Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

SegElegans Kullanarak C. elegans Floresan Görüntülerinin Otomatik Analizi

1.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69094

⸱

10 Ekim 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, 3Instituto de Automática e Informática Industrial, Universitat Politècnica de València

Bu makalede

Özet

Burada, geniş alan mikroskobu görüntülerinde tek tek solucanların otomatik segmentasyonu için geliştirdiğimiz bir derin öğrenme sistemi olan SegElegans'ın daha sonra ImageJ gibi görüntü analiz yazılımlarında kullanılmak üzere etkin bir şekilde kullanılmasına ilişkin talimatlar sunuyoruz. Sistemi hem çevrimiçi hem de çevrimdışı kullanmanın yollarını sunuyoruz.

Özet

Mikroskopi, özellikle floresan türü, C. elegans araştırmalarında sıklıkla kullanılan bir araçtır. Bununla birlikte, mikroskopi deneylerinden elde edilen verilerin analizi oldukça sıkıcı ve zaman alıcı olabilir. Bu nedenle, otomasyon arzu edilir. Çok sayıda dokunan veya üst üste binen bireylerin bulunduğu görüntülerde bile solucanların otomatik segmentasyonu için özel olarak tasarlanmış, iki başlı U-net tabanlı evrişimli bir sinir ağı sistemi olan SegElegans'ı geliştirdik. SegElegans'ın ilk bölümü bir kodlayıcı ve iki kod çözücüden oluşur. SmaAt AT modelini temel alan kodlayıcı, çift evrişimli katmanlar ve ardından bir Evrişimli Blok Dikkat Modülü (CBAM) uygular. Her iki kod çözücü de evrişimli LSTM'ler kullanır: biri solucan görüntülerinin (gövde, kenar, arka plan veya örtüşme) anlamsal segmentasyonunu gerçekleştirirken, diğeri her solucan boyunca doğrusal bir iskelet çıkarır. İkinci bölüm, iki kod çözücünün çıktılarını birleştiren ve bunları doğru örnek segmentasyonları oluşturmak için kullanan bir işlem sonrası algoritmadır. Bu segmentasyonlar daha sonra ImageJ'ye veya diğer uygun görüntü analiz araçlarına beslenebilir. Burada bu sisteme nasıl erişileceği ve çalıştırılacağı ile ilgili talimatlar sunuyoruz. Çevrimiçi, bulut bilişim tabanlı bir uygulamanın yanı sıra, gerekli donanımın mevcut olması durumunda SegElegans modellerini yerel bir makinede çevrimdışı olarak kullanmak için iki yöntem sunuyoruz.

Giriş

Caenorhabditis elegans, hücresel ve moleküler biyoloji alanlarında geniş kullanıma sahip ökaryotik bir model organizmadır 1,2,3. Hızlı bir yaşam döngüsüne (~ üç hafta) ve çok sayıda döle (tipik olarak kendi kendine döllenen hermafrodit ebeveyni ile genetik olarak özdeş) sahip küçük (vahşi tip yetişkinler için ~ 1 mm) toprakta yaşayan bir nematod solucanıdır. Göreceli basitliğine rağmen, hayvan, küçük boyutu ve şeffaflığı sayesinde, herhangi bir sabitleme veya diğer invaziv tedavilere gerek kalmadan in vivo olarak incelenebilen, tanımlanmış ve farklı doku ve organlara sahip karmaşık çok hücreli bir organizmadır4. Solucanın mikroskopi yoluyla in vivo çalışma kapasitesi, tek tek hücrelerin kolayca ayırt edilmesine ve hatta mitokondri, lipid damlacıkları veya protein agregatları gibi hücre altı organellerin/bileşenlerin ve sinyal iletimi, gen ekspresyonu, vezikül füzyonu gibi süreçlerin doğrudan görselleştirilmesine izin veren floresan raportörlerin kullanılmasıyla daha da güçlendirilebilir. otofaji, nöronal ve kas aksiyon potansiyelleri vb.5,6,7,8,9,10,11. Ek olarak, nematod ayrıca mutajenez12, mikroenjeksiyon veya mikropartikül bombardımanı13, CRISPR düzenleme14 ve en önemlisi, kolay ve uygun maliyetli genetik tarama söz konusu olduğunda, RNAi15 yoluyla genetik manipülasyona oldukça uygundur. Bu manipülasyon, genlerin ve nematodun kendisindeki rollerinin kapsamlı bir şekilde incelenmesine izin verirken, aynı zamanda, C. elegans'ın diğer model organizmalara sergilediği önemli genetik homoloji sayesinde, insanlarla ilgili temel keşifler yapar16,17. Son olarak, bu homoloji/koruma aynı zamanda solucanı ilaçlar ve kimyasal ajanlar için ideal bir ilk test alanı haline getirir ve ilaç aktivitesi mekanizmalarının aydınlatılmasına, potansiyel aktivite değiştirici genetik varyasyonların tanımlanmasına ve potansiyel istenmeyen etkileşimlerin ve hedef dışı etkilerin keşfedilmesine izin verir 18,19,20.

