Mettl3/Nrf2 Ekseni, Serotonin Nöronlarında NLRP3 ile İndüklenen Piroptozu İnhibe Ederek Parkinson Hastalığının İlerlemesini Baskılar

Parkinson hastalığı (PH), yaşlılar arasında en sık görülen ikinci nörodejeneratif bozukluktur ve 65 yaş ve üzeri bireylerin yaklaşık %2-3'ünü etkilemektedir ve bu durum hem aileler hem de toplum üzerinde önemli bir yük oluşturmaktadır¹. PH'nin arkasındaki kesin mekanizmalar kısmen anlaşılmış olsa da, biriken kanıtlar, yaşlanan beyinlerde ve PD ^2,3,4,5 dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda görülen ortak bir özellik olan mikroglial hücreler tarafından yönlendirilen nöroinflamasyon ile birlikte PD gelişimi ile nöronal iletimdeki zorluklar arasında bir bağlantı olduğunu göstermektedir. Mikroglia, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olarak görev yapar ve beyin homeostazını sürdürmek için hayati önem taşır⁶. Bununla birlikte, bu mikrogliaların kalıcı aşırı aktivasyonu, kronik nöroinflamatuar yanıtları tetikleyebilir ve sonuçta nörodejeneratif hastalığın ilerlemesine katkıda bulunabilir.

Hem merkezi hem de periferik inflamatuar süreçler PD^7,8'in patolojisini önemli ölçüde etkiler. Mikroglial hücrelerin aktivasyonu, nöronal sağkalımı 9 etkileyen inflamatuar yanıtları harekete geçirir^ve ortaya çıkan kanıtlar, ubikuitin ligazları¹⁰ tarafından hazırlandığını vurgular. Çeşitli enflamatuar yollar arasında, NOD-, LRR- ve pirin alanı içeren protein 3 (NLRP3) inflamatuar aktivasyonu, mikroglial inflamatuar düzenlemeye birincil katkıda bulunur¹¹. Aktivasyon, NLRP3 ekspresyonuna ve ardından kaspaz aktivasyonu ve işe alım alanı (CARD) adaptör proteini ve pro-kaspaz-1'den oluşan inflamatuar kompleksin montajına yol açar ve protein bölünmesi ve sitokin salınımı¹² ile sonuçlanır. PD hastalarında ve hastalığın çeşitli hayvan modellerinde nöronal ölümle sonuçlanan yüksek NLRP3 aktivasyonu gözlenmiştir. Özellikle, NLRP3'ün inhibe edilmesi, fare modellerinde PD patolojisine karşı koruyucu etkiler göstermiştir ve NLRP3 inflamatuarının PD başlangıcındaki önemli rolünün altını çizmiştir^13,14.

Serotonin (5-HT) sinyali, kapsamlı genel bakışlarda¹⁷ ayrıntılı olarak açıklandığı gibi CNS patolojisindeki roller de dahil olmak üzere, en az 14 postsinaptik reseptör alt tipi^15,16 ile etkileşimler yoluyla çok sayıda davranışı ve fizyolojik işlevi etkileyen önemli bir nöral düzenleme mekanizmasıdır. 5-HT sisteminin kapsamlı nöromodülatör etkisi, kemirgen beynindeki yaklaşık 26.000 nöron tarafından yönetilir¹⁸. Önemli literatür PD'yi ağırlıklı olarak dopaminerjik nöron kaybı ile ilişkilendirirken, 5-HT nöronları ile PD arasındaki ilişki daha az kapsamlı bir şekilde incelenmiştir.

Ökaryotik hücrelerde en yaygın mRNA modifikasyonu olan N6-metiladenosin (m6A) modifikasyonu, mRNA eklenmesini, stabilitesini ve ihracatını düzenlemenin anahtarıdır ve böylece çeşitli hücresel aktiviteleri etkiler¹⁹. m6A seviyeleri metiltransferazlar ve demetilazlar tarafından modüle edilir. Beyindeki yüksek m6A modifikasyonları,^{Alzheimer modellerinde} 22 değişmiş METTL3 ekspresyonu da dahil olmak üzere, düzensizliğinin nörodejeneratif koşullarla^20,21 yakından bağlantılı olmasıyla nörogelişim ile ilişkilendirilmiştir. Örneğin, Alzheimer hastalarından alınan ölüm sonrası beyin dokularının çözünmeyen fraksiyonunda metiltransferaz benzeri 3'ün (METTL3) birikmesi, çözünmeyen Tau proteini²³ seviyeleri ile pozitif korelasyon göstermiştir. Ayrıca, striatumdaki m6A seviyelerinde önemli bir azalma, dopamin nörotransmitter seviyelerinde önemli bir düşüşe yol açabilir²⁴. Özellikle, on iki m6A ile ilişkili tek nükleotid polimorfizmi, PD duyarlılığı²⁵ ile önemli ilişkiler göstermiştir. Bu protokol, METTL3 aracılı m6A modifikasyonlarının Nrf2/NLRP3 ekseni yoluyla mikroglial piroptozu nasıl düzenlediğini ve sonuçta PD modellerinde serotonin nöronunun hayatta kalmasını nasıl etkilediğini araştırmak için kapsamlı metodolojiler oluşturur. Akut MPTP in vivo modeli ve LPS in vitro modeli, nöroinflamatuar yanıtların güçlü indüksiyonu için seçilmiştir, ancak kronik paradigmalar aşağıda tartışıldığı gibi gelecekteki çalışmaları tamamlayabilir.

Tüm hayvan deneyleri, Feicheng Halk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (onay numarası IACUC-2024-118) onayı altında gerçekleştirildi ve laboratuvar hayvanı araştırmaları için kurumsal yönergelere ve belirlenmiş etik ilkelere sıkı sıkıya bağlı olarak gerçekleştirildi. Çalışma protokolleri, sorumlu hayvan araştırma uygulamaları için hem kurumsal standartlara hem de ARRIVE yönergelerine bağlı kalarak, özellikle acı ve sıkıntıyı en aza indirmeye vurgu yaparak tüm hayvanlara insancıl bakım ve muamele sağladı.

