Yöntem makalesi

Yaşlanma Çalışmaları için Fare Modellerinden Çok Organlı Koleksiyon

DOI:

10.3791/69128

⸱

12 Aralık 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, genç ve yaşlı farelerde organ toplama için standartlaştırılmış bir yöntem sunarak birden fazla dokuda yaşa bağlı anatomik ve histolojik değişiklikleri değerlendirerek hem etik hem de maliyet verimli deneysel tasarımı destekler.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaşlanma, neredeyse tüm organ ve dokuları aşamalı olarak etkileyen sistematik ve çok faktörlü bir biyolojik süreçtir; yapısal, hücresel ve moleküler değişikliklere yol açar. Bu protokol, farelerde yaşa bağlı anatomik ve morfolojik değişikliklerin değerlendirilmesi, kapsamlı organ toplama yoluyla daha sonraki histolojik ve moleküler analizler için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunmaktadır. Genç (2-3 aylık) ve yaşlı (20-24 aylık) fareler kullanılarak, büyük anatomik diseksiyon ve ana organların sistematik olarak toplanması için adım adım prosedürleri detaylandırıyoruz; bunlar aşağı akış kesitleri, histolojik boyama ve mikroskobik değerlendirme için gerçekleştiriliyor. Protokol, tek bir hayvandan beyin, gözler, yemek borusu, timus, kalp, aorta, akciğerler, lenf düğümleri, karaciğer, pankreas, mide, ince bağırsak, kolon, dalak, böbrek, mesane, deri, iskelet kas, kemik ve yağ dokusu dahil olmak üzere geniş bir organ ve doku yelpazesinin toplanmasını sağlar. Her konu başına veri verimini en üst düzeye çıkararak, bu iş akışı etik hayvan kullanımını azaltarak destekler, çalışmalar arasında tekrarlanabilirliği artırır ve organizma yaşlanmasının bütünleşik analizlerini kolaylaştırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaşlanma, neredeyse tüm organları etkileyen sistemik bir süreçtir, ancak çoğu deneysel çalışma tek bir dokuya odaklanır ve yaşa bağlı değişikliklerin vücutta nasıl birlikte gerçekleştiğine veya etkileşime girdiğine dair içgörüleri sınırlar. Yaşlanma, bağışıklık fonksiyonu, metabolik değişimler, rejeneratif kapasite kaybı ve yapısal dejenerasyon gibi dokuya özgü ve sistemikdeğişikliklerle kendini gösterir 1,2. Organ spesifik araştırmalar değerli bilgiler sağlamış olsa da, sistemler arasında hücresel yaşlanmanın tüm organizma gerilemesine nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için daha geniş bir bakış açısına ihtiyaç vardır. Fareler gibi preklinik in vivo modellerde çok organlı analiz, yaşa bağlı hastalıklara ve fizyolojik dayanıklılık kaybına katkıda bulunan koordineli yapısal, hücresel ve moleküler değişiklikleri belirlemek içingereklidir 3,4.

Laboratuvar faresi, genetik olarak yönetilebilirliği, kısa ömrü, korunmuş yaşlanma yolları ve bağışıklık işlevsizliği, doku fibrozizi, metabolik gerileme ve artan neoplazi gibi insan yaşlanmasının temel özelliklerini yeniden yansıtabilme yeteneği nedeniyle yaşlanma araştırmaları için vazgeçilmez ve köklü bir preklinik modelolmaya devam etmektedir 5,6,7. Ancak, verimli ve standartlaştırılmış çok organlı diseksiyon protokolleri yaygın olarak kullanılmamaktadır. Bu tür protokoller, histolojik karşılaştırmaları optimize etmek, hayvan kullanımını azaltmak ve aynı konudan dokular arasında omik veri setlerini entegreetmek için gereklidir 8,9.

Burada, farelerde çoklu organ perfüzyon, diseksiyon ve koruma için tekrarlanabilir, zaman verimli bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, genç (2-3 aylık) ve yaşlı (20-24 aylık) farelerden beyin, gözler, timus, kalp, akciğerler, aorta, inguinal lenf düğümleri, gastrointestinal yol (yemek borusu, mide, ince bağırsak, kolon), karaciğer, pankreas, dalak, böbrek, mesane, yağ dokusu, iskelet kası, kemik ve cilt dahil olmak üzere ana organların anatomik diseksiyonu ve toplanması için adım adım bir rehber sunar. Histolojik, moleküler ve kriyoseksiyon iş akışlarıyla uyumlu doku koruma için ayrıntılı talimatlar da dahil edilmiştir. Bu standartlaştırılmış yaklaşım, araştırmacıların aynı deneysel deneklerde organ-spesifik ve sistemik yaşlanma belirtilerini değerlendirmelerini sağlar ve entegre, yüksek kaliteli yaşlanmaaraştırmalarını destekler 4,10,11,12.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C57BL/6J fareleri California Üniversitesi, San Francisco'da tutuldu. Tüm hayvan prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvan Kaynak Merkezi tarafından denetlenmiştir. Fareler, kafeste beşten az yetişkin fareyle 12 saatlik ışık-karanlık döngüsünde tutuldu. Ötenazi, Amerikan Veterinerler Tıp Birliği (AVMA) Hayvanların ÖtenaziYönergeleri 13'e uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokol için, genç fareler 3 aylıkken, yaşlandırılan fareler ise 22 aylıkken feda edildi. Diseksiyon ve organ toplama işlemlerine geçmeden önce, hazırlık kontrol listesini (Tablo 1) ve doku toplama kontrol listesini (Tablo 2) bastırın ve tamamlayın. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Servikal dislokasyon

NOT: Servikal dislokasyon, servikal yapılara aşırı travmayı en aza indirmek için eğitimli bir kişi tarafından yapılmalıdır.

