Yöntem makalesi

Glycome'in Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Mekânsal Moleküler Görüntülemesi

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69154

⸱

28 Kasım 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR), University of Florida, Gainesville, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida, Gainesville, 3Markey Cancer Center, University of Kentucky, 4Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Kentucky

Bu makalede

Özet

Bu protokol, kütle spektrometrisi görüntüleme kullanılarak hem glikojen hem de N-bağlantılı glikanların titiz ve tekrarlanabilir ölçümünü mümkün kılan temel adımları detaylandırır.

Özet

Glycome'ın dokular içindeki mekansal organizasyonu, fizyolojik fonksiyonun moleküler temelinin anahtarıdır. Çeşitli ve dinamik glycome, metabolizma, sinyal ve yapışma gibi temel hücresel süreçler için kritik öneme sahiptir. Mekânsal biyolojideki yenilikler, çeşitli glycome sınıflarının mekânsal moleküler görüntülemesi için yeni yollar açmıştır. Burada, taze donmuş fare karaciğerinde glycome'un mekansal biyomoleküler görüntülemesi için optimize edilmiş bir protokolü tanımlıyoruz. İş akışı (1) hızlı hasat ve dondurma, (2) optimal kalınlık ve konumda kriyostat kesitleme, (3) karbonhidrat-aktif enzimlerle doku hazırlığı ve doku üzerinde enzim sindirimi, (4) matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon kütle spektrometrisi görüntüleme (MALDI-MSI) ile matris uygulaması ve veri toplama ile (5) bulguları biyolojik bağlama yerleştirmek için veri işleme ve görselleştirmeyi içerir. Bu yaklaşımın kullanımı, N-bağlantılı glikanların ve glikogenin ayrıntılı mekansal haritalarının elde edilmesini sağlar ve temel fizyolojik ve hücresel özellikleri ortaya çıkarır. Bu veriler, karaciğer fonksiyonu ve işlev bozukluğuyla ilişkili anahtar mekansal glinomik heterojenliğin tanımlanmasına olanak tanır. Bu iş akışı, fare karaciğerinin yüksek tekrarlanabilir ve hassas uzamsal gliomiklerini mümkün kılar. Ayrıca, diğer dokulara veya türlere kolayca uyarlanabilir ve sağlık ve hastalıklarda glycome biyolojisi hakkında yeni mekansal içgörüler sağlar.

Giriş

Mekânsal biyoloji alanı hızla genişlemekte ve canlı organizmaların dinamik mekansal biyomoleküler karmaşıklığına kritik bakış açıları sunmaktadır. Biyolojik bağlamda farklı biyomolekülleri incelemek için birden fazla yaklaşım kullanılmaktadır. Bazıları son derece uzmanlaşmış teknikler olsa da, kütle spektrometrisi (MS) hücreler, dokular veya organizmalar bağlamında geniş bir biyomolekül yelpazesini niceltmek için önemli genel bir teknik olarak ortaya çıkmıştır.

Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Kütle Spektrometrisi Görüntüleme (MALDI-MSI), multiomik uzaysal biyomolekül görüntüleme için ortaya çıkan genel tekniklerden biridir. Başlangıçta doku dilimlerinde proteinlerin ve peptitlerin görselleştirilmesiiçin kurulmuştur 1. O zamandan beri, birçok farklı biyolojik örnek ve molekülegenişletilmiştir 2. Bu teknik, hücresel örnekler3,organoidler 4, modelhayvanlar 5 ve hastaörnekleri 6,7 üzerinde uygulanabilir. Bazı moleküler sınıflar, birçok metabolit ve lipid dahil olmak üzere MSI tabanlı yaklaşımlarla doğrudan ölçülebilirken, proteinler ve glikanlar gibi daha karmaşık biyomoleküller MSI tabanlı tespite için enzimatik veya kimyasal işlem gerektirir 2,8.

