler DAPI ile boyanır. Ölçek çubukları: 200 μm (A); 500 μm (B,C); 50 μm (D). Kısaltmalar: SO'lar = cilt organoidleri; HF'ler = saç kökleri; hiPSC'ler = insan kaynaklı pluripotent kök hücreler; ALI = hava-sıvı arayüzü; Sütun IV = tip IV kolajen; PMEL = premelanazom proteini; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: SO üretimi sırasında önemli adımlarda hücre agrega morfolojisinin temsili görüntüleri. (A) Farklı aşamalarda uygun (sol paneller) ve yetersiz (orta ve sağ paneller) morfolojilere sahip kistik SO'ların temsili görüntüleri. 2. Günde, hücre kümeleri düzgün bir dağılım göstermelidir (sol panel), oysa santrifüjlemeden sonra uygun olmayan plaka kullanımı hücre dağılımını bozabilir (sağ panel). 0. Günde, iyi biçimlendirilmiş agregalar kompakt, yoğun hücresel kümeler (sol panel) olarak görünürken, düşük hücre canlılığı, yaygın hücre ölümüne ve kompakt 3B yapıların kaybına ( sağ panel) neden olur. 3. günde, belirgin bir dış epitel tabakası görünür hale gelir (sol panel), yokluğu BMP4 konsantrasyonunun optimizasyona ihtiyacı olduğunu gösterebilir (sağ panel). 12. Günde, mezenkimal hücreler bir kutupta birikir ve epitelyal kisti (sol panel) sarmak için göç ederken, aşırı epitelyal (orta panel) veya mezenkimal (sağ panel) farklılaşma, uygun epitel tabakalaşmasını engeller. 50. Günde, SO'lar bir tarafta kistik deri ve diğer tarafta ağırlıklı olarak kıkırdak olmak üzere yan ürünler ( sol panel) ile bipolar morfoloji sergiler. Aşırı epitelyal (orta panel) veya mezenkimal (sağ panel) diferansiyasyon düzgün cilt gelişimini engeller. (B) 80. Gün civarında görünür saç mandalları olan kistik SO'ların temsili görüntüleri. Cilde göre yan ürünlerin (kesikli eğrinin solundaki) değişken oranına dikkat edin. En soldaki üç panel 2-4 düzlemsel SO oluşturulmasına izin verirken, en sağdaki panel düzleştirme için yetersiz kalitede bir SO gösterir. Ölçek çubukları: Gün -2, Gün 50 ve Gün 80 için 500 μm; 0. Gün, 3. Gün ve 12. Gün için 200 μm. Kısaltma: SO = cilt organoidi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Düzlemsel SO'ların üretilmesine yönelik teknik adımların şematik gösterimi. Bir LAF başlığı içinde bir stereomikroskop altında kistik SO'ların düzleştirilmesini gerçekleştirin. (A) Steril bir neşter kullanarak kistik SO'dan yan ürünler biriktiren direği çıkarın. (B) Doku açılmasını kolaylaştırmak için SO'nun üst ve alt ekstremitelerini kesin. (C) Düzlemsel dokuyu 2-4 parçaya kesin. Her bir parçayı, epidermal tarafı yukarı bakacak şekilde, steril forseps kullanarak kollajen kaplı bir ek parçaya aktarın ve düzleştirin. (D) Düzleştirilmiş dokuyu içeren kültür ekini 600 μL ortam içeren standart 12 oyuklu bir plakaya yerleştirin. (E) Plakayı 37 °C'de %5CO2 ile inkübe edin. (F) (B)'de gösterilen deri organoidinin şematik enine görünümü. (G) (C)'de gösterilen deri organoidinin şematik enine görünümü. (H) 600 μL ortam içeren 12 oyuklu bir plakaya yerleştirilmiş bir hücre kültürü eki üzerine dökülen bir tip I kollajen jel üzerine yerleştirilmiş düzlemsel bir SO'nun görüntüsü. Kısaltmalar: SO = cilt organoidi; LAF = laminer hava akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: hiPSC'den türetilen düzlemsel SO'ların karakterizasyonu. (A) Düzleştirme sonrası 1. ve 27. günlerde H&E boyalı düzlemsel SO'nun temsili parlak alan görüntüleri. 27. Günde, düzlemsel SO'lar, çok katlı bir epidermis ve yağ bezi benzeri yapılar (ok uçları) içeren HF'ler ile cilt olgunlaşması gösterir. (B) Anti-β4 integrin ve anti-keratin 10 veya anti-loricrin antikorları ile boyanmış düzlemsel SO kesitlerinin konfokal görüntüleri, 1. günde erken suprabazal farklılaşma (KRT10+ hücreleri) ve 27. günde geç farklılaşma (LOR+ tabakası) gösterir. Çekirdekler DAPI ile boyanır. Ölçek çubukları: 50 μm (A); 100 μm (B). Kısaltmalar: SO = cilt organoidi; hiPSC = insan kaynaklı pluripotent kök hücre; H&E = hematoksilen ve eozin; β4 = b4 integrin; KRT10 = keratin 10; LOR = loricrin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada açıklanan protokol, doku düzleşmesi ve apikal epidermisin havaya maruz kalması yoluyla doğal doku oryantasyonunu ve ortamını eski haline getirerek kistik SO sisteminin önemli bir sınırlamasının üstesinden gelir. Bu yöntem, organoidin kendine özgü hücresel ve yapısal karmaşıklığını korur, fizyolojik olarak ilgili organizasyonu destekler ve deneysel manipülasyon için çok katlı epidermal yüzeye doğrudan erişim sağlar.

