Yöntem makalesi

Fare Kalp Dokularından Endozom İzolasyonu ve Kardiyomiyositlerle Birlikte Kültür için Yenilikçi Bir Yöntem

DOI:

10.3791/69146

⸱

10 Ekim 2025

 ,  ,  , 
1Pharmacological and Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Houston

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endozomlar, endositik membran taşıma yolunun bir parçası olan hücre içi sıralama organellerinin bir koleksiyonudur. Otomatik bir nanofiltrasyon ekipmanı kullanarak endozomları kalp dokusundan izole etmek için yeni bir yöntem oluşturduk ve endozomları birincil kardiyomiyositlerle birlikte kültürleyerek hücresel alımını araştırdık.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endozomlar, hücre içi kaçakçılık, sinyal iletimi ve zar geri dönüşümünde önemli roller oynayan zara bağlı organellerdir. Kardiyovasküler biyolojideki işlevleri tanınmaya başlasa da, endozomların kalp dokusundan etkili bir şekilde izole edilmesi önemli bir teknik zorluk olmaya devam etmektedir. Hücre altı fraksiyonlamayı ultra hızlı bir nanofiltrasyon izolasyon platformuyla birleştirerek endozomları fare kalp dokusundan izole etmek için hızlı ve yüksek verimli bir protokol geliştirdik. Bu yöntem, sıralı santrifüjlemeyi, nanofiltrasyonu ve veziküllerin nano gözenekli membran bazlı alımını içerir. İzole endozomlar, western blotlama, dinamik ışık saçılımı (DLS) ve nano akış sitometrisi (NanoFCM) analizi ile karakterize edildi. Biyoaktiviteyi değerlendirmek için saflaştırılmış endozomlar, primer neonatal kardiyomiyositlerle birlikte kültürlendi. Endozomal belirteçler EEA1 ve Rab7, izole veziküllerde oldukça zengindi. DLS analizinde ortalama vezikül çapı 187.30 ± 23.42 nm ve zeta potansiyeli -26.60 ± 5.79 mV (n = 12) olarak saptandı. NanoFCM ölçümü, 100 mg kalp dokusundan yaklaşık 1.07 ± 0.31 × 1012 partikül/mL (n = 12) verdi. Endozomların kardiyomiyositler tarafından fonksiyonel alımı, in vitro ko-kültürü takiben gözlendi, bu da vezikül bütünlüğünün ve aktivitesinin korunduğunu gösterdi. Bu entegre izolasyon platformu, kalp dokularından yüksek saflıkta endozomların ekstraksiyonu için tekrarlanabilir ve etkili bir yöntem sağlar. Protokol, aşağı yönlü biyokimyasal ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırarak, endozomların kardiyovasküler fizyoloji ve hastalıktaki rollerini araştırmak için değerli bir araç sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endozomlar, endositozu, kargo sıralamasını ve sinyal yollarınıdüzenleyen temel hücre içi organellerdir 1,2. Aktive edilmiş sinyal reseptörleri ve diğer aşağı regüle edilmiş proteinler, başlangıçta erken endozomlar (EE'ler) içinde intralümenal veziküllere (ILV'ler) ayrılır ve bunlar daha sonra multiveziküler cisimlere (MVB'ler) veya endozomal taşıyıcı veziküllere (ECV'ler) olgunlaşır. Bu veziküller daha sonra kargoyu lizozomal bozunmaya veya alternatif yollara yönlendirmek için ikincil ayırma merkezleri olarak hizmet eden geç endozomlarla (LE'ler) birleşir. ILV'ler, plazma zarı 3,4 ile endozom füzyonunu takiben eksozomlar olarak da salgılanabilir. Buna paralel olarak, otofaji yolu, geç endositik bölmeler5 ile füzyon üzerine parçalayıcı kapasite kazanan otofagozomlar yoluyla LE'lere sitozolik materyal iletir. Endozomlar artık reseptör geri dönüşümünün6, iyon kanalı lokalizasyonunun7, eksozom biyogenezinin8 ve hücreler arası iletişim9 süreçlerinin kritik düzenleyicileri olarak kabul edilmektedir - özellikle nöronlar ve kardiyomiyositler gibi özel hücrelerle ilgilidir.

Ortaya çıkan kanıtlar, endozomal yolların kardiyovasküler fonksiyondaki önemli rolünü vurgulamıştır. Eps15 Homoloji Alanı proteini 3 (EHD3), Na+/Ca2+ değiştirici ve L-tipiCa2+ kanalları dahil olmak üzere önemli kardiyak iyon taşıyıcılarının endozomal geri dönüşümünü düzenler. Farelerde EHD3 eksikliği bradikardi, iletim anomalileri ve değişmişCa2+ kullanımına yol açar10. Vasküler düz kas hücrelerinde fonksiyonel endozom-lizozom trafiği, kronik böbrek hastalığı ve ateroskleroz ile ilgili olan fosfat kaynaklı medial kalsifikasyonu önler11. Bununla birlikte, endozomların kardiyovasküler hastalıklardaki fonksiyonel rolleri ve terapötik hedefler olarak potansiyelleri tam olarak anlaşılamamıştır ve bu da daha fazla araştırmayı gerektirmektedir.

Birden fazla yöntem, fonksiyonel olarak sağlam endozomların biyokimyasal izolasyonunu sağlamıştır. Marsh ve meslektaşları, asitleşmelerini ve yapısal bütünlüklerini koruyarak erken ve geç endozomları geri kazanmak için ilk olarak yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeyi serbest akışlı elektroforez ile birleştirdiler12. Sükroz gradyan yaklaşımı gibi son metodolojiler, aşağı akış proteomik ve lipidomik çalışmalar için gerekli olan erken ve geç endozomal popülasyonları ayırmak için standart bir yol sunar13. Spin-kolon tabanlı ticari kitler, yüksek verimli uygulamalar için geliştirilmiştir.