Yukarıda belirtilen tüm avantajlar, C. elegans'ı hücresel ve moleküler biyoloji çalışmaları için, özellikle mikroskopi yoluyla süreçlerin in vivo ve genellikle gerçek zamanlı izlenmesiyle ilgilenen bilim adamları için çekici bir model haline getirmiştir. Bu tür çalışmalar tipik olarak özel yazılımlar aracılığıyla önemli miktarda görüntü analizi içerir ve en yaygın kullanılan seçenek ImageJ 21,22,23'tür. Bu tür yazılımlar aracılığıyla yapılan analizin ortak bir özelliği, kullanıcının/araştırmacının seçim araçlarını kullanarak analiz için İlgi Alanlarını (ROI'ler) belirleme ihtiyacıdır. Oldukça sık olarak, bir görüntüdeki her bir solucan, basit morfolojik özellikler (vücut boyutları gibi) veya bir genin ekspresyon seviyeleri (bir floresan raportör ile ölçülen), oranmetrik bir raportörün okuması, lipid damlacıklarının sayısı ve boyutu gibi daha "gelişmiş" deneysel okumalar hakkında solucan başına bilgi elde etmek amacıyla kendi ROI'si olarak seçilecektir. protein agregatlarının oluşumu, bireysel organellerin morfolojisi ve ağları vb.5,8,10,24,25,26,27. Bu solucan başına seçimler tipik olarak manuel olarak yapılır, çünkü standart görüntü işleme algoritmalarına dayanan otomatik seçim yöntemleri, özellikle solucanların ana hatlarının net bir şekilde görülemediği karanlık alan görüntülerinde veya dokunan ve üst üste binen önemli sayıda hayvanın bulunduğu parlak alan görüntülerinde, genellikle solucanın şekillerini ve özelliklerini ayırt etmek için yeterli değildir. Bununla birlikte, manuel işlem yavaştır (ihtiyaç duyulan hassasiyete ve kullanıcının deneyimine bağlı olarak solucan başına 20 saniye ila 1 dakika), zahmetlidir ve kullanıcı önyargısına ve hatasına tabidir.

Bireysel C. elegans ROI'lerinin (bilgisayarla görme alanında tipik olarak segmentasyon olarak adlandırılan bir görev) oluşturulması için alternatif ve çok daha güçlü bir yaklaşım, bunu derin öğrenme/sinir ağı tekniklerinin yardımıyla otomatikleştirmektir. Öncelikle Mask R-CNN28 ve U-net mimarilerine29 dayanan evrişimli sinir ağları, C. elegans 33,34,35,36,37,38,39 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik model sistemleri 30,31,32 üzerindeki segmentasyon görevlerinde iyi sonuçlar vermiştir , ancak hiçbiri, çok sayıda dokunan veya tamamen örtüşen solucan içeren yüksek çözünürlüklü görüntülerde tek tek hayvanları doğru bir şekilde ayırt eden tam vücut segmentasyonları (örnek segmentasyonu) oluşturma sorununa tatmin edici bir çözüm sağlamadı. Bu ihtiyacı karşılamak için, bu görev40 için özel olarak tasarlanmış ve optimize edilmiş bir derin öğrenme modeli olan SegElegans'ı geliştirdik.

SegElegans iki ana bölümden oluşmaktadır (Şekil 1). İlk bölüm, iki başlı bir U-net varyantı evrişimli sinir ağıdır. Bir kodlayıcı bloğu ve iki kod çözücü bloğundan oluşur. Kodlayıcı bloğu, SmaAt AT model41'e dayanmaktadır ve bir Evrişimli Blok Dikkat Modülüne (CBAM)42 beslenen her katman için çift evrişim blokları kullanır. İki kod çözücü bloğu, evrişimli uzun kısa süreli bellek (LSTM) ağına43 dayanmaktadır. Bir kod çözücü, görüntülerin her pikselini bir solucanın ana gövdesinin bir parçası, bir solucanın kenarının bir parçası, arka planın bir parçası veya solucanların üst üste geldiği bir alanın bir parçası olarak kategorize etmekten sorumludur (bu genellikle anlamsal segmentasyon olarak adlandırılır). Diğer kod çözücü, her solucanın uzunluğu boyunca doğrusal bir "iskelet" çizmekten sorumludur. İkinci bölüm, iki kod çözücünün çıktılarını birleştiren ve bunları doğru örnek segmentasyonları oluşturmak için kullanan bir işlem sonrası algoritmadır. Başlangıçta, anlamsal segmentasyon çıktısını iskelet olanla karşılaştırarak gerçek örtüşme segmentlerini tanımlar. Ardından, çakışma olmadan doğrudan solucanlar için veya çakışan40 için segmentlerden birleştirerek örnek segmentasyonunun çıktısını alır. Bu segmentasyonlar, ikili maskelerin yanı sıra ImageJ uyumlu yatırım getirileri olarak kaydedilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Aşağıdaki bölümlerde SegElegans'ın etkili bir şekilde nasıl kullanılacağına ilişkin ayrıntılı talimatlar yer almaktadır (Şekil 2). Bunlar, hazırlık amaçlı görüntü edinme (Bölüm 1), modelin çevrimiçi (Bölüm 2) veya çevrimdışı (Bölüm 3-5) nasıl çalıştırılacağı ve ROI'lerin ImageJ'ye veya diğer araçlara aktarılması (Bölüm 6) ile ilgili talimatları içerir. Görüntülerin model aracılığıyla değerlendirilmesi, en az 6 GB (ideal olarak daha fazla) video rasgele erişim belleğine (VRAM) sahip CUDA uyumlu Grafik İşlem Birimi'ne (GPU) sahip bir bilgisayar gerektirdiğinden, çoğu kullanıcının (Google'ın hizmetlerine erişimleri olması koşuluyla) bulut bilişim yoluyla bu donanım gereksinimlerini karşılayan ve aşan modelin çevrimiçi sürümünü kullanmaları önerilir (Bölüm 1 > Bölüm 2 > Bölüm 6). Alternatif olarak, uygun şekilde güçlü donanıma erişimi olan ve komut satırı/terminal kullanımı hakkında temel bir anlayışa sahip olan kullanıcılar (veya yukarıda belirtilen bulut bilişim seçeneklerine erişimi olmayan kullanıcılar) modeli yerel olarak çalıştırmayı daha uygun bulabilirler (Bölüm 1 > Bölüm 3 > Bölüm 4 veya 5 > Bölüm 6).

