Yöntem makalesi

In Vitro Epitelyal organoid-T hücre ko-kültür sistemi kullanılarak yerleşik bellek CD8 T hücresi farklılaşması

DOI:

10.3791/69120

⸱

3 Şubat 2026

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Brown University, 2Pathobiology Graduate Program, Brown University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD8 T hücresinin farklılaşmasını ve işlevini in vitro incelemek için, CD8 T hücreleri fareden izole edilip önceden oluşturulmuş enfekte fare vajinal epitelyal organoidleriyle uzun süreli birlikte kültürlenebilir. Burada, bu süreci tanımlıyoruz ve ortak kültür sırasında yerleşik hafıza T hücresi belirteçlerinin edinilişini değerlendiriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bariyer mukoza dokuları, yerleşik T hücrelerinin farklılaşması ve işlevinde önemli bir rol oynar. Bu dokulardaki çeşitli hücre popülasyonları arasında, epitel hücreler T hücresi farklılaşmasının temel itici güçleridir. Ancak, mukozal ortamlarda T hücresi biyolojisini şekillendiren epitelyal türeme sinyalleri hakkındaki anlayışımız, büyük ölçüde belirli araçların eksikliği ve mevcut model sistemlerinin karmaşıklığı nedeniyle sınırlı kalıyor. Burada, enfekte epitel ile virüs-spesifik CD8 T hücreleri arasındaki dinamik etkileşimleri modelleyen bir fare vajinal epitel organoid-CD8 T hücresi ko-kültür sistemini tanımlıyoruz. Bu protokol, fizyolojik olarak ilgili üç boyutlu epitel mikro ortamında T hücresi yanıtlarının fenotipik ve fonksiyonel analizini mümkün kılar. Bu sistemi kullanarak, efektör CD8 T hücrelerinin doku yerleşik hafıza T hücrelerine (TRM) farklılaşmasını gösteriyoruz. Bu çok yönlü in vitro kültür sistemi, bariyer organlarda koruyucu bağışıklık ve immünopatolojiyi yöneten CD8 T hücre farklılaşmasının arkasındaki epitel ipuçlarının moleküler detaylarını incelemek için indirgemeci fırsatlar sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD8 yerleşik bellek T hücreleri (TRM'ler), kan ve lenfoid dokularda rutin dolaşım olmadan periferik dokularda kalıcı olarak tutulan benzersiz bir hafıza CD8 T hücre popülasyonunu temsil eder. Bu TRM hücreleri, deri, akciğerler, bağırsaklar ve üreme yolu gibi bariyer organlarda stratejik olarak konumlandırılır ve patojenlere ve yeni ortaya çıkan tümörlere karşı bekçi olarakgörev yaparlar 1,2. Patojen tespit edildiğinde, CD8 TRM hücreleri hızla sitotoksik granüller salgılayarak enfekte hücreleri doğrudan yok eder ve aynı zamanda çevredeki doku hücrelerini uyarın ve dolaşımdaki bağışıklık efektörlerini patojenin yayılmasını kontrol altına almak için işe alan inflamatuar sitokinlersalgılar 3,4. CD8 TRM'lerin antipatojenler bağışıklığı ve kanser immünoterapisindeki etkinliği zaten kanıtlanmış 5,6. Bu nedenle, bariyer mukoza dokularında işlevsel olarak yeterli CD8 TRM'nin bol miktarda yerleştirilmesi, aşılar ve immünoterapi stratejileri için kritik bir hedeftir.

CD8 TRM'nin periferik organlarda oluşumu ve korunması, yerel dokuya özgü programlamaya kritik derecede bağlıdır. Bu yerel çevresel ipuçları, doku kaynaklı benzersiz sitokinler ve metabolik ajanlar ile dokuya özgü TRMkimliğini (7,8,9) topluca uygulayan hücrelerarası etkileşimleri içerir. Bu doku programlaması, TRM'nin bağışıklık gözetim görevlerini yerine getirirken dokuya özgü taleplere uyum sağlamasına olanak tanır. Ancak, bu etkileşimlerin doğasını anlamamız, bu süreçleri sadakatle yakalayan sağlam model sistemlerinin eksikliği nedeniyle eksiktir. Küçük hayvan modelleri, çok bilgilendirici olmalarına rağmen, genellikle hızlı ve yüksek verimli çalışmaları engelleyen çok bağlantılı, karmaşık bir etkileşim ağından muzdarip olur.