Protokoldeki birkaç adım, yüksek kaliteli kistik SO'ların üretilmesinden başlayarak, yüksek kaliteli düzlemsel SO'lar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Temel kalite kontrol kontrolleri ve potansiyel protokol değişiklik noktaları,12'den önce kapsamlı bir şekilde açıklanmıştır. Kısaca, başlangıç noktası, yüksek nükleer-sitoplazmik orana sahip, sıkıca paketlenmiş hücreler gösteren, %70-80 birleşme oranında, iyi korunmuş, farklılaşmamış hiPSC kültürleri olmalıdır. Kistik SO'ların üretilmesi, yüzey ektoderm indüksiyonu12 sırasında BMP4 sinyalinin hassas modülasyonunu gerektirir. BMP4 hassasiyeti hiPSC hatları arasında değişebileceğinden, optimum sonuçlar için titrasyon gerekli olabilir. BMP4 konsantrasyonlarının 2,5 ila 15 ng/mL arasında test edilmesi önerilir, çünkü bu aralığın dışında başarılı bir vaka bildirilmemiştir. Reaktif kaynağındaki tutarlılık da önemlidir; Bu nedenle, tek bir tedarikçiden gelen toplu stoklar, tam biyolojik aktiviteyi sağlamak ve değişkenliği en aza indirmek için önerilen koşullarda hazırlanmalı ve depolanmalı ve son kullanma tarihlerinden önce kullanılmalıdır.

Uygun morfoloji ve boyuta sahip kistik SO'ların seçilmesi, başarılı SO düzleştirmesi için çok önemlidir. Kistik SO'ların olgunlaşması ve buna bağlı olarak mandalların ve saç plakodlarının oluşumu hiPSC çizgileri arasında değişebilir, bu nedenle düzleşmenin zamanlaması 70. gün ile 90. gün arasında değişebilir. Bir GSK3 inhibitörü ve WNT sinyal agonisti olan CHIR99021'in kistik SO oluşumunun 3. gününde eklenmesi düşünülebilir, çünkü proliferasyonu teşvik ederek ve nöral krest göçünü inhibe ederek organoid boyutu arttırdığı ve kıkırdak oluşumunu azalttığı gösterilmiştir12. Umut verici olmasına rağmen, kültürlerimizde bu değişiklikle tutarlı sonuçlar gözlemlemedik.

Düzleştirme işlemi, el becerisi ve dokuya aşinalık gerektirir. Özellikle, deri parçasının kaplanmış ek parçaya aktarılması sırasında, doğru doku oryantasyonunu sağlamak için özen gösterilmelidir. Stereomikroskop altında ince forseps kullanarak oryantasyonun doğrulanması ve apikal taraf yukarı bakana kadar dokunun nazikçe ayarlanması önerilir. Düzgün yerleştirildiğinde, mandallar/saç plakodları aşağı bakmalıdır. Düzlemsel SO'ların ALI kültürüne transferini takiben, HF'ler tipik olarak birkaç gün içinde gözle görülür büyüme ve saç şaftı pigmentasyonu göstermeye başlar.

