SegElegans Kullanarak C. elegans Floresan Görüntülerinin Otomatik Analizi

Caenorhabditis elegans, hücresel ve moleküler biyoloji alanlarında geniş kullanıma sahip ökaryotik bir model organizmadır ^1,2,3. Hızlı bir yaşam döngüsüne (~ üç hafta) ve çok sayıda döle (tipik olarak kendi kendine döllenen hermafrodit ebeveyni ile genetik olarak özdeş) sahip küçük (vahşi tip yetişkinler için ~ 1 mm) toprakta yaşayan bir nematod solucanıdır. Göreceli basitliğine rağmen, hayvan, küçük boyutu ve şeffaflığı sayesinde, herhangi bir sabitleme veya diğer invaziv tedavilere gerek kalmadan in vivo olarak incelenebilen, tanımlanmış ve farklı doku ve organlara sahip karmaşık çok hücreli bir organizmadır⁴. Solucanın mikroskopi yoluyla in vivo çalışma kapasitesi, tek tek hücrelerin kolayca ayırt edilmesine ve hatta mitokondri, lipid damlacıkları veya protein agregatları gibi hücre altı organellerin/bileşenlerin ve sinyal iletimi, gen ekspresyonu, vezikül füzyonu gibi süreçlerin doğrudan görselleştirilmesine izin veren floresan raportörlerin kullanılmasıyla daha da güçlendirilebilir. otofaji, nöronal ve kas aksiyon potansiyelleri vb.5,6,7,8,9,10,11. Ek olarak, nematod ayrıca mutajenez¹², mikroenjeksiyon veya mikropartikül bombardımanı¹³, CRISPR düzenleme¹⁴ ve en önemlisi, kolay ve uygun maliyetli genetik tarama söz konusu olduğunda, RNAi¹⁵ yoluyla genetik manipülasyona oldukça uygundur. Bu manipülasyon, genlerin ve nematodun kendisindeki rollerinin kapsamlı bir şekilde incelenmesine izin verirken, aynı zamanda, C. elegans'ın diğer model organizmalara sergilediği önemli genetik homoloji sayesinde, insanlarla ilgili temel keşifler yapar^16,17. Son olarak, bu homoloji/koruma aynı zamanda solucanı ilaçlar ve kimyasal ajanlar için ideal bir ilk test alanı haline getirir ve ilaç aktivitesi mekanizmalarının aydınlatılmasına, potansiyel aktivite değiştirici genetik varyasyonların tanımlanmasına ve potansiyel istenmeyen etkileşimlerin ve hedef dışı etkilerin keşfedilmesine izin verir 18,19,20.

Yukarıda belirtilen tüm avantajlar, C. elegans'ı hücresel ve moleküler biyoloji çalışmaları için, özellikle mikroskopi yoluyla süreçlerin in vivo ve genellikle gerçek zamanlı izlenmesiyle ilgilenen bilim adamları için çekici bir model haline getirmiştir. Bu tür çalışmalar tipik olarak özel yazılımlar aracılığıyla önemli miktarda görüntü analizi içerir ve en yaygın kullanılan seçenek ImageJ 21,22,23'tür. Bu tür yazılımlar aracılığıyla yapılan analizin ortak bir özelliği, kullanıcının/araştırmacının seçim araçlarını kullanarak analiz için İlgi Alanlarını (ROI'ler) belirleme ihtiyacıdır. Oldukça sık olarak, bir görüntüdeki her bir solucan, basit morfolojik özellikler (vücut boyutları gibi) veya bir genin ekspresyon seviyeleri (bir floresan raportör ile ölçülen), oranmetrik bir raportörün okuması, lipid damlacıklarının sayısı ve boyutu gibi daha "gelişmiş" deneysel okumalar hakkında solucan başına bilgi elde etmek amacıyla kendi ROI'si olarak seçilecektir. protein agregatlarının oluşumu, bireysel organellerin morfolojisi ve ağları vb.5,8,10,24,25,26,27. Bu solucan başına seçimler tipik olarak manuel olarak yapılır, çünkü standart görüntü işleme algoritmalarına dayanan otomatik seçim yöntemleri, özellikle solucanların ana hatlarının net bir şekilde görülemediği karanlık alan görüntülerinde veya dokunan ve üst üste binen önemli sayıda hayvanın bulunduğu parlak alan görüntülerinde, genellikle solucanın şekillerini ve özelliklerini ayırt etmek için yeterli değildir. Bununla birlikte, manuel işlem yavaştır (ihtiyaç duyulan hassasiyete ve kullanıcının deneyimine bağlı olarak solucan başına 20 saniye ila 1 dakika), zahmetlidir ve kullanıcı önyargısına ve hatasına tabidir.