MALDI-MSI ayrıca, N-bağlantılı glikanlar ve glikojenlerin mekansal analizinde de uygulanmıştır; enzimatik işlem gerektiren iş akışlarını kullanarak MSItespiti için uygun glikan parçaları üretilmiş 9,10,11,12,13,14,15. N-glikanlar, proteinlerin asparagin kalıntısından PNGase F ile kesilir, glikojen glukoz zincirleri ise izoamilazla bölünür. MALDI glikojen analizinin temel avantajları, biyolojik örnekte glikojen dağılımının mekansal tanımını, göreceli niceliklendirmeyi ve glukoz zincirlerinin dallanması hakkında bilgi sağlamasıdır. Hem N-glikan hem de glikojen iş akışları, MSI analizi için numunenin enzimatik işlenmesini gerektirdiğinden, bunlar glycome analizi için entegre bir iş akışına birleştirilmiştir (Şekil 1A). Bu iş akışı, glycome'un MS analizini mümkün kılmak için biyolojik örneklerin dikkatli hazırlanmasını ve özel işleme gerektiriyor, ardından veri toplama ve işleme süreci gerçekleşiyor. İş akışı bir dizi özel adım gerektirse de, yüksek derecede tekrarlanabilir ve birçok farklı örnek türüne uyarlanabilen zengin, yüksek kaliteli uzamsal glycome verileriüretir 16. Ayrıca, iş akışı modülerdir; böylece örnek işleme adımları, MALDI-MSI veri toplama ve analizinin son aşamalarını gerçekleştiren özel tesislere gönderilmeden önce bağımsız araştırma laboratuvarları tarafından gerçekleştirilebilir.

Protokol

Bu araştırma, Florida Üniversitesi'ndeki kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Karaciğerin hasadı

  1. Hayvan ötenazi ve diseksiyon
    1. Fareyi ötenazi etmek için servikal dislokasyon ve kafa kesme işlemi yapın (kurum tarafından onaylanmış protokollere uygun olarak).
      NOT: Bu örnek için 6 aylık bir vahşi tip C57BL/6J fare kullanılmıştır. Bu yaşta fareler ~25-33 g arasındadır. Bu analiz için çok çeşitli yaşlar, boyutlar ve suşlar uygundur.
    2. Hayvanı hemen emici bir alt pedin üzerine yerleştirin ve steril bir skarpel kullanarak karın boşluğunu açığa çıkarın.
    3. Steril forseps ve makas kullanarak, karaciğeri minimum manipülasyon ve doku hasarıyla izole edin.
      NOT: Metabolik değişiklikler hızla gerçekleşir. Mümkünse perfüzyon veya sedasyondan kaçının ve diseksiyon adımlarının mümkün olan en hızlı şekildeyapılmasını sağlayın 17.
  2. Mendiliyi hızlıca yıkayın ve temizleyin.
    1. Karaciğeri 1x fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla (PBS) nazikçe batırarak kanı alın.
    2. Dokuyu iki kez deiyonize (DI) suya batırın.
    3. Fazla suyu temiz bir silecek cihazına nazikçe dokunarak lekeleyebilirsiniz.
      NOT: Standart mikroskop slaytına sığabilecek ölçüden büyük örnekler, dondurmadan önce parçalara ayrılmalıdır.
  3. Numune dondurma
    1. Temizlenmiş karaciğeri doğrudan sıvı azot üzerinde yüzen önceden soğutulmuş tek kullanımlık polistiren tartı teknesine yerleştirin.
    2. Mendil parlak opak bir renge döndüğünde, yaklaşık 3 dakika sonra, dokuyu kuru buz üzerine önceden hazırlanmış ve etiketlenmiş alüminyum folyo paketlerine yerleştirin.
    3. Alüminyum folyo paketlerini numunelerle birlikte -80 °C sıcaklığında dondurucuya yerleştirerek depolayın. Örnekler uzun süreli olarak -80 °C'de saklanabilir.