1. Örnek ve kılavuz görüntülerin alınması

  1. Hangi floresan raportörleri ifade edip etmediklerine bakılmaksızın, herhangi bir solucan türünden yetişkin solucanların segmentasyonlarını elde etmek için SegElegans'ı kullanın. İlgilenilen fenotip(ler)/veriler parlak alan görüntülerinde ölçülüyorsa, bunları normal olarak geniş alan mikroskobu ve uyumlu bir yazılım kullanarak, 4x veya benzeri bir objektif lens kullanarak elde edin.
    NOT: SegElegans, geniş bir parlaklık ve kontrast aralığına sahip görüntüleri analiz edebilir, ancak doygun parlak veya koyu piksellerin olmaması tercih edilir. Boyutlarla ilgili olarak, sistem 1328 x 1048 görüntülerle eğitilmiştir, ancak en az 512x512 boyutundaki herhangi bir görüntüyle çalışmalıdır.
  2. İlgilenilen fenotip(ler)/veriler karanlık alan görüntülerinde ölçülürse (bir veya daha fazla transgenik floresan raportör veya boya kullanıldığında tipiktir), kılavuz görüntüler olarak kullanılacak verilerin yanı sıra parlak alan görüntüleri elde edin (adım 1.1'de açıklandığı gibi). İdeal olarak, mikroskobun işletim yazılımı tarafından sağlanan çok kanallı toplama seçeneklerini kullanarak, kılavuz görüntülerin floresan kanal(lar)ının karanlık alan görüntüleriyle uzamsal olarak ve zaman açısından mümkün olduğunca yakın bir şekilde mükemmel bir şekilde eşleştiğinden emin olun. Kılavuz görüntülerini, her ikisi için de aynı adı kullanarak ilgili karanlık alan veri görüntülerinden ayrı bir klasöre kaydedin.

2. SegElegans'ın çevrimiçi sürümünü çalıştırma

  1. Bir web tarayıcısında bir Google hesabına giriş yapın. Bu amaçla yeni bir özel laboratuvar hesabı oluşturmanız önerilir.
  2. Google Drive'a (https://drive.google.com) girin ve parlak alan resimlerinin (veri veya kılavuz) bulunduğu klasörü yükleyin. Daha önce de belirtildiği gibi, karanlık alan görüntüleri için ROI oluşturmak için kılavuz görüntüler kullanılıyorsa, söz konusu karanlık alan veri görüntülerini bu klasöre dahil etmeyin.
  3. https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0'a gidin ve SegElegans Body Prediction Interface.ipynb dosyasına tıklayın. Açılan dosyanın üst kısmında bulunan Colab'de Aç butonuna tıklayın. SegElegans için Jupyter not defteri/arayüzü Google Colab'da açılacaktır.
  4. Başlığın altındaki oynat (figure-protocol-1) düğmesine basarak kod bloğu 1'i çalıştırın. Çalışma zamanına kodu çalıştırma ve yürütme bittikten sonra çıkışı gözlemleme izni verin (yürüt düğmesinin yanında yeşil bir onay işareti görünür). Colab, CUDA uyumlu doğru çalışma zamanını otomatik olarak çalıştırmalı ve bir NVIDIA-SMI çıktı tablosu göstermelidir. Aksi takdirde, Çalışma Zamanı > Çalışma zamanı türünü değiştir menüsü aracılığıyla T4 GPU çalışma zamanı kullanımını zorlayın.
  5. Google Drive'ın içeriğini çalışma zamanına yüklemek için kod bloğu 2'yi yürütün. Tüm onay iletişim kutularını kabul edin ve istenen tüm izinleri verin.
  6. 3 ve ardından 4 kod bloklarını yürütün. Blok 3'ün tamamlanması birkaç dakika sürecektir, bu nedenle 4'e geçmeden önce yeşil onay işaretinin göründüğünden emin olun.
  7. Colab arayüzünün solundaki klasör sekmesinin bulunduğu simgeyi açın. Bu, Drive'ın /content/drive/MyDrive olarak içe aktarılan içerikleri de dahil olmak üzere çalışma zamanına yüklenen dosyaları görüntüler. Resimlerin bulunduğu klasöre sağ tıklayın, yolu kopyalayın ve kod bloğu 5'in test_images giriş formuna yapıştırın. Şöyle göründüğünden emin olun: /content/drive/MyDrive/Imagefolder. Benzer şekilde, analiz çıktısı için bir yol belirtin (örneğin, /content/drive/MyDrive/Imagefolder/Output). Bu ortamdaki yolların klasörleri ayırmak için eğik çizgi (/) kullandığını unutmayın.
  8. Kod bloğu 5'i yürütün.
  9. Model tarafından analiz edilecek görüntülerin tam uzantısını sağlanan kod bloğu 6 biçiminde belirtin. Bu girişin amacı doğrultusunda ".tif", ". TIF" ve ".tiff" farklı uzantılar olarak kabul edilir.
  10. Sistem varsayılan T4 GPU çalışma zamanında çalışıyorsa (kullanım düzeylerine bağlı olarak tüm kullanıcılara günde sınırlı sayıda saat için ücretsiz olarak sağlanır) kod bloğu 6'daki batch_crop_img girişini ayarlamayın. Çalışma zamanı bellek kullanılabilirliği sorunlarını ortaya çıkarırsa azaltın.
  11. Kod bloğu 6'yı yürütün. Bu biraz zaman alacaktır, bu nedenle devam etmeden önce yeşil onay işaretinin göründüğünden emin olun.
  12. Kod bloğu 7'yi yürütün. Girişlerini varsayılan T4 çalışma zamanı için ayarlamayın, ancak alt işlem sayısını azaltın veya bellek kullanılabilirliği sorunları ortaya çıkarsa paralel işlemeyi tamamen devre dışı bırakın. Bu da önemli ölçüde zaman alacaktır.
  13. Google Drive'a farklı bir tarayıcı penceresinden veya sekmesinden erişin ve 2.7'de belirtilen çıktı klasörüne gidin.
    NOT: Bu noktada SegElegans, segmentasyonların ilk değerlendirmesini ve son işlemesini tamamlamış ve çıktıları olan birkaç alt klasör oluşturmuştur. 0_summary sonuçlar , her solucana atanmış bir dizin numarasıyla her görüntünün çıktısını özetleyen grafikler içerir. 1_complete_mask , algoritmanın analiz için iyi olduğuna karar verdiği tüm segmentasyonlar için seçilmiş ikili maskeleri içerir. 1_edge_small_mask , algoritmanın reddetmeye karar verdiği tüm segmentasyonlar için ikili maskeler içerir, çünkü hayvanlar çok küçüktür veya görüntünün kenarında kısmen gizlenmiştir. 1_overlap_mask , gerçek çakışmalar sergileyen ve varsayılan olarak seçilen çıktıya eklenmeyen tüm solucan segmentasyonları için ikili maskeler içerir. 1_all_rois_results , küratörlükten bağımsız olarak TÜM 3 türün segmentasyonlarını ImageJ formatında (ROI'li zip dosyaları) içerir.
  14. Bu noktada, üç seçenekten birini seçin:
    1. ImageJ'de 1_all_rois_results'da sağlanan ROI'leri kullanın ve oraya aktardıktan sonra istenmeyen ROI'leri reddedin (bkz. protokol bölüm 6).
    2. Seçilmiş iyi maskeleri herhangi bir manuel düzeltme olmadan (ve üst üste binen solucanlar dahil etmeden) kabul edin (2.16'ya atlayın).
    3. Çıktıya dahil edilecek solucanları (çakışanlar dahil) seçerek küratörlüğü manuel olarak ayarlayın (2.15'e devam edin).
  15. Küratörlüğü manuel olarak ayarlamak için kod bloğu 8'i kullanın. 0_summary sonuçlar klasöründeki özet grafiklerden ilk küratörlüğün sonuçlarını inceleyin. Düzeltilmesi gereken her görüntü için, orijinal giriş görüntüsünün tam adını (uzantılı) "name_image_change" formuna ve saklanacak maskelerin numaralarını (özet grafiğinden) "index_images" formuna virgülle ayırarak girin. Kod bloğu 8'i yürütün. Düzeltilmesi gereken diğer görüntüler için bu adımı tekrarlayın.
  16. Düzeltmeden sonra veya kullanıcılar ilk küratörlüğü düzeltmeler olmadan (ve çakışan solucanlar olmadan) kabul etmeyi seçerse, kod bloğu 9'u yürütür. Google Drive'daki çıktılar klasöründe 2_curated_rois_results adında yeni bir alt klasör oluşturulacaktır. ImageJ formatındaki tüm son küratörlü segmentasyonları içerir (ROI'li zip dosyaları).
  17. İşlemi farklı bir görüntü klasörü için yeniden yürütmek için, Çalışma Zamanı > Oturumu Yeniden Başlat menüsünden çalışma zamanını sıfırlayın ve baştan başlayın.