Bireysel C. elegans ROI'lerinin (bilgisayarla görme alanında tipik olarak segmentasyon olarak adlandırılan bir görev) oluşturulması için alternatif ve çok daha güçlü bir yaklaşım, bunu derin öğrenme/sinir ağı tekniklerinin yardımıyla otomatikleştirmektir. Öncelikle Mask R-CNN²⁸ ve U-net mimarilerine²⁹ dayanan evrişimli sinir ağları, C. elegans ^{33,34,35,36,37,38,39} dahil olmak üzere çeşitli biyolojik model sistemleri ^30,31,32 üzerindeki segmentasyon görevlerinde iyi sonuçlar vermiştir , ancak hiçbiri, çok sayıda dokunan veya tamamen örtüşen solucan içeren yüksek çözünürlüklü görüntülerde tek tek hayvanları doğru bir şekilde ayırt eden tam vücut segmentasyonları (örnek segmentasyonu) oluşturma sorununa tatmin edici bir çözüm sağlamadı. Bu ihtiyacı karşılamak için, bu görev⁴⁰ için özel olarak tasarlanmış ve optimize edilmiş bir derin öğrenme modeli olan SegElegans'ı geliştirdik.

SegElegans iki ana bölümden oluşmaktadır (Şekil 1). İlk bölüm, iki başlı bir U-net varyantı evrişimli sinir ağıdır. Bir kodlayıcı bloğu ve iki kod çözücü bloğundan oluşur. Kodlayıcı bloğu, SmaAt AT model^41'e dayanmaktadır ve bir Evrişimli Blok Dikkat Modülüne (CBAM)⁴² beslenen her katman için çift evrişim blokları kullanır. İki kod çözücü bloğu, evrişimli uzun kısa süreli bellek (LSTM) ağına⁴³ dayanmaktadır. Bir kod çözücü, görüntülerin her pikselini bir solucanın ana gövdesinin bir parçası, bir solucanın kenarının bir parçası, arka planın bir parçası veya solucanların üst üste geldiği bir alanın bir parçası olarak kategorize etmekten sorumludur (bu genellikle anlamsal segmentasyon olarak adlandırılır). Diğer kod çözücü, her solucanın uzunluğu boyunca doğrusal bir "iskelet" çizmekten sorumludur. İkinci bölüm, iki kod çözücünün çıktılarını birleştiren ve bunları doğru örnek segmentasyonları oluşturmak için kullanan bir işlem sonrası algoritmadır. Başlangıçta, anlamsal segmentasyon çıktısını iskelet olanla karşılaştırarak gerçek örtüşme segmentlerini tanımlar. Ardından, çakışma olmadan doğrudan solucanlar için veya çakışan⁴⁰ için segmentlerden birleştirerek örnek segmentasyonunun çıktısını alır. Bu segmentasyonlar, ikili maskelerin yanı sıra ImageJ uyumlu yatırım getirileri olarak kaydedilir.

Aşağıdaki bölümlerde SegElegans'ın etkili bir şekilde nasıl kullanılacağına ilişkin ayrıntılı talimatlar yer almaktadır (Şekil 2). Bunlar, hazırlık amaçlı görüntü edinme (Bölüm 1), modelin çevrimiçi (Bölüm 2) veya çevrimdışı (Bölüm 3-5) nasıl çalıştırılacağı ve ROI'lerin ImageJ'ye veya diğer araçlara aktarılması (Bölüm 6) ile ilgili talimatları içerir. Görüntülerin model aracılığıyla değerlendirilmesi, en az 6 GB (ideal olarak daha fazla) video rasgele erişim belleğine (VRAM) sahip CUDA uyumlu Grafik İşlem Birimi'ne (GPU) sahip bir bilgisayar gerektirdiğinden, çoğu kullanıcının (Google'ın hizmetlerine erişimleri olması koşuluyla) bulut bilişim yoluyla bu donanım gereksinimlerini karşılayan ve aşan modelin çevrimiçi sürümünü kullanmaları önerilir (Bölüm 1 > Bölüm 2 > Bölüm 6). Alternatif olarak, uygun şekilde güçlü donanıma erişimi olan ve komut satırı/terminal kullanımı hakkında temel bir anlayışa sahip olan kullanıcılar (veya yukarıda belirtilen bulut bilişim seçeneklerine erişimi olmayan kullanıcılar) modeli yerel olarak çalıştırmayı daha uygun bulabilirler (Bölüm 1 > Bölüm 3 > Bölüm 4 veya 5 > Bölüm 6).

