Yöntem makalesi

Xenopus Oositlerinden ve Embriyolarından Elde Edilen Proteinlerin İmmünoblotlama ile Optimize Edilmiş Analizi

DOI:

10.3791/69139

⸱

19 Eylül 2025

 , 
1Department of Biomolecular Chemistry, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, Xenopus oositlerinden ve embriyolarından alınan proteinleri immünoblotlama ile analiz etmek için bir protokolü açıklamaktadır. Toplama adımları açıklanır, ardından numune işleme, SDS-PAGE, transfer, antikor boyama ve görüntülemeye karşılık gelen adımlar gelir. Protokol, endojen antikorlar ve protein afinite etiketlerine karşı antikorlar içeren translasyonel düzenleyici protein komplekslerinin incelenmesini vurgulamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinlerin sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve ardından immünoblotlama (western blotlama) ile analizi, moleküler biyoloğun araç setinin hayati bir parçasıdır. Bu teknik, karmaşık bir protein karışımını moleküler ağırlığa göre ayırır ve ardından spesifik antikorlar kullanarak hedef proteinlerin varlığını test eder. İmmünoblotlamanın çeşitli uygulamaları vardır. Örnekler, protein-protein etkileşimcilerini incelemek için hedefli bir yaklaşım olarak veya protein hedeflerinin ekspresyonunu veya tükenmesini doğrulamak için bir kontrol olarak kullanımı içerir. Bununla birlikte, immünoblotlamanın başarılı bir şekilde yürütülmesi karmaşık, çok adımlı deneyler gerektirir. Protokoller her organizma, hedef protein ve uygulama için optimize edilmelidir. Bu nedenle, model kurbağa Xenopus laevis de dahil olmak üzere birçok modelde immünoblotların kullanımı için bilgi boşlukları mevcuttur.

Büyük boyutları, biyokimyasal deneyler için bol miktarda malzeme içermeleri ve kolay kullanımları nedeniyle, X. laevis oositleri ve embriyoları, translasyonel kontrol ilkelerini incelemek için hayati önem taşımaktadır. Bununla birlikte, bu tür, sağlam ve rutin immünoblotlama için özel protokollerden yoksundur. Burada, birden fazla Xenopus gelişim aşamasından alınan örnekler için optimize edilmiş, western blotlama için derinlemesine bir protokol sunuyoruz. Daha sonra geliştirme genelinde çeviri düzenleyicilerini analiz ediyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel mekanizmaları anlamak, spesifik protein türlerinin izlenmesini gerektirir. Yaygın sorular arasında ekspresyonlarının mekansal ve zamansal olarak nasıl değiştiği, hangi proteinlerle etkileşime girdikleri ve farklı koşullara yanıt olarak değiştirilip değiştirilmedikleri yer alır. Halk arasında "Western blotlama" olarak bilinen immünoblotlama, bu zorlukların üstesinden gelmek için önemli bir metodolojidir. Bir immünoblot deneyi, proteinleri karmaşık bir numuneden (örneğin, tüm hücre lizatından) ayırır ve bunları antikorlar kullanarak tanımlar. Spesifik olarak, proteinler denatüre edilir ve daha sonra boyutlarına göre sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrılır. Boyut fraksiyonlu proteinler, nitroselüloz membran gibi katı bir destek üzerine aktarılır ve ilgilenilen protein, antikor reaktifleri kullanılarak tanımlanır. İmmünoblotlama, moleküler biyoloğun araç setinin standart bir parçası haline geldi. Farklı bağlamlarda protein ekspresyonunu izlemek için veya immünopresipitasyon deneyleri gibi deneyler için bir son nokta olarak yaygın olarak kullanılır. Bu avantajlara rağmen, testin her adım ve deneysel bağlam için optimize edilmesi gerektiğinden, kararlı durum protein seviyelerinin immünoblotlama ile analizi zordur (Şekil 1).

Zorlu bağlamlardan biri, Afrika pençeli kurbağası Xenopus laevis'ten elde edilen materyali analiz etmektir. X. laevis, RNA-protein etkileşimlerini incelemek için önemli bir organizmadır. Bu sistemin sayısız avantajı vardır, bunların başında X. laevis'in yüzlerce oosit üretmesi ve ardından bir seferde eşzamanlı olarak embriyo geliştirmesi gelir. Her oosit, biyokimyasal deneyler için bol miktarda malzeme sağlayan ~25 μg yumurta sarısı olmayan protein1'e sahiptir. Oositlerin ve embriyoların büyük boyutu (~1250 μm)1 ayrıca etiketli veya mutasyona uğramış proteinleriölçek 2'de eksojen olarak eksojen olarak eksprese etmek için mRNA mikroenjeksiyonunu kolaylaştırır. Bu nitelikler, bir translasyonel düzenleyici proteinin bir mRNA üzerindeki etkisinin, o proteinin RNA bağlama kapasitesinden bağımsız olarak test edilebildiği bağlı fonksiyon testi gibi X. laevis'te translasyon kontrolünü test etmek için güçlü deneyler sağlar 3,4,5,6. Bununla birlikte, Xenopus oositlerinde ve embriyolarında immünoblotlama, bu erken hücrelerde7 büyük yumurta sarısı trombosit kütlelerinin müdahalesi de dahil olmak üzere, çıkarılmadığı takdirde sonuçları gizleyecek zorluklarla birlikte gelir.

Burada, translasyonel düzenleyici proteinlerin saptanmasına vurgu yaparak , X. laevis'te etkili immünoblotlama için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Son immünoblotun görüntülenmesi için oositlerin ve embriyoların nasıl toplanacağı ve işleneceği hakkında talimatlar veriyoruz. Ayrıca, optimum protein yüklemesi ve görüntülemenin yanı sıra numunenin yumurta sarısı kontaminasyonunu önlemek için ayrıntılı talimatlar da dahildir. Ek olarak, Xenopus proteinleriyle uyumlu antikorları bulmak için olası protokol değişikliklerini ve stratejilerini tartışıyoruz. Araştırmacılara, yeterince kullanılmayan bu model organizmada kendi deneylerinin bir parçası olarak immünoblotlamayı zahmetsizce gerçekleştirmeleri için rehberlik sağlamayı amaçlıyoruz.

figure-introduction-1
Şekil 1: Xenopus numune hazırlama ve müteakip immünoblot analizi için iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde temsil edilen hayvanlarla (X. laevis) yapılan tüm çalışmalar, UW-Madison Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'ne uygundur ve bu komite tarafından onaylanmıştır. Ekipmanın, kullanılan reaktiflerin ve kullanılan antikor konsantrasyonlarının ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Bir ekipman seçimi aşağıdaki Şekil 2'de görülebilir.