Burada, CD8 TRM farklılaşmasının arkasındaki epitel hücresinden türetilen ipuçlarının moleküler detaylarının incelenmesine olanak tanıyacak fare modeline in vitro bir alternatif tanımlıyoruz. Önceden oluşturulmuş vajinal epitel organoidleri (VEO'ları) aktive edilmiş CD8 T hücreleriyle birlikte kültürleyerek in vitro CD8 TRM ürettik. CD8 T hücre aktivasyonu ve ortak kültür sürecinin ayrıntılı bir tanımı, bu sürecin dokular arasında daha geniş yayılmasını sağlayacak ve ön hattaki dokularda CD8 T hücre hafızasını şekillendiren hücresel etkileşimlerin daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler Brown Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından incelenip onaylandı (Protokol numarası 22-10-0001).

1. Bir aktivasyon plakasının temel kurulumu ve hazırlanması

  1. Deneye başlamadan bir gün önce, naif CD8 T hücreleriyle tohumlanmak üzere işlememiş bir doku kültürü plakası hazırlanın. Anti-CD3ε (2C11) için son konsantrasyonda steril dPBS'de aktive edici antikorlar için bir çözelti hazırlamak için 1 μg/mL ve B7-1 Fc için 0.167 μg/mL ol. 24 kuyu bir plaka için, her kuyu başına 600 μL bu çözelti dağıtın. Gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapın, kullanıma hazır olana kadar.
  2. Steril dPBS'de %2 kömürle soyulmuş FBS ve 1 mM EDTA ekleyerek steril dPBS'de Lenfosit Zenginleştirme Tamponunu hazırlayın. Kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklanın.
  3. 10 mM potasyum bikarbonat, 155 mM amonyum klorür klorit ve 0,1 mM EDTA ekleyerek ddH2O içinde amonyum-klorür-potasyum kırmızı kan hücresi (ACK RBC) lizin tamponunu hazırlayın. Filtre, sterilize et ve oda sıcaklığında tut.
  4. %5 kömürle soyulmuş FBS ekleyerek RPMI'de uygun miktarda hasat ortamı hazırlayın. Kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklanın. Her fare için hasat için 50 mL hasat ortamı önerilir.
    NOT: Penisillin/streptomisin ve amfoterisin B isteğe bağlıdır, ancak son konsantrasyon olarak 100 birim/mL penisilin (100 μg/mL) streptomisin ve 0.2 μg/mL amfoterisin B konsantrasyonu, doku izolasyonu sırasında T hücresi kültürünün bakteriyel ve mantar kontaminasyonunu önlemeye yardımcı olabilir.
  5. T hücresi ortamını %10 kömürle soyulmuş FBS, 2 mM L-glutamin, 100 birim/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 1x esansiyiz olmayan amino asit ve 1 mM sodyum piruvat ekleyerek RPMI'de hazırlayın. 24 kuyu bir plaka için, her kuyu için 2 mL T hücre ortamı ve tam bir plaka için 50 mL T hücre ortamı kullanın. Kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklanın.
  6. Diseksiyon aletlerini (0,4 mm mikro diseksiyon makası ve 0,8 mm ince kavisli mikro disseksiya dişli forseps) sterilizasyon torbasında otoklav veya %70 etanolde bekleterek hazırlayın.