1. Örnek ve kılavuz görüntülerin alınması

1. Hangi floresan raportörleri ifade edip etmediklerine bakılmaksızın, herhangi bir solucan türünden yetişkin solucanların segmentasyonlarını elde etmek için SegElegans'ı kullanın. İlgilenilen fenotip(ler)/veriler parlak alan görüntülerinde ölçülüyorsa, bunları normal olarak geniş alan mikroskobu ve uyumlu bir yazılım kullanarak, 4x veya benzeri bir objektif lens kullanarak elde edin.
   NOT: SegElegans, geniş bir parlaklık ve kontrast aralığına sahip görüntüleri analiz edebilir, ancak doygun parlak veya koyu piksellerin olmaması tercih edilir. Boyutlarla ilgili olarak, sistem 1328 x 1048 görüntülerle eğitilmiştir, ancak en az 512x512 boyutundaki herhangi bir görüntüyle çalışmalıdır.
2. İlgilenilen fenotip(ler)/veriler karanlık alan görüntülerinde ölçülürse (bir veya daha fazla transgenik floresan raportör veya boya kullanıldığında tipiktir), kılavuz görüntüler olarak kullanılacak verilerin yanı sıra parlak alan görüntüleri elde edin (adım 1.1'de açıklandığı gibi). İdeal olarak, mikroskobun işletim yazılımı tarafından sağlanan çok kanallı toplama seçeneklerini kullanarak, kılavuz görüntülerin floresan kanal(lar)ının karanlık alan görüntüleriyle uzamsal olarak ve zaman açısından mümkün olduğunca yakın bir şekilde mükemmel bir şekilde eşleştiğinden emin olun. Kılavuz görüntülerini, her ikisi için de aynı adı kullanarak ilgili karanlık alan veri görüntülerinden ayrı bir klasöre kaydedin.

