Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Mettl3/Nrf2 Ekseni, Serotonin Nöronlarında NLRP3 ile İndüklenen Piroptozu İnhibe Ederek Parkinson Hastalığının İlerlemesini Baskılar

592 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69124

⸱

7 Kasım 2025

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Feicheng People's Hospital, 2Department of Neurology, Yantai Yantaishan Hospital

Bu makalede

Özet

Burada, Mettl3'ün m6A modifikasyonu yoluyla Nrf2'yi nasıl düzenlediğini, böylece mikroglial piroptozu baskıladığını ve Parkinson hastalığı modellerinde serotonin nöronlarını nasıl koruduğunu epitranskriptomik nöroinflamasyon araştırmalarındaki uygulamalarla araştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Parkinson hastalığı (PD) patogenezinin altında yatan kesin mekanizmalar, özellikle mikroglial inflamasyonun ve serotonin nöronunun sağkalımının rolü ile ilgili olarak tam olarak anlaşılamamıştır. Bu protokol, metiltransferaz benzeri 3'ün (Mettl3) nükleer faktör eritroid 2 ile ilişkili faktör 2'yi (Nrf2) N6-metiladenozin (m6A) modifikasyonu yoluyla nasıl modüle ettiğini, böylece mikroglial piroptozu nasıl azalttığını ve serotonin nöronlarını hem in vitro hem de in vivo PD modellerinde nasıl koruduğunu açıklamak için kapsamlı bir çerçeve çizmektedir. Birincil amaç, araştırmacılara, inflamatuar kaskadları simüle etmek için BV2 hücrelerinde lipopolisakkarit (LPS) ile indüklenen mikroglial aktivasyon ile başlayarak, nöroinflamatuar yolların epitranskriptomik regülasyonunu incelemek için tekrarlanabilir metodolojiler sağlamak ve ardından m6A analizi için metillenmiş RNA immünopresipitasyon kantitatif PCR (MeRIP-qPCR) sağlamaktır. İn vivo olarak, striatumda hedeflenen Nrf2 modülasyonu için adeno-ilişkili virüs serotip 9 (AAV9) vektörlerinin stereotaktik iletimi ile tamamlanan MPTP ile indüklenen bir PD fare modelinin oluşturulmasını detaylandırıyoruz. Davranışsal değerlendirmeler, motor eksiklikleri ölçmek için ön ayak yerleşimi, hızlandırılmış rotarod ve açık alan testlerini kapsarken, moleküler testler arasında piroptoz belirteçleri için Western blotlama (örneğin, NLRP3, bölünmüş-kaspaz-1), sitokinler için enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve serotonin nöronlarında reaktif oksijen türlerinin (ROS) tespiti için dihidroetidyum (DHE) boyama. Iba1 ve TPH2 için immünohistokimya gibi gelişmiş mikroskopi teknikleri, mikroglial dinamiklerin ve serotonerjik bütünlüğün görselleştirilmesini sağlar. Sonuçlar, Mettl3 eksikliğinin Nrf2 aşağı regülasyonunu, NLRP3 inflamatuar hiperaktivasyonunu, piroptotik hücre ölümünü ve bunun sonucunda serotonin nöron dejenerasyonunu şiddetlendirdiğini doğrulamaktadır. Bu yöntem yalnızca m6A aracılı nöroproteksiyonun araştırılması için sağlam bir deneysel iskele sağlamakla kalmaz, aynı zamanda nörodejeneratif bağlamlarda Mettl3/Nrf2 ekseninin hedeflenen modülasyonu yoluyla PD ilerlemesini hafifletmeye yönelik potansiyel terapötik yolları da vurgular.

Giriş

Parkinson hastalığı (PH), yaşlılar arasında en sık görülen ikinci nörodejeneratif bozukluktur ve 65 yaş ve üzeri bireylerin yaklaşık %2-3'ünü etkilemektedir ve bu durum hem aileler hem de toplum üzerinde önemli bir yük oluşturmaktadır1. PH'nin arkasındaki kesin mekanizmalar kısmen anlaşılmış olsa da, biriken kanıtlar, yaşlanan beyinlerde ve PD 2,3,4,5 dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda görülen ortak bir özellik olan mikroglial hücreler tarafından yönlendirilen nöroinflamasyon ile birlikte PD gelişimi ile nöronal iletimdeki zorluklar arasında bir bağlantı olduğunu göstermektedir. Mikroglia, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olarak görev yapar ve beyin homeostazını sürdürmek için hayati önem taşır6. Bununla birlikte, bu mikrogliaların kalıcı aşırı aktivasyonu, kronik nöroinflamatuar yanıtları tetikleyebilir ve sonuçta nörodejeneratif hastalığın ilerlemesine katkıda bulunabilir.

Hem merkezi hem de periferik inflamatuar süreçler PD7,8'in patolojisini önemli ölçüde etkiler. Mikroglial hücrelerin aktivasyonu, nöronal sağkalımı 9 etkileyen inflamatuar yanıtları harekete geçirirve ortaya çıkan kanıtlar, ubikuitin ligazları10 tarafından hazırlandığını vurgular. Çeşitli enflamatuar yollar arasında, NOD-, LRR- ve pirin alanı içeren protein 3 (NLRP3) inflamatuar aktivasyonu, mikroglial inflamatuar düzenlemeye birincil katkıda bulunur11. Aktivasyon, NLRP3 ekspresyonuna ve ardından kaspaz aktivasyonu ve işe alım alanı (CARD) adaptör proteini ve pro-kaspaz-1'den oluşan inflamatuar kompleksin montajına yol açar ve protein bölünmesi ve sitokin salınımı12 ile sonuçlanır. PD hastalarında ve hastalığın çeşitli hayvan modellerinde nöronal ölümle sonuçlanan yüksek NLRP3 aktivasyonu gözlenmiştir. Özellikle, NLRP3'ün inhibe edilmesi, fare modellerinde PD patolojisine karşı koruyucu etkiler göstermiştir ve NLRP3 inflamatuarının PD başlangıcındaki önemli rolünün altını çizmiştir13,14.

Serotonin (5-HT) sinyali, kapsamlı genel bakışlarda17 ayrıntılı olarak açıklandığı gibi CNS patolojisindeki roller de dahil olmak üzere, en az 14 postsinaptik reseptör alt tipi15,16 ile etkileşimler yoluyla çok sayıda davranışı ve fizyolojik işlevi etkileyen önemli bir nöral düzenleme mekanizmasıdır. 5-HT sisteminin kapsamlı nöromodülatör etkisi, kemirgen beynindeki yaklaşık 26.000 nöron tarafından yönetilir18. Önemli literatür PD'yi ağırlıklı olarak dopaminerjik nöron kaybı ile ilişkilendirirken, 5-HT nöronları ile PD arasındaki ilişki daha az kapsamlı bir şekilde incelenmiştir.