2. Yetişkin fare ikincil lenfoid organlarının toplanması ve ayrılması

  1. Santrifüjü uygun adaptörlerle 4 °C'ye hızlıca soğutarak 15 mL konik tüpleri tutabilir.
  2. Hasat ve kuluçka dönemlerinde dokuların ve lenfositlerin taşınması için buz hazırlayın.
  3. Her fare için en az 5 mL hasat ortamı içeren steril 15 mL konik bir tüp hazırlayın.
  4. Kurumsal protokole göre bir yetişkin CD8 T hücresi transgenik fareyi (~8 haftalık) laminar akış başlıkta anestezi ve ötenazi yapın.
  5. Farenin uzuvlarını temiz bir polistiren köpük yüzeyine herhangi bir boyutta iğneyle sabitleyin ve gövdeye %70 etanol püskürtün, böylece tüylerin kesiyi engelleyip aletlere yapışmasını önleyin.
  6. Temiz mikro diseksiya makası ve pensis kullanarak, dikey bir karın kesisi yapın ve cildi altındaki ince bağ dokusu tabakasından ayırın. Deriyi polistiren köpük yüzeyine herhangi bir boyutta iğnelerle sabitleyin ve kalan bağ dokusunu keserek gövde içindeki organları açığa çıkarın.
  7. Dalağı dikkatlice yerleştirin ve fazla yağı kavisli forsepsle çıkararak çıkarın ve hasat ortamı içeren 15 mL konik tüpe aktarın. Dalağı buz üzerinde bırakın ve mümkün olduğunca çok lenf düğümünü (örneğin, iliak ve inguinal) izole ederek dalak ile aynı konik tüpte buz üzerinde birleştirin.
    NOT: Iliak lenf düğümleri, gastrointestinal yolun altındaki alt karın bölgesinde kaudal vena kavanın her iki yanında, inguinal lenf düğümleri ise gövdenin alt karın derisinin her iki yanındaki yüzeysel epigastrik venin dallanma noktasına yakın konumdadır. Zenginleştirme sonrası CD8 T hücrelerinin verimini artırmak için daha fazla lenf düğümü izole etmek; ancak dalağı tek başına izole etmek genellikle birkaç milyon CD8 T hücresi sağlamak için yeterlidir.
  8. Dalak ve lenf düğümlerini 60 mm ölçenmiş bir kaba aktarın ve 3 mL'lik bir şırıngalı pistonun düz ucunu kullanarak dalak ve lenf düğümlerini mekanik olarak ayırın; dokuyu öğüterek büyük parçalar kalmayınca.
  9. Süspansiyonu, steril 70 μm hücre süzgecinden geçirerek taze steril 15 mL konik bir tüpten geçirerek toplayın. 60 mm kabı 5 mL hasat ortamı ile yıkayarak bölünmüş hücrelerin ve filtrenin aynı 15 mL'lik konik tüplere tam transferini garanti edin.
  10. Süspansiyonu 584 × g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve tüpü tabanı santrifüj tüp tutucusunun ızgarasından hızlı ve güçlü bir şekilde geçirerek peleti gevşetmek için rafa yerleştirin.
  11. Eritrositleri gevşetmiş peleti 2 mL ACK RBC liz tamponuna yeniden süzülerek lizize eder. Girdabla oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka yapın.
  12. 2 dakika sonra, 2 ml hasat ortamı ekleyerek liz tamponunu nötralize edin. Süspansiyonu 5 mL serolojik pipet ile aspire edin ve steril 70 μm filtreden aynı 15 mL'lik konik tüpten geri filtreleyin.
    NOT: Bu filtreleme tüm kümelerin çıkarılması için önemlidir.
  13. Süspansiyonu 584 × g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjle yapın. Üst atıcı atılır ve pelleti 950 μL Lenfosit Zenginleştirme Tamponu ile yeniden süzülür.

3. CD8 T hücre zenginleştirmesi ve aktivasyonu

  1. Ticari olarak mevcut bir izolasyon kiti kullanarak lenfositlerden naif CD8 T hücrelerini zenginleştirmeye devam edin. Üreticinin protokolünü takip edin.
  2. CD8 T hücreleri zenginleştirildikten sonra, zenginleştirilmiş süspansiyon yeni steril 15 mL konik bir tüpe aktarılır ve hacmi 10 mL'ye kadar hasat ortamıyla doldurur.
  3. Hemositometre ile say.
    NOT: Bir yetişkin fareden, en az 5-10 milyon saf CD8 T hücresini >%95 saflıkta izole etmek mümkündür.
  4. 24 kuyuluğa sahip bir plakanın her kuyusu, 2 mL T hücre ortamında en az 500.000 hücre plaka yapın. Kaplamadan önce T hücrelerini iyice karıştırarak homojen bir tek hücreli süspansiyon sağlanır. T hücresi ortamını 100 birim/mL IL-2, 2.5 ng/mL IL-12 ve 55 μM beta-merkaptoetanol konsantrasyonla tamamlayın.
  5. Daha önce antikor kaplı doku kültür plakasını 4 °C'den çıkarın ve kaplama çözeltisini dikkatlice kuyrukların dibine dokunmadan aspire edin.
  6. Hemen T hücrelerini levhalayın. 37 °C'de %5CO2 ile 2 gün kuluçka yapın.

4. Aktivasyon sinyallerini çıkarıp aktive edilmiş CD8 T hücrelerinin dinlenmesi

  1. Aktif kuyuları ışık mikroskobu altında gözlemleyin. 2 günlük aktivasyondan sonra, kuyularda küçük T hücre kümeleri arayın. Daha büyük kümeler daha fazla aktivasyonun göstergesidir. Eğer küme yoksa veya az sayıda küme varsa, plakayı %5CO2 ile 37 °C'de 1 gün daha kuluçka halinde geçirin ve ardından dinlenmeye geçin.
  2. Kuluçka dönemlerinde ve kullanılmadığında T hücresi süspansiyonunu depolamak için buz hazırlayın.
  3. T hücrelerini P1000 pipeti kullanarak kuyunun her köşesinde birkaç kez yukarı ve aşağı pipet ile yeniden süzülür. T hücreleri kalktığında, kuyunun içeriğini steril 50 mL konik bir tüpe aktarın ve sayın.
    NOT: Her kuyunun 1 mL dPBS ile yıkaması isteğe bağlıdır, ancak dPBS yıkamayı T hücresi süspansiyonu ile birleştirmek T hücre verimini artırabilir.
  4. T hücrelerini Step 3.4'teki konsantrasyonda, 250.000 hücre/mL ile yeniden kaplamak, her kuyu başına 2 mL olarak. 100 birim/mL IL-2 ve 55 μM beta-merkaptoetanol ile desteklenen uygun miktarda T hücresi ortamı hazırlanır.
  5. Süspansiyonu 584 × g boyunca 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin, üst yüzeyi atın ve pelleti, kaplama yapılacak kuyu sayısı için önceki adımda hazırlanan uygun T hücre ortamında yeniden askıya alın. Homojen tek hücreli süspansiyon elde etmek için iyice karıştırın.
  6. Antikor kaplaması olmayan yeni, işlenmemiş doku kültürü plakasında 2 mL T hücresi süspansiyonu (500.000 hücre/kuyruk) levha. 37 °C'de %5CO2 ile 2 gün kuluçka yapın.