2. SegElegans'ın çevrimiçi sürümünü çalıştırma

1. Bir web tarayıcısında bir Google hesabına giriş yapın. Bu amaçla yeni bir özel laboratuvar hesabı oluşturmanız önerilir.
2. Google Drive'a (https://drive.google.com) girin ve parlak alan resimlerinin (veri veya kılavuz) bulunduğu klasörü yükleyin. Daha önce de belirtildiği gibi, karanlık alan görüntüleri için ROI oluşturmak için kılavuz görüntüler kullanılıyorsa, söz konusu karanlık alan veri görüntülerini bu klasöre dahil etmeyin.
3. https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0'a gidin ve SegElegans Body Prediction Interface.ipynb dosyasına tıklayın. Açılan dosyanın üst kısmında bulunan Colab'de Aç butonuna tıklayın. SegElegans için Jupyter not defteri/arayüzü Google Colab'da açılacaktır.
4. Başlığın altındaki oynat () düğmesine basarak kod bloğu 1'i çalıştırın. Çalışma zamanına kodu çalıştırma ve yürütme bittikten sonra çıkışı gözlemleme izni verin (yürüt düğmesinin yanında yeşil bir onay işareti görünür). Colab, CUDA uyumlu doğru çalışma zamanını otomatik olarak çalıştırmalı ve bir NVIDIA-SMI çıktı tablosu göstermelidir. Aksi takdirde, Çalışma Zamanı > Çalışma zamanı türünü değiştir menüsü aracılığıyla T4 GPU çalışma zamanı kullanımını zorlayın.
5. Google Drive'ın içeriğini çalışma zamanına yüklemek için kod bloğu 2'yi yürütün. Tüm onay iletişim kutularını kabul edin ve istenen tüm izinleri verin.
6. 3 ve ardından 4 kod bloklarını yürütün. Blok 3'ün tamamlanması birkaç dakika sürecektir, bu nedenle 4'e geçmeden önce yeşil onay işaretinin göründüğünden emin olun.
7. Colab arayüzünün solundaki klasör sekmesinin bulunduğu simgeyi açın. Bu, Drive'ın /content/drive/MyDrive olarak içe aktarılan içerikleri de dahil olmak üzere çalışma zamanına yüklenen dosyaları görüntüler. Resimlerin bulunduğu klasöre sağ tıklayın, yolu kopyalayın ve kod bloğu 5'in test_images giriş formuna yapıştırın. Şöyle göründüğünden emin olun: /content/drive/MyDrive/Imagefolder. Benzer şekilde, analiz çıktısı için bir yol belirtin (örneğin, /content/drive/MyDrive/Imagefolder/Output). Bu ortamdaki yolların klasörleri ayırmak için eğik çizgi (/) kullandığını unutmayın.
8. Kod bloğu 5'i yürütün.
9. Model tarafından analiz edilecek görüntülerin tam uzantısını sağlanan kod bloğu 6 biçiminde belirtin. Bu girişin amacı doğrultusunda ".tif", ". TIF" ve ".tiff" farklı uzantılar olarak kabul edilir.
10. Sistem varsayılan T4 GPU çalışma zamanında çalışıyorsa (kullanım düzeylerine bağlı olarak tüm kullanıcılara günde sınırlı sayıda saat için ücretsiz olarak sağlanır) kod bloğu 6'daki batch_crop_img girişini ayarlamayın. Çalışma zamanı bellek kullanılabilirliği sorunlarını ortaya çıkarırsa azaltın.
11. Kod bloğu 6'yı yürütün. Bu biraz zaman alacaktır, bu nedenle devam etmeden önce yeşil onay işaretinin göründüğünden emin olun.
12. Kod bloğu 7'yi yürütün. Girişlerini varsayılan T4 çalışma zamanı için ayarlamayın, ancak alt işlem sayısını azaltın veya bellek kullanılabilirliği sorunları ortaya çıkarsa paralel işlemeyi tamamen devre dışı bırakın. Bu da önemli ölçüde zaman alacaktır.
13. Google Drive'a farklı bir tarayıcı penceresinden veya sekmesinden erişin ve 2.7'de belirtilen çıktı klasörüne gidin.
    NOT: Bu noktada SegElegans, segmentasyonların ilk değerlendirmesini ve son işlemesini tamamlamış ve çıktıları olan birkaç alt klasör oluşturmuştur. 0_summary sonuçlar , her solucana atanmış bir dizin numarasıyla her görüntünün çıktısını özetleyen grafikler içerir. 1_complete_mask , algoritmanın analiz için iyi olduğuna karar verdiği tüm segmentasyonlar için seçilmiş ikili maskeleri içerir. 1_edge_small_mask , algoritmanın reddetmeye karar verdiği tüm segmentasyonlar için ikili maskeler içerir, çünkü hayvanlar çok küçüktür veya görüntünün kenarında kısmen gizlenmiştir. 1_overlap_mask , gerçek çakışmalar sergileyen ve varsayılan olarak seçilen çıktıya eklenmeyen tüm solucan segmentasyonları için ikili maskeler içerir. 1_all_rois_results , küratörlükten bağımsız olarak TÜM 3 türün segmentasyonlarını ImageJ formatında (ROI'li zip dosyaları) içerir.
14. Bu noktada, üç seçenekten birini seçin:
    1. ImageJ'de 1_all_rois_results'da sağlanan ROI'leri kullanın ve oraya aktardıktan sonra istenmeyen ROI'leri reddedin (bkz. protokol bölüm 6).
    2. Seçilmiş iyi maskeleri herhangi bir manuel düzeltme olmadan (ve üst üste binen solucanlar dahil etmeden) kabul edin (2.16'ya atlayın).
    3. Çıktıya dahil edilecek solucanları (çakışanlar dahil) seçerek küratörlüğü manuel olarak ayarlayın (2.15'e devam edin).
15. Küratörlüğü manuel olarak ayarlamak için kod bloğu 8'i kullanın. 0_summary sonuçlar klasöründeki özet grafiklerden ilk küratörlüğün sonuçlarını inceleyin. Düzeltilmesi gereken her görüntü için, orijinal giriş görüntüsünün tam adını (uzantılı) "name_image_change" formuna ve saklanacak maskelerin numaralarını (özet grafiğinden) "index_images" formuna virgülle ayırarak girin. Kod bloğu 8'i yürütün. Düzeltilmesi gereken diğer görüntüler için bu adımı tekrarlayın.
16. Düzeltmeden sonra veya kullanıcılar ilk küratörlüğü düzeltmeler olmadan (ve çakışan solucanlar olmadan) kabul etmeyi seçerse, kod bloğu 9'u yürütür. Google Drive'daki çıktılar klasöründe 2_curated_rois_results adında yeni bir alt klasör oluşturulacaktır. ImageJ formatındaki tüm son küratörlü segmentasyonları içerir (ROI'li zip dosyaları).
17. İşlemi farklı bir görüntü klasörü için yeniden yürütmek için, Çalışma Zamanı > Oturumu Yeniden Başlat menüsünden çalışma zamanını sıfırlayın ve baştan başlayın.