Ökaryotik hücrelerde en yaygın mRNA modifikasyonu olan N6-metiladenosin (m6A) modifikasyonu, mRNA eklenmesini, stabilitesini ve ihracatını düzenlemenin anahtarıdır ve böylece çeşitli hücresel aktiviteleri etkiler19. m6A seviyeleri metiltransferazlar ve demetilazlar tarafından modüle edilir. Beyindeki yüksek m6A modifikasyonları,Alzheimer modellerinde 22 değişmiş METTL3 ekspresyonu da dahil olmak üzere, düzensizliğinin nörodejeneratif koşullarla20,21 yakından bağlantılı olmasıyla nörogelişim ile ilişkilendirilmiştir. Örneğin, Alzheimer hastalarından alınan ölüm sonrası beyin dokularının çözünmeyen fraksiyonunda metiltransferaz benzeri 3'ün (METTL3) birikmesi, çözünmeyen Tau proteini23 seviyeleri ile pozitif korelasyon göstermiştir. Ayrıca, striatumdaki m6A seviyelerinde önemli bir azalma, dopamin nörotransmitter seviyelerinde önemli bir düşüşe yol açabilir24. Özellikle, on iki m6A ile ilişkili tek nükleotid polimorfizmi, PD duyarlılığı25 ile önemli ilişkiler göstermiştir. Bu protokol, METTL3 aracılı m6A modifikasyonlarının Nrf2/NLRP3 ekseni yoluyla mikroglial piroptozu nasıl düzenlediğini ve sonuçta PD modellerinde serotonin nöronunun hayatta kalmasını nasıl etkilediğini araştırmak için kapsamlı metodolojiler oluşturur. Akut MPTP in vivo modeli ve LPS in vitro modeli, nöroinflamatuar yanıtların güçlü indüksiyonu için seçilmiştir, ancak kronik paradigmalar aşağıda tartışıldığı gibi gelecekteki çalışmaları tamamlayabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Feicheng Halk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (onay numarası IACUC-2024-118) onayı altında gerçekleştirildi ve laboratuvar hayvanı araştırmaları için kurumsal yönergelere ve belirlenmiş etik ilkelere sıkı sıkıya bağlı olarak gerçekleştirildi. Çalışma protokolleri, sorumlu hayvan araştırma uygulamaları için hem kurumsal standartlara hem de ARRIVE yönergelerine bağlı kalarak, özellikle acı ve sıkıntıyı en aza indirmeye vurgu yaparak tüm hayvanlara insancıl bakım ve muamele sağladı.

1. Hücre kültürü ve mikroglial aktivasyon modeli

  1. BV2 hücresi hazırlama ve bakımı
    1. Dondurulmuş BV2 mikroglial hücre stoklarını 37 °C'lik bir su banyosunda 2 dakika boyunca hızla çözdürün ve termal şoku önlemek için hafif bir girdap sağlayın.
    2. Kriyoprotektan çıkarmak için çözülmüş hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
    3. Süpernatanı atın ve hücre peletini %10 FBS, %1 penisilin-streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş 10 mL tam yüksek glikozlu DMEM ortamında yeniden süspanse edin.
    4. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak hücre canlılığı değerlendirmesi yapın (10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL %0,4 tripan mavisi ile karıştırın, hemositometre kullanarak sayın), devam etmeden önce %>95 canlılık sağlayın.
    5. T75 kültür şişelerindeki plaka hücreleri, şişe başına 1 × 106 hücre yoğunluğunda ve %5 CO2 ile 37°C'de nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe muhafaza edilir.
    6. Standart tripsinizasyon prosedürleri kullanılarak %80-85 birleşmeye ulaşıldığında her 48 saatte bir geçiş hücreleri.
      NOT: Tekrarlanabilir inflamatuar yanıtlar sağlamak için tutarlı geçiş sayılarını (pasaj 3-8) koruyun. Tüm hücre kültürü deneyleri, değişkenliği en aza indirmek için koşul başına üç teknik kopya ile bağımsız olarak en az üç kez tekrarlandı.
  2. LPS kaynaklı mikroglial aktivasyon
    1. BV2 hücrelerini, tedaviden 24 saat önce 2 mL tam ortamda kuyu başına 2 × 105 hücrede 6 oyuklu plakalarda tohumlayın.
    2. LPS stok çözeltisini steril PBS'de 1 mg/mL'de hazırlayın, 0,22 μm'lik bir filtreden filtreyle sterilize edin ve -20 °C'de tek kullanımlık kısımlarda saklayın.
    3. Her deneyden önce endotoksin konsantrasyonunu doğrulamak için Limulus Amebocyte Lysate (LAL) testini kullanarak LPS aktivitesini doğrulayın26.
    4. Kullanmadan hemen önce LPS stoğunu serumsuz DMEM'de 1 μg/mL'lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
    5. Kültür ortamını kuyucuklardan çıkarın ve hücreleri steril PBS ile iki kez yıkayın.
    6. Tedavi kuyucuklarına 2 mL LPS içeren ortam (1 μg/mL nihai konsantrasyon) ve kontrol kuyucuklarına serumsuz DMEM ekleyin.
    7. Hücreleri 37 °C'de 24 saat boyunca %5CO2 ile inkübe edin 2 inflamatuar aktivasyon için.
    8. İnflamatuar yanıtı doğrulamak için 100 ng/mL tümör nekroz faktörü (TNF)-α ile tedavi edilen pozitif kontrol kuyularını ve yalnızca araçlı (PBS) negatif kontrol kuyularını dahil edin.
      NOT: Tutarlı biyoaktiviteyi sürdürmek için her deney için taze LPS çözeltisi hazırlayın. İnflamatuar yanıt zayıfsa (örneğin, <2 kat sitokin artışı), reaktif stabilitesini kontrol edin veya inkübasyonu 48 saate uzatın.
  3. Mettl3 aşırı ekspresyon ve yıkım
    1. Standart oligonükleotid sentez protokollerini kullanarak Mettl3'ü ve karıştırılmış kontrol dizilerini hedefleyen küçük enterferans yapan RNA (siRNA) dizilerini tasarlayın ve sentezleyin. 19-21 nükleotid uzunluğuna sahip Mettl3 mRNA'nın (GenBank erişimi: NM_019721) kodlama bölgesinden hedef dizileri seçin ve GC içeriğinin %40-60 olmasını sağlayın27.
    2. Özgüllüğü doğrulamak ve hedef dışı etkilerden kaçınmak için BLAST analizini kullanarak siRNA dizilerini doğrulayın (hedef olmayan genlerle %<70 homoloji sağlayın).
    3. EcoRI ve XhoI kısıtlama bölgelerini kullanarak pcDNA3.1 vektörüne klonlanmış tam uzunlukta Mettl3 cDNA içeren aşırı ekspresyon vektörlerini hazırlayın.
    4. Katyonik lipid transfeksiyon reaktifi kullanarak hücreleri %70-80 birleşmede transfekte edin:
      1. 2 μL katyonik lipid transfeksiyon reaktifini 50 pmol siRNA veya 2 μg plazmit DNA ile 100 μL Opti-MEM ortamında karıştırın.
      2. Karışımı RT'de 15 dakika inkübe edin.
      3. Transfeksiyon kompleksini hücrelere damla damla ekleyin ve taze tam ortama geçmeden önce 4-6 saat inkübe edin.
    5. Yeterli protein ekspresyonu değişikliklerine izin vermek için LPS tedavisinden önce transfekte edilmiş hücreleri 48 saat inkübe edin.
    6. Devam etmeden önce floresan mikroskobu ile %70 verimliliği >hedefleyen floresan raportör ko-transfeksiyonunu (kuyu başına 100 ng pEGFP-C1) kullanarak transfeksiyon verimliliğini doğrulayın.