Otomatik ultra hızlı izolasyon sistemi aracılığıyla eksozom izolasyonu, biyoakışkanlardan14 yüksek saflıkta eksozomların izolasyonunu sağlamak için periyodik negatif basınç salınımı ve çift bağlantılı harmonik salınımlarla entegre edilmiş çift membranlı bir nanofiltrasyon sistemine sahip yenilikçi ultrasonik nanofiltrasyon teknolojisini kullanır. Burada, fare kalp dokusundan yüksek verim ve yüksek saflıkta hızlı endozom izolasyonu için yeni bir yöntem elde etmek için otomatik ultra hızlı izolasyon sistemini kullanarak hücre altı fraksiyonasyonu endozom izolasyonu ile birleştirdik.

Ayrıca, ekstrakte edilen endozomları in vitro olarak primer kardiyomiyositler (CM) ile birlikte kültürledik ve eksojen endozomların CM'ye başarılı bir şekilde girdiğini bulduk. Endozom lokalize proteini Numb'un mCherry kırmızı floresan proteini15,16 ile kaynaştırıldığı bir endozom raportörü kullanarak, CM'lerin içinde punkta desenli lokalize mCherry floresansı gözlemledik.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Yönergeleri izlenerek ve Houston Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirildi.

NOT: İzolasyon prosedürüne başlamadan önce, gerekli tüm tamponların taze olarak hazırlandığından ve 4 °C'ye soğutulduğundan emin olmak önemlidir. Sterilize edilmiş aletler, doku kültürü plakaları ve uygun tüpler, aksi belirtilmedikçe tüm malzemeler buz üzerinde veya 4 °C'de tutularak belirlenmiş iş istasyonlarında düzenlenmelidir. Santrifüjler ve rotorlar, kullanımdan önce en az 2-3 saat boyunca 4 °C'ye dengelenmelidir. Fraksiyonasyon tamponu deney gününden önce hazırlanmalı ve 4 °C'de saklanmalı ve deney sırasında ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde tutulmalıdır. Aksi belirtilmedikçe, tüm inkübasyon ve santrifüjleme adımları 4 °C'de gerçekleştirilmelidir.

1. Kalp lizatı hazırlama

  1. Cerrahi alanı %70 etanol kullanarak dezenfekte edin, ardından çalışma yüzeyine sterilize edilmiş cerrahi aletlerin yerleştirildiği steril bir emici ped yerleştirin.
  2. Fareleri ötenazi yapın (C57BL / 6 erkek, 8-12 hafta, 20-25 g ve mCherry: NumbKI erkekleri, 8-12 hafta, 20-25 g) CO2 inhalasyonu yoluyla (% 10-30 CO2 3-5 dakika boyunca) veya ilgili kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylanan alternatif bir yöntemle.
    DİKKAT: Lütfen açık bir alanda çalıştırın ve sızıntıyı önlemek içinCO2 tüpünün zamanında kapandığından emin olun. Bilinç kaybını ve uygun prosedürü doğrulamak için ötenazi sırasında fareler izlenmelidir. Bilincini kaybettikten sonra, ölümü sağlamak için servikal çıkık, torakotomi veya kan kaybı gibi ikincil bir yöntem kullanın.
  3. Fareyi sırtüstü pozisyonda konumlandırın ve göğüs bölgesini %70 etanol ile temizleyin.
    1. Kalbi toplamak için göğüs boşluğunu hızla açın ve kalbi buz üzerine yerleştirilmiş 60 mm'lik bir kapta buz gibi Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisine (HBSS) aktarın.
    2. Kalan kanı cımbız kullanarak kalp odacıklarından nazikçe çıkarın ve odacıklarda kan kalmayana kadar kalbi çok iyi yıkayın. İşlem boyunca kalbi buzda tutun.
      NOT: Pozitif kontrol olarak western blot (WB) analizi için 50-100 mg kalp dokusu kaydedin. Kalp, sıvı nitrojen içinde dondurulabilir ve -80 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
  4. Buz üzerinde 50 mL'lik bir tüpe 8 mL fraksiyonasyon tamponu (Tablo 1) ekleyin. 100-120 mg taze veya dondurulmuş fare kalp dokusunu fraksiyonasyon tamponunu içeren bir tüpe aktarın.
    NOT: Fare kalp dokusunun herhangi bir kısmı endozomları çıkarmak için kullanılabilir. Sonraki analizler için yeterli endozom elde etmek için minimum 100 mg kalp dokusu gereklidir. Deney grupları arasında tutarlılığı sağlamak için, Fraksiyonasyon Tamponuna eklenmeden önce doku doğru bir şekilde tartılmalıdır.
    DİKKAT: Vücutla doğrudan teması önlemek için fraksiyonasyon tamponunu çalıştırırken uygun KKD giyin.
  5. Dokuyu her zaman buz üzerinde fraksiyonasyon tamponunda mikrocerrahi makası kullanarak yaklaşık 1 mm3 parçaya bölün.
  6. Elektrikli homojenizatör ile orta hızda, 40 sn'lik bir çalışma 30 sn'lik bir durma döngüsünde homojenize edin. 5-7 döngü için homojenize edin (Şekil 1A).
    NOT: Kapsamlı bir homojenizasyon işlemi gereklidir ve endozomların nihai konsantrasyonunu artırmaya yardımcı olacaktır.
  7. Homojenize kalp lizatını buzlu su banyosunda ultrasonik banyo ile 10 dakika boyunca sonikleştirin (Şekil 1A).