1. Hücre kültürü ve mikroglial aktivasyon modeli

1. BV2 hücresi hazırlama ve bakımı
   1. Dondurulmuş BV2 mikroglial hücre stoklarını 37 °C'lik bir su banyosunda 2 dakika boyunca hızla çözdürün ve termal şoku önlemek için hafif bir girdap sağlayın.
   2. Kriyoprotektan çıkarmak için çözülmüş hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
   3. Süpernatanı atın ve hücre peletini %10 FBS, %1 penisilin-streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş 10 mL tam yüksek glikozlu DMEM ortamında yeniden süspanse edin.
   4. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak hücre canlılığı değerlendirmesi yapın (10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL %0,4 tripan mavisi ile karıştırın, hemositometre kullanarak sayın), devam etmeden önce %>95 canlılık sağlayın.
   5. T75 kültür şişelerindeki plaka hücreleri, şişe başına 1 × 10⁶ hücre yoğunluğunda ve %5 CO₂ ile 37°C'de nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe muhafaza edilir.
   6. Standart tripsinizasyon prosedürleri kullanılarak %80-85 birleşmeye ulaşıldığında her 48 saatte bir geçiş hücreleri.
      NOT: Tekrarlanabilir inflamatuar yanıtlar sağlamak için tutarlı geçiş sayılarını (pasaj 3-8) koruyun. Tüm hücre kültürü deneyleri, değişkenliği en aza indirmek için koşul başına üç teknik kopya ile bağımsız olarak en az üç kez tekrarlandı.
2. LPS kaynaklı mikroglial aktivasyon
   1. BV2 hücrelerini, tedaviden 24 saat önce 2 mL tam ortamda kuyu başına 2 × 10⁵ hücrede 6 oyuklu plakalarda tohumlayın.
   2. LPS stok çözeltisini steril PBS'de 1 mg/mL'de hazırlayın, 0,22 μm'lik bir filtreden filtreyle sterilize edin ve -20 °C'de tek kullanımlık kısımlarda saklayın.
   3. Her deneyden önce endotoksin konsantrasyonunu doğrulamak için Limulus Amebocyte Lysate (LAL) testini kullanarak LPS aktivitesini doğrulayın²⁶.
   4. Kullanmadan hemen önce LPS stoğunu serumsuz DMEM'de 1 μg/mL'lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
   5. Kültür ortamını kuyucuklardan çıkarın ve hücreleri steril PBS ile iki kez yıkayın.
   6. Tedavi kuyucuklarına 2 mL LPS içeren ortam (1 μg/mL nihai konsantrasyon) ve kontrol kuyucuklarına serumsuz DMEM ekleyin.
   7. Hücreleri 37 °C'de 24 saat boyunca %5_CO2 ile inkübe edin 2 inflamatuar aktivasyon için.
   8. İnflamatuar yanıtı doğrulamak için 100 ng/mL tümör nekroz faktörü (TNF)-α ile tedavi edilen pozitif kontrol kuyularını ve yalnızca araçlı (PBS) negatif kontrol kuyularını dahil edin.
      NOT: Tutarlı biyoaktiviteyi sürdürmek için her deney için taze LPS çözeltisi hazırlayın. İnflamatuar yanıt zayıfsa (örneğin, <2 kat sitokin artışı), reaktif stabilitesini kontrol edin veya inkübasyonu 48 saate uzatın.
3. Mettl3 aşırı ekspresyon ve yıkım
   1. Standart oligonükleotid sentez protokollerini kullanarak Mettl3'ü ve karıştırılmış kontrol dizilerini hedefleyen küçük enterferans yapan RNA (siRNA) dizilerini tasarlayın ve sentezleyin. 19-21 nükleotid uzunluğuna sahip Mettl3 mRNA'nın (GenBank erişimi: NM_019721) kodlama bölgesinden hedef dizileri seçin ve GC içeriğinin %40-60 olmasını ^sağlayın27.
   2. Özgüllüğü doğrulamak ve hedef dışı etkilerden kaçınmak için BLAST analizini kullanarak siRNA dizilerini doğrulayın (hedef olmayan genlerle %<70 homoloji sağlayın).
   3. EcoRI ve XhoI kısıtlama bölgelerini kullanarak pcDNA3.1 vektörüne klonlanmış tam uzunlukta Mettl3 cDNA içeren aşırı ekspresyon vektörlerini hazırlayın.
   4. Katyonik lipid transfeksiyon reaktifi kullanarak hücreleri %70-80 birleşmede transfekte edin:
      1. 2 μL katyonik lipid transfeksiyon reaktifini 50 pmol siRNA veya 2 μg plazmit DNA ile 100 μL Opti-MEM ortamında karıştırın.
      2. Karışımı RT'de 15 dakika inkübe edin.
      3. Transfeksiyon kompleksini hücrelere damla damla ekleyin ve taze tam ortama geçmeden önce 4-6 saat inkübe edin.
   5. Yeterli protein ekspresyonu değişikliklerine izin vermek için LPS tedavisinden önce transfekte edilmiş hücreleri 48 saat inkübe edin.
   6. Devam etmeden önce floresan mikroskobu ile %70 verimliliği >hedefleyen floresan raportör ko-transfeksiyonunu (kuyu başına 100 ng pEGFP-C1) kullanarak transfeksiyon verimliliğini doğrulayın.