2. Hayvan modeli geliştirme ve deney tasarımı

  1. Hayvan hazırlama ve randomizasyon
    1. Vital River Laboratuvarı'ndan C57BL/6J fareleri elde edin, 8 haftalık, 19-26 g ağırlığında eşit erkek-dişi oranları sağlayın.
    2. 12:12 saat aydınlık-karanlık döngüsü, kontrollü sıcaklık (22 ± 2°C) ve nem (%50-60) ile belirli patojen içermeyen (SPF) koşullarda ev hayvanları.
    3. Standart yem ve suya ad libitum erişim ile 7 günlük bir iklimlendirme süresine izin verin.
    4. İklimlendirme sırasında temel davranışsal değerlendirmeler yapın: Ön ayak yerleştirme testi (her tarafta 10 deneme), hızlandırıcı rotarod değerlendirmesi (5 dakika boyunca 4-40 rpm) ve açık alan lokomotor aktivite analizi (50 cm × 50 cm × 50 cm'lik bir aparatta 10 dakikalık seanslar) dahil olmak üzere kapsamlı davranışsal değerlendirmeler yapın28,29,30.
    5. Önyargıyı en aza indirmek için bilgisayarlı rastgeleleştirme kullanarak hayvanları deney gruplarına rastgele atayın (n = grup başına 6): sahte, Model, Model+Nrf2-KD, Model+oe-Nrf2.
    6. Davranışsal değerlendirmeler yapan araştırmacıların grup ödevlerinden habersiz olduğu kör bir deneysel tasarım uygulayın.
  2. 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) ile indüklenen Parkinson hastalığı modeli
    1. Enjeksiyondan hemen önce 15 mg MPTP hidroklorürü 5 mL steril salin içinde çözerek ve hacmi hayvan ağırlığına göre ayarlayarak steril salin içinde 30 mg/kg MPTP çözeltisi hazırlayın.
      DİKKAT: MPTP oldukça nörotoksiktir. Çift eldiven ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanla kimyasal çeker ocakta tutun.
    2. MPTP'yi 30 mg / kg vücut ağırlığında (enjeksiyon hacmi 10 mL / kg) intraperitoneal enjeksiyon yoluyla üç ardışık gün boyunca her gün aynı saatte (09:00 ± 30 dakika) uygulayın.
    3. Sahte grup hayvanlara aynı enjeksiyon programını izleyerek eşdeğer hacimlerde steril salin enjekte edin.
    4. Standartlaştırılmış puanlama tablolarını kullanarak MPTP uygulama süresi boyunca hayvanları günlük olarak sıkıntı, kilo kaybı (%>15'i son nokta olarak kabul edilir) veya advers reaksiyon belirtileri açısından izleyin.
    5. Nörodejenerasyon gelişimine izin vermek için hayvanları son enjeksiyondan sonra 8 gün boyunca koruyun.
      NOT: Hayvanlar bu dönemde sürekli izleme ile normal şekilde barındırılabilir.
  3. Stereotaktik viral enjeksiyon
    1. Polietilenimin (PEI; 1:3 DNA:PEI oranı) kullanarak HEK293T hücrelerinin üçlü transfeksiyonu ile AAV9 viral vektörlerini hazırlayın, transfeksiyondan 72 saat sonra hasat edin, iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjleme (2 saat boyunca 177.000 × g ) kullanarak saflaştırın ve 1 × 1012 genom kopyası / mL elde etmek için santrifüj filtre cihazları kullanarak konsantre edin.
    2. ITR bölgelerini hedefleyen primerleri kullanarak kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yoluyla viral titreyi doğrulayın ve standart eğri analizi ile titrelerin 1 × 10¹² genom kopyası/mL'ye ulaşmasını sağlayın.
    3. ITR'ye özgü primerlerle SYBR Green bazlı kantitatif PCR kullanarak viral titreyi doğrulayın, bilinen standartların seri seyreltmelerini gerçekleştirin ve standart eğri analizini kullanarak genom kopyalarını hesaplayın. p24 ELISA kullanarak replikasyon yetkin virüs kontaminasyonunun olmadığını doğrulayın.
    4. Fareleri izofluran (%3 indüksiyon, %1.5-2 bakım) ile burun konisinden 0.8-1.0 L/dk oksijen akış hızında uyuşturun, işlem boyunca solunum hızını (60-100 nefes/dak) ve ayak parmağı sıkıştırma refleksini izleyin. Fareyi stereotaktik çerçeveye sabitleyin ve korneanın kurumasını önlemek için oftalmik merhem sürün.
    5. Fareyi stereotaktik çerçeveye sabitleyin ve korneanın kurumasını önlemek için oftalmik merhem sürün.
    6. Steril bir neşter bıçağı kullanarak 1,5 cm'lik bir orta hat kafa derisi kesisi yapın ve 0,1 mm hassasiyetle stereotaktik koordinatları kullanarak bregma dönüm noktasını belirleyin.
    7. Striatum için enjeksiyon koordinatlarını hesaplayın: anterior-posterior -0.5 mm, medial-lateral ±2.0 mm, bregma'dan dorsal-ventral -3.0 mm.
    8. Hedefleme doğruluğunu doğrulamak için floresan izleyici (örneğin, yeşil floresan proteini [GFP]) ile pilot enjeksiyonlar gerçekleştirin ve deneysel enjeksiyonlardan önce immünohistokimya yoluyla mikroglial belirteçlerle (Iba1) %>80 birlikte lokalizasyonu doğrulayın.
    9. Enjeksiyon iğnesini (33-G) 1 mm/dak hızında hedef derinliğe indirin ve otomatik kontrolörlü bir mikro şırınga pompası kullanarak 0,2 μL/dak'da 2 μL viral süspansiyon enjekte edin. Enjeksiyon iğnesini hedef derinliğe indirin ve bir mikro şırınga pompası kullanarak 0.2 μL / dak hızında 2 μL viral süspansiyon enjekte edin.
    10. Geri akışı önlemek için enjeksiyondan sonra 5 dakika boyunca iğne pozisyonunu koruyun.
    11. İğneyi 0,5 mm/dk hızla yavaşça geri çekin, kesi kesi 4-0 ipek dikişle kesintili bir desen kullanarak kapatın ve ısıtılmış bir iyileşme pedi üzerinde anesteziden kurtulmaya izin verin.
    12. Ameliyat sonrası analjezi (3 gün boyunca günde bir kez deri altından 5 mg/kg karprofen) uygulayın ve ayrıntılı gözlem sayfalarıyla iyileşmeyi 24 saat boyunca izleyin.