3. İlk kullanımdan önce SegElegans'ın çevrimdışı sürümünün hazırlanması

  1. SegElegans'ı Colab'da çevrimiçi çalıştırmaya alternatif olarak, Google'ın bulut bilişim hizmetlerini kullanamayan veya kullanmamayı tercih eden kullanıcılar için SegElegans'ın çevrimdışı bir sürümü mevcuttur. Bu, en az 6 GB VRAM'e sahip CUDA uyumlu GPU'ya (https://developer.nvidia.com/cuda-gpus) sahip bir bilgisayar (Windows veya Linux) gerektirir (ancak varsa ve uygun fiyatlıysa 16 önerilir).
    NOT: Bölüm 3-5'teki aşağıdaki talimatlar Windows'a odaklanmıştır, ancak yazılım, kullanılan komutlarda bazı küçük değişikliklerle Linux tabanlı sistemlerde de çalışabilir.
  2. Kullanılan aygıta uygun sürümü almak için talimatları izleyerek https://developer.nvidia.com/cuda-downloads'den CUDA araç seti yükleyicisini indirin.
    NOT: SegElegans, araç setinin 12.9 ve 13.0 sürümleri ve Windows'ta CUDA Sürüm 11 ile test edilmiştir, ancak gelecekteki sürümlerin geriye dönük uyumluluğu koruması beklenmektedir.
    1. Yükleyicinin talimatlarını izleyerek araç setini kurun. Visual Studio gerekli değildir.
  3. Cihaz için Python yükleyicisinin uygun sürümünü https://www.python.org/downloads/'den indirin. Yükleyicinin talimatlarını izleyerek ve python.exe PATH'e eklendiğinden emin olarak Python'u yükleyin.
    NOT: SegElegans, Python 3.13 üzerinde oluşturulmuş ve test edilmiştir, ancak gelecekteki sürümlerin geriye dönük uyumluluğu koruması beklenmektedir.
  4. https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOffline/releases/tag/v1'ye gidin. SegElegans'ı yerel olarak kurmak ve çalıştırmak için gerekli dosyaları içeren paketi indirmek için Kaynak kodu (zip) bağlantısına tıklayın.
  5. Zip dosyasını ayıklayın. C:\SegElegans gibi yüksek ve hatta üst düzey bir klasöre yerleştirin. Zip dosyasının içeriği zaten bir alt klasör içinde geliyor SegElegansOffline-1.
  6. Windows komut istemini açın (cmd.exe). python -m venv "fullsegeleganspath" komutunu yazın, burada "fullsegeleganspath" tırnak içinde tam yoldur, tırnak içinde SegElegansOffline-1 alt klasörüne.
    NOT: Örneğin, zip dosyası C:\SegElegans'ta ayıklandıysa, tam yol C:\SegElegans\SegElegansOffline-1 olur ve komut python -m venv "C:\SegElegans\SegElegansOffline-1" olacaktır. Bu ortamdaki yolların klasörleri ("\") ayırmak için ters eğik çizgi kullandığını unutmayın.
  7. Komut isteminde, SegElegansOffline-1 klasörünün içinde gezinmek için standart kontrolleri kullanın ve Scripts\activate komutunu yürütün. Bir sonraki istem imlecinden önce Python ortamının artık etkin olduğunu belirten bir (SegElegansOffline-1) etiketi görünmelidir.
  8. Etkin (SegElegansOffline-1) ortamdayken, komutu çalıştırın pip install -r requirements.txt . İşlem biraz zaman alacaktır.
  9. python assemblenetworks.py komutunu girin ve çalıştırın.
    NOT: SegElegans artık çalışmaya hazır. Bunu başarmanın iki yolu sağlanmıştır: küratörlüğü manuel olarak düzeltme seçeneği olmadan tüm segmentasyonları otomatik olarak ImageJ ROI'leri olarak sağlayacak hızlı bir komut dosyası (bölüm 4) ve küratörlüğe genel bakış ve düzeltme seçeneği sağlayacak yerel bir Jupyter not defteri (bölüm 5). İkinci yaklaşım çoğu kullanıcı için önerilir.