5. Önceden oluşturulmuş fare vajinal epitel organoidlerini virüsle enfekte etmek

NOT: Organoidlerin viral enfeksiyonunu gerçekleştirmek için hem Herpes Simpleks virüsü-2 (HSV-2) hem de Lenfositik koriomenenjit virüsü (LCMV) kullandık. Her ikisi de Biyogüvenlik Seviye-2 (BSL-2) ajanları olarak kabul edilir. Enfeksîyonel ajanlarla ilgili tüm işlemleri sertifikalı bir BSL-2 biyogüvenlik kabinde gerçekleştirin. Çalışma alanlarını hem kullanımdan önce hem de sonrasında %70 etanol ile temizleyin ve tüm malzemeleri kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak atabilirsiniz. Bu protokol için,10'dan önce tanımlandığı gibi C57BL/6 dişi farelerin vajinal epitelinden alınan vajinal epitel hücrelerinden VEO'lar oluşturduk.

  1. Plaka VEO'ları, enfeksiyondan 7-10 gün önce, 24 kuyu bir plakanın her kuyusundaki 20 μL bazal membran ekstraktında (BME) 10.000 hücre yoğunluğunda.
  2. Ortak kültürden bir gün önce, doğru enfeksiyon çokluğu (MOI) elde etmek için tripsinize edilip sayılması için bir VEO kuyusu ayırın. %0,25 Tripsin-EDTA'yı 37 °C su banyosunda 5 dakika önceden ısıtın.
    NOT: %0,25 Tripsin-EDTA enfeksiyon sırasında kullanılmayacak; sadece MOI hesaplamaları sırasında VEO'ları ayırmak için gereklidir. Plastik kapların (yani pipet uçları, konik tüpler) %2,5 BSA ile dPBS ile kaplaması bu aşamada isteğe bağlıdır ancak daha doğru sayım için organoid ve hücre kaybını azaltmaya yardımcı olabilir.
  3. Belirlenen kuyiden aspirasyon hücre kültürü ortamı yapın ve dPBS ile yıkayın.
  4. 600 μL önceden ısıtılmış %0,25 Tripsin-EDTA kuyuya dağıtın ve BSA kaplı P1000 pipetiyle iyice yeniden süzülerek mekanik olarak BME'yi bozun. Kuyunun içeriğini BSA kaplı steril 15 mL konik bir tüpe aktarın.
  5. 37 °C su banyosunda 5 dakika kuluçka yapın. 5 dakika sonra, tripsizasyonu söndürmek için RPMI'da %10 FBS ekleyin.
  6. Süspansiyonu 500 x g sıcaklığında 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Süpernatantı atıp 100-300 μL T hücresi-organoid kültür ortamında veya düz DMEM/F12 içinde BSA kaplı pipet ucu kullanarak yeniden süzülün.
    NOT: Hacim, pelletin boyutuna bağlıdır. Eğer pellet zar zor görünürse, daha düşük bir hacimde tekrar süsküyde bırakın.
  7. Hemositometre ile say. Aşağıdaki denkleme göre bilinen viral titre ve hücre yoğunluğu kullanılarak 0.1 MOI elde etmek için gereken uygun virüs miktarını hesaplayın:
    figure-protocol-1
  8. VEO kuyulardan aspirasyon hücre kültürü ortamı enfekte edilip 500 μL önceden ısıtılmış (37 °C) dPBS ile yıkanır. Kuyular dPBS ile 37 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
  9. 5 dakika sonra dPBS atılır ve her kuyuya 500 μL organoid ortam eklenerek yeterli viral parçacık içerir ve MOI 0.1 olur. 37 °C'de %5CO2 ile 1 saat boyunca kuluçka yapın; doku kültür plakasını her 20-30 dakikada bir nazikçe manuel döndürün.
  10. 1 saatlik kuluçkadan sonra, viral organoid ortamı aspire edin ve 500 μL önceden ısıtılmış (37 °C) dPBS ile yıkanın. dPBS aspirasyonu yapın ve yerine yeni organoid ortam verin.