figure-protocol-1
Şekil 2: İşlenmiş embriyo ekstraktı ve immünoblotlama ekipmanı. (A) Santrifüjlenmiş X. laevis evre VI oosit ekstraktı. Lipitler ve yağda çözünen proteinler zirveye çıkarken, vitellogenin (yumurta sarısı) ve pigmentli kalıntılar bir pelet oluşturur. (B) Proteinleri moleküler ağırlığa göre ayırmak için SDS-PAGE ekipmanı. (i) Güç kaynağı, (ii) Dikey elektroforez tankı, (iii) Elektroforez tankı kapağı, (iv) Elektrot tertibatı, (v) Tampon barajı, (vi) Prekast elektroforez jeli; Her biri çıkarılması gereken yeşil tarağa (üstte) ve mavi etikete (altta) dikkat edin. (C) Membran transferi için ekipman. Dikey elektroforez tankı ve kapağı, kapsamlı bir durulamadan sonra transfer için yeniden kullanılır. (i) Kabarcıkları gidermek için silindir, (ii) Transfer klipsi, (iii) Küçük karıştırma çubuğu, (iv) İki koruyucu mavi kağıt yaprağı arasında nitroselüloz membran, (v) Selüloz kromatografi filtre kağıdı, (vi) Transfer süngeri yastıkları, (vii) Transfer montajı için cam pişirme kabı, (viii) Buz torbası, (ix) Transfer çekirdeği. (D) Diğer ekipman. (i) Jel ayırıcı (transfer öncesi jel kuyularını düzeltmek için), (ii) Jel kaset açma kolu, (iii) Forseps (membranı tutmak için), (iv) Kap (membranı tutmak için), (v) kap kapağı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Xenopus oositlerinin ve embriyolarının toplanması

  1. Oosit hazırlama
    1. Ticari bir tedarikçiden (Ecocyte Bio Science, Austin, Texas) defollike edilmiş X. laevis oositleri alın veya tarif edildiği gibi izole edin ve defolliklatedin 8.
    2. Modifiye Barth Çözeltisi (MBS; 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.4 mM CaCl2, 0.33 mM Ca(NO3)2, 0.8 mM MgSO4, 5 mM Tris-HCl, 2.4 mM NaHCO3, pH 7.4) içinde kültür izole edilmiş oositler kullanıma kadar.
  2. Embriyo hazırlama
    1. X. laevis yumurtalarını izole edin ve tarif edildiği gibidölleyin 9,10.
    2. 0.25x Marc's Modified Ringer solüsyonu11 (MMR) (1x MMR: 0.1 M NaCl, 2.0 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES) içinde kültür döllenmiş embriyolar.
    3. NaOH kullanarak pH 8.2'ye ayarlanmış 0.1x MMR'de %2'lik bir sistein çözeltisi hazırlayın.
    4. Döllenme için kullanılan tabaktan 0.25x MMR'yi çıkarın ve jöle kaplamayı12 çıkarmak için embriyoları sistein solüsyonu ile kaplayın. Embriyoların eşit şekilde açığa çıkması için çözeltiyi hafifçe karıştırın.
    5. Embriyoları 2x ila 25x büyütme arasında bir stereomikroskopla yakından izleyin. Jöle tabakası çözüldükten sonra (tipik olarak 3-5 dakika), embriyolar birbirine yakın bir şekilde toplanacaktır. Sisteine uzun süre maruz kalmaktan kaçının.
    6. Sistein solüsyonunu çıkarın ve embriyoları 0.25x MMR ile birkaç kez durulayın.
    7. İstenilen büyüme aşamasına kadar 0.25x MMR'de kültürleyin.
  3. İstenilen sayıda embriyo veya oosit (numune başına en az beş önerilir) 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın.
  4. Hücrelere zarar vermekten kaçınarak fazla ortamı bir pipetleyiciyle çıkarın.
  5. Numuneleri hemen kullanın veya kullanana kadar -80 °C'de saklayın. Oositler ve embriyolar birkaç yıl saklanabilir.

2. Xenopus ekstraktının hazırlanması

  1. Dondurulmuşsa numuneleri buz üzerinde çözdürün.
  2. Embriyo/oosit başına çift deiyonize su ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile 1x'e seyreltilmiş 10 μL soğutulmuş 10x hücre lizis tamponu ekleyin ve numuneleri buz üzerinde bir mikrotokmakla homojenize edin.
  3. Numuneleri 4 °C'de 5000 g'da bir tezgah üstü santrifüjde 10 dakika boyunca yumurta sarısı ve çözünmeyen pigmentler dahil olmak üzere kalıntıları pelet haline getirmek için döndürün.
  4. Peletten kaçınmaya dikkat ederek süpernatanı ayrı bir 1.5 mL tüpe çıkarın (Şekil 2A).
  5. Süpernatanta %5 w/v 2-merkaptoetanol ile desteklenmiş eşit hacimde 2x Laemmli numune tamponu ekleyin ve numune proteinlerini denatüre etmek için 95-100 derecede 10 dakika kaynatın.
  6. Numuneleri hemen kullanın veya -20 °C'de aylarca veya yıllarca saklayın.

3. SDS SAYFASI

  1. SDS çalışma tamponu hazırlayın: 1x Tris-MOPS-SDS tamponu (6.06 g Tris bazı, 10.46 g 3- (N-morfolino)propansülfonik asit [MOPS], 1.0 g SDS, 0.3 g etilendiamintetraasetik asit [EDTA], 1000 mL'ye çift deiyonize su).
  2. %4-12 bis-tris SDS prekast jeli ambalajından çıkarın. Jelin altındaki etiketi çıkarın.
  3. Jeli bir tampon barajının karşısındaki elektrot düzeneğine yerleştirin. Elektrot tertibatını dikey elektroforez tankına yerleştirin (Şekil 2B).
  4. Elektrot tertibatını ve elektroforez tankının tabanını 1x Tris-MOPS-SDS çalışma tamponu ile doldurun.
  5. Jel tarağını jelden yavaşça çıkarın ve kabarcıkları gidermek ve tamponu dengelemek için tamponu kuyucuklara pipet akıtın.
  6. İlk kuyucuğa 5 μL önceden boyanmış protein standartlarını ve her numunenin 10 μL'sini ek kuyucuklara dikkatlice yükleyin.
  7. (İSTEĞE BAĞLI) Jelin daha eşit çalışmasını sağlamak için kalan kuyucukları 10 μL 1x Laemmli numune tamponu ile yükleyin.
  8. Kapağı elektroforez tankına yerleştirin ve bir güç kaynağına bağlayın. 200 V uygulayın.
  9. Numune tampon boya önü jelden çıktığında elektroforezi durdurun.