4. SegElegans'ın çevrimdışı sürümünü hızlı bir komut dosyasıyla çalıştırma

  1. Windows komut istemini açın (cmd.exe). Adım 3.7'de açıklandığı gibi, SegElegans ortam klasörüne gidin ve etkinleştirin.
  2. Hızlı komut dosyasını kullanmak için, komut istemindeyken etkin (SegElegansOffline-1) ortam girişi ve komutunu çalıştırırken python SegElegansBodyQuickEval.py -i "pathtoinputfolder" -x burada "pathtoinputfolder", tırnak içinde, parlak alan görüntülerinin bulunduğu klasörün tam yoludur (örn. "D:\Data\Experiment12365\Condition 1") ve kullanıcıların analiz etmek istediği görüntülerin tam dosya uzantısıdır (Örnek". TIF"). Cihaz işleyebiliyorsa, komut dosyası tarafından işlemeyi hızlandırmak için değiştirilebilecek ek parametrelerle ilgili talimatlar için python SegElegansBodyQuickEval.py -h komutunu yazın.
    NOT: Bu durumda çıktı klasörü giriş klasörünün içinde oluşturulacaktır (Yukarıdaki örnek için: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output"). İçeride bir dizi alt klasör var. 0_summary sonuçlar , her solucana atanan bir dizin numarasıyla birlikte her görüntünün çıktısını özetleyen grafikler içerir. 1_complete_mask , algoritmanın analiz için iyi olduğuna karar verdiği tüm örtüşmeyen segmentasyonlar için seçilmiş ikili maskeleri içerir. 1_edge_small_mask , hayvanlar çok küçük olduğu veya görüntünün kenarında kısmen gizlendiği için algoritmanın reddetmeye karar verdiği tüm segmentasyonlar için ikili maskeler içerir. 1_overlap_mask, gerçek örtüşmeler sergileyen tüm solucan segmentasyonları için ikili maskeler içerir. 1_all_rois_results , küratörlükten bağımsız olarak TÜM 3 türün segmentasyonlarını ImageJ formatında (ROI'li zip dosyaları) içerir. Burada küratörlüğü manuel olarak düzeltmenin bir yolu olmadığından, 2_curated_rois_results varsayılan olarak algoritma tarafından iyi kabul edilen tüm segmentasyonları VE ImageJ formatındaki tüm örtüşen segmentasyonları (ROI'li zip dosyaları) içerir.