  1. Fareyi bir elinizle kuyruğun tabanını sıkıca tutarak tutun.
  2. Karşı elin başparmağı ve işaret parmağını kafatasının tabanına yerleştirin.
  3. Rahim omurlarını çıkarmak için sert ve hızlı basınç uygulayın. Boynu palpasyon ederek kafatası ile bitişik omurlar arasındaki ayrımı doğrulayın.
  4. Başarılı ötanaziyi (kurumsal onaylı protokollere uygun olarak) solunum durdurulmasını ve zararlı uyarılara yanıt vermemesini garanti ederek doğrulamak.
  5. Perfüzyon ve doku toplama öncesinde farenin vücut ağırlığını kaydedin.

2. Torakotomi ve perfüzyon

NOT: Perfüzyon isteğe bağlıdır. Paraformaldehit (PFA) ile ilgili tüm işlemleri, uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) takarak sertifikalı kimyasal bir duman davlumanında gerçekleştirin; bunlar arasında laboratuvar önlüğü, nitril eldivenler ve koruyucu gözlük dahil. PFA çözeltilerini kurumsal kimyasal güvenlik yönergelerine uygun olarak bertaraf et. Tüm atık PFA ve kirlenmiş maddeleri (örneğin eldivenler, mendiller, kaplar) açıkça etiketlenmiş tehlikeli atık konteynerinde toplamak ve bunları kurumun Çevre Sağlığı ve Güvenliği ofisi aracılığıyla yerel, eyalet ve federal düzenlemelere uygun protokollere uygun olarak bertaraf etmek.

DIKKAT: Fiksasyon için paraformaldehit (PFA) kullanıyorsanız, formaldehit buharlarına maruz kalmamak için tüm adımları bir duman kapağının altında yapın.

  1. Perfüzyondan sıvıyı toplamak için emici bir malzemeyle kaplı bir strafor kapak yerleştirin. Faresi bu diseksiyon yüzeyine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve uzuvları vücudu stabilize etmek için iğnelerle sabitleyin: ön uzuvlar yanlara yerleştirilerek torakal boşluğu açar ve arka uzuvlar kaudal olarak uzanarak karın duvarında hafif bir gerginlik yaratır.
    NOT: Bu konumlandırma görüşü artırır, engeli en aza indirir ve organ toplama için çalışma alanını maksimize eder.
  2. Göğüs bölgesine %70 etanol uygulayın.
  3. Diyafram seviyesinde enine bir kesi yapmak için keskin makas kullanın, ardından kaburga kafesini ortaya çıkaracak iki V şeklindeki kesik yapılabilir (Şekil 1A).
  4. Kör uçlu forseps kullanarak, cildi nazikçe kaldırın ve kalan tutucuları dikkatlice keserek torakal bölgeyi tamamen açığa çıkarın.
  5. Kaburga kafesinin her iki tarafında yaklaşık 2 cm uzunluğunda V şeklinde iki kesik açarak torakal boşluğu açın.
  6. Göğüs kemiğini kaldırın ve farenin omzuna başının yanına sabitleyin.
  7. Kör uçlu forseps kullanarak kalbi dikkatlice açığa çıkarın. Perfüzyon hattındaki hapsolmuş hava kabarcıklarını çıkarın, ardından sol ventrikülün ucuna yaklaşık 3-4 mm derinliğe bir kelebek iğnesi veya kanül yerleştirin. Perfüzyonun dışarı çıkmasını sağlamak için sağ atriyumda yaklaşık 5 mm uzunluğunda bir kesi yapın (Şekil 1B).
  8. Dolaşım sistemini temizlemek için kalsiyum ve magnezyum içermeyen fizyolojik bir çözelti (örneğin, PBS, salin veya HBSS) ile perfüzyona başlayın.
    NOT: Perfüzyon 20 mL bir şırınga, pompa veya yerçekimiyle beslenen bir sistem kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ortalama olarak, her fare başına 15-20 mL perfüzyon çözeltisi gereklidir ki, damar damarlarından tam temizlenme sağlansın. İyi perfüzyon, karaciğer ve akciğerlerin hızlı temizlenmesi (beyazlaşması) ile ağız ve dilin solgun görünmesi ile belirtilir. Tam perfüzyon kalpten net ve kansız çıkış sağlar.
  9. Istenirse, perfüzyon hattını kalsiyum ve magnezyum içermeyen fizyolojik çözeltiden (ön yıkama ve kan alınımı için kullanılır) 50 mL'lik bir enşırıngaya çevirerek başlatın; iğne yerinde tutulur. Hatta hava kabarcıkları bulaştırmamaya dikkat edin. %4 PFA ile perfüze etmeye devam edin, ta ki vücudun kademeli sertleşmesiyle istenen fiksasyon derecesi değerlendirilene kadar. Yaklaşık 30 mL fiksator tek bir fare için yeterlidir.