4. Proteinlerin bir zara ıslak transferi

  1. Numuneler elektroforez yapılırken 1 L transfer tamponu hazırlayın (3.0 g Tris Baz, 4.08 g bisin, 900 mL çift deiyonize su, 100 mL metanol). Transfer tamponunu 4 °C'de önceden soğutun.
    DİKKAT: Konsantre metanol stoklarını çeker ocakta tutun ve ciltle temasından kaçının. Metanol, etanol ile ikame edilebilir.
  2. Elektroforez tamamlanmadan önce, transfer klipsinde transfer "sandviçini" birleştirmeye başlayın (Şekil 2C).
    1. Bir cam fırın tepsisini soğutulmuş transfer tamponu ile doldurun. Sonraki sandviç montaj adımlarında malzemelerin bu tampona batırıldığından emin olun.
    2. Transfer klipsini, siyah yarısı tabağın dibine yaslanacak, beyaz yarısı açık ve yukarı bakacak ve transfer klipsi sola açık olacak şekilde tabağa yerleştirin.
    3. Transfer klipsinin siyah yarısına bir veya iki fiber süngeri düz bir şekilde yerleştirin.
    4. İki adet 0,35 mm selüloz kromatografi kağıdını (filtre kağıdı) boyutuna göre kesin ve süngerlerin üzerine bir tane koyun.
  3. Elektroforez tamamlandıktan sonra jeli elektroforez tankından çıkarın.
  4. Jelin plakalarından birine bağlı kalmasını sağlayarak, jelin plakalarını jel kaseti açma koluyla dikkatlice ayırın (Şekil 2D). Jel ayırıcı ile jelin üst kısmındaki kuyucukları kesin.
  5. Hala plastik kasetin yarısına bağlı olan jeli filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Jelin filtre kağıdı üzerinde kalması için kasetin yarısını çıkarın.
  6. Jelin boyutlarına uyması için 0,45 μm nitroselüloz membrandan bir kare kesin. Membranı koruyucu kağıttan çıkarın, transfer tamponunda kısa bir süre ıslatın ve jelin üzerine yerleştirin.
    NOT: Membranın istenmeyen protein kontaminasyonunu önlemek için membranı eldiven veya forseps ile köşelerinden dikkatlice tutun.
  7. Nitroselüloz membranın üzerine ikinci bir filtre kağıdı yerleştirin. Filtre kağıdının üzerindeki bir rulo kullanarak kabarcıkları nazikçe ama sıkıca çıkarın.
  8. Filtre kağıdının üzerine bir ila iki fiber sünger daha koyun.
  9. Transfer kasetini kapatın ve sıkıca klipsleyerek 'sandviç'i tamamlayın.
  10. Transfer sandviçini, transfer klipsi yukarı bakacak ve transfer klipsinin siyah tarafı çekirdeğin siyah tarafına bakacak şekilde transfer göbeğine yerleştirin.
  11. Transfer çekirdeğini elektroforez tankına yerleştirin. Karıştırma çubuğunun serbestçe dönebilmesi için tanka bir buz torbası ve bir karıştırma çubuğu ekleyin.
    NOT: Transfer, bir buz torbasına ek olarak veya buz torbasının yerine, adım 4.13'te 4 °C'de soğuk bir odada çalıştırılabilir.
  12. Depoyu soğutulmuş transfer tamponu ile doldurun. Kapağı sıkıca üstüne sabitleyin.
  13. Elektrot renklerini hizaladığınızdan emin olarak transfer aparatını güç kaynağına bağlayın. Aktarımı 1 saat, 100 V, 4 °C'de, karıştırma çubuğu dönerek çalıştırın.

5. Transfer sonrası membran işleme

  1. 10x Tris Tamponlu Salin (100 mM Tris bazı; 1,5 M NaCl) hazırlayın. pH'ı 8'e ayarlayın ve filtreleyin, sterilize edin.
  2. 10x TBS çözeltisini 500 mL çift deiyonize suda 1:10 seyrelterek ve 500 μL Tween-20 ekleyerek Tween-20 (TBSTw) ile 1x Tris-Tamponlu Salin hazırlayın.
  3. Engelleme tamponu hazırlayın (500 mL TBSTw, 25 g yağsız süt tozu).
    NOT: Yağsız süt, bloke edici tamponda% 2-5 sığır serum albümini (BSA) ile ikame edilebilir. Süt biyotin içerdiğinden, deneysel uygulama biyotinlenmiş proteinlerin görselleştirilmesini içeriyorsa BSA kullanılmalıdır.
  4. Transfer tamamlandıktan sonra, sandviçi dikkatlice çıkarın ve sökün ve nitroselüloz membranı çıkarın. Membranın hangi tarafının jel ile temas ettiğini işaretleyin ve sonraki adımlarda bu tarafı yukarı bakacak şekilde tutun.
  5. Protein görselleştirmesi için geri dönüşümlü bir leke olan 50 mL Ponceau boyası (%0.5 Ponceau S, %1 asetik asit) hazırlayın.
    DİKKAT: Ponceau lekesi aşındırıcıdır. Cilt ile temasından kaçının.
  6. Membranı küçük bir kaba yerleştirin ( Şekil 2D'de gösterildiği gibi), kabın dibine yaslanacak şekilde. Membranı Ponceau boyasıyla kaplayın ve 5-10 dakika boyunca bir sallanan sandalye üzerinde hafifçe sallayın.
  7. Ponceau lekesini dökün.
    NOT: Ponceau boyası birden çok kez tekrar kullanılabilir.
  8. Fazla Ponceau giderilene ve şeritlerdeki protein bantları çözülmeye başlayana kadar membranı tekrar tekrar çift deiyonize su yıkamalarında durulayın.
  9. Açıkça çözülmüş bantlara sahip düz, eşit şeritlerin varlığıyla aktarımın verimliliğini onaylayın.
  10. Kalan sıvıyı dökün ve aşağı akış adımlarında membrana spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için lekeyi bloke edici tampona daldırın.
  11. Oda sıcaklığında 30-60 dakika boyunca bir rocker üzerinde hafifçe sallayın.

6. Antikor inkübasyonu

  1. Birincil antikoru 10 mL taze bloke edici tampon içinde istenen konsantrasyona seyreltin.
    NOT: Her yeni antikor için optimal konsantrasyonun ampirik olarak belirlenmesi gerekecektir. Tipik bir başlangıç noktası 1:1000'dir veya üreticinin tavsiyelerine uyun.
  2. Bloke edici tamponu çıkarın ve antikor karışımı ile değiştirin. Gece boyunca (~16 saat) 4 °C'de hafifçe sallayarak inkübe edin.
  3. Birincil antikor solüsyonunu dökün ve membranı solüsyona batırarak ve hızla dökerek TBSTw ile durulayın.
    NOT: Çoğu antikor karışımı iki ila üç kez kaydedilebilir ve yeniden kullanılabilir. Bu, her antikor için ampirik olarak belirlenmelidir.
  4. Membranı TBSTw'ye daldırarak ve oda sıcaklığında 5 dakika hafifçe sallayarak yıkayın. Toplam üç kez 5 dakikalık yıkama gerçekleştirin.
  5. İkincil antikoru 30 mL TBSTw içinde istenen konsantrasyona seyreltin.
    NOT: Konsantrasyonun her antikor için ampirik olarak belirlenmesi gerekecektir. Genellikle 1:30.000 kullanırız.
  6. TBSTw yıkama solüsyonunu dökün ve ikincil antikor karışımıyla değiştirin. Oda sıcaklığında 45 dakika boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin.
  7. Membranı bir kez TBSTw ile hızlı bir şekilde durulayın ve ardından üç kez 5 dakikalık TBSTw yıkaması yapın.