2. Hücre altı fraksiyonlama

  1. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünün üzerine 40 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve homojenize kalp lizatını süzgeçten süzün (Şekil 1A).
  2. Nükleer pelet için: kalp lizatını 1.000 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aktarın ve yeni etiketli bir tüpe yerleştirin.
    NOT: Nükleer fraksiyon olan peleti toplayın ve WB için nükleer fraksiyon gerekiyorsa nükleer peleti 200 μL WB Lizis Tamponunda yeniden süspanse edin. Nükleer peleti radyo immünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu ile 20 kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyin ve 10 dakika boyunca sonikasyon yapın. Nükleer lizatı 10 dakika boyunca 14.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın. Adım 2.2 isteğe bağlıdır; Sadece veziküller gerekliyse atlanabilir.
  3. Mitokondriyal fraksiyon için: süpernatanı 4 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 × g'da tekrar santrifüjleyin. Pelet, mitokondriyal fraksiyonu içerir. Süpernatanı aktarın ve yeni bir ultrasantrifüjlenmiş tüpe yerleştirin.
    NOT: WB için bir mitokondriyal fraksiyon isteniyorsa, peleti önceki NOT'ta açıklandığı gibi adım 2.2 olarak kaydedin.
  4. Tüpleri dikkatlice dengeleyin. Her tüpü tartın ve eşit ağırlık sağlamak için daha hafif tüpe ek soğuk fraksiyonasyon tamponu ekleyin. Ultrasantrifüj rotorunu ve adaptörlerini 4 °C'de 2-3 saat önceden soğutun. Süpernatanı 4 °C'de 30 dakika boyunca 160.000 × g'da ultrasantrifüjleyin.
    NOT: Ultrasantrifüjleme adımı sırasında, tüm ultrasantrifüj tüplerinin uygun şekilde dengelendiğinden ve jantın yaklaşık 0,5-1 cm altına kadar tamponla doldurulduğundan emin olmak çok önemlidir. Yetersiz doldurma, uygulanan yüksek merkezkaç kuvvetleri nedeniyle tüpün deformasyonuna veya çökmesine neden olabilir.
  5. Süpernatanı yeni bir tüpe çıkarın. Süpernatan endozomlar içerir. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünün üzerine 0,45 μm'lik bir şırınga filtresine bağlı 10 mL'lik bir şırınga yerleştirin ve süpernatanı tüpe süzün. Çözeltiyi seyreltmek ve filtrenin tıkanmasını önlemek için 5 mL sterilize PBS tamponu ekleyin.
    NOT: Filtreleme adımı, izolasyon adımlarına başlarken süpernatanttaki tüm endozomların <450 nm olmasını sağlar.
  6. Peleti adım 2.4'ten itibaren 5 mL sterilize PBS tamponu ile yeniden süspanse edin ve peleti iyice karıştırmak için en az 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Pelet, diğer hücre içi vezikülleri içerir. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünün üzerine 0,45 μm'lik bir şırınga filtresine bağlı 10 mL'lik bir şırınga yerleştirin ve pelet çözeltisini tüpe süzün. Çözeltiyi seyreltmek ve filtrenin tıkanmasını önlemek için ilave 5 mL sterilize PBS tamponu ekleyin.
    NOT: Filtreleme adımı, izolasyon adımlarına başlarken peletteki tüm veziküllerin <450 nm olmasını sağlar.

3. Endozomların ve diğer hücre içi veziküllerin izolasyon süreci

  1. Adım 2.5'ten filtrelenmiş süpernatanı ve adım 2.6'dan filtrelenmiş pelet çözeltisini sterilize edilmiş PBS tamponu ile sırasıyla 50 mL'lik tüplerde 30 mL'lik bir nihai hacme kadar seyreltin. Numuneleri 4 °C'de saklayın (Şekil 1A).
    NOT: Numuneler 4 °C'de 24 saat saklanabilir. Aşağıdaki adımları aynı gün gerçekleştirmek için yeterli zaman yoksa, 4 °C'de buzdolabında saklanabilir ve ardından deneye devam etmek için ertesi günü bekleyebilirler.
  2. Cihazı açın ve genellikle 20 dakika süren günlük temizlik programını başlatın.
  3. İzolasyon için Orta EXODUS izolasyon cihazını (M EID) seçin. 50 mL'lik bir tüp adaptörü takın ve numunenin bulunduğu 50 mL'lik tüpü numune konumuna getirin. Ekranda EID'ye dokunun ve M EID'yi yükleyin.
    NOT: Orta EID, 20-50 mL'lik bir numune içindir ve 30 mL önerir.
  4. Programı ayarla:
    1. Numune adını ve numune hacmini girin.
    2. Örnek türünü seçin: Plazma.
    3. Program seçiniz: Plazma. Güçlü-MA. A03.
    4. Bir santrifüj tüpü seçin: 50 mL.
    5. Yüksek Saflık Modu'nu açın.
    6. Program Seçeneği 3000'i seçin.
    7. Başlamak için Tamam'a dokunun.
      NOT: Tüm izolasyon işleminin tamamlanması 1-2 saat sürer. Daha yüksek bir numune konsantrasyonu daha uzun zaman alacaktır.
  5. Endozomları ve diğer hücre içi vezikülleri kurtarın:
    1. EID'yi alın ve sonraki adımlar için kaputa getirin.
    2. 200 μL sterilize PBS tamponunu 200 μL'lik bir pipetle EID'ye aktarın. Nano gözenekli zarın her iki tarafını sırasıyla 20 kez durulayın.
    3. Endozomları veya diğer hücre içi vezikülleri toplayın, 1.5 mL'lik bir tüpte 200 μL'de yeniden süspanse edin. 24-48 saat kullanılıyorsa 4 °C'de, uzun süreli saklama için -80 °C'de saklayın.
      NOT: Elüat, endozomları veya diğer hücre içi vezikülleri içerir ve kardiyomiyositlerle daha ileri analiz ve birlikte kültür için kullanılır. Endozom numunesi, elde edilen verilere göre -80 °C'de 5 ay saklandığında stabildir.
  6. WB için endozomları ve diğer hücre içi vezikülleri ayrıştırın:
    1. EID'yi alın. 80 μL WB lizis tamponunu EID'ye aktarın. Nano gözenekli zarın her iki tarafını sırasıyla 20 kez durulayın.
    2. Tam çözünmeyi sağlamak için EID'yi buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, her 10 dakikada bir EID'nin içinde pipet tamponu kullanın. Endozomları veya diğer hücre içi vezikülleri 1.5 mL'lik tüplerde toplayın. 4°C'de 14.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Uzun süreli depolama için süpernatanı -80 °C'de toplayın ve saklayın. Tüpte herhangi bir pelet kalırsa peleti atın.