5. SegElegans'ın çevrimdışı sürümünü Jupyter not defteriyle çalıştırma

  1. Windows komut istemini açın (cmd.exe). Adım 3.7'de açıklandığı gibi, SegElegans ortam klasörüne gidin ve etkinleştirin.
  2. Jupyter arayüzünü kullanmak için, aktif (SegElegansOffline-1) ortamla komut istemindeyken, jupyter notebook komutunu girin ve yürütün. Bu, yerel olarak barındırılan bir siteye sahip bir web tarayıcı penceresi/sekmesi açacaktır. Başlangıç ekranında SegElegansOfflineJupyterInterface.ipynb dosyasını seçin.
  3. Kod bloğu 1'deki kodu seçerek (gerçek kodun sol dışına tıklayın) ve yukarıdaki araç çubuğundaki oynat (figure-protocol-2) düğmesine basarak çalıştırın. Yürütme tamamlandığında kod bloğunun altında bir onay mesajı görünecektir.
  4. Kod bloğu 2'yi yürütün. Bu, kod bloğunun altındaki okumada bazı giriş formları oluşturacaktır. Oluşturulan formları, parlak alan görüntülerinin bulunduğu giriş klasörünün yolu (Örnek: "D:\Data\Experiment12365\Koşul 1"), analiz çıktısı için istenen yol (Örnek: "D:\Data\Experiment12365\Koşul 1\Çıktı") ve analiz edilecek görüntülerin kesin dosya uzantısı (Örnek") ile doldurun. TIF"). Cihaz yeterince yetenekliyse, sağlanan ek ayarları yapın (parti başına alt ürün sayısını 9 veya 16'ya yükseltin ve birden fazla işlem sonrası paralel işlem çalıştırın).
  5. Kod bloğu 3'ü yürütün.
  6. Kod bloğu 4'ü yürütün. Bu biraz zaman alacaktır, bu nedenle devam etmeden önce tamamlandığından emin olun.
  7. Kod bloğu 5'i yürütün. Yine, bu biraz zaman alacak. Bundan sonra, yukarıda belirtilen çıktı klasörüne gidin.
    NOT: Bu noktada SegElegans, segmentasyonların ilk değerlendirmesini ve son işlemesini tamamlamış ve çıktıları olan birkaç alt klasör oluşturmuştur. 0_summary sonuçlar , her solucana atanmış bir dizin numarasıyla her görüntünün çıktısını özetleyen grafikler içerir. 1_complete_mask , algoritmanın analiz için iyi olduğuna karar verdiği tüm segmentasyonlar için seçilmiş ikili maskeleri içerir. 1_edge_small_mask , algoritmanın reddetmeye karar verdiği tüm segmentasyonlar için ikili maskeler içerir, çünkü hayvanlar çok küçüktür veya görüntünün kenarında kısmen gizlenmiştir. 1_overlap_mask , gerçek çakışmalar sergileyen ve varsayılan olarak seçilen çıktıya eklenmeyen tüm solucan segmentasyonları için ikili maskeler içerir. 1_all_rois_results , küratörlükten bağımsız olarak TÜM 3 türün segmentasyonlarını ImageJ formatında (ROI'li zip dosyaları) içerir.
  8. SegElegans'ın çevrimiçi sürümüne benzer şekilde, aşağıda listelenen üç seçenekten herhangi birini kullanın:
    1. ImageJ'de 1_all_rois_results'da sağlanan ROI'leri kullanın ve oraya aktardıktan sonra istenmeyen ROI'leri reddedin (bkz. protokol bölüm 6).
    2. Otomatik olarak seçilen iyi maskeleri herhangi bir manuel düzeltme yapmadan (ve çakışan solucanlar dahil etmeden) kabul edin (adım 5.11'e atlayın).
    3. Çıktıya dahil edilecek solucanları (çakışanlar dahil) seçerek küratörlüğü manuel olarak ayarlayın (adım 5.9'a devam edin).
  9. Küratörlüğü manuel olarak ayarlamak için 6 ve 7 kod bloklarını kullanın. Önce 6'yı çalıştırın. Bu, kodun altındaki okumada giriş formları oluşturacaktır.
  10. 0_summary sonuçları alt klasöründeki özet grafiklerden ilk küratörlüğün sonuçlarını inceleyin. Düzeltilmesi gereken her görüntü için, INPUT görüntüsünün tam adını (uzantılı) Düzeltilecek Görüntü: formuna ve tutulacak maskelerin numaralarını (özet grafikten) Tutulacak maskeler: formuna virgülle ayırarak girin. Kod bloğu 7'yi yürütün ve yürütmenin tamamlandığından emin olun. Düzeltilmesi gereken diğer görüntüler için bu adımı tekrarlayın.
  11. Kürasyon düzeltmesi yapıldıktan sonra veya kullanıcılar ilk kürasyonu düzeltmeler olmadan (ve çakışan solucanlar olmadan) kabul etmeyi seçerse, kod bloğu 8'i yürütür. Belirlenen çıktılar klasöründe 2_curated_rois_results adlı yeni bir alt klasör oluşturulacaktır. ImageJ formatındaki tüm son küratörlü segmentasyonları içerir (ROI'li zip dosyaları).
  12. İşlemi farklı bir görüntü klasörü için tekrar yürütmek için, Çekirdek > Çekirdeği Yeniden Başlat ve Tüm Hücrelerin Çıktılarını Temizle menüsünden çalışma zamanını sıfırlayın ve baştan başlayın.