3. Organ ve doku koleksiyonu

NOT: Genç ve yaşlı fareleri karşılaştırırken organ toplama sırası kritik öneme sahiptir. Yaşlı hayvanlarda organlar genellikle kırılgan ve otoliz veya mekanik hasara karşı duyarlıdır, bu yüzden hızlı ve tutarlı doku kullanımı gereklidir. Toplama sırasının standartlaştırılması, ölüm sonrası değişkenliği en aza indirir, taşınma eserlerini azaltır ve hayvanlar arasında eşit fiksasyon kalitesinisağlar 14,15. Tutarlılık, yaşa bağlı ince morfolojik değişiklikleri tespit etmek için hayati öneme sahiptir; çünkü gecikmeli veya tutarsız örnekleme önyargı yaratabilir. PFA perfüzyonu yapılmadıysa, organlar hızla alınmalıdır. Pankreas, mide, akciğerler ve beyin, hemen işlenmezse özellikle hızlı otoliz ve histolojik bozulmaya yatkındır. Yaşlı farelerde sıklıkla neoplastik lezyonlar geliştiği için, dalak, karaciğer, lenf düğümleri, akciğerler ve timusu asimetri, büyüme, nodul veya renk değişikliği açısından dikkatlice inceleyin. Bu bulguları genel hastalık yükünün bir parçası olarak kaydedin (bkz. Tablo 2).

  1. Perfüzyon veya servikal dislokasyon sonrası hayvanın sırtüstü pozisyonda başlamasıyla torakal ve karın boşluklarının ana organlarını toplan (Şekil 1C).
  2. Saplamadan sonra gaz bezi veya sprey şişesi kullanarak %70 etanol nazikçe uygulayın; bu da kürk kontaminasyonunu en aza indirir ve hassas bölgelerde doku nemlendirilmesini korur. Bu yöntem, tam daldırmanın dezavantajlarından kaçınırken kürk kalıntılarını azaltmak ve diseksiyon sırasında görüşü artırmak için ellerimizde etkili olduğunu kanıtlamıştır.
  3. Makaslı ve kör uçlu forseps kullanarak, diyaframdan pelvise orta hat kesimi yaparak karın boşluğunu dikkatlice açın, ardından Şekil 1A'daki kırmızı çizgilerle gösterilen iki yan kesi yapılacaktır. Deriyi ve karın duvarını yukarı çekerek iç organları tamamen açığa çıkar.
  4. Mide, ince bağırsak ve kolon: Mideyi özofagus birleşiminde ayırın, pylorik ucu ise ince bağırsakla sürekli bırakın. Destekleyici bağları keserek gastrointestinal sistemi nazikçe serbest bırakın, ardından ince bağırsak ve kolonu da dahil olmak üzere traktı çıkarın. Rektumda distal kesik.
    1. Luminal içeriği temizlemek için, ince bağırsak proksimal, duodenojejunal fleksiyonda ve ileosekal birleşimde distal olarak ayrılır. Kolon için, sekumda proksimal olarak kesin. Yaklaşık 20 ml fizyolojik çözelti ile ince bağırsak ve kolonu besleyici iğneyle takılı bir şırınga ile yıkayın, dokunun ince uçlu penslerle nazikçe sabitlenerek zarar görmesini önleyin.
  5. Yemek borusu: Yemek borusunu servikal bölgeden mide birleşimine izole edin.
  6. Dalak ve pankreas: Dalak ve pankreası çevredeki dokulardan ince diseksiyon ile izole ederek mekanik hasarı en aza indirin. Pankreası dalaktan dikkatlice ayırın. Pankreası hemen küçük parçalara ayırın ve küçük parçalara (≤5 mm) ayırın, ötenazi sonrası 5 dakika içinde fiksasyona daldırın; böylece otolizi en aza indirin ve optimal doku morfolojisi korunur. Dalağı inceleyin, büyüklüğünü, rengini, şeklini ve görünür herhangi bir anormaliyi not edin.
  7. Karaciğer: İnce uçlu forseps kullanarak, karaciğer lobları arasındaki merkezi bağ dokusunu tutun ve hafifçe yukarı doğru çekerek gerilim oluşturun. Diseksiyon makası ile karaciğer ile bitişik organlar arasındaki tüm bağlantıları dikkatlice kesin. Karaciğerde renk, kıvam ve nodül veya diğer anormallikler açısından kontrol edin.
  8. Viseral yağ: Visseral yağ depolarından örnekler toplayın.
    NOT: Genç hayvanlarda genellikle minimum visseral yağ bulunurken, yaşlı hayvanlarda özellikle bağırsaklar, böbrekler ve gonadal bölgelerde artan yağ birikimi görülür.
  9. Böbrekler ve mesane: Her iki böbreği, bağlı üreter ve mesaneyi de çıkarın. Böbrekleri çevredeki yağ dokusu ve bağ yapılarından dikkatlice ince makas veya kör uçlu penslerle ayırın. İdrar yolu mesaneye kadar distal olarak takip edin, kalan bağlantıları keserek tüm idrar yolunu izole edin. Daha fazla işlem öncesi böbrekler ve mesaneyi büyüklük, renk ve anormallikler açısından inceleyin.
  10. Lenf düğümleri: Deriyi peritondan geri çekerek inguinal bölgeyi açığa çıkarın. Lenf damarları boyunca meme yağ pedindeki lenf düğümlerini tespit edin. Düğümleri ince uçlu forsepsle izole edip çıkarın, böylece çevredeki yağ ve bağ dokusunun bozulmasını en aza indirin.
  11. Kalp: Büyük damarları keserek kalbi dikkatlice çıkarın.
  12. Timus: Timusu dikkatlice keserek yapısını koruyun. Timusun yaşla birlikte involüsiyona uğradığını ve yaşlı farelerde sadece minimal veya hiç timik dokusu olmayabileceğini unutmayın.
  13. Akciğerler: Keskin makas ve ince uçlu penses kullanarak, akciğerleri ve bağlı trakeayı bir parça halinde dikkatlice çıkarın.
  14. Aorta: Aorta ile omurga arasına kapalı forseps yerleştirin ve aortayı nazikçe yerinden çıkararak dorsal taraf boyunca ayırın. Kabı yırtmamaya dikkat edin. İnce uçlu forseps kullanarak, çevredeki yağ ve bağ dokusunu dikkatlice aortadan diseksiyon mikroskopu altında çıkarın.
  15. İskelet kası: Arka uzuvların üzerindeki deriyi keserek uyluk kemiği ve çevresindeki kasları açığa çıkarın. İnce makas kullanarak, uyluk kemiğine bağlı kasları çevredeki bağ dokusundan ayırarak dikkatlice izole edin ve tendon yerleştirmelerini keserek lif bütünlüğünü koruyun.
  16. Kemik (tibia): Diseksiyon makası kullanarak, üst deri ve kası rezek ederek tibia'yı açığa çıkarın. Diseksiyon makası ve küt forseps kullanarak, diz ve ayak bileği eklemlerindeki tibia'yı dikkatlice ayırın. Kalan yumuşak dokuları kemiğe zarar vermeden çıkarın.
  17. Gözler: Büyük diseksiyon makası kullanarak farenin kafasını kesin. Gözleri ince uçlu penslerle dikkatlice çıkarın.
  18. Beyin: Ön kafatasını açmak için saç derisini kesirin. Keskin makas veya bir skalpel kullanarak, kranial dikişleri takip edin ve kemik segmentlerini kaldırarak beyni açığa çıkarın (Şekil 1D). Koku soğanlarını ve ventral bağlantıları kesin. Beyni nazikçe kafatası boşluğundan çıkarın. Dokuyu hemen işleyerek morfolojiyi koruyun.
  19. Cilt temizleme: Eğer sonraki uygulamalar için tüy çıkarma gerekiyorsa, elektrikli saç kesici ile tüyleri çıkarın. Sırt derisinin bir kısmını künt forsepsle sıkıştırın, makasla kesin ve dokuyu daha fazla işlem için toplayın.
  20. İlgi duyulan tüm organlar çıkarıldıktan sonra, fare karkasının tamamını %4 PFA ile önceden doldurulmuş 450 mL'lik bir kaba yerleştirin; beklenmedik bulgular için arşivlemek veya incelemecilerin ıslak dokuya geri dönmesi gerekebilecek sorularını cevaplamak için.