4. Endozom protein ölçümü ve vezikül karakterizasyonu

  1. Western blot analizi
    1. Bir bisinkoninik asit (BCA) testi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçmek için her numuneden 5 μL tasarruf edin.
    2. Numuneleri 4× Laemmli numune tamponunda seyreltin ve vorteksleyerek iyice karıştırın. Proteinleri denatüre etmek için numuneleri 95 °C'de 10 dakika ısıtın.
    3. Denatüre numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 14.000 × g'da santrifüjleyin ve elde edilen süpernatanı analiz için toplayın.
    4. Poliakrilamid jelleri elektroforez aparatına monte edin ve hazneyi sodyum dodesil sülfat (SDS) çalışma tamponu ile doldurun.
    5. Hedef proteinlerin moleküler ağırlığına göre uygun bir akrilamid yüzdesi seçerek jelin üzerine bir moleküler ağırlık işaretleyici ve hazırlanan protein numuneleri yükleyin.
      NOT: Tipik olarak, hem kalp dokusu lizatları hem de endozom lizatları için kuyu başına 20 μg protein yüklenir.
    6. Jeli yaklaşık 120 dakika boyunca veya boya cephesi jelin dibine ulaşana kadar 6 V'ta çalıştırın.
    7. Bir western blot transfer sistemi kullanarak proteinleri jelden bir poliviniliden florür (PVDF) membranına aktarın.
      NOT: Islak transfer yöntemi de işe yarar.
    8. PVDF membranını% 0.05 Tween-20 (TBST) içeren Tris tamponlu salin ile kısaca durulayın.
    9. Membranı, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 1 sığır serum albümini (BSA) ile desteklenmiş TBST ile bloke edin.
    10. Membranı, seçilen endozomal belirtece özgü birincil antikor (Malzeme Tablosu) ile 4 ° C'de gece boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin.
    11. Ertesi gün, membranı TBST ile üç kez yıkayın, her yıkama oda sıcaklığında bir rocker üzerinde 10 dakika sürer.
      NOT: Spesifik olmayan arka planı azaltmak için uygun yıkama şarttır; Membranın işlem boyunca tamamen nemli kalmasını sağlayın.
    12. Membranı uygun ikincil antikorla (Malzeme Tablosu) oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    13. Membranı TBST ile üç kez yıkayın, her yıkama oda sıcaklığında bir külbütör üzerinde 10 dakika sürer.
    14. Antikora bağlı proteinlerin tespiti için membrana kemilüminesan substrat uygulayın.
    15. Membranı ortaya çıkarmak ve proteinlerin görüntülerini almak için bir jel görüntüleme sistemi kullanmak.
  2. Dinamik ışık saçılımı (DLS) analizi
    1. Endozomların partikül boyutu ve zeta potansiyeli, dinamik ışık saçılımı (DLS) tekniği17 kullanılarak ölçülür. Kalliope yazılım sürümü 2.10.4 ile donatılmış bir Litesizer 500 (Anton Paar) kullanarak. DLS ölçümleri, 25 °C'de 90° algılama açısına sahip 658 nm lazer kullanılarak üç kopya halinde gerçekleştirilir.
    2. Ultra saf suda "boyut standart nanoküreleri" seyreltin, tek kullanımlık küvete 1 mL hacim ekleyin ve hazneye yerleştirin.
      NOT: Bilinmeyen numunenin beklenen boyutuna göre standart nanoküreler (küçük veya büyük) kullanın.
    3. DLS yazılımını açın ve yeni ölçüm sekmesine tıklayın. Ölçüm modundan partikül boyutunu seçin. Dosyayı Başlıksız alanına adlandırın ve giriş parametrelerini (çözücü, sıcaklık vb.) girin ve başlat'a tıklayın. Standart parçacıkların boyutunu belirledikten sonra küveti hazneden çıkarın.
    4. Ultra saf suda "zeta potansiyel referans malzemesini" seyreltin, zeta potansiyeli omega küvetine yerleştirin ve küvet odasına yerleştirin. Yazılımdaki yeni ölçüm sekmesine tıklayın. Ölçüm modundan zeta potansiyelini seçin. Dosyayı Başlıksız alana adlandırın ve giriş parametrelerini (solvent, sıcaklık vb.) girin ve başlat'a tıklayın.
    5. Endozomların partikül boyutunun ve zeta potansiyelinin belirlenmesi için endozom numunesini ultra saf suyla seyreltin, ilgili küvetlere koyun ve küvet odasına yerleştirin. Ölçümleri standartlar için açıklandığı şekilde yapın.
      NOT: Bilinmeyen numunelerin ultra saf sudaki konsantrasyonuna göre seyreltilmesini sağlayın.
  3. NanoFCM analizi
    NOT: Endozom partikül konsantrasyonları, Professional Suite V2.3 yazılımı ile NanoFCM Flow NanoAnalyzer kullanılarak belirlenir18. Parçacık sinyali alımı, %0,2 SS bozunması ile 20 mW'a ayarlanmış 488 nm mavi lazer ve/veya %10 SS bozunması ile 8 mW'a ayarlanmış 638 nm kırmızı lazer kullanılarak, 1,0 kPa'lık bir örnekleme basıncında 2 dakika boyunca gerçekleştirilir. Numune, yerçekimi beslemesi yoluyla kılıf sıvısı olarak ultrapur su kullanılarak 1.4 μm'ye odaklanır. Optimum lazer hizalaması, silika nanoküre kokteyli QC boncukları (S16M-Exo) kullanılarak test edilir ve kalibre edilir. Boyut kalibrasyon ölçümleri, analizden önce S16M-Exo boyutunda standart boncuklar (bilinen konsantrasyonu 2,17 × 10 olan 68, 91, 113 ve 155 nm çapında parçacıklar içeren silika nanopartikül kokteyli) kullanılarak gerçekleştirilir.10/mL).