2: Biyolojik bir örnek hazırlama

  1. Kryoseksiyon için hazırlık
    1. Kriyostatın açıldığından ve dokuya uygun sıcaklıkta, -16 °C ile -20 °C arasında dengelendiğinden emin olun. Tam sıcaklık, doku türüne bağlıdır. Karaciğer, dokuda yırtıkların önlenmesi için yaklaşık -16 °C ile -17 °C arasında biraz daha sıcak bir sıcaklıkta kesitlendirilmelidir; diğer dokular ise -20 °C sıcaklıkta kesitlenmelidir.
    2. Kriyostatta en az iki çak, iki ince boya fırçası, bir çift ince cımbız ve 70 mm cam bir iç olduğundan emin olun. Ayrıca, slaytları kriyostata yerleştirmeden önce kurşun kalemle etiketleyin.
    3. Dokuyu -80 °C dondurucudan kuru buz üzerindeki kriyostata aktarın.
    4. Dokuların kriostattaki sıcaklığa en az 30 dakika alışmasına izin verin.
    5. Cam insertin kenarında zarar olmadığından ve dokunun anti-roll kılavuzuyla buluşacağı yerde pürüzsüz olduğundan emin olun, eldivenli parmakla kenar boyunca gezdirin.
    6. Cam insert kısmını anti-roll kılavuzuna yerleştirin.
    7. Düşük profilli bir bıçağı dikkatlice açık bıçak tutucusuna kaydırın ve bıçak tutucusunu kapatın. Kırmızı bıçak koruyucusunu bıçağın üzerine yerleştirin ve kesitlenmeye kadar.
    8. Dokuyu MS ile uyumlu olan M1 montaj ortamı kullanarak çakmaya monte edin. Oda sıcaklığında M1 montaj malzemesini kriostat içindeki çakan üzerine yerleştirin, doku sabitlenmiş şekilde en az iki halka üzerine yerleştirilin.
      NOT: Optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği genellikle kriyobölümlemede kullanılır; ancak MS uygulamalarında iyon baskılanmasına neden olur ve kaçınılmalıdır. Eğer OCT kullanılmak gerekiyorsa, OCT'yi en aza indirmek veya kaldırmak için ek bir çok adımlı protokol kullanılmalıdır. Ayrıca, bazı MS kaynak merkezleri OCT'ye gömülü örnekleri analiz etmez.
    9. Soğutulmuş bir cımbız alın ve alüminyum folyodan dokuyu çıkarın. Dokuyu cımbızla istediğiniz yönde yumruya yerleştirin.
    10. Montaj ortamının donması için chuck'u kriostata yerleştirin, yaklaşık 2 dakika. Dondurulduğunda sertleşir ve opak görünür.
  2. Kriyobölüm karaciğer dokusu
    1. Çakanı, monte edilmiş mendil ile birlikte chuck tutucuya yerleştirin. Çukuru, doku bıçağa 90° açıyla kesecek şekilde konumlandırın.
    2. Çuk tutucusunu doku bıçakla temas etmeyecek kadar geri çekin. Çuku yavaşça içeri getirin, doku bıçağın hemen yanına gelene kadar kesimlere başlayın.
    3. İstenmeyen dokuyu çıkarmak için 30 μm kalınlıkta bir dilimle kesitlere başlayın.
    4. Rulo plakası derinliğinin düzgün bir bölüm oluşturduğundan ve dokunun rulo plakasının üstüne yuvarlanmadığından emin olun. Eğer durum buysa, rulo plakasını biraz gevşet. Eğer doku rulo plakasını hareket ettirip dönüş sıfırlamasında ikinci kez çarparsa, rulo plakasını biraz sıkıştırın.
    5. İstenilen bölüm yaklaşırken, dilimin amaçlanan kalınlığını 10 μm'ye veya belirli uygulamaya uygun başka istenen kalınlığa düşürebilirsiniz.
    6. Çakmanın doğru kalınlıkta olması için 10 tur tamamlayın, böylece gecikme ve düzensiz kesitler önlenir.
    7. Bölümleme hazırlıkları için soğutucu bir fırça kullanarak sahneyi temizleyin. Rulo plakasını bıçağın üzerine kapatın ve dokunun bir kesitini yavaşça alın.
    8. Rulo plakasını kaldırın ve iki soğuk, ince boya fırçasını kullanarak bölümü bıçaktan nazikçe uzaklaştırın. Kayda monte etmek için bölümü sahnenin yanına çekin.
    9. Kriostattaki bir slayt taşıyıcısından soğutulmuş bir slayt alın ve bir işaret parmağınızı slaytın karşı tarafına yerleştirin, dokunun 10 saniye boyunca konumlanacağı yere yerleştirin.
    10. Sürgü kağıdı nazikçe dokuya indirip tekrar yukarı kaldır. Sert bastırmayın, çünkü bu dokuyu yırtır. Doku kaydıra eriyip saydam hale gelmeli.
    11. Sürgüleri hızla kurutmak için bir kurutucuya aktarın. Sürgü kurutucuda 1 saat kurutuldu.
    12. Kuruduktan sonra, slaytlar doğrudan MS için işlenebilir veya vakum kapalı ile -80 °C'de saklanabilir.