3. Moleküler biyoloji teknikleri ve validasyonu

  1. RNA ekstraksiyonu ve kalite kontrolü
    1. Deneysel son noktalardan hemen sonra hücreleri veya striatal beyin dokusu örneklerini CO2 inhalasyonu ve ardından servikal çıkık yoluyla hayvanları insanca ötenazi yaparak hasat edin; dokuyu buz üzerinde inceleyin, ince kıyın ve hücreleri topluyorsanız 37 ° C'de 10 dakika boyunca% 0.25 tripsin ile enzimatik olarak ayrıştırın.
    2. Mekanik homojenizasyon (bir dounce homojenizatörde 20-25 vuruş) ve kloroform faz ayrımı (1 mL TRIzol başına 0.2 mL kloroform) ile TRIzol reaktifi (1 106 hücre veya 100 mg doku başına 1 mL) kullanarak toplam RNA'yı çıkarın.
    3. 28S ve 18S ribozomal bantlarını doğrulamak için spektrofotometri (A260/A280 oranı 1.8-2.0) ve jel elektroforezi (%1 agaroz) kullanarak RNA kalitesini değerlendirin.
    4. Bir spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün.
    5. RNA örneklerini -80 °C'de nükleaz içermeyen suda -80 °C'de RNaz inhibitörü (40 birim/μL) ilavesiyle analize kadar saklayın.
  2. Nükleer-sitoplazmik fraksiyonlama
    1. Hücreleri toplayın (minimum 2 × 106 ) ve buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın (yıkama başına 5 mL, 300 × g'da 5 dakika santrifüjleme).
    2. Aşağıdaki protokole sahip ticari bir hücre fraksiyonlama kiti kullanın.
      1. Hücre peletini proteaz inhibitörleri ile 200 μL sitoplazmik ekstraksiyon tamponunda yeniden süspanse edin.
      2. Her 3 dakikada bir vorteksleme ile 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
      3. 4 °C'de 5 dakika boyunca 16.000 × g'da santrifüjleyin ve süpernatan (sitoplazmik fraksiyon) toplayın.
      4. Peleti sitoplazmik ekstraksiyon tamponu ile iki kez yıkayın.
      5. Peleti 100 μL nükleer ekstraksiyon tamponunda yeniden süspanse edin.
      6. Her 10 dakikada bir vorteksleme ile 40 dakika buz üzerinde inkübe edin.
      7. 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı (nükleer fraksiyon) toplayın
    3. Western blot kullanarak nükleer belirteç (U6) ve sitoplazmik belirteç (GAPDH) dağılımını analiz ederek fraksiyonasyon verimliliğini doğrulayın.
    4. RNA'yı nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlardan ayrı ayrı çıkarın.
    5. Fraksiyona özgü referans genlerle RT-qPCR kullanarak her fraksiyondaki Nrf2 mRNA seviyelerini analiz edin.
  3. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (RT-qPCR)
    1. Rastgele primerlere sahip bir ters transkripsiyon reaktif kiti kullanarak 1 μg toplam RNA'dan cDNA sentezleyin.
    2. Gerçek zamanlı bir PCR sisteminde gene özgü primerler içeren Premix Ex Taq II kitini kullanarak qPCR gerçekleştirin.
    3. Erime eğrisi analizini kullanarak primer özgüllüğünü doğrulayın ve jel elektroforezi ile tek bir amplikonu doğrulayın.
    4. Aşağıdaki termal döngü koşullarını kullanın: 95 °C'de 10 dakika boyunca ilk denatürasyon, ardından 15 saniye boyunca 95 °C'lik 40 döngü, 30 saniye boyunca 60 °C ve 30 saniye boyunca 72 °C.
    5. Dahili referans olarak β-aktin ile 2-ΔΔCt yöntemini kullanarak bağıl mRNA ekspresyon seviyelerini hesaplayın.
    6. Şablonsuz kontrolleri dahil edin ve geNorm analizini kullanarak deneysel koşullar arasında referans gen stabilitesini doğrulayın (stabilite değeri M < 0.5).
      NOT: Tekrarlanabilirlik puanları: üç bağımsız çalışmada tahlil içi varyasyon katsayısı (CV) <%10.
  4. m6A modifikasyon analizi için MeRIP-qPCR
    1. Toplam RNA'yı (minimum 20 μg) ekstrakte edin ve RNA parçalanma reaktifi (10 mM ZnCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7.0) kullanarak 5 dakika boyunca 70 °C'de 100-200 nükleotidi parçalayın.
    2. İmmünopresipitasyon tamponunda (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 750 mM NaCl, %0.5 NP-40) rotasyon (10 rpm) ile gece boyunca 4 °C'de m6A'ya özgü antikor (20 μg RNA başına 2 μg) kullanarak immünopresipitasyon gerçekleştirin.
    3. Bilinen m6A ile modifiye edilmiş ve modifiye edilmemiş RNA kontrollerini kullanarak antikor özgüllüğünü doğrulayın.
    4. İmmün çökeltilmiş kompleksleri yıkama tamponu ile beş kez yıkayın.
    5. Bağlı RNA'yı ayrıştırın ve rastgele primerler kullanarak ters kopyalayın.
    6. Rastgele primerler kullanarak ayrıştırılan RNA'yı ters kopyalar ve potansiyel m6A bölgelerini kapsayan Nrf2'ye özgü primerleri kullanarak qPCR analizi gerçekleştirir.
    7. Nrf2'ye özgü primerleri kullanarak qPCR analizi yapın ve giriş RNA'sına göre zenginleştirmeyi hesaplayın.
      NOT: Algılama tutarsızsa, tekrarlanabilirliği artırmak için parçalanma süresini (4-6 dakika) optimize edin; kantitatif kıyaslama: IgG kontrollerine kıyasla sinyal-gürültü oranı >15:1.