4. Doku koruma ve işleme

NOT: Doku bütünlüğünü korumak için, diseksiyon ile koruma arasındaki zamanı en aza indirin. Gecikmeler doku morfolojisi ve moleküler kalite açısından zarar görebilir; doku toplama ve korumanın kritik zamanlaması için daha fazla detay Tablo 2'de gösterilmiştir.

DIKKAT: Fiksasyon için paraformaldehit (PFA) kullanıyorsanız, formaldehit buharlarına maruz kalmamak için tüm adımları bir duman davlumbazının içinde yapın.

  1. Diseksiyon sonrası hemen dokumaları, hedeflenen aşağı akış uygulamasına göre uygun protokolü (adım 4.1, 4.2 veya 4.3) seçerek işleyin.
    1. Paraformaldehit (PFA) fiksasyonu: Histolojik analiz için tasarlanan dokuları %4 PFA'ya 4 °C'de 12-24 saat boyunca yerleştirin. Fiksasyondan sonra, dokuları fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) ile iyice yıkarak kalıntı fiksantif çıkarın, ardından parafin gömülüp kesimlenene kadar %70 etanole aktarılır.
  2. Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşik gömme: OCT bileşiğine taze dokular gömme. Dokuları, OCT bileşiğiyle doldurulmuş gömülü kalıplara yerleştirin, hava kabarcıklarını ortadan kaldırın, oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın, ardından sıvı azotun buhar fazında dondurun. Alüminyum folyo ile mühürleyin ve OCT bloklarını −80 °C'de saklayın, ta ki kesimlenmeye kadar.
  3. Sıvı azot buharı fazında ani donma: Sıvı azotun buhar fazında RNA, protein veya metabolit analizi için tasarlanmış dokuların snap-freeze ile buz kristali oluşumunu en aza indirmek. Dokuları etiketlenmiş kriyotüplere yerleştirin ve sıvı azotun üzerinde askıda tutup hızlı dondurulmasını sağlarsınız. Tamamen dondurulduktan sonra, örnekleri −80 °C saklamaya aktarın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nekropsi sırasında, yaşlı farelerde sıklıkla neoplastik lezyonlar bulunur ve patolojik bulguları belgelemek için dikkatli inceleme gerekir 13,14,16,17,18. Şekil 2A, perfüzyon sonrası sırtüstü pozisyonda 22 aylık erkek C57BL/6 faresini göstermektedir. Akciğerlerin tam ağarması etkili perfüzyonu doğrularken, karaciğer sadece kısmi beyazlanma gösterir. Karaciğerin daha yakından incelenmesinde, birçok kötü huylu nodül (Şekil 2B), büyümüş seminal veziküller (Şekil 2A) ve dalak omegali (Şekil 2C) ortaya çıktı. Bu bulgular yaşlı farelerde yaygındır ve toplam hastalık yükünün bir parçası olarakbelgelenmelidir 18.

Şekil 3, diseksiyon ve perfüzyon sonrası toplanan makroskopik normal organları göstermekte olup, anatomik bütünlük ve perfüzyon etkinliğinin değerlendirilmesini sağlar. Sindirim sistemi fizyolojik çözeltiyle yıkanarak sindirilen içerikler çıkarıldı ve mide, kolon ve ince bağırsak temiz ve saydam bir görünüme sahip oldu (Şekil 3A). Yemek borusu, pankreas, dalak, visseral yağ depoları, mesane böbrekler, lenf düğümleri, kalp ve timus gibi ek yapılar açıkça tanımlanabiliyordu ve aşağı akış analizleri için sağlam olarak izole edilebiliyordu (Şekil 3B,C,E-I).