2. Hayvan modeli geliştirme ve deney tasarımı

1. Hayvan hazırlama ve randomizasyon
   1. Vital River Laboratuvarı'ndan C57BL/6J fareleri elde edin, 8 haftalık, 19-26 g ağırlığında eşit erkek-dişi oranları sağlayın.
   2. 12:12 saat aydınlık-karanlık döngüsü, kontrollü sıcaklık (22 ± 2°C) ve nem (%50-60) ile belirli patojen içermeyen (SPF) koşullarda ev hayvanları.
   3. Standart yem ve suya ad libitum erişim ile 7 günlük bir iklimlendirme süresine izin verin.
   4. İklimlendirme sırasında temel davranışsal değerlendirmeler yapın: Ön ayak yerleştirme testi (her tarafta 10 deneme), hızlandırıcı rotarod değerlendirmesi (5 dakika boyunca 4-40 rpm) ve açık alan lokomotor aktivite analizi (50 cm × 50 cm × 50 cm'lik bir aparatta 10 dakikalık seanslar) dahil olmak üzere kapsamlı davranışsal değerlendirmeler yapın28,29,30.
   5. Önyargıyı en aza indirmek için bilgisayarlı rastgeleleştirme kullanarak hayvanları deney gruplarına rastgele atayın (n = grup başına 6): sahte, Model, Model+Nrf2-KD, Model+oe-Nrf2.
   6. Davranışsal değerlendirmeler yapan araştırmacıların grup ödevlerinden habersiz olduğu kör bir deneysel tasarım uygulayın.
2. 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) ile indüklenen Parkinson hastalığı modeli
   1. Enjeksiyondan hemen önce 15 mg MPTP hidroklorürü 5 mL steril salin içinde çözerek ve hacmi hayvan ağırlığına göre ayarlayarak steril salin içinde 30 mg/kg MPTP çözeltisi hazırlayın.
      DİKKAT: MPTP oldukça nörotoksiktir. Çift eldiven ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanla kimyasal çeker ocakta tutun.
   2. MPTP'yi 30 mg / kg vücut ağırlığında (enjeksiyon hacmi 10 mL / kg) intraperitoneal enjeksiyon yoluyla üç ardışık gün boyunca her gün aynı saatte (09:00 ± 30 dakika) uygulayın.
   3. Sahte grup hayvanlara aynı enjeksiyon programını izleyerek eşdeğer hacimlerde steril salin enjekte edin.
   4. Standartlaştırılmış puanlama tablolarını kullanarak MPTP uygulama süresi boyunca hayvanları günlük olarak sıkıntı, kilo kaybı (%>15'i son nokta olarak kabul edilir) veya advers reaksiyon belirtileri açısından izleyin.
   5. Nörodejenerasyon gelişimine izin vermek için hayvanları son enjeksiyondan sonra 8 gün boyunca koruyun.
      NOT: Hayvanlar bu dönemde sürekli izleme ile normal şekilde barındırılabilir.
3. Stereotaktik viral enjeksiyon
   1. Polietilenimin (PEI; 1:3 DNA:PEI oranı) kullanarak HEK293T hücrelerinin üçlü transfeksiyonu ile AAV9 viral vektörlerini hazırlayın, transfeksiyondan 72 saat sonra hasat edin, iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjleme (2 saat boyunca 177.000 × g ) kullanarak saflaştırın ve 1 × 10¹² genom kopyası / mL elde etmek için santrifüj filtre cihazları kullanarak konsantre edin.
   2. ITR bölgelerini hedefleyen primerleri kullanarak kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yoluyla viral titreyi doğrulayın ve standart eğri analizi ile titrelerin 1 × 10¹² genom kopyası/mL'ye ulaşmasını sağlayın.
   3. ITR'ye özgü primerlerle SYBR Green bazlı kantitatif PCR kullanarak viral titreyi doğrulayın, bilinen standartların seri seyreltmelerini gerçekleştirin ve standart eğri analizini kullanarak genom kopyalarını hesaplayın. p24 ELISA kullanarak replikasyon yetkin virüs kontaminasyonunun olmadığını doğrulayın.
   4. Fareleri izofluran (%3 indüksiyon, %1.5-2 bakım) ile burun konisinden 0.8-1.0 L/dk oksijen akış hızında uyuşturun, işlem boyunca solunum hızını (60-100 nefes/dak) ve ayak parmağı sıkıştırma refleksini izleyin. Fareyi stereotaktik çerçeveye sabitleyin ve korneanın kurumasını önlemek için oftalmik merhem sürün.
   5. Fareyi stereotaktik çerçeveye sabitleyin ve korneanın kurumasını önlemek için oftalmik merhem sürün.
   6. Steril bir neşter bıçağı kullanarak 1,5 cm'lik bir orta hat kafa derisi kesisi yapın ve 0,1 mm hassasiyetle stereotaktik koordinatları kullanarak bregma dönüm noktasını belirleyin.
   7. Striatum için enjeksiyon koordinatlarını hesaplayın: anterior-posterior -0.5 mm, medial-lateral ±2.0 mm, bregma'dan dorsal-ventral -3.0 mm.
   8. Hedefleme doğruluğunu doğrulamak için floresan izleyici (örneğin, yeşil floresan proteini [GFP]) ile pilot enjeksiyonlar gerçekleştirin ve deneysel enjeksiyonlardan önce immünohistokimya yoluyla mikroglial belirteçlerle (Iba1) %>80 birlikte lokalizasyonu doğrulayın.
   9. Enjeksiyon iğnesini (33-G) 1 mm/dak hızında hedef derinliğe indirin ve otomatik kontrolörlü bir mikro şırınga pompası kullanarak 0,2 μL/dak'da 2 μL viral süspansiyon enjekte edin. Enjeksiyon iğnesini hedef derinliğe indirin ve bir mikro şırınga pompası kullanarak 0.2 μL / dak hızında 2 μL viral süspansiyon enjekte edin.
   10. Geri akışı önlemek için enjeksiyondan sonra 5 dakika boyunca iğne pozisyonunu koruyun.
   11. İğneyi 0,5 mm/dk hızla yavaşça geri çekin, kesi kesi 4-0 ipek dikişle kesintili bir desen kullanarak kapatın ve ısıtılmış bir iyileşme pedi üzerinde anesteziden kurtulmaya izin verin.
   12. Ameliyat sonrası analjezi (3 gün boyunca günde bir kez deri altından 5 mg/kg karprofen) uygulayın ve ayrıntılı gözlem sayfalarıyla iyileşmeyi 24 saat boyunca izleyin.