7. Membranın bir film geliştiricisi üzerinde görüntülenmesi

  1. Karanlık bir odada film geliştiricisini açın ve ısınmasına izin verin.
  2. Membranı kaplayacak kadar büyük iki kare plastik sargı kesin. Forseps kullanarak, nitroselüloz membranı 'yüzü yukarı bakacak şekilde' plastik sargının ilk karesine yerleştirin.
  3. 1,5 mL'lik bir tüpte, eşit miktarlarda geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) Luminol ve Enhancer reaktiflerini karıştırın. 1 mL karışık çözelti kullanmak çoğu zarı kaplamalıdır.
  4. ECL reaktifini membran üzerine pipetleyin ve tam kaplamayı sağlamak için plastik ambalajı kullanarak membranı nazikçe hareket ettirin. 1 dakika inkübe edin.
  5. Membranı forseps ile kavrayarak ve sıvıyı hafifçe silkeleyerek veya membranın bir köşesini bir kağıt havluya dokundurarak sıvıyı emerek fazla ECL reaktifini çıkarın.
  6. Membranı yüzü yukarı bakacak şekilde plastik sargının ikinci karesine yerleştirin ve plastik sargıyı gevşek bir şekilde kapatılana kadar zarın üzerine katlayın. Sarılmış membranı bir otoradyografi kasetine güvenli bir şekilde bantlayın.
  7. Karanlık odada, kasetin içine bantlanmış zarı kaplayan bir film yerleştirin. Kaseti sıkıca kapatın ve filmi 1 dakika boyunca membrana maruz bırakın.
  8. Açıkta kalan filmi membran boyunca sürüklememeye dikkat ederek filmi dikkatlice çıkarın. Film geliştiricisine besleyin.
  9. Geliştirilen filmi değerlendirdikten sonra, istenen protein görselleştirmesi elde edilene kadar sonraki filmlerle pozlama süresini ayarlayın. Protein görselleştirmesi zayıf bir sinyal sağlıyorsa, ECL reaktifi inkübasyon adımını daha hassas bir ECL reaktifi ile tekrarlayın ve yeniden görüntüleyin.
  10. Geliştirilen filmi karanlıkta parlayan işaretleyicilerle hizalayın ve bu referansı, membran üzerindeki önceden boyanmış protein standartlarının konumunu film üzerine işaretlemek için kullanın.
  11. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, membranı plastik sargıdan dikkatlice çıkarın ve kalan ECL reaktifini yıkamak için TBSTw'ye daldırın.

8. (İsteğe bağlı) Ek antikor inkübasyonları

NOT: Bir immünoblotun sıyrılması, ilk birincil ve ikincil antikorların bir denatüre edici çözelti (sıyırma tamponu) ile çıkarılmasını ifade eder, böylece leke farklı bir antikorla yeniden incelenebilir. Yeniden araştırma, aynı immünoblotun farklı protein hedeflerinin ekspresyonu için analiz edilmesine ve bilinmeyen proteinlerin standart olarak işlev gören iyi karakterize edilmiş proteinlerle karşılaştırılmasına izin verir. Önce nispeten en zayıf sinyali üreten antikorla araştırın. Bunu yapmak, sonraki maruziyetlerde tam olarak sıyrılmamış antikorların neden olduğu artefaktları önler ve bir lekenin tekrar tekrar sıyrılmasından kaynaklanan protein kaybının etkisini en aza indirir.

  1. Membranı sıyırma tamponuna daldırarak ve 5-10 dakika hafifçe sallayarak bağlı antikorları soyun.
  2. Membranı sıyırma tamponundan çıkarın ve kalan sıyırma solüsyonunu çıkarmak için TBSTw'de kısa bir süre durulayın.
  3. Membranı bloke edici tampona daldırın ve 30 dakika boyunca hafifçe sallayın.
  4. İstenilen konsantrasyonda bloke edici tamponda yeni bir birincil antikor çözeltisi yapın.
  5. Yeni birincil antikor seyreltmesini membrana ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de hafifçe sallayarak inkübe edin.
  6. Adım 6.3'ten itibaren devam edin. Membran sıyrılabilir ve üç defaya kadar yeniden incelenebilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmünoblotlama protokolümüzün etkinliğini göstermek için, üç tip X. laevis örneğinde afinite etiketli ve endojen translasyonel kontrol proteinlerini analiz ettik: evre VI oositler, evre 7 embriyolar (blastula) ve evre 10.5 embriyolar (gastrula). Bu aşamalar, sağlam zigotik transkripsiyonun13,14 başlangıcını işaret eden orta blastula geçişini (aşama 8.5) kapsadıkları için seçilmiştir. Orta blastula geçişinden önceki gelişim, transkripsiyonun yokluğunda meydana geldiğinden, zigotik öncesi (yani anne tarafından kontrol edilen) embriyolar, hücre kaderi proteinlerini doğru zamansal ve uzamsal çözünürlükte15 eksprese etmek için büyük ölçüde translasyonel kontrol mekanizmalarına güvenir. Bu nedenle, orta blastula geçişi, RNA-protein etkileşimlerini incelemek için hayati bir bağlamdır.

İmmünoblotlama yoluyla protein ekspresyonunu analiz etmek için, X. laevis oositlerine ve embriyolarına, 3x hemaglutinin (HA) afinite etiketlerine kaynaşmış X. laevis Bicaudal-C'nin (Bicc1) C-terminal yarısını kodlayan 500 pg mRNA enjekte edildi. Xenopus biyolojisi ve protein-RNA etkileşimleri ile ilgisi nedeniyle Bicc1'i analiz etmeyi seçtik. Bicc1, erken embriyo16,17,18'de hücre kaderi kararlarına rehberlik eden bir mRNA bağlayıcı protein ve translasyonel baskılayıcıdır. Daha sonraki gelişimde, sol-sağ deseni 19,20,21 ve böbrekler 22,23,24,25 dahil olmak üzere organların işlevini etkiler. Bicc1, translasyonel baskılamayı5 ve spesifik mRNA'lara 5,26,27,28 bağlanmaya aracılık eden hnRNP K homoloji (KH) alanlarını yönlendiren bir bölge içerir.

Ekstraktlar, beş HA-Bicc1 enjekte edilmiş oosit veya embriyodan, negatif kontroller olarak karşılık gelen enjekte edilmemiş numunelerle birlikte hazırlandı. Her ekstraktın onda biri, %4-12'lik bir gradyan bis-tris jel üzerinde elektroforeze tabi tutuldu ve bir nitroselüloz membran üzerine ıslak olarak aktarıldı. Toplam proteini saptamak için membranın Ponceau boyaması başarılı transferi doğruladı (Şekil 3A). Çalışmalarımızın bir parçası olarak, tavşanlarda insan Bicc1 proteininin C-terminal yarısını tanıyan bir antikor ürettik. Bu antikor, endojen ve eksojen Xl-Bicc1 proteinini saptamak için kullanıldı (Şekil 3B). Önceki çalışmalar, Bicc1 proteininin X. laevis oositlerinde bulunmadığını, ancak zigotik genom aktif olmadan önce MBT öncesi embriyolarda eksprese edildiğini gösterdi16. Bu, Bicc1 mRNA'nın oogenez sırasında birikirken, translasyonel olarak baskılandığını göstermektedir. Bu önceki çalışma ile uyumlu olarak, oositlerde endojen Bicc1 tespit edilmedi. Buna karşılık antikor, hem evre 7 hem de 10.5 embriyolarda endojen Bicc1'i (~MW 107 kDa) tanıdı. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar antikorun endojen Bicc1 proteinini tanıdığını doğrular (Şekil 3B, üst panel, kırmızı ok ucu). Bicc1 antikoru, mRNA enjekte edilen numunelerden hazırlanan ekstraktlarda yaklaşık 70 kDa'lık daha küçük bir proteini tanıdı (Şekil 3B, üst panel, siyah ok ucu, şerit 2, 4 ve 6'yı şerit 1, 3 ve 5 ile karşılaştırın). Bicc1 antikorunun özgüllüğü için bir kontrol olarak, membran sıyrıldı ve HA afinite etiketine karşı bir antikorla yeniden incelendi. HA antikoru, enjekte edilen numunelerde 70 kDa proteinini tanımladı, ancak endojen Bicc1'i tanımadı (Şekil 3B, ikinci panel, siyah ok ucu). HA-Bicc1 C-teriminin tespiti, farklı hücre tiplerinde enjekte edilen mRNA'dan protein ekspresyonundaki farklılıklar nedeniyle aşamalar arasında yoğunluk bakımından değişir.