    1. Konsantrasyon standardı edinimi:
      1. NanoFCM'nin akışkanlarını başlatın ve başlatın. QC boncuklarını (1:100) 0,22 μm membranla filtrelenmiş ultra saf suda seyreltin, 0,5 mL'lik bir tüpe ekleyin ve yükleme bölmesine yerleştirin. Sample Inf açılır menüsünden QC FL SiNP'leri seçin ve QC boncuk numunesinin seyreltme faktörünü girin.
      2. Numune Akışı açılır menüsünden, QC örneğini yüksek hızda vermek için güçlendirmeyi seçin ve temizleme solüsyonunu 45 saniye boyunca sistemden çıkarın. Güçlendirme sırasında, lazer gücünü %0,2 SS bozulması ile 488 nm mavi lazer için 20/50 mV ve 638 nm kırmızı lazer için 20/100 mW'a ayarlayın.
      3. Sample Flow açılır menüsünden samplamayı seçin ve büyük sinyal için eşik ayarı yapın. Örnekleme sırasında, sinyal yoğunlaştırma merceği hizalamasını manuel olarak ve gerekirse yazılımdan lazer odaklama merceği hizalamasını ayarlayın. Büyük bir sinyal için otomatik eşik ayarı, yan saçılma kanalı için 50-120 arasında ve her iki floresan kanalı için 75'in altında kalmalıdır.
      4. 120 sn boyunca veri almak için Kayıt Süresi'ni tıklatın. Verileri alırken ilgilenilen bölgenin (ROI) 1500-15000 arasında olmasına dikkat edin. Sonuç dosyasını "nfa" uzantılı açılır klasöre kaydedin ve numune tüpünü boşaltın.
        NOT: Her s'den sonraample, işlenmiş s'yi çıkarmak için temizleme solüsyonu (1x) kullanınamp45 saniye boyunca güçlendirerek borudan çıkarın. Ardından, bir sonraki numuneyi yüklemeden önce kılcal damarın dışından kalan temizleme solüsyonunu çıkarmak için kılcal ucu ultrpure suya batırın.
    2. Boyut standardı edinimi:
      1. "Boyut standart boncukları" (1:100) 0,22 μm membran filtreli ultrpaure suyunda seyreltin ve yükleme bölmesine yerleştirin. Sample Inf açılır menüsünden 68-155 S16M-Exo'yu seçin ve boyut standart boncuk numunesinin seyreltme faktörünü girin.
      2. Sample Flow açılır menüsünden, boyut standart boncuklarını tanıtmak ve temizleme solüsyonunu 45 sn'lik bir süre boyunca sistemden çıkarmak için güçlendirmeyi seçin. Artırırken, lazer gücünü %10 SS bozulması ile 488 nm mavi lazer için 8/50 mV ve 638 nm kırmızı lazer için 20/100 mW'a ayarlayın.
      3. Sample Flow açılır menüsünden Sampling öğesini seçin ve küçük bir sinyal için eşik ayarı yapın. Pencerede dört farklı tepe noktası (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) görünmelidir. 120 sn boyunca veri almak için Kayıt Süresi'ni tıklatın. Sonuç dosyasını "nfa" uzantılı açılır klasöre kaydedin ve numune tüpünü boşaltın.
    3. Boş standart edinimi:
      1. Ölçümü yukarıda anlatılanla aynı işlemde almak için ultra saf su veya (numunenin tamponu/seyrelticisi) kullanın, dosyayı "boş" adıyla "nfa" uzantılı klasöre kaydedin ve numune tüpünü boşaltın.
    4. Endozomların partikül konsantrasyonunun belirlenmesi
      1. Endozom örneğini ultra saf suyla seyreltin ve yükleme bölmesine yerleştirin.
      2. Numuneyi güçlendirdikten ve örnekledikten sonra, ölçümleri başlatmak için Kaydetme Süresi'ni tıklatın. Yan saçılma kanalı için eşik 50-120 aralığında değilse veya ROI 15.000'den fazlaysa, numuneyi seyreltmeyi düşünün.
    5. Veri analizi:
      1. Yazılımdaki Edinme sekmesinden Analiz sekmesine geçin ve kaydedilen "nfa" dosyalarını açın. FL SnNPs.nfa date__QC QC sonuçlarının kaydedilmiş dosyasını açarak konsantrasyon standardını ayarlayın, eşik ayarlama aracına tıklayarak büyük sinyalde eşiği ayarlayın.
      2. Daire geçit aracını kullanarak partikül konsantrasyonunu seçin. Pencereyi kapatmadan önce STD'yi Say'a tıklayın ve QC boncuklarının konsantrasyonunu (2,17 × 1010/mL) kontrol edin.
      3. Boyut standardını ayarlamak için date_68-155 S16M-Exo.nfa dosyasını açın. Standart eğri oluşturma penceresini açmak için Boyut aracına tıklayın ve eşik ayarlama aracına tıklayarak küçük sinyal için eşiği ayarlayın.
      4. Kullanıcı Tanımlı açılır menüsünden S16 exo 68-155 nm'yi seçin. Dört boyutlu popülasyonların en yüksek SS yoğunluklarını belirlemek için Zirveleri Bul'a tıklayın.
      5. Boş dosyayı seçin ve numunenin kaldırılması için yanlış pozitiflerin sayısını belirlemek için Boş Bırak'a tıklayın. Endozom konsantrasyonunu analiz etmek için önce numuneyi seçin ve eşik ayarlama aracına tıklayarak eşiği küçük bir sinyale ayarlayın. Niceliksel verileri boyut (nm) ve konsantrasyon (partikül/mL) raporu olarak sunun.