3. Moleküler biyoloji teknikleri ve validasyonu

1. RNA ekstraksiyonu ve kalite kontrolü
   1. Deneysel son noktalardan hemen sonra hücreleri veya striatal beyin dokusu örneklerini CO₂ inhalasyonu ve ardından servikal çıkık yoluyla hayvanları insanca ötenazi yaparak hasat edin; dokuyu buz üzerinde inceleyin, ince kıyın ve hücreleri topluyorsanız 37 ° C'de 10 dakika boyunca% 0.25 tripsin ile enzimatik olarak ayrıştırın.
   2. Mekanik homojenizasyon (bir dounce homojenizatörde 20-25 vuruş) ve kloroform faz ayrımı (1 mL TRIzol başına 0.2 mL kloroform) ile TRIzol reaktifi (1 10⁶ hücre veya 100 mg doku başına 1 mL) kullanarak toplam RNA'yı çıkarın.
   3. 28S ve 18S ribozomal bantlarını doğrulamak için spektrofotometri (A260/A280 oranı 1.8-2.0) ve jel elektroforezi (%1 agaroz) kullanarak RNA kalitesini değerlendirin.
   4. Bir spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün.
   5. RNA örneklerini -80 °C'de nükleaz içermeyen suda -80 °C'de RNaz inhibitörü (40 birim/μL) ilavesiyle analize kadar saklayın.
2. Nükleer-sitoplazmik fraksiyonlama
   1. Hücreleri toplayın (minimum 2 × 10⁶ ) ve buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın (yıkama başına 5 mL, 300 × g'da 5 dakika santrifüjleme).
   2. Aşağıdaki protokole sahip ticari bir hücre fraksiyonlama kiti kullanın.
      1. Hücre peletini proteaz inhibitörleri ile 200 μL sitoplazmik ekstraksiyon tamponunda yeniden süspanse edin.
      2. Her 3 dakikada bir vorteksleme ile 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
      3. 4 °C'de 5 dakika boyunca 16.000 × g'da santrifüjleyin ve süpernatan (sitoplazmik fraksiyon) toplayın.
      4. Peleti sitoplazmik ekstraksiyon tamponu ile iki kez yıkayın.
      5. Peleti 100 μL nükleer ekstraksiyon tamponunda yeniden süspanse edin.
      6. Her 10 dakikada bir vorteksleme ile 40 dakika buz üzerinde inkübe edin.
      7. 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı (nükleer fraksiyon) toplayın
   3. Western blot kullanarak nükleer belirteç (U6) ve sitoplazmik belirteç (GAPDH) dağılımını analiz ederek fraksiyonasyon verimliliğini doğrulayın.
   4. RNA'yı nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlardan ayrı ayrı çıkarın.
   5. Fraksiyona özgü referans genlerle RT-qPCR kullanarak her fraksiyondaki Nrf2 mRNA seviyelerini analiz edin.
3. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (RT-qPCR)
   1. Rastgele primerlere sahip bir ters transkripsiyon reaktif kiti kullanarak 1 μg toplam RNA'dan cDNA sentezleyin.
   2. Gerçek zamanlı bir PCR sisteminde gene özgü primerler içeren Premix Ex Taq II kitini kullanarak qPCR gerçekleştirin.
   3. Erime eğrisi analizini kullanarak primer özgüllüğünü doğrulayın ve jel elektroforezi ile tek bir amplikonu doğrulayın.
   4. Aşağıdaki termal döngü koşullarını kullanın: 95 °C'de 10 dakika boyunca ilk denatürasyon, ardından 15 saniye boyunca 95 °C'lik 40 döngü, 30 saniye boyunca 60 °C ve 30 saniye boyunca 72 °C.
   5. Dahili referans olarak ^{β-aktin ile 2-ΔΔCt} yöntemini kullanarak bağıl mRNA ekspresyon seviyelerini hesaplayın.
   6. Şablonsuz kontrolleri dahil edin ve geNorm analizini kullanarak deneysel koşullar arasında referans gen stabilitesini doğrulayın (stabilite değeri M < 0.5).
      NOT: Tekrarlanabilirlik puanları: üç bağımsız çalışmada tahlil içi varyasyon katsayısı (CV) <%10.
4. m6A modifikasyon analizi için MeRIP-qPCR
   1. Toplam RNA'yı (minimum 20 μg) ekstrakte edin ve RNA parçalanma reaktifi (10 mM ZnCl₂, 10 mM Tris-HCl, pH 7.0) kullanarak 5 dakika boyunca 70 °C'de 100-200 nükleotidi parçalayın.
   2. İmmünopresipitasyon tamponunda (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 750 mM NaCl, %0.5 NP-40) rotasyon (10 rpm) ile gece boyunca 4 °C'de m6A'ya özgü antikor (20 μg RNA başına 2 μg) kullanarak immünopresipitasyon gerçekleştirin.
   3. Bilinen m6A ile modifiye edilmiş ve modifiye edilmemiş RNA kontrollerini kullanarak antikor özgüllüğünü doğrulayın.
   4. İmmün çökeltilmiş kompleksleri yıkama tamponu ile beş kez yıkayın.
   5. Bağlı RNA'yı ayrıştırın ve rastgele primerler kullanarak ters kopyalayın.
   6. Rastgele primerler kullanarak ayrıştırılan RNA'yı ters kopyalar ve potansiyel m6A bölgelerini kapsayan Nrf2'ye özgü primerleri kullanarak qPCR analizi gerçekleştirir.
   7. Nrf2'ye özgü primerleri kullanarak qPCR analizi yapın ve giriş RNA'sına göre zenginleştirmeyi hesaplayın.
      NOT: Algılama tutarsızsa, tekrarlanabilirliği artırmak için parçalanma süresini (4-6 dakika) optimize edin; kantitatif kıyaslama: IgG kontrollerine kıyasla sinyal-gürültü oranı >15:1.