Daha sonra, Bicc1 ile etkileşime giren endojen translasyonel düzenleyici proteinlerin ekspresyonunu test ederek sonuçları genişlettik. İlk olarak, büyük bir iskele proteini ve Ccr4-Not deadenilaz (CNOT) kompleksinin bir parçası olan Ccr4-Not Transkripsiyon Kompleksi Alt Birimi 1'in (Cnot1) ekspresyonunu analiz ettik. Çok alt birimli CNOT kompleksi, başlıca ökaryotik deadenilazlardan biridir ve esas olarak, bozunmalarının bir başlangıcı olarak haberci mRNA'ların sonundaki poli(A) kuyruğunu kesmesiyle bilinir. Bununla birlikte, bu kompleksin translasyonel kontrolde deadenilasyon29'un ötesine uzanan çeşitli rolleri vardır. CNOT kompleksinin mRNA regülasyonu için önemi ve Cnot1'in Bicc120,30 ile etkileşime girdiğine dair önceki gözlemler nedeniyle Cnot1 ekspresyonunu test etmekle ilgilendik. Cnot1 ekspresyonunu analiz etmek için endojen Cnot1 proteinini tanıyan bir antikor kullandık. Her numunede 250 kDa ve 270 kDa'da iki protein tanımladı, Cnot1'in tahmin edilen boyutu (Şekil 3B, üçüncü panel). Bu nedenle, bu protokol, bir düzenleyici kompleksin kritik bir bileşenini kolayca tanımlamamızı sağlar. Ek olarak, bu veriler protokolün yüksek moleküler ağırlıklı proteinleri başarılı bir şekilde tanımlama yeteneğini desteklemektedir.

Bu sonuçların genellenebilirliğini daha fazla test etmek için, daha sonra örnekleri, translasyonel baskılamada yer alan belirgin bir DEAD-box sarmalı, DEAD-box helikaz 6'nın (Ddx6, daha önce Xenopus'ta xp54 ve Drosophila'da me31b olarak biliniyordu) varlığı açısından analiz ettik. Ddx6, ribonükleoprotein granüllerinin önemli bir bileşenidir, mRNA depolanmasında yer alır ve Bicc1 ve Cnot1 6,31,32 ile etkileşime girer. Endojen Ddx6'yı tanıyan bir antikor, her numunede yaklaşık 54 kDa'lık bir protein tanımladı (Şekil 3B, dördüncü panel). Zigotik embriyolarda ekspresyon azaldı (Şekil 3B, şerit 5 ve 6'yı 1-4 ile karşılaştırın), daha önce bildirildiği gibi33.

Son olarak, numuneler arasında gözlemlediğimiz farklılıkların ekspresyondaki farklılıklardan kaynaklandığından emin olmak için, immünoblotu Gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz (Gapdh) enzimini tanıyan bir antikorla soyduk ve yeniden araştırdık. Gapdh, her yerde ifade edilen bir "yükleme kontrolü" görevi görür. Eşdeğer Gapdh ekspresyonu seviyeleri, Ponceau boyamasını doğrular: numuneler arasında eşit miktarda toplam protein analiz edilmektedir (Şekil 3B, beşinci panel).

Bu sonuçlar birlikte, bu immünoblot yönteminin etkinliğini doğrulamaktadır. RNA-protein etkileşimlerinin incelenmesiyle ilgili çoklu X. laevis gelişim aşamalarında eksojen ve endojen Bicc1'i tanımlayabildik: yalnızca maternal olarak biriktirilen mRNA'ları içeren oositler ve MBT öncesi embriyolar ve zigotik olarak kopyalanan mRNA'ları da içeren MBT sonrası embriyolar. Bu sonuçları, çeşitli moleküler ağırlıklarda (Bicc1, Cnot1 ve Ddx6) ve bir yükleme kontrolünde (Gapdh) çoklu translasyonel kontrol proteinlerinin ekspresyonunu analiz ederek genelleştirebildik. Ayrıca, bu protokolün X. tropicalis embriyoları, daha küçük boyutlarını hesaba katmak için kullanılan materyal miktarını artırmak için modifikasyonla kullanılabilir (Ek Şekil 1).

figure-results-1
Şekil 3: X. laevis'te immünoblotlama yoluyla translasyonel düzenleyici protein seviyelerinin belirlenmesi. (A) X. laevis evre VI oositlerden, evre 7 embriyolardan ve evre 10.5 embriyolardan toplam proteini tanımlamak için immünoblotun Ponceau boyaması. Her şerit, bir ekstrakttan (0,5 oosit veya embriyo) hazırlanan proteinin 'unu temsil eder. (B) Evre VI oositlerde, evre 7 embriyolarda ve evre 10.5 embriyolarda seçilen X. laevis translasyonel düzenleyici proteinlerin immünoblot analizi. Şerit 2, 4 ve 6, analizden önce HA-Bicc1 mRNA ile mikroenjekte edilen numunelere karşılık gelirken, şerit 1, 3 ve 5, negatif (enjekte edilmemiş) kontroller olarak hizmet eder. α-Bicc1 antikoru, endojen Bicc1'in aşamalar boyunca ekspresyonunu test etmek için kullanıldı (üst panel). Leke daha sonra sıyrıldı ve α-Bicc1 antikor özgüllüğü için bir kontrol olarak HA afinite etiketine karşı bir antikorla yeniden incelendi (ikinci panel). Lekeler sıyrıldı ve α-Cnot1 (üçüncü panel) ve α-Ddx6 (dördüncü panel) kullanılarak ek düzenleyici proteinler için yeniden incelendi. α-Gapdh (alt panel), eşit protein yüklemesi için bir kontrol görevi gördü. Kırmızı ok uçları endojen Bicc1'in yerini işaretlerken, siyah ok uçları eksojen olarak eksprese edilen HA-Bicc1 C-teriminin yerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Xenopus laevis'te Xenopus tropicalis'e karşı Bicc1 proteininin immünoblot analizi. α-Bicc1 antikoru, farklı miktarlarda X. laevis ve X. tropicalis embriyo ekstraktında endojen ve eksojen Bicc1'in ekspresyonunu test etmek için kullanıldı. Şerit 1: 0.5 enjekte edilmemiş X. laevis embriyosu. Şerit 2: 0.5 HA-Bicc1 enjekte edildi X. laevis embriyosu. Şerit 3: 3 enjekte edilmemiş X. tropicalis embriyosu. Şerit 4: 1 enjekte edilmemiş X. tropicalis embriyosu. Şerit 5: 0.5 enjekte edilmemiş X. tropicalis embriyosu. Endojen Bicc1'i tanıyan iki antikor kullanıldı: biri insan Bicc1'e (üst panel) ve diğeri X. laevis Bicc1'e (orta panel) karşı yükseltildi. Eşit protein yüklemesini kontrol etmek için α-Gapdh (alt panel) kullanıldı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konsept olarak basit olmasına rağmen, birkaç güne yayılan birden fazla adım nedeniyle immünoblotlama pratikte zordur. Bu nedenle tutarlı, yüksek kaliteli sonuçlara ulaşmak çoğu zaman zordur. Bununla birlikte, immünoblotlama, modern biyolojinin hayati ve her yerde bulunan bir bileşenidir. Örneğin, immünoblotlama, X. laevis oositlerinde ve embriyolarında mikroenjekte edilen mRNA'nın başarılı translasyonunu ve ekspresyonunu doğrulamak için kritik öneme sahiptir ve X. laevis araştırması için önemini vurgular. Ayrıca, immünopresipitasyon deneyleri, in vivo protein-protein etkileşimlerini analiz etmek için immünoblotlamayı kullanır. Spesifik proteinlerin verimli tespiti, büyük ölçüde bolluklarına ve antikor saptama reaktiflerinin kalitesine bağlı olacaktır. Bu çalışmada, analiz ettiğimiz endojen proteinin tahmini konsantrasyonları Xenopus yumurtasında neredeyse 500 kat değişmektedir (Bicc1: 37.22 nM, Cnot1: 115.08 nM, Ddx6: 980.55 nM, Gapdh: 17.907.26 nM)34, ancak hepsi kolayca tespit edildi. Bu aralığın altında, gerekirse tespitin doğruluğunu ve verimliliğini artırmak için bir immünoblotun esasen her adımında (numune toplamadan görüntülemeye kadar) iş akışında değişiklikler yapılabilir.