6. CD8 T hücrelerinin virüs enfekte olmuş, önceden oluşturulmuş fare vajinal epitelyal organoidlerle birlikte kültürlenmesi

  1. Ortak kültürden önce (ideal olarak 4-24 saat önce), BME'yi -80 °C'den 4 °C'ye eritip transfer edin. Ortak kültür deneysel tasarımına göre uygun miktarda BME erimesini öngör: 96 kuyuluğa ait bir plakada her kuyu başına 8 μL BME ve 24 kuyuluğa ait bir plakada her kuyu başına 20 μL BME levha planlayın.
    NOT: BME viskozdur ve 4 °C'de daha uzun bir erime süresi viskoziteyi azaltır ve manevra kabiliyetini artırır.
  2. %2,5 BSA dPBS ile hazırlayın ve filtre sterilizasyonu yapın. Bu BSA çözümünü VEO'larla temas eden her plastik yüzeyi (örneğin pipet uçları, konik tüpler) kaplamak için kullanın.
    NOT: Bu kaplama, VEO'ların plastik yüzeye yapışmasını ve kullanım sırasında kaybolmasını önler.
  3. VEO'ları boyut ve genel sağlık açısından ışık mikroskobu altında kontrol edin. VEO'ların kültürden 7-10 gün sonra ve ortalama ~100 mikron çapında olduğunu doğrulayın. Sağlıklı VEO'lar az veya hiç tek hücre sunmaz ve teker, yuvarlak bir morfolojiye sahiptir.
    NOT: 24 kuyu bir plakada yetiştirildiğinde ve 24 kuyu bir plakada yeniden kaplama yapılırsa, VEO'lar 1:1 oranında yeniden kaplama yapılır (yani, bir VEO kuyusu, bir kuyu T hücresi-organoid ortak kültürü yeniden tohumlanacaktır). 24 kuyuyla bir plakadan 96 kuyuyla bir plakada yeniden kaplama yapılırsa, VEO'ları 1:2 oranında yeniden kaplama yapın (yani, bir VEO kuyusu, iki T hücresi-organoid ortak kültür kuyusu yeniden tohumlanacaktır).
  4. Birlikte kültür için kullanılacak gerekli sayıda steril 96 veya 24 delikli doku kültür plakalarını 37 °C kuluçka makinesine yerleştirin.
    NOT: Isıtılmış bir plaka, BME yapışmasını ve katılaşmasını hızlandırır.
  5. DMEM/F12'de %2 B-27 takviyesi, 2 mM L-glutamin, 100 birim/mL penisilin (100 birim/mL penisilin), 100 μg/mL streptomisin, 1 adet esansiysel olmayan amino asit, 1 mM sodyum piruvat ve 0.2 μg/mL amfoterisin B eklenerek T hücresi-organoid kültür ortamı hazırlanır. Kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklanın.
  6. VEO kuyulardan aspirasyon hücre kültürü ortamı yapın ve her kuyuyu 500 μL soğuk (2-8 °C) steril dPBS ile yıkayın.
  7. dPBS aspirasyonu yapın ve 200-500 μL soğuk (2-8 °C) organoid toplama çözeltisi ekleyin (en az 10 kat organoid BME damlası). BSA kaplı bir P200 pipetiyle yukarı aşağı pipet yapın ve mekanik olarak BME'yi bozun.
  8. Yörünge sallayıcısında 4 °C'de hafif sallama (~100 rpm) ile 20 dakika boyunca inkübe plakası yapın. Soğuk yörünge sallayıcısı yoksa, plakayı her 5 dakikada bir elle sallayarak buz üzerinde kuluçka yapın. BME 20 dakika sonra depolimerize olmadıysa, kuluçka süresini gerektiği kadar uzatın.
  9. Kuyu içeriğini, BSA kaplı pipet ucu kullanarak BSA kaplı steril 15 mL veya 50 mL konik bir tüpten buz üzerinde aktarın. Süspansiyonu 500 × g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
  10. Üst yüzeyleri atın ve VEO'ları 5-10 mL soğuk (2-8 °C) dPBS (en az 10 kat karma organoid BME damlacıkları) ile yıkayın. Süspansiyonu 500 × g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
  11. dPBS'yi atın ve pelleti BSA kaplı P1000 pipet ucu kullanarak 1 mL T hücre-organoid kültür ortamında yeniden süzülün. VEO süspansiyonunu buzda bırakın, T hücreleri birlikte kültüre hazır olana kadar.
  12. T hücrelerini birlikte kültür için toplamaya başlayın. Dinlenme T hücrelerini boyut ve genel sağlık açısından ışık mikroskobu altında kontrol edin. Sinyalleri aktive etmeden, T hücreleri çoğalmasını yavaşlatır ancak yine de bazı kümeler oluşturmuş olmalı. Hücre kalıntısı veya parça olmadığını doğrulayın ve T hücrelerinin morfolojisi büyümüştür. T hücrelerini P1000 pipeti kullanarak kuyunun her köşesinde birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yaparak yeniden süzülün ve canlı CD8 T hücrelerinin toplam sayısını sayın.
    NOT: 96 kuyuyla bir plakanın her kuyusu, 8 μL BME'de her ortak kültür için 100.000 T hücresi tohumlanın. 24 kuyruklu bir plakanın her kuyusu, her birlikte kültür için 200.000 T hücresi 200 μL BME'de tohumlanacaktır.
  13. Süspansiyonu 584 × g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Üst maddeyi atıp pelleti 10 mL T hücre-organoid kültür ortamında yeniden askıya alın. T hücrelerini, VEO'ları içeren konik tüpte kaplanacak uygun sayıda T hücresi aktararak VEO'larla birleştirin.
  14. Santrifüj 584 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca koyun. Süpernatantı atın ve VEO ile T hücrelerini uygun miktarda BME'de yeniden süspansiyona bırakın. BSA kaplı pipet ucu ile iyice karıştırın ve önceden ısıtılmış doku kültürü plakasına tabaklayın; 24 kuyu için 20 μL veya 96 kuyu plakası için 8 μL.
    NOT: Kaplama sırasında BME'yi buz üzerinde veya soğutma bloğunda 4 °C'de tutun. Pipet uçlarının kaplamadan önce 4 °C buzdolabına 30 dakika koymak, BME'nin erken katılaşmasını önlemeye yardımcı olabilir.
  15. Plakayı ters olarak 37 °C kuluçka makinesine yerleştirin ve tam BME yapışması ve katılaşması için 30 dakika bekleyin.
  16. Bu kuluçka döneminde, hazır T hücresi-organoid kültür ortamına 100 ng/mL mL mare EGF, 55 μM beta-merkaptoetanol ve 10 birim/mL mL mare IL-2 eklenerek tam T hücresi-organoid kültür ortamı hazırlanır.
  17. Kuluçka döneminden sonra, 24 kuyruklu bir plakanın her kuyusuna dikkatlice 500 μL tam T hücresi-organoid kültür ortamı veya 96 kuyuyla bir plakanın her kuyusuna 250 μL tam T hücre-organoid kültür ortamı eklenin. BME damlasını bozmamak için medyayı kuyunun kenarlarına yayın. Medya her 2 günde bir analiz için hasat edilene kadar değiştir.