Açıklanan modelin ana sınırlamaları, gereken zaman ve yüksek düzeyde bakım ve modelin olgunlaşmamış olmasıdır. Saç mandalları ile donatılmış kistik SO'ların gelişimi 70 ila 90 gün sürer ve bunu 4 haftalık ALI kültürü takip eder. Bu uzatılmış zaman çizelgesi, zahmetli bir düzleştirme prosedürüyle birleştiğinde, sistemi, özellikle ticari olarak temin edilebilen insan derisi eşdeğerleriyle karşılaştırıldığında, yüksek verimli uygulamalar için daha az uygun hale getirir. Küçük optimizasyonlar kültür süresini biraz azaltabilirken, önemli bir azalma olası değildir. Derinin yüksek hücresel ve yapısal çeşitliliği, in vitro 15,16,17,18 eksojen faktörlerin eklenmesiyle muhtemelen hızlandırılamayan karmaşık bir epitelyal-mezenkimal etkileşimler ve mekanik ipuçları dizisine bağlıdır. Kistik SO'ların oluşumu ve düzlemsel forma ilerlemeleri yüksek düzeyde bakım gerektirir. Kistik kültürün ilk 18 günü dışında, en yoğun kullanım dönemlerinden biri, düzlemsel SO'lar düşük nemli bir atmosferde tutulduğunda ve günlük orta ikmal gerektirdiğinde ortaya çıkar. Diğer hiPSC'den türetilen modellere benzer şekilde, SO'lar in vitro fetal benzeri bir fenotipi korur. Ayrıca, ter bezleri ve arrector pili kasları, muhtemelen vaskülarizasyon, bağışıklık hücreleri ve kesme stresi, gerilme ve sürtünme gibi mekanik kuvvetlerin eksikliğinden dolayı SO'larda14'te büyük ölçüde yoktur - bunların tümü uygun olgunlaşma için gereklidir 15,16,17,18,19. Bu sınırlamalardan bazıları, modelin karmaşıklığı artırılarak ele alınabilir. Otolog hiPSC'den türetilmiş makrofajlar17 ile birlikte kültür, bir perfüzyon sisteminin9 entegrasyonu veya mekanik germe17 uygulaması, model olgunluğunun20,21 desteklenmesine yardımcı olabilir.

Transwell ekleme formatının, düzlemsel SO'larda HF'lerin aşağı doğru büyümesini bir şekilde kısıtladığına dikkat edilmelidir. Sonuç olarak, HF'ler yanal olarak yayılma eğilimindedir ve havaya maruz kalabilir. HF'ler normalde cilt içinde in vivo olarak korunduğundan, deneyler tasarlanırken bu dikkate alınmalıdır. Daha kalın bir hidrojel tabakası uygulayarak kesici uç kaplamasını değiştirmek bu sorunun azaltılmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, bu modelde kıl telleri nadiren cilt yüzeyinin dışına taşar. Gözlemlerimiz, düzlemsel SO'lardaki HF'lerin, ALI kültürünün 27. gününe kadar aktif büyüme fazı olan anajende kaldığını göstermektedir. İnsan HF'lerinde uzun anajen süresi göz önüne alındığında, bu tamamen beklenmedik bir durum değildir. Uzun vadeli kültür sonunda faz geçişini destekleyebilse de, sistemik ipuçlarının yokluğunda bu olası değildir. Foliküler döngü için gerekli moleküler sinyallerin tanımlanması ve desteklenmesi, katajen ve telojen fazlarının yapay olarak indüklenmesini sağlayabilir.