6. Segmentasyonları ImageJ'ye (veya alternatiflerine) aktarma

  1. ImageJ'de gerçek veri görüntülerinden birini açın.
  2. Bu görüntünün yatırım getirilerini içeren ilgili zip dosyasını açın. Bu, seçimleri ImageJ ROI yöneticisine yükleyecektir. 2_curated_rois_results çıktıdan ROI iseler, normalde kullanılan istenen yöntemlerle (tercihen süreci daha da otomatikleştirmek ve hızlandırmak için makroların kullanılmasıyla) analize hazırdırlar.
  3. Bunlar 1_all_rois_results çıktısından ROI ise, ROI yöneticisinden istenmeyen segmentasyonları kaldırın. Bunları seçin ve yönetici penceresinin kendisindeki Sil düğmesine basın. Klavyedeki Sil tuşuna basmayın, çünkü bu işlem görüntüdeki seçimin içeriğini siler.
  4. Analiz için ImageJ dışında bir yazılıma ihtiyaç duyulursa, ROI formatı büyük olasılıkla uyumlu olmayacaktır. Bu durumda, segmentasyonları 1_complete_mask ve 1_overlap_mask klasörlerinde sağlanan, evrensel olarak kullanılan ikili maskeler biçiminde içe aktarın. Bu içe aktarmanın nasıl gerçekleştirileceği konusunda alıcı yazılımın talimatlarına bakın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Araştırmacılar, bu protokolü izleyerek, görünür solucan sınırları olmayan floresan görüntülerin analizi için bile yüksek kaliteli solucan segmentasyonları çıkarabilmelidir. Protokolün 6. bölümünde tartışıldığı gibi, bu segmentasyonlar doğrudan ImageJ'ye aktarılabilir ve floresan raportörlerin yoğunluğu (genellikle ifade ölçümü için kullanılır) veya floresan etiketli alanların sayısı, boyutu ve morfolojisi (protein agregatlarını veya organellerini incelemek için sıklıkla kullanılır) gibi ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sunulan metodoloji, kullanıcıların C. elegans mikroskopi deneylerini doğrulukta herhangi bir kayıp olmadan önemli ölçüde daha hızlı bir zaman diliminde analiz etmelerine izin vermelidir. Gerçek floresandan bağımsız olarak parlak alan kılavuz görüntülerinden segmentasyonları çıkardığı için (protokol bölüm 1'de tartışıldığı gibi), herhangi bir suşla ve solucan başına fenotiplerin ölçülmesini gerektiren herhangi bir uygulama için kullanılabilir. Bunlar, hastalık modellerinde...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarların laboratuvarındaki çalışmalar Genel Sekreterlik tarafından finanse edilmektedir.
Yunanistan Kalkınma Bakanlığı Araştırma ve Yenilik,
Avrupa Birliği - NextGenerationEU (proje kodu: TAEDR-0535850, Kısaltma:
BrainPrecision) "Amiral Gemisi Eylemleri" Eylemi çerçevesinde
Bağlantılı Özel İlgi Duyulan Disiplinlerarası Bilimsel Alanlar
Üretken Dokuya" Ulusal İyileşme ve Dayanıklılık kapsamında
"Yunanistan 2.0" Planı, Avrupa Komisyonu Araştırma Yürütme Ajansı
Mükemmellik Merkezi "CHAngeing" (GA-101087071) ve Yunan Vakfı
Araştırma ve İnovasyon (H.F.R.I.) için "1. H.F.R.I. Çağrısı" kapsamında
Öğretim Üyelerini ve Araştırmacıları desteklemeye yönelik Araştırma Projeleri ve
yüksek maliyetli araştırma ekipmanı tedariki" (Proje Numarası:
HFRI-FM17C3-0869, NöroMitofaji).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İnternet erişimi olan bilgisayar (örneğin: Dell Vostro Desktop)Birkaç şirket (örneğin Dell) -Bu, SegElegans'ın önerildiği gibi bulut bilişim üzerinden çevrimiçi çalıştırılmasına ve ImageJ gibi görüntü analiz yazılımlarının kullanılmasına olanak tanıyacaktır.
En az 6 GB VRAM içeren CUDA uyumlu Grafik İşlemci Birimi (örneğin: MSI Geforce RTX  RTX3050 Ventus 2X 6GB) (Isteğe bağlı)NVIDIA + birkaç üretici (örneğin Micro Star International)https://developer.nvidia.com/cuda-gpusBu, SegElegans'ı yerel bir makinede çevrimdışı çalıştırmanıza olanak tanır.
CUDA uyumlu GPU yonga setleri burada bulunabilir:
https://developer.nvidia.com/cuda-gpus
VRAM, üreticinin çipsetin GPU'ya uygulanmasına bağlıdır.
UYARI: Bulut bilişim versiyonunun elde ettiği performansa ayak uydurmak için minimum gereksinimi (16+ GB VRAM) çok aşan pahalı ve güçlü bir CUDA kartına ihtiyacınız olacak.
Epifloresans Mikroskobu (Invitrogen EVOS FL Auto 2)ThermoFisher Scientific AMAFD2000 örneğinNeredeyse aynı anda hem parlak alandan hem de bir veya daha fazla floresan kanalından otomatik olarak görüntü alabilen bir sistem kullanmanızı öneriyoruz.
ImageJ (İsteğe Bağlı)NIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsFiji dağıtımını öneriyoruz, burada bulunabilir:
https://imagej.net/software/fiji/downloads
NVIDIA GPU uyumluluğuna sahip PC (örneğin: Dell Vostro Desktop) (İsteğe bağlı) Birkaç şirket (örneğin Dell) -Bu, SegElegans'ı yerel bir makinede çevrimdışı çalıştırmak için GPU ile birlikte gereklidir.
Bir GPU, anakartta uygun PCI yuvaları, kartın sığması için yer ve yeterince güçlü bir güç kaynağı ile Windows uyumlu donanım gerektirir.
SegElegans-https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 Tam talimatlar için el yazmasına bakınız. 