Perfüzyon kalitesi, yüksek damarlı dokularda blanşlama incelenerek değerlendirildi. Şekil 3D ve Şekil3J'de gösterildiği gibi, karaciğer ve akciğerler perfüze olmayan, iyi perüzlenmiş ve kısmen perüzlenmiş durumlar arasında belirgin farklılıklar göstermiştir. Tam beyazlaştırma başarılı perfüzyonu doğrularken, eksik beyazlama teknik değişkenlik veya altta yatan anormallikleri gösterdi. Aorta, iskelet kası, tibia, beyin, göz ve cilt gibi diğer dokular, histolojik, moleküler veya görüntüleme uygulamaları için uygun olan korunmuş morfolojiyle izole edilmiştir (Şekil 3K-P). Bu standartlaştırılmış diseksiyon prosedürü, sağlam ve iyi korunmuş doku ve organların tutarlı şekilde geri alınmasını sağlar ve çeşitli sonraki analizleri desteklemek için büyük anatomik değerlendirmeyi mümkün kılar. Diseksiyon ve organ toplama, her hayvan için operatör deneyimine ve patolojik bulguların varlığına bağlı olarak yaklaşık 40-60 dakika sürdü.

Şekil 4, parafin gömülmesi, kesitlenmesi ve hematoksilin ile eosin (H&E) boyama sonrası toplanan organlarda yaşlanmaya bağlı örnek değişiklikleri göstermektedir. Yaşlı farelerin deri kesitlerinde, epitelel incelme ve saç foliküllerinin kaybı genç kontrol gruplarına kıyasla gözlemlenmiştir (Şekil 4A). Böbrek bölümlerinde Bowman kapsüllerinin büyümesi, fibrotik ve nekrotik değişiklikler ve lenfomalarla uyumlu bölgeler tespit edildi (Şekil 4B). Pankreas kesitlerinde, yaşlı hayvanlarda apoptotikcisimler 19 ve lenfomatöz bölgelerde artış gözlemlenmiş, bu da yaşla birlikte doku bütünlüğünün zayıfladığını göstermektedir (Şekil 4C). Dalak kesitleri, yaşlanmış hayvanlarda amiloid birikintileri ve lenfoma bölgelerini göstererek yaşa bağlı patolojinin ek özelliklerini yansıtıyordu (Şekil 4D).