Özetle, düzlemsel SO'lar üretme protokolü, kistik SO'da uygulanabilir veya ilgili olmayan çok çeşitli deneysel yaklaşımlara olanak tanır. Düzlemsel SO'lar, bakteriyel11 ve viral enfeksiyonları22, ultraviyole radyasyonun neden olduğu doku hasarını22 ve ilişkili ilaç yanıtlarını 12,22,23 modellemek için zaten başarıyla kullanılmıştır. Fizyolojik olarak ilgili, karmaşık bir cilt eşdeğerinin apikal yüzeyine erişme yeteneği, alan için önemli bir ilerlemeyi temsil eder ve cilt araştırmalarında çeşitli yeni uygulamalara kapı açar.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi hiPSC Oteli'ndeki meslektaşlarımıza hiPSC hatları sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Danimarka'daki Novo Nordisk Vakfı tarafından desteklenen Novo Nordisk Vakfı Kök Hücre Tıbbı Merkezi tarafından desteklenmiştir (hibe numarası NNF21CC0073729) KR, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale'de (INSERM) Maslahatgüzardır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İleri DMEM/F12Thermo Fisher Scientific#12634010metinde İleri Medium olarak adlandırılır.
ALK5, inhib. TGFb tip 1, SB431542Tocris Bioscience#1614Aliquot, -20 derece ve derecede mağaza edin; C ve  4 derece ve derecede devam et; C en fazla 7 gün/nbsp;
Anti-CD104 sıçan monoklonal klonu 439-9B antikorBD Biosciences#555719NA
anti-kollajen tip IV poliklonal antikorMerckMillipore#Ab769NA
Anti-sitokeratin 10 tavşan poliklonal antikoruBiolegend#905401NA
Anti-loricrin tavşan poliklonal antikoruBiolegend#905101NA
anti-PMEL fare monoklonal antikorNovus Biologicals#NBP2-29407 NA
B-27 Takviyesi, A vitamini hariçThermo Fisher Scientific#12587010Aliquot, -20 derece ve derecede mağaza edin; C 
Hücre kültürü insertleriGreiner Bio-one#66564112-well, gözenek boyutu 0.4 ve mikro; m; şeffaf (48 ekleme/kutu) ; https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html
Kolajen Tip ICorning#354249Stok çözeltiyi 4 derece derecede tutun; C
Tek kullanımlık skalpel steril 0507 No. 21Swann Morton#0507NA
Dulbecco' s Fosfat-tamponlu tuzlu (DPBS)Thermo Fisher Scientific#14190094NA
Temel 6 (E6) ortamıThermo Fisher Scientific#A1516401hiPSC minimal ortam (hiMinM)  olarak adlandırılır; metinde bulunuyor.
FasudilLC Labs#F-4660Aliquot 1000x stok çözeltisi ile -20 °C derecede depolayın. Çözüldükten sonra 4 derece sıcaklıkta kalın; C en fazla 14 gün/nbsp;
Hafif Hücre Dissosiyası  ReaktifKök Hücre Teknolojileri#100-0485NA
GlutaMAX TakviyesiThermo Fisher Scientific#35050038NA
İnsan FGF-2 temel prenium derecesiMiltenyi Biotec#130-093-842Aliquot, -80 derece ve derecede mağaza edin; C ve  4 derece ve derecede devam et; C en fazla 7 gün/nbsp;
LDN 193189 dihidroklorürTocris#6053Aliquot, ışığa duyarlı, -20 derece ve derecede depola; C 
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış Bazal Zar MatrisiCorning#354230Aliquot, -20 derece ve derecede mağaza edin; C ve  4 derece ve derecede devam et; C en fazla 7 gün/nbsp;
2-MerkaptoetanolThermo Fisher Scientific#21985023Tehlikeli madde, toksik, aşındırıcı, tahriş edici, sağlık ve çevre tehlikesi.
NaOHMerck#567530-250MGTehlikeli madde, aşındırıcı ve tahriş edici. Bir çözümü doğaçlı olarak hazırlayın.
Nörobazal OrtamThermo Fisher Scientific#21103049Sinirsel Bazal ortam olarak adlandırılır  metinde bulunuyor.
Norbosin 50 mg/mlInvivogen#ant-NR-1testte antibiyotik-antimikotik takviyesi olarak adlandırılır. Aliquot, -20 derece ve derecede mağaza edin; C ve  4 derece ve derecede devam et; C en fazla 14 gün/nbsp;
Nunclon Sphera 96-WellU-Bottom MikroplakasıThermo Fisher Scientific#174929NA
Nunclon Sphera 174930 24 kuyu çoklu çeşidliThermo Fisher Scientific#174930NA
N2 EkiThermo Fisher Scientific#17502048Aliquot, -20 derece ve derecede mağaza edin; C 
Yörünge sallayıcısıThermo Fisher Scientific#88881102NA
Penisillin-StreptomisinThermo Fisher Scientific#15070063NA
Rekombinant insan BMP4 proteiniR& D Sistemleri#314-BP-010Aliquot, -80 derece ve derecede mağaza edin; C ve  4 derece ve derecede devam et; C en fazla 7 gün/nbsp;
StemFlex (SF) ortamıThermo Fisher Scientific#A3349401hiPSC bakım ortamı (hiMM)  olarak adlandırılır; metinde bulunuyor.
SteriMax smart - Kızılötesi Döngü KısırlaştırıcıWLD-TEC#4.002.000 Opsiyonel
CımbızMerck#T4537-1EAStil 5; İnce iğne keskin, anti-manyetik paslanmaz çelik
VitronektinKök Hücre Teknolojileri#07180NA