4. Protein analizi ve validasyonu

1. Protein ekstraksiyonu ve miktar tayini
   1. Proteaz inhibitörleri (1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF), 1 μg/mL leupeptin, 1 μg/mL pepstatin A) ve fosfataz inhibitörleri (1 mM sodyum ortovanadat, 5 mM sodyum florür) içeren 200 μL radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponunda lyse hücreleri (1 ×¹⁰ 6 hücre) veya doku örneklerini (1 mg striatal doku) homojenize edin.
   2. Lizatları buz üzerinde 30 dakika boyunca periyodik vorteksleme ile inkübe edin (10 saniye boyunca her 10 dakikada bir).
   3. Hücresel kalıntıları gidermek ve süpernatan toplamak için 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüjleyin.
   4. Sığır serum albümin standartları (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 μg/mL) ile bisinkoninik asit (BCA) tahlilini kullanarak protein konsantrasyonunu üçlü ölçümlerde ölçün.
   5. Western blot kullanarak tüm numunelerde temizlik protein seviyelerini (GAPDH, beklenen MW: 36 kDa) analiz ederek protein bütünlüğünü doğrulayın.
2. Western blot analizi
   1. Protein numunelerini sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yükleme tamponunda eşit yükleme (30-50 μg) ile hazırlayın (nihai konsantrasyonlar: 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, %2 SDS, %10 gliserol, %5 β-merkaptoetanol, %0.003 bromofenol mavisi) ve 95 °C'de 5 dakika denatüre edin.
   2. Tris-glisin-SDS tamponunda 30 dakika boyunca 80 V'ta ve ardından 90 dakika boyunca 120 V'ta çalışan %10 poliakrilamid jeller kullanarak SDS-PAGE ile proteinleri ayırın.
   3. Transfer tamponunda (25 mM Tris, 192 mM glisin, %20 metanol) yarı kuru bir transfer sistemi (90 dakika boyunca 400 mA) kullanarak proteinleri poliviniliden florür (PVDF) membranlarına aktarın.
   4. Antikor inkübasyonuna geçmeden önce tersinir protein boyama (Ponceau S: 5 dakika boyunca %5 asetik asit içinde %0,1) kullanarak transfer verimliliğini doğrulayın.
   5. Membranları TBST'de (TBS +% 0.1 Tween-20) %5 yağsız sütle RT'de 1 saat boyunca hafif çalkalama ile bloke edin.
   6. Bloke edici tamponda 1:1000 oranında seyreltilmiş birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de hafif çalkalama ile inkübe edin.
   7. Membranları TBST ile üç kez yıkayın (her biri 10 dakika) ve RT'de 1 saat boyunca HRP konjuge ikincil antikorlarla (1:5000 seyreltme) inkübe edin.
   8. Gelişmiş kemilüminesans kullanarak protein bantlarını tespit edin ve dansitometri kullanarak ölçün.
   9. Hedef protein ekspresyonunu yükleme kontrolüne (GAPDH) normalleştirin ve uygun kontrolleri (birincil antikorlar için peptit blokajı, yalnızca ikincil kontroller) kullanarak antikor özgüllüğünü doğrulayın.

5. Davranışsal değerlendirme ve fonksiyonel analiz

1. Ön ayak yerleştirme testi
   1. Değerlendirmeden önce farenin 30 dakika boyunca test ortamına (sessiz oda, 22 °C, loş ışık) alışmasını bekleyin.
   2. Fareyi sırt derisinden nazikçe kavrayın, dört uzvunu da masa kenarından yaklaşık 0,5 cm yukarıya asın ve farenin masa yüzeyini görememesini sağlayın.
   3. Yerleştirme refleksini tetiklemek ve 2 saniye içinde başarılı ön ayak yerleşimini kaydetmek için her iki taraftaki vibrissaları masa kenarına doğru fırçalayın.
   4. Denemeler arasında 30 saniyelik aralıklarla, sol ve sağ tarafları değiştirerek her iki tarafta 10 deneme yapın.
   5. Sirkadiyen etkileri en aza indirmek için testleri tutarlı aydınlatma koşullarında (50-100 lüks) ve günün saatinde (13:00-17:00) gerçekleştirin.
   6. Başarı oranını başarılı yerleştirmelerin yüzdesi olarak hesaplayın: (başarılı yerleştirmeler/toplam deneme sayısı) × 100.
2. Rotarod testinin hızlandırılması
   1. Rotarod aparatını, 5 dakikalık bir süre boyunca 40 rpm'ye doğrusal ivme ile 4 rpm'lik bir başlangıç hızına ayarlayın.
   2. Öğrenme etkilerini en aza indirmek için test etmeden önce fareleri art arda 3 gün (günde 3 deneme, 15 dakikalık aralıklarla) rotarod üzerinde eğitin.
   3. RT (22 ± 2 °C), aydınlatma (100 lüks) ve arka plan gürültü seviyeleri (<50 dB) dahil olmak üzere test koşullarını standartlaştırın.
   4. Fareyi öne bakacak şekilde dönen çubuğun üzerine yerleştirin ve hızlanma protokolünü hemen başlatın.
   5. Her deneme için düşme gecikmesini (başlangıçtan farenin düşmesine veya 5 dakikalık denemeyi tamamlamasına kadar geçen süre) kaydedin ve 15 dakikalık dinlenme aralıklarıyla hayvan başına 5 kez test edin.
   6. Motivasyon faktörlerinden kaynaklanan değişkenliği en aza indirmek için en uzun üç denemeden ortalama gecikmeyi hesaplayın.
3. Açık alan testi
   1. Arenanın 1 m yukarısına yerleştirilmiş bir video takip sistemi ile açık alan aparatı (50 cm × 50 cm × 50 cm şeffaf akrilik kutu) kullanın.
   2. Koku ipuçlarını ortadan kaldırmak için aparatı hayvanlar arasında %70 etanol ile temizleyin (sprey ve silin, 5 dakika havayla kurutun).
   3. Fareyi cihazın ortasına yerleştirin ve 30 fps'de video çekimi ile tutarlı aydınlatma (200 lüks) altında 10 dakika boyunca aktiviteyi kaydedin.
   4. Otomatik izleme yazılımını kullanarak birden fazla parametreyi analiz edin:
      Kat edilen toplam mesafe (cm)
      Merkez bölge süresi (duvarlardan 10 cm olarak tanımlanır, s cinsinden rapor edilir)
      Hareket hızı (cm/s)
      Çevre ve merkez bölgelerde geçirilen süre
4. Merkezi bölgeyi duvarlardan 10 cm olarak tanımlayın ve merkezde harcanan zamanı ve kat edilen mesafeyi çevre bölgelere göre ölçün.