Bu sonuçlar, birden fazla dokuda yaşlanmanın temsil eden histopatolojik özelliklerini vurgulayarak, bu protokolün yaşa bağlı gerilemenin yapısal işaretlerini tespit etmede ne kadar faydalı olduğunu göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Fare diseksiyon ve organ maruziyetlerinin şematik genel bakışı. (A) Toraks ve karın boşluklarının (kırmızı çizgiler) açılması için kesi noktaları; diyafram seviyesinde enine bir kesi, ardından kaburga kafesinin her iki yanında V-şeklinde kesikler yapılarak torakal boşluğu açmak ve diyaframdan pelvise orta hat kesi, karın boşluğunu tamamen açığa çıkarmak için iki taraflı kesikler. (B) Sol ventriküle kelebek iğnesinin yerleştirilmesini ve sağ atriumun kesilmesini gösteren perfüzyon düzeni, böylece etkili kan tahliyesi sağlanır. (C) Çürük maruziyetinden sonra ana torasik ve karın organlarının anatomik düzeni. (D) Baş diseksiyon adımları, kafatasının çıkarılması ve kafatasının beyni açığa çıkarması dahil. Kırmızı çizgiler kesi yerlerini gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Yaşlı farelerde neoplastik lezyonların tanımlanması. (A) %4 PFA ile perfüzyon sonrasında sırtüstü pozisyonda 22 aylık erkek C57BL/6 faresini temsil ediyor. Akciğerlerin tam ağarması (pembe ok ucu) etkili perfüzyonu doğrularken, karaciğer (yeşil ok ucu) sadece kısmi beyazlanma gösterir. Mavi ok uçları büyümüş seminal vezikülleri gösterir. (B) Karaciğerin ayrıntılı görünümü ve çoklu kötü huylu nodüller (siyah ok uçları) ortaya çıkar. (C) Yaşlı bir C57BL/6 faresinden (sağ taraf) genç bir hayvanın normal dalağına kıyasla (sol taraf) genç bir dalak büyüttüğü dalak. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Diseksiyon ve perfüzyon sonrası başlıca fare organları ve doku bütünlüğünün genel görünümü. (A) Mide, ince bağırsak ve kolon, sindirilmiş içeriğin çıkarılması için fizyolojik çözeltiyle yıkamadan önce ve sonra. (B) Yemek borusu. (C) Pankreas ve dalak bağlı. (D) Perfüzyon olmayan karaciğer, etkili perfüzyon sonrası tam ağarma ve eksik perfüzyon veya altta yatan patolojiye işaret eden kısmi ağartma. (E) Visseral yağ dokusu. (F) Bağlı mesanesi olan böbrekler. (G) Kang lenf düğümleri. (H) Kalp. (I) Timus. (J) Perfüzyon olmadan, etkili perfüzyon sonrası tam ağarma ve kısmi ağartma ile akciğerler. (K) Aorta. (L) Arka uzuvdan izole edilmiş iskelet kası. (M) Kemik yapısı korunmuş tibia. (N) Beyin. (O) Göz. (P) Deri. Ölçek çubukları: 5 mm içinde A, C, D, E, F, J, L, N, P; Diğer tüm panellerde 1 mm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Hematoksilin ve eozin (H&E) boyama kullanılarak ana organların histolojik analizi. (A) 3 aylık (genç) ve 22 aylık (yaşlı) farelerden deri kesitleri. Yaşlı hayvanlardan alınan kesitlerde epitelyal incelme ve saç foliküllerinin kaybı görülür. (B) Bowman kapsüllerini vurgulayan böbrek bölümleri. Yaşlı hayvanlardan alınan kesitlerde kapsül büyümesi, fibrotik ve nekrotik değişiklikler ve lenfomalar (turuncu ok uçları) görülür. (C) Genç ve yaşlı hayvanlardan pankreas kesitleri, yaşlı hayvanlarda artan apoptotik cisimler (mavi ok uçları) ve lenfoma bölgeleri (turuncu ok uçları) görülür. (D) 3 aylık (genç) ve 22 aylık (yaşlı) farelerden dalak kesitleri. Yaşlı hayvanlardan alınan kesitlerde amiloid birikintileri (kireç-yeşili ok uçları) ve lenfoma bölgeleri görülür. Ölçek çubuğu (A-C) 100 μm. Ölçek çubuğu (D) 500 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Hazırlık kontrol listesi. Fare dokusu diseksiyonu ve korunması için temel hazırlıkların adım adım listesi; tüp ve kalıp etiketleme, tampon ve fiksatif hazırlığı, kriyo-gömme kurulumu, diseksiyon aleti sterilizasyonu, çalışma istasyonu düzenlemesi ve dokümantasyon planlaması dahil. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Doku toplama kontrol listesi. Toplanan dokuları kaydetmek için tabloyu kullanın. Toplama süresi ve durum veya anormalliklerle ilgili notlar ekleyin. Çalışmanız için kritik olan dokulara öncelik verin; doku otiliz/bozulmasını önlemek için önerilen zaman aralığında en ilgili organları toplayın.*Organ renk değişimi, nodüller, kötü hutlu büyüme, anormal organ büyüklüğü dahil olmak üzere herhangi bir anormalliği not edinin. **Koruma yöntemini belgelemeyi düşünün (PFA fiksasyonu, OCT gömü veya snap dondurma dahil). Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, genç ve yaşlı farelerde çoklu organ sistemlerinin sistematik olarak toplanması için tekrarlanabilir bir strateji sunar ve anatomik, histolojik ve moleküler analizleri mümkün kılar. Çeşitli teknik hususlar sonucun kalitesini etkileyebilir ve tarif edilen yöntemin sınırlamalarını giderebilir. İlk olarak, perfüzyon kalitesindeki değişkenlik dikkate alınması gereken önemli bir faktördür. Eksik perfüzyon ise histoloji, immünohistokimya ve moleküler analizleri tehlikeye atan kan kalıntısı bırakabilir. Boyun dislokasyonu sonrası perfüzyon servikal dokulara travma verebilir ve akciğerlerde kan kontaminasyonuna yol açabilir. Bu nedenle servikal dislokasyon yalnızca eğitimli personel tarafından yapılmalıdır. En iyi sonuçlar için, perfüzyon IACUC ve AVMAyönergelerine 13 uygun olarak başka20,21 bölümlerinde tanımlandığı gibi terminal anestezi altında yapılmalıdır. İkinci olarak, fiksasyon doku bütünlüğünün kritik belirleyicisidir. %4 paraformaldehit (PFA) yaygın olarak kullanılsa da, büyük veya yoğun organlara yeterince nüfuz etmeyebilir, bu da kötü histoloji ve antijen korumasına yol açar. Bu sınırlama, %10 nötr tamponlu formalin (NBF) kullanılarak veya dokuları ≤5 mm kesitlere dilimleyerek nüfuzuartırarak azaltılabilir 22. Üçüncüsü, özellikle pankreas, mide ve beyin gibi bazı dokular hızlı otoliz geçirir; bu da ötenazi sonrası 5-10 dakika içinde fiksasyon veya dondurma ile önceden soğutulmuş diseksiyon aletlerinin kullanılmasını gerektirir23. Yaşlı farelerde neoplazi, anatomiyi daha da bozabilir ve diseksiyonu zorlaştırabilir. Yetersiz fiksasyon hacmi veya donma nedeniyle ek artefaktlar ortaya çıkabilir, bu da küçülme ve kenar etkilerine yol açabilir; bunlar, en az 10:1 sabitleyici-doku oranı korunarak, aşırı kalabalıktan kaçınarak ve gömülmeden önce OCT kalıplarının önceden soğutulmasıyla en aza indirilebilir. Son olarak, PFA ve formalin kullanımı güvenlik ve bertaraf endişeleri yaratmaktadır; Glukssal bazlı fiksatörler daha az toksik alternatifler sunar. Bu nedenle, tekrarlanabilirlik, doku kalitesi ve aşağı akış analizlerinin güvenilirliğini en üst düzeye çıkarmak için standartlaştırılmış işleme, optimize fiksasyon ve dikkatli zamanlamagereklidir 24.

Aynı hayvanda 15'ten fazla organdan doku alınarak, bu iş akışı denek başına biyolojik verimi en üst düzeye çıkarır ve hayvan kullanımını azaltma etik talimatlarıyla uyumludur. Sistematik prosedür, yaşa bağlı fizyolojik gerileme ve organ spesifik patolojileri inceleyen orta verimli çalışmalara kolayca ölçeklenebilir25.