4. Protein analizi ve validasyonu

  1. Protein ekstraksiyonu ve miktar tayini
    1. Proteaz inhibitörleri (1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF), 1 μg/mL leupeptin, 1 μg/mL pepstatin A) ve fosfataz inhibitörleri (1 mM sodyum ortovanadat, 5 mM sodyum florür) içeren 200 μL radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponunda lyse hücreleri (1 ×10 6 hücre) veya doku örneklerini (1 mg striatal doku) homojenize edin.
    2. Lizatları buz üzerinde 30 dakika boyunca periyodik vorteksleme ile inkübe edin (10 saniye boyunca her 10 dakikada bir).
    3. Hücresel kalıntıları gidermek ve süpernatan toplamak için 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüjleyin.
    4. Sığır serum albümin standartları (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 μg/mL) ile bisinkoninik asit (BCA) tahlilini kullanarak protein konsantrasyonunu üçlü ölçümlerde ölçün.
    5. Western blot kullanarak tüm numunelerde temizlik protein seviyelerini (GAPDH, beklenen MW: 36 kDa) analiz ederek protein bütünlüğünü doğrulayın.
  2. Western blot analizi
    1. Protein numunelerini sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yükleme tamponunda eşit yükleme (30-50 μg) ile hazırlayın (nihai konsantrasyonlar: 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, %2 SDS, %10 gliserol, %5 β-merkaptoetanol, %0.003 bromofenol mavisi) ve 95 °C'de 5 dakika denatüre edin.
    2. Tris-glisin-SDS tamponunda 30 dakika boyunca 80 V'ta ve ardından 90 dakika boyunca 120 V'ta çalışan %10 poliakrilamid jeller kullanarak SDS-PAGE ile proteinleri ayırın.
    3. Transfer tamponunda (25 mM Tris, 192 mM glisin, %20 metanol) yarı kuru bir transfer sistemi (90 dakika boyunca 400 mA) kullanarak proteinleri poliviniliden florür (PVDF) membranlarına aktarın.
    4. Antikor inkübasyonuna geçmeden önce tersinir protein boyama (Ponceau S: 5 dakika boyunca %5 asetik asit içinde %0,1) kullanarak transfer verimliliğini doğrulayın.
    5. Membranları TBST'de (TBS +% 0.1 Tween-20) %5 yağsız sütle RT'de 1 saat boyunca hafif çalkalama ile bloke edin.
    6. Bloke edici tamponda 1:1000 oranında seyreltilmiş birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de hafif çalkalama ile inkübe edin.
    7. Membranları TBST ile üç kez yıkayın (her biri 10 dakika) ve RT'de 1 saat boyunca HRP konjuge ikincil antikorlarla (1:5000 seyreltme) inkübe edin.
    8. Gelişmiş kemilüminesans kullanarak protein bantlarını tespit edin ve dansitometri kullanarak ölçün.
    9. Hedef protein ekspresyonunu yükleme kontrolüne (GAPDH) normalleştirin ve uygun kontrolleri (birincil antikorlar için peptit blokajı, yalnızca ikincil kontroller) kullanarak antikor özgüllüğünü doğrulayın.

5. Davranışsal değerlendirme ve fonksiyonel analiz

  1. Ön ayak yerleştirme testi
    1. Değerlendirmeden önce farenin 30 dakika boyunca test ortamına (sessiz oda, 22 °C, loş ışık) alışmasını bekleyin.
    2. Fareyi sırt derisinden nazikçe kavrayın, dört uzvunu da masa kenarından yaklaşık 0,5 cm yukarıya asın ve farenin masa yüzeyini görememesini sağlayın.
    3. Yerleştirme refleksini tetiklemek ve 2 saniye içinde başarılı ön ayak yerleşimini kaydetmek için her iki taraftaki vibrissaları masa kenarına doğru fırçalayın.
    4. Denemeler arasında 30 saniyelik aralıklarla, sol ve sağ tarafları değiştirerek her iki tarafta 10 deneme yapın.
    5. Sirkadiyen etkileri en aza indirmek için testleri tutarlı aydınlatma koşullarında (50-100 lüks) ve günün saatinde (13:00-17:00) gerçekleştirin.
    6. Başarı oranını başarılı yerleştirmelerin yüzdesi olarak hesaplayın: (başarılı yerleştirmeler/toplam deneme sayısı) × 100.
  2. Rotarod testinin hızlandırılması
    1. Rotarod aparatını, 5 dakikalık bir süre boyunca 40 rpm'ye doğrusal ivme ile 4 rpm'lik bir başlangıç hızına ayarlayın.
    2. Öğrenme etkilerini en aza indirmek için test etmeden önce fareleri art arda 3 gün (günde 3 deneme, 15 dakikalık aralıklarla) rotarod üzerinde eğitin.
    3. RT (22 ± 2 °C), aydınlatma (100 lüks) ve arka plan gürültü seviyeleri (<50 dB) dahil olmak üzere test koşullarını standartlaştırın.
    4. Fareyi öne bakacak şekilde dönen çubuğun üzerine yerleştirin ve hızlanma protokolünü hemen başlatın.
    5. Her deneme için düşme gecikmesini (başlangıçtan farenin düşmesine veya 5 dakikalık denemeyi tamamlamasına kadar geçen süre) kaydedin ve 15 dakikalık dinlenme aralıklarıyla hayvan başına 5 kez test edin.
    6. Motivasyon faktörlerinden kaynaklanan değişkenliği en aza indirmek için en uzun üç denemeden ortalama gecikmeyi hesaplayın.
  3. Açık alan testi
    1. Arenanın 1 m yukarısına yerleştirilmiş bir video takip sistemi ile açık alan aparatı (50 cm × 50 cm × 50 cm şeffaf akrilik kutu) kullanın.
    2. Koku ipuçlarını ortadan kaldırmak için aparatı hayvanlar arasında %70 etanol ile temizleyin (sprey ve silin, 5 dakika havayla kurutun).
    3. Fareyi cihazın ortasına yerleştirin ve 30 fps'de video çekimi ile tutarlı aydınlatma (200 lüks) altında 10 dakika boyunca aktiviteyi kaydedin.
    4. Otomatik izleme yazılımını kullanarak birden fazla parametreyi analiz edin:
      Kat edilen toplam mesafe (cm)
      Merkez bölge süresi (duvarlardan 10 cm olarak tanımlanır, s cinsinden rapor edilir)
      Hareket hızı (cm/s)
      Çevre ve merkez bölgelerde geçirilen süre
  4. Merkezi bölgeyi duvarlardan 10 cm olarak tanımlayın ve merkezde harcanan zamanı ve kat edilen mesafeyi çevre bölgelere göre ölçün.