3. İlk kullanımdan önce SegElegans'ın çevrimdışı sürümünün hazırlanması

1. SegElegans'ı Colab'da çevrimiçi çalıştırmaya alternatif olarak, Google'ın bulut bilişim hizmetlerini kullanamayan veya kullanmamayı tercih eden kullanıcılar için SegElegans'ın çevrimdışı bir sürümü mevcuttur. Bu, en az 6 GB VRAM'e sahip CUDA uyumlu GPU'ya (https://developer.nvidia.com/cuda-gpus) sahip bir bilgisayar (Windows veya Linux) gerektirir (ancak varsa ve uygun fiyatlıysa 16 önerilir).
   NOT: Bölüm 3-5'teki aşağıdaki talimatlar Windows'a odaklanmıştır, ancak yazılım, kullanılan komutlarda bazı küçük değişikliklerle Linux tabanlı sistemlerde de çalışabilir.
2. Kullanılan aygıta uygun sürümü almak için talimatları izleyerek https://developer.nvidia.com/cuda-downloads'den CUDA araç seti yükleyicisini indirin.
   NOT: SegElegans, araç setinin 12.9 ve 13.0 sürümleri ve Windows'ta CUDA Sürüm 11 ile test edilmiştir, ancak gelecekteki sürümlerin geriye dönük uyumluluğu koruması beklenmektedir.
   1. Yükleyicinin talimatlarını izleyerek araç setini kurun. Visual Studio gerekli değildir.
3. Cihaz için Python yükleyicisinin uygun sürümünü https://www.python.org/downloads/'den indirin. Yükleyicinin talimatlarını izleyerek ve python.exe PATH'e eklendiğinden emin olarak Python'u yükleyin.
   NOT: SegElegans, Python 3.13 üzerinde oluşturulmuş ve test edilmiştir, ancak gelecekteki sürümlerin geriye dönük uyumluluğu koruması beklenmektedir.
4. https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOffline/releases/tag/v1'ye gidin. SegElegans'ı yerel olarak kurmak ve çalıştırmak için gerekli dosyaları içeren paketi indirmek için Kaynak kodu (zip) bağlantısına tıklayın.
5. Zip dosyasını ayıklayın. C:\SegElegans gibi yüksek ve hatta üst düzey bir klasöre yerleştirin. Zip dosyasının içeriği zaten bir alt klasör içinde geliyor SegElegansOffline-1.
6. Windows komut istemini açın (cmd.exe). python -m venv "fullsegeleganspath" komutunu yazın, burada "fullsegeleganspath" tırnak içinde tam yoldur, tırnak içinde SegElegansOffline-1 alt klasörüne.
   NOT: Örneğin, zip dosyası C:\SegElegans'ta ayıklandıysa, tam yol C:\SegElegans\SegElegansOffline-1 olur ve komut python -m venv "C:\SegElegans\SegElegansOffline-1" olacaktır. Bu ortamdaki yolların klasörleri ("\") ayırmak için ters eğik çizgi kullandığını unutmayın.
7. Komut isteminde, SegElegansOffline-1 klasörünün içinde gezinmek için standart kontrolleri kullanın ve Scripts\activate komutunu yürütün. Bir sonraki istem imlecinden önce Python ortamının artık etkin olduğunu belirten bir (SegElegansOffline-1) etiketi görünmelidir.
8. Etkin (SegElegansOffline-1) ortamdayken, komutu çalıştırın pip install -r requirements.txt . İşlem biraz zaman alacaktır.
9. python assemblenetworks.py komutunu girin ve çalıştırın.
   NOT: SegElegans artık çalışmaya hazır. Bunu başarmanın iki yolu sağlanmıştır: küratörlüğü manuel olarak düzeltme seçeneği olmadan tüm segmentasyonları otomatik olarak ImageJ ROI'leri olarak sağlayacak hızlı bir komut dosyası (bölüm 4) ve küratörlüğe genel bakış ve düzeltme seçeneği sağlayacak yerel bir Jupyter not defteri (bölüm 5). İkinci yaklaşım çoğu kullanıcı için önerilir.