7. Akış sitometrisi analizi için birlikte kültürlenmiş CD8 T hücrelerinin toplanması

  1. Ortak kültürler kültürde en az 7. güne ulaştıktan sonra, analiz için hasat yapın. T hücreleri 7. güne kadar ko-kültürde TRM benzeri belirteçleri ifade etmezse, fenotipik alım ve VEO ile T hücre yaşamına bağlı olarak 7-14. gün arasında hasat tarihini optimize eder.
  2. Akış sitometrisi boyama ve analiz için %0,2 w/v sığır serum albümini ve %0,1 w/v sodyum azidi ekleyerek fluoresan aktif hücre ayırma (FACS) tamponu hazırlamak için dPBS'ye %0,2 w/v sığır serum albümini ve %0,1 w/v sodyum azidi ekleyin.
    NOT: Sodyum azid, son derece toksik bir kimyasaldır. Tüm atıkların işlenmesi ve bertarafı konusunda kurumsal biyolojik güvenlik düzenlemelerine uygun olarak kurumsal önerilere uyun.
  3. Analiz için istenen belirteçlere bağlı olarak, yüzey boyama için FACS tamponu içinde bir floresan antikor kokteyli hazırlayın. Her kuyu için en az 50 μL antikor kokteyli hesaba katılmalıdır.
  4. dPBS'de floresan bir canlılık boyası hazırla. Her kuyu için en az 50 μL canlılık boyası hesaba katılmalıdır.
  5. Her kuyunun içindeki ortamı dikkatlice çıkarın ve soğuk (2-8 °C) FACS tamponunda iyice tekrar süzülün, 10-20 kez yukarı aşağı pipet yaparak mekanik olarak BME'yi bozun. Her kuyunun içeriğini etiketlenmiş 96 kuyruklu yuvarlak tabanlı plakaya aktarın.
  6. Santrifüj ile 859 × g sıcaklığında 4 °C'de 2 dakika sür. Tüm santrifüj aşamalarında yavaşlama rampasını indirerek pellet remixing'den örnek kaybını önleyin.
  7. Üst yüzeyi plakayı ters çevirip sıvıyı tek ve sert bir aşağı hareketle dışarı çıkararak çıkarın. 50 μL antikor kokteyli ile yeniden süzülür. Hücre pelletinin tam bir yeniden süspansiyonu sağlamak için çok kanallı pipet kullanarak en az 5 kez yukarı ve aşağı pipet yapın.
  8. 4 °C veya gerektiğinde oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın, ışıktan korunarak. Kuluçka döneminin sonunda, çok kanallı pipet ve 859 × g sıcaklıkta 4 °C'de 2 dakika boyunca her kuyuya 150 μL dPBS eklenir.
  9. Üst tabakayı ters çevirip sürekli bir hareketle aşağı doğru sallayarak departmanı departin. 50 μL canlılık boyası ile yeniden süzülür. Hücre pelletinin tam bir yeniden süspansiyonu sağlamak için çok kanallı pipet kullanarak en az 5 kez yukarı ve aşağı pipet yapın.
  10. Oda sıcaklığında, ışıktan korunarak 15 dakika kuluçka yapın. Kuluçka döneminin sonunda, çok kanallı pipet ve 859 × g sıcaklıkta 4 °C'de 2 dakika boyunca her kuyuya 150 μL FACS tamponu eklenin.
  11. Üst kaplamayı önceki gibi dekant edin ve numuneler hemen akış sitometresinde çalıştırılacaksa 150 μL FACS tamponunda tekrar süzülün veya %0,5 paraformaldehit içeren 150 μL sabitlenip 4 °C'de bırakın. Hücre pelletinin tam bir yeniden süspansiyonu sağlamak için çok kanallı pipet kullanarak en az 5 kez yukarı ve aşağı pipet yapın. Aletlerin tıkanmasını önlemek için sabit örnekleri filtrele ve floresans kaybını önlemek için 12-36 saat içinde akış sitometresinde çalıştırıldı.
    NOT: Paraformaldehit tehlikeli bir kimyasal olarak kabul edilir. Kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerini takip edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD8 T hücresi enfekte organoid ko-kültürünün mikroskobik görselleştirmesi