6. Gelişmiş mikroskopi ve görüntüleme

  1. ROS tespiti için DHE boyama
    1. Kullanmadan hemen önce PBS'de 10 μM'de taze dihidroetidyum (DHE) çözeltisi hazırlayın (ışıktan koruyun).
    2. Serotonin nöronlarını spesifik olarak tanımlamak için DHE'yi triptofan hidroksilaz 2 (TPH2) antikoru (1:500 seyreltme) ile birleştirerek ko-immünofloresan boyama gerçekleştirin.
      NOT: Bu çift etiketleme yaklaşımı, DHE'nin süperoksit ile oksidasyon üzerine, menşe hücre içinde lokalize kalan membran geçirimsiz floresan ürünler oluşturduğu ilkesine dayanarak, TPH2-pozitif nöronal hücre gövdeleri içindeki ROS üretiminin çevredeki glial hücrelerdeki oksidatif stresten ayırt edilmesini sağlar.
    3. Doku kesitlerini (20 μm kalınlığında) nemlendirilmiş bir odada karanlık koşullarda 37 °C'de 30 dakika DHE çözeltisi ile inkübe edin.
    4. ROS tespit özgüllüğünü doğrulamak için negatif kontrolleri (DHE yok) ve pozitif kontrolleri (30 dakika boyunca 100 μMH2O2 tedavisi) dahil edin.
    5. Bölümleri PBS ile üç kez yıkayın ve solmayı önleyen montaj ortamıyla monte edin.
    6. Numuneler arasında tutarlı pozlama ayarlarıyla (200 ms) floresan mikroskobu (DHE: 518 nm uyarma/605 nm emisyon, TPH2: 488 nm uyarma/525 nm emisyon) kullanılarak görüntü; Görüntüleme sistemleri, standart floresan boncuklar kullanılarak haftalık olarak kalibre edildi (sinyal-gürültü oranı > 20:1).
    7. TPH2 pozitif hücrelerdeki floresan yoğunluğunu yalnızca standartlaştırılmış analiz protokollerine sahip ImageJ yazılımını kullanarak ölçün (eşik: 50-255, parçacık boyutu: 10-∞ piksel2). Bitişik mikroglia, astrositler veya diğer hücre tiplerinden gelen sinyalleri hariç tutarken, özellikle serotonerjik nöronlar içindeki oksidatif stresin ölçülmesini sağlamak için TPH2 immünoreaktivitesine dayalı ROI sınırları oluşturun. Her hayvan için, birden fazla doku kesitinde en az 50 TPH2-pozitif nöronu analiz edin.
  2. İmmünohistokimya
    1. Doku kesitlerini PBS'de% 4 paraformaldehit içinde 24 saat boyunca 4 ° C'de hafif çalkalama ile sabitleyin.
    2. Dereceli bir etanol serisinden (%70, %80, %90, %95, %100 × her biri 2, 1 saat) dehidre edin ve otomatik bir işlemci kullanarak parafine gömün.
    3. Bir mikrotom kullanarak 5 μm'lik kesitler kesin ve slayt başına 3-4 kesit sağlayacak şekilde şarjlı cam slaytlara monte edin.
    4. Ksilen (2 × 10 dakika) kullanarak kesitleri deparafinize edin ve dereceli etanol yoluyla suya rehidre edin.
    5. Bir mikrodalgada (2 dakikalık soğutma aralıklarıyla 10 dakika boyunca 750 W) sitrat tamponu (10 mM sodyum sitrat, pH 6.0) kullanarak antijen alımını gerçekleştirin.
    6. Uygun negatif kontrolleri (birincil antikor yok) ve pozitif kontrol dokularını (hedef proteinleri eksprese ettiği bilinen beyin bölümleri) kullanarak antikor özgüllüğünü doğrulayın.
    7. RT'de 10 dakika boyunca metanol içinde% 3 hidrojen peroksit ile endojen peroksidaz aktivitesini bloke edin.
    8. Birincil antikorları gece boyunca nemlendirilmiş bir odada 4 °C'de uygulayın.
    9. HRP konjuge ikincil antikorlar (1:500 seyreltme, RT'de 1 saat) ve DAB kromojeni (kahverengi renk gelişene kadar, tipik olarak 2-5 dakika inkübe edin) kullanarak tespit edin.
    10. Hematoksilen (30 s) ile karşı boyayın, kurutun, temizleyin ve kalıcı montaj ortamıyla monte edin.
    11. Sistematik rastgele örnekleme ile stereolojik yöntemler kullanarak pozitif hücreleri ölçün (her 5. bölümde, bölüm başına 3 sayma çerçevesi, ×40 büyütme).