6. Gelişmiş mikroskopi ve görüntüleme

1. ROS tespiti için DHE boyama
   1. Kullanmadan hemen önce PBS'de 10 μM'de taze dihidroetidyum (DHE) çözeltisi hazırlayın (ışıktan koruyun).
   2. Serotonin nöronlarını spesifik olarak tanımlamak için DHE'yi triptofan hidroksilaz 2 (TPH2) antikoru (1:500 seyreltme) ile birleştirerek ko-immünofloresan boyama gerçekleştirin.
      NOT: Bu çift etiketleme yaklaşımı, DHE'nin süperoksit ile oksidasyon üzerine, menşe hücre içinde lokalize kalan membran geçirimsiz floresan ürünler oluşturduğu ilkesine dayanarak, TPH2-pozitif nöronal hücre gövdeleri içindeki ROS üretiminin çevredeki glial hücrelerdeki oksidatif stresten ayırt edilmesini sağlar.
   3. Doku kesitlerini (20 μm kalınlığında) nemlendirilmiş bir odada karanlık koşullarda 37 °C'de 30 dakika DHE çözeltisi ile inkübe edin.
   4. ROS tespit özgüllüğünü doğrulamak için negatif kontrolleri (DHE yok) ve pozitif kontrolleri (30 dakika boyunca 100 μM_H2O2 tedavisi) dahil edin.
   5. Bölümleri PBS ile üç kez yıkayın ve solmayı önleyen montaj ortamıyla monte edin.
   6. Numuneler arasında tutarlı pozlama ayarlarıyla (200 ms) floresan mikroskobu (DHE: 518 nm uyarma/605 nm emisyon, TPH2: 488 nm uyarma/525 nm emisyon) kullanılarak görüntü; Görüntüleme sistemleri, standart floresan boncuklar kullanılarak haftalık olarak kalibre edildi (sinyal-gürültü oranı > 20:1).
   7. TPH2 pozitif hücrelerdeki floresan yoğunluğunu yalnızca standartlaştırılmış analiz protokollerine sahip ImageJ yazılımını kullanarak ölçün (eşik: 50-255, parçacık boyutu: 10-∞ piksel²). Bitişik mikroglia, astrositler veya diğer hücre tiplerinden gelen sinyalleri hariç tutarken, özellikle serotonerjik nöronlar içindeki oksidatif stresin ölçülmesini sağlamak için TPH2 immünoreaktivitesine dayalı ROI sınırları oluşturun. Her hayvan için, birden fazla doku kesitinde en az 50 TPH2-pozitif nöronu analiz edin.
2. İmmünohistokimya
   1. Doku kesitlerini PBS'de% 4 paraformaldehit içinde 24 saat boyunca 4 ° C'de hafif çalkalama ile sabitleyin.
   2. Dereceli bir etanol serisinden (%70, %80, %90, %95, %100 × her biri 2, 1 saat) dehidre edin ve otomatik bir işlemci kullanarak parafine gömün.
   3. Bir mikrotom kullanarak 5 μm'lik kesitler kesin ve slayt başına 3-4 kesit sağlayacak şekilde şarjlı cam slaytlara monte edin.
   4. Ksilen (2 × 10 dakika) kullanarak kesitleri deparafinize edin ve dereceli etanol yoluyla suya rehidre edin.
   5. Bir mikrodalgada (2 dakikalık soğutma aralıklarıyla 10 dakika boyunca 750 W) sitrat tamponu (10 mM sodyum sitrat, pH 6.0) kullanarak antijen alımını gerçekleştirin.
   6. Uygun negatif kontrolleri (birincil antikor yok) ve pozitif kontrol dokularını (hedef proteinleri eksprese ettiği bilinen beyin bölümleri) kullanarak antikor özgüllüğünü doğrulayın.
   7. RT'de 10 dakika boyunca metanol içinde% 3 hidrojen peroksit ile endojen peroksidaz aktivitesini bloke edin.
   8. Birincil antikorları gece boyunca nemlendirilmiş bir odada 4 °C'de uygulayın.
   9. HRP konjuge ikincil antikorlar (1:500 seyreltme, RT'de 1 saat) ve DAB kromojeni (kahverengi renk gelişene kadar, tipik olarak 2-5 dakika inkübe edin) kullanarak tespit edin.
   10. Hematoksilen (30 s) ile karşı boyayın, kurutun, temizleyin ve kalıcı montaj ortamıyla monte edin.
   11. Sistematik rastgele örnekleme ile stereolojik yöntemler kullanarak pozitif hücreleri ölçün (her 5. bölümde, bölüm başına 3 sayma çerçevesi, ×40 büyütme).