5. Birincil kardiyomiyosit kültürü

NOT: 50'ye kadar yenidoğan fare veya sıçan kalbinden kardiyomiyositlerin izolasyonu için yeterli reaktifler sağlayan bir birincil kardiyomiyosit izolasyon kiti kullanarak kardiyomiyositleri izole edin. Kit ayrıca birincil kardiyomiyosit kültürünü desteklemek için uygun bileşenleri içerir. Hücreleri rahatsız etmemek için tüm ortamlar ve tamponlar dikkatle çıkarılmalıdır. 1000 μL'lik bir pipet ucu kullanılarak manuel pipetleme önerilir, vakum aspirasyonundan kaçınılmalıdır. Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), işleme başlamadan önce 4 °C'ye kadar önceden soğutulmalıdır.

  1. Kitte bulunan Kardiyomiyosit İzolasyon Enzimi 1'i (papain içeren) 2 ekleyerek sulandırın. Bir şişeye mL soğutulmuş HBSS. Yaklaşık 5 dakika veya enzim tamamen eriyene kadar hafifçe karıştırın. İşlem boyunca enzim solüsyonunu buz üzerinde tutun.
    NOT: Sulandırılmış Enzim 1'in tek bir şişesi, 10 yenidoğan kalbinden kardiyomiyositlerin izolasyonu için yeterlidir. -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir ve iki donma-çözülme döngüsü boyunca stabildir. 4 °C'de saklanırsa, enzimatik aktiviteyi sağlamak için çözelti 1 hafta içinde kullanılmalıdır.
  2. Yeni diseke edilmiş yenidoğan kalplerini ayrı ayrı steril 1'e yerleştirin. mL mikrosantrifüj tüpleri ve hemen her tüpe 500 μL buz gibi soğuk HBSS ekleyin.
    NOT: Verimi ve tekrarlanabilirliği en üst düzeye çıkarmak için tüp başına bir kalbin işlenmesi önerilir.
  3. Steril diseksiyon makası kullanarak kalp dokusunu 1 mm³ parçalara ayırın. Kalan kanı çıkarmak için her numuneyi 500 μL buz gibi soğuk HBSS ile iki kez yıkayın.
  4. Her tüpe, kitte bulunan 200 μL sulandırılmış Kardiyomiyosit İzolasyon Enzimi 1 (papain) ve 10 μL Kardiyomiyosit İzolasyon Enzimi 2 (termolizin içeren) ekleyin. Tüpleri yavaşça karıştırın ve 37 °C'de 30-35 dakika inkübe edin.
    NOT: Kardiyomiyosit İzolasyon Enzimi 2, HBSS'de bir süspansiyon olarak sağlanır ve kullanımdan önce buz üzerinde çözülmelidir. Numunelere eklenmeden önce düzgün bir süspansiyon sağlamak için enzimi yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin.
  5. Enzimatik sindirimin ardından, enzim çözeltisini dikkatlice aspire edin ve her numuneyi 500 μL buz gibi soğuk HBSS ile iki kez yıkayın.
  6. Her tüpe Birincil Hücre İzolasyonu için mL Tam DMEM ekleyin. Steril 1,0 mL'lik bir pipet ucu kullanarak 25-30 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuyu nazikçe öğütün. Bu adım sırasında hava kabarcığı oluşumunu en aza indirin.
    NOT: Pipetleme yoluyla dokuyu bozmak hücre verimini artırır. Ancak aşırı pipetleme hücre hasarına yol açabilir.
  7. Süpernatanı 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  8. Complete DMEM'i bir pipetle dikkatlice çıkarın. Tüpe 1 mL taze Tam DMEM ekleyin ve steril 1,0 mL'lik bir pipet ucu kullanarak 25-30 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Pipetleme sırasında hava kabarcıklarından kaçının.
  9. Doku esas olarak tek hücreli bir süspansiyon olduktan sonra, toplam hacmi 1,5 mL'ye getirmek için her tüpe birincil hücre izolasyonu için 0,5 mL Tam DMEM ekleyin. Hücre konsantrasyonunun ve hücre canlılığının belirlenmesi için tek tek hücre süspansiyonlarını birleştirin.