7. İstatistiksel analiz ve veri doğrulama

  1. İstatistiksel tasarım ve analiz
    1. G*Power 3.1.9.7 yazılımını kullanarak biyolojik olarak anlamlı farklılıkları (etki büyüklüğü ≥ 0,8, güç ≥ 0,80, α = 0,05) tespit etmek için yeterli örneklem boyutlarını belirlemek üzere güç analizi yapın.
    2. Shapiro-Wilk testini kullanarak veri normalliğini doğrulayın ve parametrik analizden önce Levene testini kullanarak varyansın homojenliğini değerlendirin.
    3. Deneysel tasarım ve veri dağılımına dayalı uygun istatistiksel testlerle istatistiksel bir yazılım kullanarak verileri analiz edin.
    4. Tek faktörlü karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve faktöriyel tasarımlar için iki yönlü ANOVA (örneğin, tedavi × zaman etkileşimleri) uygulayın.
    5. ANOVA anlamlılık gösterdiğinde (p < 0.05) çoklu karşılaştırmalar için Tukey'in post hoc testini kullanın ve uygun olduğunda Bonferroni düzeltmesi uygulayın.
    6. İstatistiksel anlamlılık eşiğini tüm analizler için p < 0,05 olarak ayarlayın ve p < 0,01 ve p < 0,001 için ek gösterim yapın.
    7. Kapsamlı bir istatistiksel yorum sağlamak için etki büyüklüklerini (Cohen's d veya η2) ve %95 güven aralıklarını p değerlerinin yanı sıra rapor edin.
    8. Verileri, n ≤ 10 olduğunda gösterilen bireysel veri noktaları ile en az üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SEM olarak sunun.
      NOT: Tüm hücre kültürü deneyleri, her deney uygun kontroller ve çoklu teknik kopyalar içerecek şekilde bağımsız olarak en az üç kez tekrarlanmalıdır ve gözlemlenen değişkenlik (örneğin, CV

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Protokol, kontrol gruplarına kıyasla hem mRNA hem de protein seviyesindeki azalmalarla kanıtlandığı gibi, LPS ile tedavi edilen mikroglial hücrelerde Mettl3 ekspresyonunun azaldığını başarıyla göstermektedir (Şekil 1) (Şekil 1B,C). ELISA analizi, kültür süpernatantlarında yüksek IL-6 ve TNF-α seviyeleri yoluyla başarılı LPS aracılı inflamatuar aktivasyonu doğrulamaktadır (Şekil 1A).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için dikkatli dikkat gerektiren birkaç kritik adım vardır. LPS aktivasyon zamanlaması çok önemlidir - inflamatuar yanıtlar tedaviden 24 saat sonra zirve yapar ve depolanan çözeltiler biyoaktiviteyi19,20 kaybedebileceğinden, her deney için taze LPS çözeltisi hazırlamanızı şiddetle tavsiye ederiz. MeRIP-qPCR analizi için antikor kalitesi çok önemlidir. Deneysel numunelerden önce bilinen pozitif v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bu çalışmayla ilgili herhangi bir rakip mali çıkar veya çıkar çatışması beyan etmemektedir. Hiçbir yazarın bu makalede ürünlerinden bahsi geçen firmalarla herhangi bir mali ilişkisi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, deneysel prosedürler ve hayvan bakımı konusundaki yardımları için Feicheng Halk Hastanesi ve Yantai Yantaishan Hastanesi'ndeki teknik personele teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AAV9 viral vektörleriVektör Çekirdeği TesisiTöreNrf2 yapılarını içeren
Hızlandırıcı rotarodUgo Basile47600Davranışsal testler için
Anti-GAPDH antikorHücre Sinyal Teknolojisi5174Birincil antikor, 1:5000
Anti-GSDMD antikoruAbcamAB219800Birincil antikor, 1:1000
Anti-Iba1 antikorWako019-19741Birincil antikor, 1:500
Anti-NLRP3 antikorAdipoGenAG-20B-0014Birincil antikor, 1:1000
Anti-Nrf2 antikorAbcamab62352Birincil antikor, 1:1000
Anti-SLC6A4 antikorNovus BiologicalsNBP1-85726Birincil antikor, 1:500
Anti-TPH2 antikorMilliporeMAB847Birincil antikor, 1:500
BCA Protein Test KitiDelmek23225Protein nicelendirmesi için
BV2 mikroglial hücreleriShengen BiyolojisiSG-BV2Fare mikroglial hücre hattı
C57BL/6J fareleriVital River Laboratuvarı2138 haftalık, 19-26 g
Hücre Fraksiyon KitiHücre Sinyal Teknolojisi9038Nükleer-sitoplazmik ayrım
Tam yüksek glukozlu DMEMGibco11965092Hücre kültürü ortamı
DAB KromojenVektör LaboratuvarlarıSK-4100İmmünohistokimya için
Diş matkapıGüzel Bilim Araçları18000-17Burr deliği sondajı için
DHE (Dihydroethidium)Moleküler ProblarD11347ROS tespiti
ELISA Kiti (IL-1β)R& D SistemleriMLB00CMouse IL-1β Algılama
ELISA Kiti (IL-18)R& D Sistemleri7625Fare IL-18 tespiti
ELISA Kiti (IL-6)R& D SistemleriM6000BFare IL-6 tespiti
ELISA Kiti (TNF-α)R& D SistemleriMTA00BFare TNF-α Algılama
Fetal Sığır SerumuGibco16000044Hücre kültürü takviyesi
HRP ile konjuge ikincil antikorJackson ImmunoResearch111-035-003Anti-tavşan, 1:10000
İzofluranRWD Yaşam BilimleriR510-22Anestezik ajan
LAL Test KitiLonza50-647ULPS etkinlik doğrulaması
Lipofektamin transfeksiyon reaktifiInvitrogen11668019Hücre transfeksiyonu için
LPS (Lipopolisakkarid)Sigma-AldrichL2630E. coli'den, 1 mg/mL stok
m6A antikoruSinaptik Sistemler202003MeRIP için, 1:200
Mikro şırınga pompasıHarvard Aparatı70-3007Stereotaktik enjeksiyon için
MPTPSigma-AldrichM0896Nörotoksin, 30 mg/kg
Açık alan cihazıANY-MAZETöre50 cm ve keskin; 50 cm ve keskin; 50 cm
ParaformaldehitSigma-AldrichP6148PBS'de %4
pcDNA3.1 vektörüInvitrogenV79020İfade vektörü
Penisillin-StreptomisinGibco15140122Antibiyotik çözeltisi
Premix Ex Taq II KitiTakaraRR820AqPCR için
PrimeScript RT KitTakaraRR037ATers transkripsiyon
PVDF membranıMilliporeIPVH00010Western blot için
RIPA tamponuHücre Sinyal Teknolojisi9806Protein ekstraksiyonu
siRNA (Mettl3)RiboBioTöreHedef dizisi doğrulaması
Stereotaktik çerçeveRWD Yaşam Bilimleri68001Beyin ameliyatı için
TRIzol reaktifiInvitrogen15596026RNA çıkarımı
Trypan mavisiSigma-AldrichT8154Hücre canlılığı boyama