4. SegElegans'ın çevrimdışı sürümünü hızlı bir komut dosyasıyla çalıştırma

1. Windows komut istemini açın (cmd.exe). Adım 3.7'de açıklandığı gibi, SegElegans ortam klasörüne gidin ve etkinleştirin.
2. Hızlı komut dosyasını kullanmak için, komut istemindeyken etkin (SegElegansOffline-1) ortam girişi ve komutunu çalıştırırken python SegElegansBodyQuickEval.py -i "pathtoinputfolder" -x burada "pathtoinputfolder", tırnak içinde, parlak alan görüntülerinin bulunduğu klasörün tam yoludur (örn. "D:\Data\Experiment12365\Condition 1") ve kullanıcıların analiz etmek istediği görüntülerin tam dosya uzantısıdır (Örnek". TIF"). Cihaz işleyebiliyorsa, komut dosyası tarafından işlemeyi hızlandırmak için değiştirilebilecek ek parametrelerle ilgili talimatlar için python SegElegansBodyQuickEval.py -h komutunu yazın.
   NOT: Bu durumda çıktı klasörü giriş klasörünün içinde oluşturulacaktır (Yukarıdaki örnek için: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output"). İçeride bir dizi alt klasör var. 0_summary sonuçlar , her solucana atanan bir dizin numarasıyla birlikte her görüntünün çıktısını özetleyen grafikler içerir. 1_complete_mask , algoritmanın analiz için iyi olduğuna karar verdiği tüm örtüşmeyen segmentasyonlar için seçilmiş ikili maskeleri içerir. 1_edge_small_mask , hayvanlar çok küçük olduğu veya görüntünün kenarında kısmen gizlendiği için algoritmanın reddetmeye karar verdiği tüm segmentasyonlar için ikili maskeler içerir. 1_overlap_mask, gerçek örtüşmeler sergileyen tüm solucan segmentasyonları için ikili maskeler içerir. 1_all_rois_results , küratörlükten bağımsız olarak TÜM 3 türün segmentasyonlarını ImageJ formatında (ROI'li zip dosyaları) içerir. Burada küratörlüğü manuel olarak düzeltmenin bir yolu olmadığından, 2_curated_rois_results varsayılan olarak algoritma tarafından iyi kabul edilen tüm segmentasyonları VE ImageJ formatındaki tüm örtüşen segmentasyonları (ROI'li zip dosyaları) içerir.