Hangi tip SDS-PAGE jeli ve membranının kullanılacağı, herhangi bir immünoblotlama deneyi için önemli hususlardır. Deneyimlerimize göre, prekast jeller, şirket içinde üretilen jellerden daha kolay ve tekrarlanabilirdir. Prekast jeller, jellerin poliakrilamid konsantrasyonunun yukarıdan aşağıya doğru kademeli olarak arttığı gradyan formatlarında mevcut olma avantajına sahiptir. Gradyan jeller, araştırmacıların çok farklı moleküler ağırlıklara sahip çok çeşitli proteinleri çözmesine ve analiz etmesine olanak tanır. Bunu yapmak, yüksek moleküler ağırlıklı proteinleri çözen düşük akrilamid yüzdeli jel (%<7) ile düşük moleküler ağırlıklı proteinleri çözmede daha iyi olan yüksek yüzdeli jel (%>12) arasındaki tipik ödünleşimi önler. Protein transferi için nitroselüloz veya poliviniliden florür (PVDF) membran kullanılıp kullanılmayacağını düşünmek de önemlidir. Her membran tipinin mekanizması ve avantajları kapsamlı bir şekilde tartışılmıştır 35,36. Kısacası PVDF, nitroselüloz membrandan daha yüksek bir protein bağlama kapasitesine (ve dolayısıyla daha yüksek duyarlılığa) sahiptir ve tekrarlanan kullanım için daha dayanıklıdır. Bununla birlikte, PVDF, metanol inkübasyonu ile aktivasyon şeklinde ek işlem gerektirir ve daha pahalıdır. Her iki membranın da çoğu uygulama için uygun olduğunu bulsak da, maliyet kaygıları nedeniyle rutin olarak nitroselüloz kullanıyoruz.

İmmünoblotun görüntülenmesi, protokolün çok önemli bir bileşenidir. Bu adım sırasında araştırmacılar, gerekli tüm bilgileri ileten ancak arka plan gürültüsünü minimumda tutan bir immünoblotun görüntüsünü yakalamak için muhakeme yapmalıdır. Standart HRP konjuge antikorlar için iki ana görüntüleme yöntemi vardır: X-ışını filmi veya dijital görüntüleme sistemleri. Deneyimlerimize göre, X-ışını filmi ile görüntü yakalamanın birçok faydası vardır. X-ışını filmleri genellikle dijital görüntüleme sistemlerinden çok daha hassastır ve düşük bolluktaki proteinlerin tespitini kolaylaştırır. X-ışını filmleri ayrıca deneyin yüksek çözünürlükte açıklama eklenebilen ve sayısallaştırılabilen fiziksel bir kaydını da üretir. Bununla birlikte, bir dijital görüntüleme sistemi, bir film geliştiricisinden çok daha üstün bir doğrusal aralığa (sinyal gücü ile görüntü yoğunluğu arasındaki ilişki) sahip olacaktır. Hassasiyeti nedeniyle, bir X-ışını filmi hızlı bir şekilde aşırı pozlanabilir ve niceliksel bilgileri kaybedebilir. Bu nedenle, sonuçlarının kesin niceliğini arayan bir araştırmacı, dijital bir görüntüleme sistemi kullanmalı veya gelişmekte olan immünoblotları X-ışını filmi ile aşırı pozlamamaya özellikle dikkat etmelidir.

Ana hatlarıyla belirttiğimiz protokolü izledikten sonra, görüntüleme sırasında soluk veya "bulanık" bantlar gibi immünoblotlama sonuçları tatmin edici değilse, sonucu iyileştirmek için birden fazla ayarlama yapılabilir. Örneğin, analiz edilen Xenopus protein karışımının miktarı ayarlanabilir. Bir embriyonun beşte biri kadar küçük bir miktardan elde edilen toplam protein, jel şeridi başına iki adede kadar embriyo veya oosit yüklemek mümkün olsa da, güçlü sonuçlar verebilir. Çok fazla protein yüklemek, görüntüleme sırasında artefaktlara veya sahte yüksek arka plan sinyallerine neden olabilir. Ek olarak, daha uzun bir çalışma süresi için daha düşük bir voltajda (100 V) elektroforez genellikle daha keskin protein bantlarına yol açar. Benzer şekilde, protein transferini 100 V'ta bir saat yerine düşük voltajda (30 V) 4°C'de gece boyunca gerçekleştirmek, özellikle yüksek moleküler ağırlıklı türler için protein tespitini iyileştirebilir. Son olarak, bazı birincil antikor inkübasyonları, gece boyunca 4 °C yerine oda sıcaklığında 1 saatlik inkübasyonları kullanarak hedeflerini daha sağlam bir şekilde tespit eder. Bu protokol modifikasyonu her birincil antikor için test edilmelidir.

Endojen proteinleri saptamak için antikorların tanımlanması, Xenopus'ta immünoblotlama için büyük bir zorluk teşkil eder, çünkü nispeten az sayıda Xenopus'a özgü antikor ticari olarak mevcuttur. Araştırmacılar, Xenbase 37 (https://www.xenbase.org/xenbase/), Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası (https://dshb.biology.uiowa.edu/) ve Avrupa Xenopus Kaynak Merkezi (https://xenopusresource.org/) gibi ticari olmayan Xenopus antikor kaynaklarından yararlanabilirler. Alternatif olarak, insan veya fare proteinini tanımak için üretilen antikorlar, antikor üretimi için kullanılan bölgelerin korunmasına bağlı olarak homolog Xenopus proteinlerini saptamak için yararlı olabilir. Örneğin, bu protokolde sunulan bir Bicc1 antikoru, insan Bicc1 proteinine karşı yükseltildi. Bu tür reaktifler için, Xenopus proteinleri ile çapraz reaksiyona girme yeteneği ampirik olarak belirlenmelidir. Şirketlerin antikor oluşturmak için kullandıkları epitop genellikle tescilli olsa da, birçoğu talep üzerine epitop için bir amino asit aralığı sağlayacaktır. Bu bölge daha sonra homolog Xenopus proteininin karşılık gelen bölgesi ile hizalanabilir. Başarı garanti edilmese de, hedef türlerde antikor üretimi için kullanılan epitop, Xenopus'taki karşılaştırılabilir dizi uzantısına en az %75 veya daha fazla benzerlik gösterdiğinde tipik olarak başarı elde ettik. Xenopus olmayan proteinlere karşı üretilen antikorlar, kapsamlı kullanımdan önce doğrulanmalıdır, çünkü antikorların yanlış doğrulanması, tekrarlanamayan araştırmalara önemli bir katkıda bulunur38,39. Bu, mRNA mikroenjeksiyonu40 yoluyla embriyolarda ilgilenilen etiketli bir Xenopus proteininin eksprese edilmesiyle yapılabilir. Aynı numunelerin afinite etiketine karşı bir antikorla analiz edilmesi daha sonra endojen proteine karşı antikorun ve etiketli proteine karşı antikorun her ikisinin de aynı varlığı tanıdığını doğrulamak için kullanılır (Şekil 3B'deki gibi).