6. Kardiyomiyositlerle birlikte kültür endozomu

  1. Kardiyomiyositleri 60 mm'lik bir kaba ekin ve toplam hacme Tam DMEM ekleyin.
    NOT: Her yenidoğan fare kalbinin bir tabağa ekilmesi ve her kuyucuğun toplam hacminin 5 mL olması beklenir (Şekil 1B).
  2. 60 mm'lik kabı 37 °C'de %5CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra, ortamı 1000x seyreltilmiş Kardiyomiyosit Büyüme Takviyesi içeren Birincil Hücre İzolasyonu için eşdeğer hacimde taze Tam DMEM ile değiştirin.
  3. Adım 3 ile üretilen endozom elüatını 1 saat boyunca -80 °C'den -20 °C'ye aktarın. Ardından, endozomları buza koyun ve yavaş yavaş çözün.
    NOT: Buz üzerinde kademeli olarak çözülme, endozomların zarını daha sağlam hale getirebilir ve bozulmayı azaltabilir.
  4. 48 saat sonra, her 100 μL endozom elüatını 5 mL taze Tam DMEM ile karıştırın ve her tabaktaki eski ortamı değiştirin. 24 saat boyunca kardiyomiyositlerle birlikte kültür endozomları.
  5. Kardiyomiyositleri 2 mL soğuk steril PBS ile yıkayın. 80-100 μL lizis tamponu ile her tabağa buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin. Soğuk plastik bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kazıyın ve hücreleri 1,5 mL'lik tüplerde toplayın.
  6. Adım 4.1'de açıklanan WB protokolünü gerçekleştirin.
  7. İmmün boyama (IF) için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
    1. Kardiyomiyositleri 8 oyuklu odacıklı bir slaytta tohumlayın. Tek hücreli süspansiyonu tamamlanmış DMEM ile 1.5 mL'den 3 mL'ye seyreltin.
    2. Her odaya 300 μL süspansiyon tohumlayın. 6.2-6.4 arasındaki adımları tekrarlayın.
    3. Kardiyomiyositleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 200 μL% 4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin ve üç kez 200 μL steril PBS ile yıkayın. 8 oyuklu hazneli sürgü IF için hazırdır.
      DİKKAT: %4 PFA ile çalışırken lütfen uygun KKD giyin. Lütfen kullanımdan sonra %4 PFA'yı uygun bir kapta atın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beş grup arasında erken endozomlar, geç endozomlar, lizozomlar ve otofagozomlar için belirteçlerin ekspresyon seviyelerini inceledik: kalp dokusu lizatı, nükleer fraksiyon, mitokondriyal fraksiyon, adım 2.6 ve adım 3.6'daki diğer hücre içi veziküller ve adım 2.5 ve adım 3.6'daki endozomlar. Western blot sonucu, EEA1'in (Erken Endozom Antijeni 1) endozomlarda en yüksek ekspresyon seviyesine sahip olduğunu ve diğer gruplarda neredeyse hiç eksprese edilmediğini gösterdi (Şekil 2A,B).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, hücre altı fraksiyonasyonu ultra hızlı bir izolasyon platformu14 ile birleştirerek fare kalp dokularından yüksek saflıkta endozomları izole etmek için hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme12 veya immün izolasyon gibi endozom izolasyonu için geleneksel yaklaşımlar genellikle zaman ve emek yoğundur ve büyük miktarlarda doku veya özel antikorlar gerektirir. Mekanik homojenizasyon protokol...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü hibesi 2R01HL121700-06A1 ve R01HL172834-01 MW'ye, Amerikan Kalp Derneği 24TPA1303770 ve 25EIA1422015 hibesi MW ABD'ye EPA84045701 XL'ye

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
µ-Slide 8 Kuyu yüksekaynı eser80806-90
1,5 mL dereceli mikrosantrifüj tüpüABD Bilimsel1615-5500
10x Tris/Glisin TamponuBiyo Rad1610734
4x Laemmli Numune TamponuBiyo Rad1610747
Tezgah üstü santrifüjEppendorf BelediyesiEppendorf Santrifüj 5810R
Sığır serumu albümin SigmaA9418 Serisi
hücre süzgeciCorningCLS431750Gözenek boyutu 40  μ m, steril
CELLSTAR Doku Kültürü KaplarıVWR82050-546Polistiren, Steril, 60 mm ´ 15 mm
ChemiDoc görüntüleme sistemiBiyo RadKimyasal Belge XRS+
Temizleme solüsyonuNanoFCM17159
Pierce Birincil Hücre İzolasyon Kitleri için DMEMFisher BilimselPI88287
DTTFisher BilimselBP172 Serisi
Dulbecco' fosfat tamponlu salin (PBS)Termo Bilimsel10010023
ECL western blot tespit reaktifiBiyo Rad1705061
EDTASigmaE4884
AÇA1Hücre sinyali3288'LERDünya Bankası (1:1000)
EGTASigmaE-4378-25
bayramEXODUSMA03 BAYRAMI
ERp72Hücre sinyali5033'LERDünya Bankası (1:1000)
EtanolUH Araştırma Mağazası200 Kanıt, 5 Galon
ÇIKIŞ H-600EXODUSH-600 Serisi
GAPDHProtein teknolojisi10494-1-APDünya Bankası (1:5000)
Hank' dengeli tuz çözeltisi (HBSS)Termo Bilimsel14175095
HEPESSigmaH3375 Serisi
HomojenizatörFisher Bilimsel15340167
KartalSigmaP3911
Lamba1AbcamAB320851Dünya Bankası (1:2000)
LC3 SerisiHücre sinyali2775'LERDünya Bankası (1:1000)
Litesizer 500 Anton PaarLitesizer 500Diğer ekipmanlar gibi Zetasizer (Malvern) veya DLS  (Wyatt) kullanılabilir
mKirazBiorbyt Hakkındaküre66657Dünya Bankası (1:500)
MgCl2Fisher BilimselBP214-500 Serisi
NaClSigmaS7653 Serisi
NanoFCMNanoFCMAkış NanoAnalizörü
Nanoküre Boyut StandartlarıTermo Bilimsel3020A
Nikon AXR eş odaklı mikroskopNikonAXR
PBS'de %4 paraformaldehit çözeltisiSanta Cruz BiyoteknolojiSC-281692
Phalloidin Etiketleme ProblarıDavetliA22284EĞER (1:500)
Pierce BCA Protein Test KitleriTermo Bilimsel23227
Pierce Primer Kardiyomiyosit İzolasyon KitiTermo Bilimsel88028
Polietersülfon şırınga filtresiKırlangıçSLHPR33RSGözenek boyutu 0.45  μ m, steril
Prekast Protein JelleriBiyo Rad4561093
Kalite Kontrol BoncuklarıNanoFCMQS2503 Serisi
Rab7Hücre sinyali9367'LERDünya Bankası (1:1000)
RIPA Lizis ve Ekstraksiyon TamponuTermo Bilimsel89900
Roche PhosSTOP (PI Kokteyli)Roche4906837001
Silika NanokürelerNanoFCMS16M-EXO
SakarozSigma84097
Sallanan kova rotoruBeckman CoulterSW55Ti
Trans-Blot Turbo Transfer Sistemi RTA Transfer KitleriBiyo Rad1704270
Ara 20Biyo Rad1662404
UltrasantrifüjBeckman CoulterOptima XE-90
Ultrasantrifüj tüpler Beckman Coulter326819
Ultrasonik Temizleme BanyosuBranson UltrasonikCPX952238R
VWR Tüp Cent 50 mLVWR89039-656
VWR Tüp Santrifüj 15 mLVWR89039-666
Zeta Potansiyel Referans MateryaliAnton Paar175108