7. İstatistiksel analiz ve veri doğrulama

1. İstatistiksel tasarım ve analiz
   1. G*Power 3.1.9.7 yazılımını kullanarak biyolojik olarak anlamlı farklılıkları (etki büyüklüğü ≥ 0,8, güç ≥ 0,80, α = 0,05) tespit etmek için yeterli örneklem boyutlarını belirlemek üzere güç analizi yapın.
   2. Shapiro-Wilk testini kullanarak veri normalliğini doğrulayın ve parametrik analizden önce Levene testini kullanarak varyansın homojenliğini değerlendirin.
   3. Deneysel tasarım ve veri dağılımına dayalı uygun istatistiksel testlerle istatistiksel bir yazılım kullanarak verileri analiz edin.
   4. Tek faktörlü karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve faktöriyel tasarımlar için iki yönlü ANOVA (örneğin, tedavi × zaman etkileşimleri) uygulayın.
   5. ANOVA anlamlılık gösterdiğinde (p < 0.05) çoklu karşılaştırmalar için Tukey'in post hoc testini kullanın ve uygun olduğunda Bonferroni düzeltmesi uygulayın.
   6. İstatistiksel anlamlılık eşiğini tüm analizler için p < 0,05 olarak ayarlayın ve p < 0,01 ve p < 0,001 için ek gösterim yapın.
   7. Kapsamlı bir istatistiksel yorum sağlamak için etki büyüklüklerini (Cohen's d veya η²) ve %95 güven aralıklarını p değerlerinin yanı sıra rapor edin.
   8. Verileri, n ≤ 10 olduğunda gösterilen bireysel veri noktaları ile en az üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SEM olarak sunun.
      NOT: Tüm hücre kültürü deneyleri, her deney uygun kontroller ve çoklu teknik kopyalar içerecek şekilde bağımsız olarak en az üç kez tekrarlanmalıdır ve gözlemlenen değişkenlik (örneğin, CV

Protokol, kontrol gruplarına kıyasla hem mRNA hem de protein seviyesindeki azalmalarla kanıtlandığı gibi, LPS ile tedavi edilen mikroglial hücrelerde Mettl3 ekspresyonunun azaldığını başarıyla göstermektedir (Şekil 1) (Şekil 1B,C). ELISA analizi, kültür süpernatantlarında yüksek IL-6 ve TNF-α seviyeleri yoluyla başarılı LPS aracılı inflamatuar aktivasyonu doğrulamaktadır (Şekil 1A).

MeRIP-qPCR analizi, Mettl3 aşırı ekspresyonunun, m6A modifikasyonlarının belirli hücresel bağlamlar altında translasyon verimliliğini artırabileceğine dair ortaya çıkan kanıtlarla tutarlı olarak, bozulmayı teşvik etmek yerine paradoksal olarak protein stabilitesini ve ekspresyonunu artıran Nrf2 mRNA m6A metilasyonunu arttırdığını ortaya koymaktadır (Şekil 2A,B). Nükleer-sitoplazmik fraksiyonasyon deneyleri, Nrf2 mRNA dağılımının hücresel bölmeler arasında değişmeden kaldığını, protein seviyelerinin Mettl3 ekspresyon durumu tarafından önemli ölçüde modüle edildiğini göstermektedir (Şekil 2C,D).

MPTP ile indüklenen PD modellerini kullanan in vivo deneyler, davranışsal eksikliklerin Mettl3/Nrf2 eksenindeki moleküler değişikliklerle ilişkili olduğunu göstermektedir. Tüm doku örnekleri striatal bölgeden alındı (koordinatlar: bregma'dan +0,5 ila -0,5 mm, ±1,5 ila ±2,5 mm lateral, -2,5 ila -3,5 mm ventral). Model grubundaki fareler, sahte kontrollere kıyasla daha düşük ön ayak yerleştirme doğruluğu, daha düşük rotarod performansı ve daha az açık alan aktivitesi sergiler (Şekil 3A). Nrf2 yıkımı bu eksiklikleri şiddetlendirirken, Nrf2 aşırı ekspresyonu kısmi koruma sağlar. İmmünohistokimyasal analiz, PD modellerinin striatal bölgelerinde azalmış mikroglial popülasyonları (Iba1-pozitif hücreler) ortaya koymaktadır ve Nrf2 modülasyonu buna göre mikroglial sağkalımı etkilemektedir (Şekil 3B).

Proinflamatuar sitokin seviyeleri (IL-1β, IL-18, TNF-α) beklendiği gibi hastalık modellerinde önemli ölçüde artar, Model grubu Sham kontrollerine kıyasla yüksek seviyeler gösterir ve Nrf2 aşırı ekspresyonu anti-inflamatuar etkiler sağlar (Şekil 3C). Moleküler analiz, MPTP ile tedavi edilen hayvanlarda GSDMD-N, bölünmüş kaspaz-1 ve NLRP3 dahil olmak üzere yüksek piroptoz belirteçlerini gösterir ve düzeltilmiş Western blot sonuçları uygun moleküler ağırlık belirteçlerini gösterir (Şekil 3D). Taramalı elektron mikroskobu, hastalıklı hayvanlarda artan piroptotik cisim oluşumunu doğrular ve Nrf2 modülasyonu piroptotik hücre ölümünün derecesini etkiler (Şekil 3E).

TPH2 immünofloresan ile birlikte DHE boyaması, özellikle PD modellerinin serotonin nöronlarında yüksek ROS seviyelerini ortaya çıkarır (Şekil 4A). DHE oksidasyon ürünlerinin TPH2 pozitif hücre gövdeleri içinde birlikte lokalizasyonu, bu nöronlarda, inflamatuar sitokin kaynaklı mitokondriyal disfonksiyon ve bozulmuş antioksidan savunma ile tutarlı olarak endojen süperoksit oluşumunu gösterir. DHE sinyalinin uzamsal dağılımı, hücre tipine özgü oksidatif stresi destekleyen, yaygın doku oksidasyonundan ziyade nöronal morfolojiyle eşleşir. İmmünohistokimya, Model ve Model+Nrf2-KD gruplarında serotonin nöron belirteçleri TPH2 ve SLC6A4'ün ekspresyonunun azaldığını ve Model+oe-Nrf2 grubunda koruyucu etkilerin gözlendiğini göstermektedir (Şekil 4B). Bu bulgular mikroglial piroptozun oksidatif strese ve ardından serotonin nöron hasarına yol açtığını göstermektedir.