RNA bağlayıcı proteinlerin, özellikle Bicc1 gibi düzenleyici işlevlere sahip olanların analizi, reaktiflerin eksikliği ve tipik olarak güçlü düzenleyici moleküllerin düşük ekspresyonu nedeniyle zor olabilir. Bu sorun, her bir reaktifin ayrı ayrı optimize edilmesi gereken ve yeterli özgüllük ve duyarlılığa sahip antikorların bulunmasının zor olabileceği immünoblotlamada daha belirgin hale gelir. Bu protokolle amacımız, Xenopus'ta immünoblotlamanın belirli sınırlamalarını ele almak ve araştırmacıların RNA bağlayıcı proteinleri analiz etmenin zorluklarının üstesinden gelebilmeleri için diğer sistemlere uygulanabilir adımları detaylandırmaktır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rakamları hazırladığı için Laura Vanderploeg'e ve Xenopus oositleri sağladığı için Bill Bement laboratuvarına teşekkür ederiz. Ayrıca Xenopus tropicalis embriyolarını sağladıkları için Marko Horb, Kelsey Coppenrath ve Ulusal Xenopus Kaynağı, Deniz Biyolojisi Laboratuvarı, Woods Hole, MA'ya teşekkür ederiz. Ayrıca Emily T. Johnson'a el yazması hakkındaki anlayışlı yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Xenbase'in (http://www.xenbase.org/; RRID: SCR_003280). E-Tablolar laboratuvarındaki çalışmalar NICHD (R01HD091921) ve NIGMS (R01GM152615) tarafından desteklenmektedir. Charlotte Kanzler, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin (T32GM135066) Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü aracılığıyla Biyoteknoloji Eğitim Programı tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 metrekarelik Ağır Hizmet Premium KaplamaSaran2570000130
10x Hücre Lizis TamponuHücre Sinyal Teknolojisi#9803
2-MerkaptoetanolSigma-AldrichM3148
2-Quart Dikdörtlü Pişirme/Servis TabağıBorcam71160010116
2x Laemmli Örnek TamponuBio-Rad#1610737
Anti-HA Yüksek Afiniteli AntikorRoche11867423001Talimatlara uygun hazırlanır ve 1:10.000 seyreltme ile kullanılır.
Anti-Tavşan IgG, HRP ile Bağlantılı AntikorHücre Sinyal Teknolojisi7074S1:30.000 seyreltme ile kullanıldı.
Otoradyografî kaseti, 5 x 7 inçResearch Products International420057Dijital görüntüleme sistemi kullanıyorsanız gerekli değildir.
Bel-Art Tek Kullanımlık HavalananlarMillipore SigmaBAF199230001
Bicaudal-C (insan) tavşan antikoruEnvigo Bioproducts (şimdi Inotiv)YOKÖzel sipariş. 1:20.000 seyreltme ile kullanıldı.
Bicaudal-C (Xenopus) Tavşan AntikoruEnvigo Bioproducts (şimdi Inotiv)YOKÖzel sipariş. 1:20.000 seyreltme ile kullanıldı. Ref. Park ve ark., 2016
Sığır Serum AlbüminiSigma-AldrichA3294Bloklayıcı tampon olarak yağsız sütün yerine geçer.
Santrifüj 5425Eppendorf13-864-456
CL-XPosure FilmThermoFisher Scientific34091Dijital görüntüleme sistemi kullanıyorsanız gerekli değildir.
CNOT1 (D5M1K) Tavşan Monoklonal AntikoruHücre Sinyal Teknolojisi#446131:2.000 seyreltme oranında kullanıldı.
DDX6/RCK (D26C11) Tavşan Monoklonal AntikoruHücre Sinyal Teknolojisi#89881:5.000 seyreltme oranında kullanılır.
E-Z Store ve Pour GeliştiriciMXR Görüntüleme103633Dijital görüntüleme sistemi kullanıyorsanız gerekli değildir.
E-Z Mağazası ve Dökme DüzelticiMXR Görüntüleme114511Dijital görüntüleme sistemi kullanıyorsanız gerekli değildir.
GAPDH Monoklonal AntikorProteinTech60004-1-Ig1:40.000 seyreltme ile kullanıldı.
Jel Serbest BırakıcıBio-Rad#1653320
Keçi Anti-Fare IgG (H+L) İkincil Antikor, HRPInvitrogenA16066Talimatlara uygun hazırlanır ve 1:40.000 seyreltme ile kullanılır.
Buz Paketi, 8 oz, 5 x 3 x 1"UlineS-18256
L-SisteinSigma-AldrichC7352
Tıbbi Film İşlemciKonica MinoltaSRX-101ADijital görüntüleme sistemi kullanıyorsanız gerekli değildir.
Mini-PROTEAN  Kaset Açma KoluBio-Rad#4560000
Mini-PROTEAN  Tetra Dikey Elektroforez HücresiBio-Rad#1658004
MSE PRO 700ml Western Blot Elektroforez TankıMSE MalzemeleriBB2369
Nitroselüloz Zarı, 0.45 & mikro; mBio-Rad#1620115
Yağsız Kuru SütSanalac1570000180
Peroksidaz AfiniSaf Keçi Anti-Fare IgG (H+L)Jackson Immunoresearch112-035-003Talimatlara uygun hazırlanır ve 1:100.000 seyreltme ile kullanılır.
Polisorbat (Ergen) 20Fisher BiyoreagentleriBP337-500
Ponceau SVWR Yaşam BilimleriK793-500ML%0,5 Ponceau S, %1 asetik asit ile yaklaşık bir tahmin yapılabilir
PowerPac Temel Güç KaynağıBio-Rad1645050
PR1MA Değişken Hızlı 2D RockerMidSciR2D-30
Precision Plus Protein Çift Renk Standartları MerdiveniBio-Rad#1610374Tercih ettiğiniz herhangi bir protein merdiveni kullanılabilir.
Saf Selüloz Kromatografi Filtre Kağıdı, 0,35 mmFisher Scientific05-714-4
Western Blot Soyma Tamponunu Geri GetirThermoFisher Scientific#21059
Sodyum KlorürFisher ChemicalS640-10
Depolama Kutusu 300 mLRosti MepalRST46608Nitroselüloz zar blokajı, antikor kuluçkası ve yıkamalar için
SuperSignal West Femto Maksimum Hassasiyet Alt TabakasıThermoFisher Scientific#34094İki bileşen içeren geliştirilmiş kemimilüminesans (ECL) bir substrat: luminol ve güçlendirici. Bu ECL reaktifi düşük femtogram hassasiyetine sahiptir.
SuperSignal West Pico PLUS Kemilyünesan Alt TabakaThermoFisher Scientific#34580İki bileşen içeren geliştirilmiş kemimilüminesans (ECL) bir substrat: luminol ve güçlendirici. Bu ECL reaktifi, pikogramdan femtograma duyarlılığa sahiptir.
SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 4&ntir; %12, 10 Well poliakrilamid jelleriGenScriptM00652
Transfer Tampon TozuGenScriptM00652
Tris Base UltrapureUSBiological77-86-1
Tris-MOPS-SDS Çalışan Tampon TozuGenScriptM00138