Kaynaklar

  1. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
  2. Markaki, M., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans as a model system for human diseases. Curr Opin Biotechnol. 63, 118-125 (2020).
  3. Zuryn, S. C. elegans as a model for health and disease. Semin Cell Dev Biol. 154 (Pt A), 1-3 (2024).
  4. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  5. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , 1-13 (2006).
  6. Feinberg, E. H., et al. GFP reconstitution across synaptic partners (GRASP) defines cell contacts and synapses in living nervous systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  7. Hammarlund, M., Jin, Y. Axon regeneration in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 27, 199-207 (2014).
  8. Daniele, J. R., et al. UPR(ER) promotes lipophagy independent of chaperones to extend life span. Sci Adv. 6 (1), eaaz1441(2020).
  9. Yemini, E., et al. NeuroPAL: A multicolor atlas for whole-brain neuronal identification in C. elegans. Cell. 184 (1), 272-288.e11 (2021).
  10. Sinnige, T., et al. Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (11), e2021888118(2021).
  11. Gkikas, I., Daskalaki, I., Kounakis, K., Tavernarakis, N., Lionaki, E. MitoSNARE assembly and disassembly factors regulate basal autophagy and aging in C. elegans. Int J Mol Sci. 24 (4), 4230(2023).
  12. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  13. Praitis, V., Maduro, M. F. Transgenesis in C. elegans. Methods Cell Biol. 106, 161-185 (2011).
  14. Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-guided genome engineering in Caenorhabditis elegans. Curr Protoc Mol Biol. 129 (1), e106(2019).
  15. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  16. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10 (5), 703-713 (2000).
  17. Kuwabara, P. E., O'Neil, N. The use of functional genomics in C. elegans for studying human development and disease. J Inherit Metab Dis. 24 (2), 127-138 (2001).
  18. Ranganathan, R., Sawin, E. R., Trent, C., Horvitz, H. R. Mutations in the Caenorhabditis elegans serotonin reuptake transporter MOD-5 reveal serotonin-dependent and -independent activities of fluoxetine. J Neurosci. 21 (16), 5871-5884 (2001).
  19. Lackner, M. R., et al. Chemical genetics identifies Rab geranylgeranyl transferase as an apoptotic target of farnesyl transferase inhibitors. Cancer Cell. 7 (4), 325-336 (2005).
  20. Yoon, S., et al. Microfluidics in high-throughput drug screening: Organ-on-a-chip and C. elegans-based innovations. Biosensors (Basel). 14 (1), 55(2024).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  23. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  24. Valente, A. J., Maddalena, L. A., Robb, E. L., Moradi, F., Stuart, J. A. A simple ImageJ macro tool for analyzing mitochondrial network morphology in mammalian cell culture. Acta Histochem. 119 (3), 315-326 (2017).
  25. Ramki, K., Thiruppathi, G., Ramasamy, S. K., Sundararaj, P., Sakthivel, P. An aggregation-induced emission-based ratiometric fluorescent chemosensor for Hg(II) and its application in Caenorhabditis elegans imaging. Methods. 221, 1-11 (2024).
  26. Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. WormBook. , 1-23 (2006).
  27. Braeckman, B. P., Smolders, A., Back, P., De Henau, S. In vivo detection of reactive oxygen species and redox status in Caenorhabditis elegans. Antioxid Redox Signal. 25 (10), 577-592 (2016).
  28. He, K., Gkioxari, G., Dollár, P., Girshick, R. Mask R-CNN. arXiv. , (2017).
  29. Ronneberger, O., Fischer, P., Brox, T. U-Net: Convolutional networks for biomedical image segmentation. arXiv. , (2015).
  30. Exploring deep learning architectures in NAECON 2018. Proc IEEE NAECON. Alom, M. Z., Yakopcic, C., Taha, T. M., Asari, V. K. IEEE National Aerospace and Electronics Conference, , 228-233 (2018).
  31. Micallef, N., Seychell, D., Bajada, C. J. Exploring the U-Net++ model for automatic brain tumor segmentation. IEEE Access. 9, 125523-125539 (2021).
  32. Plebani, E., et al. High-throughput segmentation of unmyelinated axons by deep learning. Sci Rep. 12 (1), 1198(2022).
  33. Fudickar, S., Nustede, E. J., Dreyer, E., Bornhorst, J. Mask R-CNN based C. elegans detection with a DIY microscope. Biosensors (Basel). 11 (8), 257(2021).
  34. Lalit, M., Tomancak, P., Jug, F. EmbedSeg: Embedding-based instance segmentation for biomedical microscopy data. Med Image Anal. 81, 102523(2022).
  35. Layana Castro, P. E., Garvi, A. G., Sanchez-Salmeron, A. J. Automatic segmentation of Caenorhabditis elegans skeletons in worm aggregations using improved U-Net in low-resolution image sequences. Heliyon. 9 (4), e14715(2023).
  36. A convolutional neural network model for worm imaging in 2020. Proc IEEE ISBI. Chen, L., et al. IEEE 17th International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI), , 508-512 (2020).
  37. Guan, G., et al. Cell lineage-resolved embryonic morphological map reveals signaling associated with cell fate and size asymmetry. Nat Commun. 16 (1), 3700(2025).
  38. Cao, J., et al. Establishment of a morphological atlas of the Caenorhabditis elegans embryo using deep-learning-based 4D segmentation. Nat Commun. 11 (1), 6254(2020).
  39. Zhao, C., et al. EmbSAM: Cell boundary localization and Segment Anything Model for fast images of developing embryos. bioRxiv. , (2024).
  40. Castro, P. E. L., et al. SegElegans: Instance segmentation using dual convolutional recurrent neural network decoder in Caenorhabditis elegans microscopic images. Comput Biol Med. 190, 110012(2025).
  41. Trebing, K., Stańczyk, T., Mehrkanoon, S. SmaAt-UNet: Precipitation nowcasting using a small attention-UNet architecture. Pattern Recognit Lett. 145, 178-186 (2021).
  42. Woo, S., Park, J., Lee, J. Y., Kweon, I. S. CBAM: Convolutional block attention module. arXiv. , (2018).
  43. Shi, X., et al. Convolutional LSTM network: A machine learning approach for precipitation nowcasting. arXiv. , (2015).
  44. Stuhr, N. L., et al. Rapid lipid quantification in Caenorhabditis elegans by Oil Red O and Nile Red staining. Bio Protoc. 12 (5), e4340(2022).
  45. Kuzmic, M., et al. In situ visualization of carbonylation and its co-localization with proteins, lipids, DNA and RNA in Caenorhabditis elegans. Free Radic Biol Med. 101, 465-474 (2016).
  46. Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. elegans, and mice. J Vis Exp. (129), e56301(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

C elegans G r nt lemeFloresan MikroskobiOtomatik SegmentasyonDerin renme SegmentasyonuSolucan rne i SegmentasyonuU Net Sinir AImageJ AnaliziKonvol syonel LSTMst ste Binen SolucanlarBulut G r nt Analizi
SegElegans Kullanarak C. elegans Floresan Görüntülerinin Otomatik Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.