Histolojik bütünlüğün korunması için otoliza yatkın dokuların hızlı işlenmesi gereklidir. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen fizyolojik çözeltilerin, ardından %4 PFA kullanımı, organ yapısını güvenilir şekilde korur ve pankreas ile sindirim sistemi gibi hassas dokularda otolizi en aza indirir. Tek organlara veya hastalık modellerine odaklanan protokollerin aksine, bu yaklaşım birden fazla organın hızlı ve tutarlı toplanmasını sağlar, değişkenliği azaltır ve veri verimliliğini artırır. Perfüzyondan nihai doku eksizyona kadar tüm diseksiyon, hayvan başına 60 dakika içinde tamamlanabilir, bu da büyük ölçekli veya zaman hassasiyetli çalışmalar için uygundur 3,11,26. Kesin bir perfüzyon-fiksasyon dizisine bağlılık, artefaktları en aza indirir ve tekrarlanabilir sonuçları mümkün kılar.

Doku toplama, kırpma ve gömme tutarlılığı, özellikle uzunlamasına veya çok merkezli çalışmalarda doğru histopatolojik değerlendirme için gereklidir. Dokuların nasıl işlendiği değişkenlik, artefaktlara, belirsiz patolojik bulgulara yol açabilir veya hastalık yükünün yanlış yorumlanmasına yol açabilir. RENI trim rehberleri gibi, Fare ve Farelerde Organ Örnekleme ve Kırpma için Revize Edilmiş Rehberler, bu tutarsızlıkları en aza indirmek için ayrıntılı ve standart protokoller sunar22. Bu uyumlu yöntemlerin benimsenmesi, çalışmalar ve kurumlar arasında veri karşılaştırılabilirliğini artırır, tekrarlanabilirliği güçlendirir ve yaşlanma araştırmalarında patolojiye dayalı sonuçların bütünlüğünüartırır 4,9.

Çok sayıda organın toplanması, yaşlanma araştırmalarında özellikle önemlidir; çünkü organ sistemlerinin nasıl etkileşime girdiğini anlamak, yaşla birlikte tüm vücut fizyolojik düşüşünü tetikleyen süreçleri ortaya çıkarmak için gereklidir. Bu yaklaşım çeşitli diğer araştırma soruları için de faydalı olabilir, ancak bu protokolün odağı, yaşa bağlı değişikliklerin aynı anda birden fazla organ sistemini etkileyebildiği yaşlanma çalışmalarını desteklemektir. Ancak, fibroz, rejenerasyon ve yaşlanma üzerine odaklanan çalışmalara, özellikle transkriptomik veya çoklu doku biyobelirteçkeşfi 9,27,28 dahil edilenlere de uygulanabilir.

Histolojik değerlendirmeler, birden fazla dokuda karakteristik yaşa bağlı değişiklikleri ortaya koydu (Şekil 4). Deride, yaşlı hayvanlarda epitel incelmesi ve saç foliküllerinin kaybı görülür. Böbrekte, yaşlı farelerden alınan kesitlerde Bowman kapsül büyümesi ile birlikte fibrotik, nekrotik ve lenfoma değişiklikleri görüldü. Yaşlı hayvanlardan alınan pankreas dokusunda apoptotik cisimler ve lenfomalar birikimi bulunurken, dalak kesitlerinde amiloid birikintileri ve ek lenfoma bölgeleri ortaya çıktı. Bu gözlemler, yerleşik fare yaşlanma fenotipleriyle tutarlıdır ve bu protokolün 1,18,19,27,29,30,31,32,33,34 yaşlanma göstergelerini tespit etmede faydasını göstermektedir.

Özetle, bu protokol preklinik yaşlanma modellerinde doku toplamak ve korumak için güvenilir ve ölçeklenebilir bir çerçeve sunar. Hem keşif hem de hipotez odaklı çalışmalarda kullanılarak dokuya özgü ve sistemik yaşlanma, dejenerasyon ve dayanıklılık mekanizmalarını ortaya çıkarabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Larry L. Hillblom Vakfı Start-Up Bursu, AFAR ve Glenn Foundation for Medical Research Grant, Junior Faculty for Junior Research, Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation Junior Investigator Award ve Hanna Martens'a verilen Program for Breakthrough Biomedical Research (PBBR) New Frontier Research Award ile desteklendi. Şekil 1 BioRender ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Emici pad
C57BL/6J fareler Jackson Laboratuvarı  #000664
Koleksiyon tepsileri 
Kablosuz TrimmerBravMini+ CLP-41590Tüy çıkarma için
Etanol Spreyi %70Fisher Scientific50-163-3592
Ekstra Penseps 5 INOXDumontF6521-1EALenf düğümleri için ekstra ince uçlu forsepsler
ForsepsMilliporeSigmaXX6200006PKüt uç forseps
Pensetler 5 INOXDumontF6521-1EAİnce uçlu forsepsler
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 1x 500 mLGibco14025092
Mikro-Disseksiyon Makasları (Düz, Keskin/Keskin, 25mm)Roboz CerrahiRS-5668Standart mikro makas, paslanmaz çelik, 25 mm bıçak (M-37)
Mikro-Disseksiyon Makasları (Düz, Keskin/Keskin, İnce Bıçaklar)Roboz CerrahiRS-5918İnce diseksiya makasi, 4.5" uzunluğunda (H-327)
NBFSigma HT501128Sabitleme için
Normal Salin ÇözeltisiCytiva76081-514
Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT)Fisher Scientific23730571
Paraformaldehit (PFA) %4Elektron Mikroskopi Bilimleri15710Sabitleme için
Petri kapları 100 mL x 15 mLMilliporeSigmaP5856-500EA
Fosfat-tamponlu tuzlu (PBS)Gibco10010023
PimlerEisco LaboratuvarlarıDISPINS1Diseksiyon sırasında fareyi sabitlemek için
Plastik Şırınge 20 mL, luer kilidiFisherBrand302830Perfüzyon için
Seal'N Dondurma Kutusu (Kriyo Konteyner)Ted Pella, Inc.20956
Seal'N Dondur KriyotrayTed Pella, Inc.20956-1Numuneleri kriyo kabında konumlandırmak için
Adaptörlü Sol-Vet Kelebek İğnesiSol-Millenium Medical110301070003perfüzyon için
Strafor kapak
Tissue-Tek Cyromold (Biyopsi)Sakura25608-922
Genç C57BL/6J fareleriJackson Laboratuvarı  #000664