5. SegElegans'ın çevrimdışı sürümünü Jupyter not defteriyle çalıştırma

1. Windows komut istemini açın (cmd.exe). Adım 3.7'de açıklandığı gibi, SegElegans ortam klasörüne gidin ve etkinleştirin.
2. Jupyter arayüzünü kullanmak için, aktif (SegElegansOffline-1) ortamla komut istemindeyken, jupyter notebook komutunu girin ve yürütün. Bu, yerel olarak barındırılan bir siteye sahip bir web tarayıcı penceresi/sekmesi açacaktır. Başlangıç ekranında SegElegansOfflineJupyterInterface.ipynb dosyasını seçin.
3. Kod bloğu 1'deki kodu seçerek (gerçek kodun sol dışına tıklayın) ve yukarıdaki araç çubuğundaki oynat () düğmesine basarak çalıştırın. Yürütme tamamlandığında kod bloğunun altında bir onay mesajı görünecektir.
4. Kod bloğu 2'yi yürütün. Bu, kod bloğunun altındaki okumada bazı giriş formları oluşturacaktır. Oluşturulan formları, parlak alan görüntülerinin bulunduğu giriş klasörünün yolu (Örnek: "D:\Data\Experiment12365\Koşul 1"), analiz çıktısı için istenen yol (Örnek: "D:\Data\Experiment12365\Koşul 1\Çıktı") ve analiz edilecek görüntülerin kesin dosya uzantısı (Örnek") ile doldurun. TIF"). Cihaz yeterince yetenekliyse, sağlanan ek ayarları yapın (parti başına alt ürün sayısını 9 veya 16'ya yükseltin ve birden fazla işlem sonrası paralel işlem çalıştırın).
5. Kod bloğu 3'ü yürütün.
6. Kod bloğu 4'ü yürütün. Bu biraz zaman alacaktır, bu nedenle devam etmeden önce tamamlandığından emin olun.
7. Kod bloğu 5'i yürütün. Yine, bu biraz zaman alacak. Bundan sonra, yukarıda belirtilen çıktı klasörüne gidin.
   NOT: Bu noktada SegElegans, segmentasyonların ilk değerlendirmesini ve son işlemesini tamamlamış ve çıktıları olan birkaç alt klasör oluşturmuştur. 0_summary sonuçlar , her solucana atanmış bir dizin numarasıyla her görüntünün çıktısını özetleyen grafikler içerir. 1_complete_mask , algoritmanın analiz için iyi olduğuna karar verdiği tüm segmentasyonlar için seçilmiş ikili maskeleri içerir. 1_edge_small_mask , algoritmanın reddetmeye karar verdiği tüm segmentasyonlar için ikili maskeler içerir, çünkü hayvanlar çok küçüktür veya görüntünün kenarında kısmen gizlenmiştir. 1_overlap_mask , gerçek çakışmalar sergileyen ve varsayılan olarak seçilen çıktıya eklenmeyen tüm solucan segmentasyonları için ikili maskeler içerir. 1_all_rois_results , küratörlükten bağımsız olarak TÜM 3 türün segmentasyonlarını ImageJ formatında (ROI'li zip dosyaları) içerir.
8. SegElegans'ın çevrimiçi sürümüne benzer şekilde, aşağıda listelenen üç seçenekten herhangi birini kullanın:
   1. ImageJ'de 1_all_rois_results'da sağlanan ROI'leri kullanın ve oraya aktardıktan sonra istenmeyen ROI'leri reddedin (bkz. protokol bölüm 6).
   2. Otomatik olarak seçilen iyi maskeleri herhangi bir manuel düzeltme yapmadan (ve çakışan solucanlar dahil etmeden) kabul edin (adım 5.11'e atlayın).
   3. Çıktıya dahil edilecek solucanları (çakışanlar dahil) seçerek küratörlüğü manuel olarak ayarlayın (adım 5.9'a devam edin).
9. Küratörlüğü manuel olarak ayarlamak için 6 ve 7 kod bloklarını kullanın. Önce 6'yı çalıştırın. Bu, kodun altındaki okumada giriş formları oluşturacaktır.
10. 0_summary sonuçları alt klasöründeki özet grafiklerden ilk küratörlüğün sonuçlarını inceleyin. Düzeltilmesi gereken her görüntü için, INPUT görüntüsünün tam adını (uzantılı) Düzeltilecek Görüntü: formuna ve tutulacak maskelerin numaralarını (özet grafikten) Tutulacak maskeler: formuna virgülle ayırarak girin. Kod bloğu 7'yi yürütün ve yürütmenin tamamlandığından emin olun. Düzeltilmesi gereken diğer görüntüler için bu adımı tekrarlayın.
11. Kürasyon düzeltmesi yapıldıktan sonra veya kullanıcılar ilk kürasyonu düzeltmeler olmadan (ve çakışan solucanlar olmadan) kabul etmeyi seçerse, kod bloğu 8'i yürütür. Belirlenen çıktılar klasöründe 2_curated_rois_results adlı yeni bir alt klasör oluşturulacaktır. ImageJ formatındaki tüm son küratörlü segmentasyonları içerir (ROI'li zip dosyaları).
12. İşlemi farklı bir görüntü klasörü için tekrar yürütmek için, Çekirdek > Çekirdeği Yeniden Başlat ve Tüm Hücrelerin Çıktılarını Temizle menüsünden çalışma zamanını sıfırlayın ve baştan başlayın.

6. Segmentasyonları ImageJ'ye (veya alternatiflerine) aktarma

1. ImageJ'de gerçek veri görüntülerinden birini açın.
2. Bu görüntünün yatırım getirilerini içeren ilgili zip dosyasını açın. Bu, seçimleri ImageJ ROI yöneticisine yükleyecektir. 2_curated_rois_results çıktıdan ROI iseler, normalde kullanılan istenen yöntemlerle (tercihen süreci daha da otomatikleştirmek ve hızlandırmak için makroların kullanılmasıyla) analize hazırdırlar.
3. Bunlar 1_all_rois_results çıktısından ROI ise, ROI yöneticisinden istenmeyen segmentasyonları kaldırın. Bunları seçin ve yönetici penceresinin kendisindeki Sil düğmesine basın. Klavyedeki Sil tuşuna basmayın, çünkü bu işlem görüntüdeki seçimin içeriğini siler.
4. Analiz için ImageJ dışında bir yazılıma ihtiyaç duyulursa, ROI formatı büyük olasılıkla uyumlu olmayacaktır. Bu durumda, segmentasyonları 1_complete_mask ve 1_overlap_mask klasörlerinde sağlanan, evrensel olarak kullanılan ikili maskeler biçiminde içe aktarın. Bu içe aktarmanın nasıl gerçekleştirileceği konusunda alıcı yazılımın talimatlarına bakın.