Kaynaklar

  1. Kolarsick, P. A. J., Kolarsick, M. A., Goodwin, C. Anatomy and physiology of the skin. J Dermatol Nurses Assoc. 3 (4), 203-213 (2011).
  2. Karimkhani, C., et al. Global skin disease morbidity and mortality: An update from the Global Burden of Disease Study 2013. JAMA Dermatol. 153 (5), 406(2017).
  3. Seth, D., et al. Global burden of skin disease: Inequities and innovations. Curr Dermatol Rep. 6 (3), 204-210 (2017).
  4. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing. J Invest Dermatol. 138 (10), 2095-2105.e1 (2018).
  5. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
  6. Vig, K., et al. Advances in skin regeneration using tissue engineering. Int J Mol Sci. 18 (4), 789(2017).
  7. Chu, X., et al. Functional regeneration strategies of hair follicles: Advances and challenges. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 77(2025).
  8. Motter Catarino, C., Cigaran Schuck, D., Dechiario, L., Karande, P. Incorporation of hair follicles in 3D bioprinted models of human skin. Sci Adv. 9 (41), eadg0297(2023).
  9. Kageyama, T., Miyata, H., Seo, J., Nanmo, A., Fukuda, J. In vitro hair follicle growth model for drug testing. Sci Rep. 13 (1), 4847(2023).
  10. Abaci, H. E., et al. Tissue engineering of human hair follicles using a biomimetic developmental approach. Nat Commun. 9 (1), 5301(2018).
  11. Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
  12. Jung, S., et al. Wnt-activating human skin organoid model of atopic dermatitis induced by Staphylococcus aureus and its protective effects by Cutibacterium acnes. iScience. 25 (10), 105150(2022).
  13. Zhang, M., et al. Recessive cardiac phenotypes in induced pluripotent stem cell models of Jervell and Lange-Nielsen syndrome: Disease mechanisms and pharmacological rescue. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (5), E5383-E5392 (2014).
  14. Lee, J., et al. Generation and characterization of hair-bearing skin organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 17 (5), 1266-1305 (2022).
  15. Hu, M. S., et al. Embryonic skin development and repair. Organogenesis. 14 (1), 46-63 (2018).
  16. Li, K. N., Tumbar, T. Hair follicle stem cells as a skin-organizing signaling center during adult homeostasis. EMBO J. 40 (11), e107135(2021).
  17. Biggs, L. C., Kim, C. S., Miroshnikova, Y. A., Wickström, S. A. Mechanical forces in the skin: Roles in tissue architecture, stability, and function. J Invest Dermatol. 140 (2), 284-290 (2020).
  18. Gopee, N. H., et al. A prenatal skin atlas reveals immune regulation of human skin morphogenesis. Nature. 635 (8039), 679-689 (2024).
  19. Tokuyama, E., Nagai, Y., Takahashi, K., Kimata, Y., Naruse, K. Mechanical stretch on human skin equivalents increases the epidermal thickness and develops the basement membrane. PLoS One. 10 (11), e0141989(2015).
  20. Bai, X., et al. Organoid research: Theory, technology, and therapeutics. Organoid Res. 1 (1), 025040007(2025).
  21. Wang, Y., et al. Organoid research breakthroughs in 2024: A review. Organoid Res. 1 (2), 025040005(2025).
  22. Li, P., et al. Mpox virus infection and drug treatment modelled in human skin organoids. Nat Microbiol. 8 (11), 2067-2079 (2023).
  23. Kim, M. J., Ahn, H. J., Kong, D., Lee, S., Kim, D. H., Kang, K. S. Modeling of solar UV-induced photodamage on the hair follicles in human skin organoids. J Tissue Eng. 15, 20417314241248753(2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Uyar lm Pluripotent K k H crelerK l Folik l Olu umuPlanar Cilt Organoidlerimm nofloresan BoyamaEpidermal DiferansiyasyonMezenkimal nd ksiyonSebase BezlerIn Vitro Cilt Modeli

İlgili makaleler