Preform fare VEO'ları LCMV ile enfekte edildi ve LCMV'ye özgü CD8 T hücreleriyle birlikte kültürlendi. Protokolün çok yönlülüğünü belirlemek için HSV-2 enfeksiyon modeliyle bu ko-kültürleri de uyguladık, ancak LCMV modeli için mikroskobik veriler gösteriyoruz ve aşağıdaki HSV-2 modeline T hücresi farklılaşma verilerini dahil ettik. LCMV, sarı floresan protein (YFP) eksprese eder, böylece enfekte...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD8 TRM'ler, farklılaştırma ve bakım için yerel çevresel ipuçlarına dayanır. Bu ipuçları, CD8 TRM'lerin çevrelerine uyum sağlamasını ve gerektiğinde bağışıklık gözetim görevlerini yerine getirmesini sağlayan dokuya özgü programlama sağlar. Ne yazık ki, TRM'ler dokudan çıkarıldıktan sonra in vitro hayatta kalamadı ve bu da detaylı analizlerinisınırladı 12,13. Bu protokolde, CD8 T hücrelerinin epitel hücreleriyle birlikte ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek rakip çıkarları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibesi R01AI177704-01A1, R21AI183017-01, Brown Üniversitesi tohum hibesi (L.K.B.) ve F31AI186444 (Y.L.'ye) tarafından desteklendi. YFP ifade eden Lenfositik koriomenenjit virüsü sağladığı için Dr. Dorian B. McGavern'e (NINDS, NIH) teşekkür etmek isteriz. Dr. Sanghyun Lee ve laboratuvarının Cytation-5 görüntüleme konusunda yardımını ve akış tabanlı testleri kolaylaştırmak için Brown Üniversitesi akış sitometrisi çekirdeği için teşekkür ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%16 paraformaldehit sulu çözeltisiElektron Mikroskopi Bilimleri15710-S
24-Hole polistiren işlememiş çoklu kuyu tissuce kültür plakalarıVWR International10861-558
2-MerkaptoetanolGibco21985023
3 mL Steril ŞırıngalarFisher Scientific14-955-457
5 mL,  Snap Cap,  Steril, yuvarlak tabanlı polistiren test tüpleriFalcon352058
60 mm Petri KablarıFisher ScientificFB0875713A 
70 μ m Steril Hücre SüzgeçleriFisher Scientific22-363-548
96 kuyuluklu İşlenmemiş Polistiren Yuvarlak Tabanlı MikroplakalarGreiner Bio-One650101
96 Kuyu polistiren işlememiş çoklu kuyu doku kültür plakalarıVWR International10861-562
Albümin sığır/fraksiyon VTermobilimsel KimyasallarJ6465518
Amonyum klorürFisher ScientificA661-500
Amfoterisin B Sigma-AldrichA9528-100MG
B-27 EkiGibco17504044
ioTek Cytation 5 Hücre Görüntüleme Çok Modlu Okuyucu
DMEM/F12 1:1 Orta ÖlçümCytivaSH30271. FS
Dulbecco'nun Fosfatla Tamponlu Tuz Çözeltisi 1xCorning21031CV
Etilenidiamintetraasetik Asit (0,5 M Çözeltisi/pH 8,0)Fisher ScientificBP2482-500
Ekstra İnce Mikro Disseksiya MakaslarıRoboz Cerrahi Aletler Şirketi.RS-5882
Fetal Sığır Serumu - Kömür/Dekstran TedavisiR& D SistemleriS11650
Flowjo v10 yazılımıBecton, Dickinson ve ŞirketiFlowJo (RRID:SCR_008520)
Graefe pensepsiRoboz Cerrahi Aletler Şirketi.RS-5135
HEPES ÇözümüCytivaSH30237.01
L-Glutamin (200 mM)GibcoA2916801
Mıknatıs 5mLBiolegend480019
Fare CD8 Ne ve SİL; ve T Hücre İzolasyon KitiBiolegend480044
Fare EGF Rekombinant ProteiniGibco315091MG
Temel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x)Gibco11140050
Penisillin-Streptomisin çözeltisiCytivaSV30010
Potasyum BikarbonatMP Biyomedikal0215255780
Arındırılmış anti-fare CD3ε AntikorBiolegend100360
Rekombinant Fare B7.1 (CD80)-Fc Chimera (taşıyıcısız)Biolegend555406
Rekombinant Fare IL-12 (s70) (taşıyıcısız)Biolegend577004
Rekombinant Fare IL-2 (taşıyıcısız)Biolegend575406
Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran EkstraktıR& D SistemleriBME001-10
RPMI 1640 MedyaCytivaSH30027.LS
Sodyum AzidFisher ScientificS227I-25
Sodyum Piruvat (100 mM)Gibco11360070
Tripsin %0,25 proteaz ve domuz tripsinCytivaSH30042.02
Yaşam Boyası (Kırmızı 780)Cytek Biosciences13-0865-T100