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. Hallmarks of aging: An expanding universe. Cell. 186 (2), 243-278 (2023).
  2. Schafer, M. J., et al. The senescence-associated secretome as an indicator of age and medical risk. JCI Insight. 5 (12), e133668(2020).
  3. Sladitschek-Martens, H. L., et al. Yap/taz activity in stromal cells prevents aging by controlling cGAS-STING. Nature. 607 (7920), 790-798 (2022).
  4. Tabula Muris, C. A single-cell transcriptomic atlas characterizes aging tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
  5. Farooqi, I. S., Xu, Y. Translational potential of mouse models of human metabolic disease. Cell. 187 (16), 4129-4143 (2024).
  6. Marttala, J., Andrews, J. P., Rosenbloom, J., Uitto, J. Keloids: Animal models and pathologic equivalents to study tissue fibrosis. Matrix Biol. 51, 47-54 (2016).
  7. Yuan, R., Peters, L. L., Paigen, B. Mice as a mammalian model for research on the genetics of aging. ILAR J. 52 (1), 4-15 (2011).
  8. Wang, Q., et al. The mouse multi-organ proteome from infancy to adulthood. Nat Commun. 15 (1), 5752(2024).
  9. Zhuang, J., et al. Comparison of multi-tissue aging between human and mouse. Sci Rep. 9 (1), 6220(2019).
  10. Basisty, N., et al. A proteomic atlas of senescence-associated secretomes for aging biomarker development. PLoS Biol. 18 (1), e3000599(2020).
  11. Wu, C., et al. Spatially resolved transcriptome of the aging mouse brain. Aging Cell. 23 (5), e14109(2024).
  12. Yousefzadeh, M. J., et al. Tissue specificity of senescent cell accumulation during physiologic and accelerated aging of mice. Aging Cell. 19 (3), e13094(2020).
  13. Treuting, P. M., Snyder, J. M. Mouse necropsy. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 223-233 (2015).
  14. Antal, C., et al. Tissue collection for systematic phenotyping in the mouse. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 29 (Unit 29A), 24(2007).
  15. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Mouse tissue fixation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), pdb.prot073403(2014).
  16. Brayton, C., Justice, M., Montgomery, C. A. Evaluating mutant mice: Anatomic pathology. Vet Pathol. 38 (1), 1-19 (2001).
  17. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Limited mouse necropsy. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), pdb.prot073395(2014).
  18. Pettan-Brewer, C., Treuting, P. M. Practical pathology of aging mice. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 1, (2011).
  19. Xiong, Y., et al. Arginase-II promotes tumor necrosis factor-alpha release from pancreatic acinar cells causing beta-cell apoptosis in aging. Diabetes. 66 (6), 1636-1649 (2017).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564(2012).
  21. Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).
  22. Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 3. A joint publication of the Rita and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 433-449 (2004).
  23. Zhao, H., et al. Identifying specific functional roles for senescence across cell types. Cell. 187 (25), 7314-7334 (2024).
  24. Aversa, Z., et al. Biomarkers of cellular senescence in idiopathic pulmonary fibrosis. Respir Res. 24 (1), 101(2023).
  25. Aghali, A., Koloko Ngassie, M. L., Pabelick, C. M., Prakash, Y. S. Cellular senescence in aging lungs and diseases. Cells. 11 (11), 1781(2022).
  26. Travaglini, K. J., et al. A molecular cell atlas of the human lung from single-cell RNA sequencing. Nature. 587 (7835), 619-625 (2020).
  27. Chen, S., et al. Integration of spatial and single-cell data across modalities with weakly linked features. Nat Biotechnol. 42 (7), 1096-1106 (2024).
  28. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  29. Hoj, K., et al. Age-related decline in pancreas regeneration is associated with an increased proinflammatory response to injury. Gastro Hep Adv. 3 (7), 973-985 (2024).
  30. Roeder, S. S., et al. Changes in glomerular parietal epithelial cells in mouse kidneys with advanced age. Am J Physiol Renal Physiol. 309 (2), F164-F178 (2015).
  31. Russell-Goldman, E., Murphy, G. F. The pathobiology of skin aging: New insights into an old dilemma. Am J Pathol. 190 (7), 1356-1369 (2020).
  32. Sparks, J., et al. Presence of systemic amyloidosis in mice with partial deficiency in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in aging. App Sci. 11 (16), 7373(2021).
  33. Sun, P., Juskevicius, R. Histological and immunohistochemical features of the spleen in persistent polyclonal B-cell lymphocytosis closely mimic splenic B-cell lymphoma. Diagn Pathol. 7, 107(2012).
  34. Vannan, A., et al. Spatial transcriptomics identifies molecular niche dysregulation associated with distal lung remodeling in pulmonary fibrosis. Nat Genet. 57 (3), 647-658 (2025).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Aging Mouse ModelsHistological AnalysisMolecular AnalysisAnatomical DissectionMorphological ChangesTissue HarvestingMicroscopic EvaluationAnimal Aging StudiesEthical Animal Use

İlgili makaleler