Araştırmacılar, bu protokolü izleyerek, görünür solucan sınırları olmayan floresan görüntülerin analizi için bile yüksek kaliteli solucan segmentasyonları çıkarabilmelidir. Protokolün 6. bölümünde tartışıldığı gibi, bu segmentasyonlar doğrudan ImageJ'ye aktarılabilir ve floresan raportörlerin yoğunluğu (genellikle ifade ölçümü için kullanılır) veya floresan etiketli alanların sayısı, boyutu ve morfolojisi (protein agregatlarını veya organellerini incelemek için sıklıkla kullanılır) gibi ilgili özelliklerin hızlı ölçümü için kullanılabilir. Ayrıca, SegElegans, floresandan bağımsız bir şekilde parlak alan görüntülerinden segmentasyonlar elde etmek için tasarlandığından, yoğunluk oranlarının ölçümü (örneğin, belirli organellerin otofajik bozulmasını ölçmek için) veya ortak lokalizasyon ölçümleri (örneğin, organeller arasındaki etkileşimleri tanımlamaya çalışırken) dahil olmak üzere çok kanallı analize de yardımcı olabilir.

SegElegans, %93'ün üzerinde bir segmentasyon IoU (Birlik Üzerinden Kesişme) puanı elde ederek (Tablo 1), yayınlandığı tarihteki alternatifleri geride bırakarak40. Pratikte bu, tüm görüntüleri açıklanan protokol üzerinden çalıştırdıktan sonra, yanlış bölümlere ayrılan ve kullanıcının ihtiyaçlarına bağlı olarak analizden göz ardı edilmesi veya dahil edilmeleri gerekli görülürse manuel olarak çizilen seçimlerle yeniden seçilmesi gereken bazı solucanlar olacağı anlamına gelir.

Testlerimiz, SegElegan'ları eğitmek için kullanılanlar gibi son derece hassas bir manuel seçimin (hayvanların gerçek kenarlarını mümkün olduğunca yakından/sıkı bir şekilde takip ederek), kullanıcıya bağlı olarak tek bir solucan başına 30-60 saniye sürebileceğini ve görüntü başına ortalama ~245 saniyelik bir analiz süresine yol açabileceğini göstermektedir. SegElegans, bir görüntüdeki tüm solucanlar için (7+ tane olsa bile) görüntü başına bir dakikadan kısa bir sürede bu kalitede segmentasyonlar üretebilir ve küratörlüğün manuel düzeltmeleri için kullanılan süre de dahil edilir. Ortalama olarak, SegElegans'ın etkili kullanımı, analizden önce solucan segmentasyonu için gereken süreyi manuel olarak ihtiyaç duyulanın dörtte birine, hatta beşte birine indirmelidir (Şekil 3).

Şekil 1: SegElegans'a Genel Bakış. Görüntünün anlamsal bir segmentasyonunu ve solucanların iskeletlerinin segmentasyonlarını ayrı ayrı oluşturan 1 kodlayıcı ve 2 kod çözücüden oluşan iki başlı bir U-net mimarisi üzerine inşa edilmiştir. Bu iki segmentasyon bir işlem sonrası sisteme beslenir ve daha sonra ImageJ uyumlu yatırım getirileri ve ikili maskeler biçiminde çıktı alınan son örnek segmentasyonunu oluşturmak için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Protokolün özeti ve sağlanan çoklu alternatif seçenekler. Görüntü alındıktan sonra (Bölüm 1), kullanıcılar çevrimiçi bir Jupyter arayüzü (Bölüm 2), çevrimdışı bir Jupyter arayüzü (Bölüm 3 ve 5) veya çevrimdışı bir komut dosyası (Bölüm 3 ve 4) aracılığıyla SegElegans'ı kullanarak kılavuz görüntülerden segmentasyonlar elde edebilirler. Segmentasyon çıktısı daha sonra gerçek verileri içeren görüntüleri analiz etmek için ImageJ'de veya başka bir yazılımda kullanılabilir (Bölüm 6). Bu şekilde örnek olarak kullanılan solucanlar AM141 suşu10'a aittir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Görüntü başına ortalama segmentasyon süresi (saniye cinsinden ölçülür). Hata çubukları SEM'i gösterir. **** Welch'in t-testinde <0.0001 p değerini gösterir. N = 53 resim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: SegElegans ve diğer yayınlanmış C. elegans evrişimli sinir ağları 32,34,40,41 arasındaki tam vücut segmentasyonları için farklı kesimlerde birleşme üzerinden kesişme (IoU) puanı karşılaştırmaları.

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.