Kaynaklar

  1. Poewe, W. Parkinson disease primer-a true team effort. Nat Rev Dis Primers. 6 (1), 31(2020).
  2. Badanjak, K., Fixemer, S., Smajić, S., Skupin, A., Grünewald, A. The contribution of microglia to neuroinflammation in Parkinson's disease. Int J Mol Sci. 22 (9), 4676(2021).
  3. Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140 (6), 918-934 (2010).
  4. Lee, Y., Lee, S., Chang, S. -C., Lee, J. Significant roles of neuroinflammation in Parkinson's disease:therapeutic targets for PD prevention. Arch Pharm Res. 42 (5), 416-425 (2019).
  5. Yao, L., et al. Translational evaluation of metabolic risk factors impacting DBS efficacy for PD-related sleep and depressive disorders:preclinical, prospective and cohort studies. Int J Surg. 111 (1), 543-566 (2025).
  6. Rodríguez-Gómez, J. A., et al. Microglia:agents of the CNS pro-inflammatory response. Cells. 9 (7), 1717(2020).
  7. Nguyen, M., Palm, N. W. Gut instincts in neuroimmunity from the eighteenth to twenty-first centuries. Semin Immunopathol. 44 (5), 569-579 (2022).
  8. Pajares, M., Rojo, A. I., Manda, G., Boscá, L., Cuadrado, A. Inflammation in Parkinson's disease:mechanisms and therapeutic implications. Cells. 9 (7), 1687(2020).
  9. Sampson, T. R., et al. Gut microbiota regulate motor deficits and neuroinflammation in a model of Parkinson's disease. Cell. 167 (6), 1469-1480.e12 (2016).
  10. Yao, L., et al. LRRK2 Gly2019Ser mutation promotes ER stress via interacting with THBS1/TGF-β1 in Parkinson's disease. Adv Sci. 10 (30), e2303711(2023).
  11. Haque, M. E., et al. Targeting the microglial NLRP3 inflammasome and its role in Parkinson's disease. Mov Disord. 35 (1), 20-33 (2019).
  12. Huang, Y., Xu, W., Zhou, R. NLRP3 inflammasome activation and cell death. Cell Mol Immunol. 18 (9), 2114-2127 (2021).
  13. Lee, E., et al. MPTP-driven NLRP3 inflammasome activation in microglia plays a central role in dopaminergic neurodegeneration. Cell Death Differ. 26 (2), 213-228 (2018).
  14. Humphries, F., et al. The E3 ubiquitin ligase Pellino2 mediates priming of the NLRP3 inflammasome. Nat Commun. 9 (1), 1560(2018).
  15. Berger, M., Gray, J. A., Roth, B. L. The expanded biology of serotonin. Annu Rev Med. 60 (1), 355-366 (2009).
  16. Filip, M., Bader, M. Overview on 5-HT receptors and their role in physiology and pathology of the central nervous system. Pharmacol Rep. 61 (5), 761-777 (2009).
  17. Yao, L., et al. MicroRNA-124 regulates the expression of MEKK3 in the inflammatory pathogenesis of Parkinson's disease. J Neuroinflammation. 15 (1), 13(2018).
  18. Fyodorov, D., Nelson, T., Deneris, E. Pet-1, a novel ETS domain factor that can activate neuronal nAchR gene transcription. J Neurobiol. 34 (2), 151-163 (1998).
  19. Deng, J., Chen, X., Chen, A., Zheng, X. m6A RNA methylation in brain injury and neurodegenerative disease. Front Neurol. 13, 995747(2022).
  20. Livneh, I., Moshitch-Moshkovitz, S., Amariglio, N., Rechavi, G., Dominissini, D. The m6A epitranscriptome:transcriptome plasticity in brain development and function. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 36-51 (2019).
  21. Jiang, L., Li, X., Wang, S., Yuan, Z., Cheng, J. The role and regulatory mechanism of m6A methylation in the nervous system. Front Genet. 13, 962774(2022).
  22. Yao, L., et al. MicroRNA-124 regulates the expression of p62/p38 and promotes autophagy in the inflammatory pathogenesis of Parkinson's disease. FASEB J. 33 (7), 8648-8665 (2019).
  23. Huang, H., Camats-Perna, J., Medeiros, R., Anggono, V., Widagdo, J. Altered expression of the m6A methyltransferase METTL3 in Alzheimer's disease. eNeuro. 7 (5), (2020).
  24. Mathoux, J., Henshall, D. C., Brennan, G. P. Regulatory mechanisms of the RNA modification m6A and significance in brain function in health and disease. Front Cell Neurosci. 15, 671932(2021).
  25. Guo, F., et al. Genome-wide identification of m6A-associated single nucleotide polymorphisms in complex diseases of nervous system. Neurosci Lett. 817, 137513(2023).
  26. Romaschin, A. D., Klein, D. J., Marshall, J. C. Bench-to-bedside review:clinical experience with the endotoxin activity assay. Crit Care. 16 (6), 248(2012).
  27. Zhong, L., et al. METTL3 induces AAA development and progression by modulating N6-methyladenosine-dependent primary miR34a processing. Mol Ther Nucleic Acids. 21, 394-411 (2020).
  28. Justice, J. N., et al. Battery of behavioral tests in mice that models age-associated changes in human motor function. Age (Dordr). 36 (2), 583-592 (2014).
  29. Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the Open Field Maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. J Vis Exp. (96), e52434(2015).
  30. Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785(2014).
  31. Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T., He, C. Dynamic RNA modifications in gene expression regulation. Cell. 169 (7), 1187-1200 (2017).
  32. Song, M. -Y., Lee, D. -Y., Chun, K. -S., Kim, E. -H. The role of NRF2/KEAP1 signaling pathway in cancer metabolism. Int J Mol Sci. 22 (9), 4376(2021).
  33. He, F., Ru, X., Wen, T. NRF2, a transcription factor for stress response and beyond. Int J Mol Sci. 21 (13), 4777(2020).
  34. Schöller, E., et al. Interactions, localization, and phosphorylation of the m6A generating METTL3-METTL14-WTAP complex. RNA. 24 (4), 499-512 (2018).
  35. Li, G., et al. METTL3 plays a crucial function in multiple biological processes. Acta Histochem. 124 (6), 151916(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

NLRP3 PiroptozuMikroglial İnflamasyonm6A ModifikasyonuMeRIP-qPCRMPTP Fare ModeliWestern Blotİmmünohistokimya
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.