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 679-696 (2018).
  2. Gould, G. W., Lippincott-Schwartz, J. New roles for endosomes: from vesicular carriers to multi-purpose platforms. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (4), 287-292 (2009).
  3. Bissig, C., Gruenberg, J. Lipid sorting and multivesicular endosome biogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (10), a016816(2013).
  4. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
  5. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: origins unknown, biogenesis complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 759-774 (2013).
  6. Singh, J., et al. Endosome transcriptomics reveal trafficking of Cajal bodies into multivesicular bodies. bioRxiv. , (2025).
  7. Scott, C. C., Gruenberg, J. Ion flux and the function of endosomes and lysosomes: pH is just the start: the flux of ions across endosomal membranes influences endosome function not only through regulation of the luminal pH. Bioessays. 33 (2), 103-110 (2011).
  8. Lopez-Verrilli, M. A. Exosomes: mediators of communication in eukaryotes. Biol Res. 46 (1), 5-11 (2013).
  9. Corbeil, D., et al. Uptake and fate of extracellular membrane vesicles: nucleoplasmic reticulum-associated late endosomes as a new gate to intercellular communication. Cells. 9 (9), 1931(1931).
  10. Curran, J., et al. EHD3-dependent endosome pathway regulates cardiac membrane excitability and physiology. Circ Res. 115 (1), 68-78 (2014).
  11. Kapustin, A. N., et al. Vascular smooth muscle cell calcification is mediated by regulated exosome secretion. Circ Res. 116 (8), 1312-1323 (2015).
  12. Marsh, M., et al. Rapid analytical and preparative isolation of functional endosomes by free flow electrophoresis. J Cell Biol. 104 (4), 875-886 (1987).
  13. de Araújo, M. E., Lamberti, G., Huber, L. A. Isolation of early and late endosomes by density gradient centrifugation. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (11), 1013-1016 (2015).
  14. Chen, Y., et al. Exosome detection via the ultrafast-isolation system: EXODUS. Nat Methods. 18 (2), 212-218 (2021).
  15. Miao, L., et al. Cardiomyocyte orientation modulated by the Numb family proteins-N-cadherin axis is essential for ventricular wall morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (31), 15560-15569 (2019).
  16. Miao, L., et al. The spatiotemporal expression of Notch1 and Numb and their functional interaction during cardiac morphogenesis. Cells. 10 (9), 2192(2021).
  17. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-what they are and what they are not. J Control Release. 235, 337-351 (2016).
  18. Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Rev Rep. 18 (3), 1067-1077 (2022).
  19. Wilson, J. M., et al. EEA1, a tethering protein of the early sorting endosome, shows a polarized distribution in hippocampal neurons, epithelial cells, and fibroblasts. Mol Biol Cell. 11 (8), 2657-2671 (2000).
  20. Dumas, J. J., et al. Multivalent endosome targeting by homodimeric EEA1. Mol Cell. 8 (5), 947-958 (2001).
  21. Bucci, C., et al. Rab7: a key to lysosome biogenesis. Mol Biol Cell. 11 (2), 467-480 (2000).
  22. Langemeyer, L., Fröhlich, F., Ungermann, C. Rab GTPase function in endosome and lysosome biogenesis. Trends Cell Biol. 28 (11), 957-970 (2018).
  23. Wang, C., et al. Investigation of endosome and lysosome biology by ultra pH-sensitive nanoprobes. Adv Drug Deliv Rev. 113, 87-96 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare Kalp DokusuSubh cresel FraksiyonlamaNanofiltrasyon PlatformuArd k Santrif jlemeNano Ak SitometrisiDinamik I k Sa l mKardiyomiyosit Ko K lt rEndozomal Mark rlerVezik l Karakterizasyonu

İlgili makaleler