Genel mekanik yol, Nrf2'nin Mettl3 aracılı m6A modifikasyonunun mikroglial piroptozu nasıl baskıladığını ve serotonin nöronlarını nasıl koruduğunu gösteren Şekil 5'te özetlenmiştir.

Başarılı deneyler tipik olarak Mettl3/Nrf2 ekspresyon seviyeleri ile aşağı akış inflamatuar belirteçleri arasında net doz-yanıt ilişkileri gösterir. Eksik viral transdüksiyon, yetersiz LPS aktivasyonu veya doku işleme sırasındaki teknik sorunlar nedeniyle optimal olmayan sonuçlar ortaya çıkabilir. Kontrol deneyleri, immünohistokimyasal analizlerde sürekli olarak uygun antikor özgüllüğünü ve spesifik olmayan bağlanmanın olmadığını göstermektedir. Striatumdaki viral enfeksiyon etkinliği, Iba1 ve NeuN belirteçleri ile birlikte lokalizasyon yoluyla doğrulandı ve baskın mikroglial hedefleme doğrulandı.

Şekil 1: LPS ile indüklenen mikroglial hücrelerde Mettl3'ün yetersiz ekspresyonu. (A) LPS ile tedavi edilen mikroglial hücrelerde IL-6 ve TNF-α seviyelerinin ELISA ölçümü. (B) LPS ile tedavi edilen mikroglial hücrelerde Mettl3 mRNA seviyelerinin RT-qPCR ölçümü. (C) 64 kDa'da Mettl3 ve 36 kDa'da GAPDH gösteren LPS ile tedavi edilen mikroglial hücrelerde Mettl3 protein seviyelerinin Western blot ölçümü. **Veriler, grup başına ortalama ± SEM'i temsil eder, n = 6'dır. *p < 0.05, p < 0.01'e karşı Kontrol grubu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Mettl3, LPS ile indüklenen mikroglial hücrelerde m6A modifikasyonu yoluyla Nrf2 translasyonunu etkiler. (A) oe-NC ve oe-Mettl3 gruplarında Nrf2 mRNA seviyelerinin RT-qPCR ölçümü. (B) oe-NC ve oe-Mettl3 gruplarında Nrf2 metilasyon seviyelerinin MeRIP-qPCR ölçümü. (C) Deney gruplarının çekirdeğinde ve sitoplazmasında Nrf2 mRNA seviyelerinin RT-qPCR ölçümü. (D) 110 kDa'da Nrf2 ve 36 kDa'da GAPDH gösteren deney gruplarında Nrf2 protein seviyelerinin Western blot ölçümü. **Veriler, grup başına ortalama ± SEM'i temsil eder, n = 6'dır. *p < 0.05, p < 0.01'e karşı Kontrol grubu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: NLRP3 inflamatuarı yoluyla mikroglial piroptozu tetikleyen Mettl3/Nrf2 ekseninin in vivo gösterimi. (A) Ön ayak yerleşimi, rotarod ve açık alan testlerini içeren davranışsal değerlendirmeler. (B) Beyin dokusunda Iba protein ekspresyonunun immünohistokimyasal tespiti (ölçek çubuğu = 50 μm). (C) Beyin dokusundaki inflamatuar sitokinlerin ELISA tespiti, Model gruplarında Nrf2 aşırı ekspresyonu üzerine azalma ile beklenen yükselmeyi gösterir. (D) Moleküler ağırlık açıklamaları ile piroptoz belirteçlerinin Western blot tespiti: 110 kDa'da NLRP3, 22 kDa'da bölünmüş-Kaspaz-1, 31 kDa'da GSDMD-N ve 36 kDa'da GAPDH. (E) Piroptotik cisimlerin taramalı elektron mikroskobu tespiti (karakteristik 1-5 μm membrana bağlı vezikülleri gösteren beyaz oklarla gösterilir). Bölüm başına 5 alana dayalı niceleme, n = 6 hayvan/grup. **Veriler, grup başına ortalama ± SEM'i temsil eder, n = 6'dır. *p < 0.05, p < 0.01 vs. Sham grubu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Mikroglial piroptoz, mitokondriyal hasara neden olur ve 5-HT nöron apoptozunu destekler. (A) Özellikle 5-HT nöronlarında ROS tespiti için TPH2 immünofloresan ile birleştirilmiş DHE boyaması (ölçek çubuğu = 50 μm). Ortak lokalizasyon yaklaşımı, TPH2 pozitif nöronal hücre gövdeleri içindeki oksidatif stresin çevredeki glial hücrelerden ayırt edilmesini sağlar. (B) 5-HT nöronlarında TPH2 ve SLC6A4 protein ekspresyonunun immünohistokimyasal tespiti (ölçek çubuğu = 50 μm). **Veriler, grup başına ortalama ± SEM'i temsil eder, n = 6'dır. *p < 0.05, p < 0.01 vs. Sham grubu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Nrf2'nin m6A modifikasyonu ve 5-HT nöronal ölümünün inhibisyonu yoluyla Parkinson hastalığının ilerlemesinin Mettl3 aracılı baskılanmasının şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar, bu çalışmayla ilgili herhangi bir rakip mali çıkar veya çıkar çatışması beyan etmemektedir. Hiçbir yazarın bu makalede ürünlerinden bahsi geçen firmalarla herhangi bir mali ilişkisi yoktur.