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gurdon, J. B., Wickens, M. P. The use of Xenopus oocytes for the expression of cloned genes. Methods Enzymol. 101, 370-386 (1983).
  2. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), (2010).
  3. Coller, J., Wickens, M. Tethered function assays: an adaptable approach to study RNA regulatory proteins. Methods Enzymol. 429, 299-321 (2007).
  4. Minshall, N., Allison, R., Marnef, A., Wilczynska, A., Standart, N. Translational control assessed using the tethered function assay in Xenopus oocytes. Methods. 51 (1), 165-169 (2010).
  5. Zhang, Y., Cooke, A., Park, S., Dewey, C. N., Wickens, M., Sheets, M. D. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
  6. Waghray, S., Williams, C., Coon, J. J., Wickens, M. Xenopus CAF1 requires NOT1-mediated interaction with 4E-T to repress translation in vivo. RNA. 21 (7), 1335-1345 (2015).
  7. Neff, A. W., Wakahara, M., Jurand, A., Malacinski, G. M. Experimental analyses of cytoplasmic rearrangements which follow fertilization and accompany symmetrization of inverted Xenopus eggs. Development. 80 (1), 197-224 (1984).
  8. Newman, K., Aguero, T., King, M. L. Isolation of Xenopus oocytes. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (2), (2018).
  9. Shaidani, N. -I., McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Obtaining Xenopus laevis eggs. Cold Spring Harb Protoc. 2021 (3), (2021).
  10. Shaidani, N. -I., McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Obtaining Xenopus laevis embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2021 (3), (2021).
  11. Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. Development. 77 (1), 15-37 (1983).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dejellying Xenopus laevis embryos. CSH Protoc. 2007, (2007).
  13. Zahn, N., et al. Normal table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), dev200356(2022).
  14. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  15. Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition: reprogramming of the cytoplasm and nucleus. Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).
  16. Park, S., Blaser, S., Marchal, M. A., Houston, D. W., Sheets, M. D. A gradient of maternal Bicaudal-C controls vertebrate embryogenesis via translational repression of mRNAs encoding cell fate regulators. Development. 143 (5), 864-871 (2016).
  17. Bull, A. L. Bicaudal, a genetic factor which affects the polarity of the embryo in Drosophila melanogaster. J Exp Zool. 161 (2), 221-241 (1966).
  18. Mohler, J., Wieschaus, E. F. Dominant maternal-effect mutations of Drosophila melanogaster causing the production of double-abdomen embryos. Genetics. 112 (4), 803-822 (1986).
  19. Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
  20. Minegishi, K., et al. Fluid flow-induced left-right asymmetric decay of Dand5 mRNA in the mouse embryo requires a Bicc1-Ccr4 RNA degradation complex. Nat Commun. 12 (1), 4071(2021).
  21. Maerker, M., et al. Bicc1 and Dicer regulate left-right patterning through post-transcriptional control of the Nodal inhibitor Dand5. Nat Commun. 12 (1), 5482(2021).
  22. Piazzon, N., Maisonneuve, C., Guilleret, I., Rotman, S., Constam, D. B. Bicc1 links the regulation of cAMP signaling in polycystic kidneys to microRNA-induced gene silencing. J Mol Cell Biol. 4 (6), 398-408 (2012).
  23. Kraus, M. R. -C., et al. Two mutations in human BICC1 resulting in Wnt pathway hyperactivity associated with cystic renal dysplasia. Hum Mutat. 33 (1), 86-90 (2012).
  24. Tran, U., et al. The RNA-binding protein Bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
  25. Bouvrette, D. J., Sittaramane, V., Heidel, J. R., Chandrasekhar, A., Bryda, E. C. Knockdown of Bicaudal C in zebrafish (Danio rerio) causes cystic kidneys: a nonmammalian model of polycystic kidney disease. Comp Med. 60 (2), 96-106 (2010).
  26. Mahone, M., Saffman, E. E., Lasko, P. F. Localized Bicaudal-C RNA encodes a protein containing a KH domain, the RNA binding motif of FMR1. EMBO J. 14 (9), 2043-2055 (1995).
  27. Dowdle, M. E., Park, S., Blaser Imboden, S., Fox, C. A., Houston, D. W., Sheets, M. D. A single KH domain in Bicaudal-C links mRNA binding and translational repression functions to maternal development. Development. 146 (10), dev172486(2019).
  28. Saffman, E. E., Styhler, S., Rother, K., Li, W., Richard, S., Lasko, P. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein Bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
  29. Chalabi Hagkarim, N., Grand, R. J. The regulatory properties of the Ccr4-Not complex. Cells. 9 (11), E2379(2020).
  30. Chicoine, J., Benoit, P., Gamberi, C., Paliouras, M., Simonelig, M., Lasko, P. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
  31. Kugler, J. -M., Chicoine, J., Lasko, P. Bicaudal-C associates with a Trailer Hitch/Me31B complex and is required for efficient Gurken secretion. Dev Biol. 328 (1), 160-172 (2009).
  32. Kamenska, A., et al. The DDX6-4E-T interaction mediates translational repression and P-body assembly. Nucleic Acids Res. 44 (13), 6318-6334 (2016).
  33. Ladomery, M., Wade, E., Sommerville, J. Xp54, the Xenopus homologue of human RNA helicase p54, is an integral component of stored mRNP particles in oocytes. Nucleic Acids Res. 25 (5), 965-973 (1997).
  34. Wühr, M., et al. Deep proteomics of the Xenopus laevis egg using an mRNA-derived reference database. Curr Biol. 24 (13), 1467-1475 (2014).
  35. Kurien, B. T., Dorri, Y., Dillon, S., Dsouza, A., Scofield, R. H. An overview of western blotting for determining antibody specificities for immunohistochemistry. Methods Mol Biol. 717, 55-67 (2011).
  36. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting: an introduction. Methods Mol Biol. 1312, 17-30 (2015).
  37. Fisher, M., et al. Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase. Genetics. 224 (1), iyad018(2023).
  38. Baker, M. Antibody anarchy: a call to order. Nature. 527 (7579), 545-551 (2015).
  39. Baker, M. Reproducibility crisis: blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  40. Martin, S. A., Page, S. J., Piccinni, M. Z., Guille, M. J. Confirming antibody specificity in Xenopus. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (12), (2020).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Xenopus EmbriyolarWestern BlotlamaSDS PAGEProtein AnaliziProtein TransferiAntikor nk basyonuKemil minesans TespitProtein Ekspresyonu

İlgili makaleler