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosato, P. C., Beura, L. K., Masopust, D. Tissue resident memory T cells and viral immunity. Curr Opin Virol. 22, 44-50 (2017).
  2. Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nat Med. 21, 688-697 (2015).
  3. Schenkel, J. M., et al. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346 (6205), 98-101 (2014).
  4. Ariotti, S., et al. Skin-resident memory CD8 + T cells trigger a state of tissue-wide pathogen alert. Science. 346 (6205), 101-105 (2014).
  5. Christo, S. N., Park, S. L., Mueller, S. N., Mackay, L. K. The Multifaceted Role of Tissue-Resident Memory T Cells. Annu Rev Immunol. 42 (1), 317-345 (2024).
  6. Gavil, N. V., Cheng, K., Masopust, D. Resident memory T cells and cancer. Immunity. 57 (8), 1734-1751 (2024).
  7. Christo, S. N., et al. Discrete tissue microenvironments instruct diversity in resident memory T cell function and plasticity. Nat Immunol. 22 (9), 1140-1151 (2021).
  8. Pan, Y., et al. Survival of tissue-resident memory T cells requires exogenous lipid uptake and metabolism. Nature. 543, 252-256 (2017).
  9. Hasan, M. H., Beura, L. K. Cellular interactions in resident memory T cell establishment and function. Curr Opin Immunol. 74, 68-75 (2022).
  10. Ulibarri, M. R., et al. Epithelial organoid supports resident memory CD8 T cell differentiation. Cell Rep. 43 (8), 114621(2024).
  11. Evrard, M., et al. Single-cell protein expression profiling resolves circulating and resident memory T cell diversity across tissues and infection contexts. Immunity. 56 (7), 1664-1680.e9 (2023).
  12. Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8+ T Cell and Invariant NKT Subsets. J Immunol. 202 (7), 2153-2163 (2019).
  13. Künzli, M., et al. Long-lived T follicular helper cells retain plasticity and help sustain humoral immunity. Sci Immunol. 5 (45), eaay5552(2020).
  14. Kang, J. S., et al. Generation of induced alveolar assembloids with functional alveolar-like macrophages. Nat Commun. 16, 3346(2025).
  15. Lin, M., et al. Establishment of gastrointestinal assembloids to study the interplay between epithelial crypts and their mesenchymal niche. Nat Commun. 14, 3025(2023).
  16. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 364 (6444), 960-965 (2019).
  17. Quintard, C., et al. A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip. Nat Commun. 15, 1452(2024).
  18. Vincenti, I., et al. Tissue-resident memory CD8+ T cells cooperate with CD4+ T cells to drive compartmentalized immunopathology in the CNS. Sci Transl Med. 14 (640), eabl6058(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Resident Memory T CellsCD8 T CellsEpithelial OrganoidsOrganoid Co cultureVaginal Epithelial OrganoidsFlow CytometryTissue ResidencyViral Infection ModelInterferon Gamma Production

İlgili makaleler