3. Glikomik MSI için slayt hazırlığı

  1. Enzimlerin hazırlanması
    NOT: MS-hazır düşük tuzlu liyofilize PNGase F satın alınabilir ve doğrudan kullanılabilir.
    1. İzoamilaz, MS uygulamaları için fazla tuz gidermek için diyaliz gerektirir. Bir veya daha fazla diyaliz kabını HPLC suyuna 15 dakika koyarak hazırlayın.
    2. 200 μL stok izoamilazı, 500 μL diyaliz kabı ile 14,3 mL HPLC suyunda 4 °C'de 2 saat boyunca karıştırmadan dialize edin. 14,3 mL HPLC suyunu taze HPLC suyla değiştirin ve 4 °C'de gece boyunca ekstra 16 saat diyaliz yapın. 14,3 mL HPLC suyunu taze HPLC suyla değiştirin ve 4 °C'de ekstra 8 saat diyaliz yapın.
    3. İzoamilazı pipetle fincandan nazikçe çıkarın ve 1.5 mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Diyaliz sonrası izoamilazın toplam hacmini (μL cinsinden) ölçün. Stokun başlangıç aktivitesinden, genellikle 200 Birim/mL ve nihai hacimden, 3 Birim izoamilaza için gereken toplam hacim hesaplanır.
    4. 3 birimlik izoamilazı ince duvarlı PCR tüplerine pipet aliquotları ile alın. Sıvı azotta snap dondurma tüpleri kullanın. -80 °C'de sakla. Her püskürtme protokolü için bir diyalizlenmiş izoamilaza çözeltisi tüpü kullanılabilir ve bu dört slayt için yeterlidir. Enzim aktivitesini korumak için donma/erime döngülerinden kaçının.
  2. Doku fiksasyonu ve yıkaması
    1. Slaytları bir sürgü tutucuya yerleştirin ve %10 Nötr Tamponlu Formalin (NBF) ile dolu cam bir kapta 1 saat daldırın.
    2. NBF'den slaytları çıkarın. Slaytları 2 saat boyunca %70 etanole batırın.
    3. Dört Coplin kavanozu 70%, 80%, %90 ve %100 etanol içeriyor. Sıralı yıkama sırasında karışıklığı önlemek için her kavanozu net etiketleyin.
    4. Slaytları ardışık olarak şu şekilde aktarın: %70 etanol 5 dakika, %80 etanol 5 dakika, %90 etanol 5 dakika, %100 etanol 5 dakika.
    5. Slaytları taze %100 ksilen ile doldurulmuş cam bir petri kabına aktarın. Kaydırakların tamamen suyun altında olduğundan emin olun. Slaytları dokudaki lipid içeriğine bağlı olarak 70 rpm'de bir shaker üzerinde 1 saat kuluçka edin. Bu adımı her yıkamada taze ksilen kullanarak iki kez daha tekrarlayın.
      NOT: Bu protokol, lipidlerin iyon baskılanmasına yol açtığı ve dolayısıyla maksimum tekrarlanabilirliğe yol açtığı bilindiği için maksimum delipidasyona izin vermek üzere tasarlanmıştır. Ancak bu, sinyallerin delokalizasyonuna yol açar ve elde edilebilecek çözünürlüğü azaltır. Yıkama adımlarının azalması, işlem süresinin sınırlandırılması ve nem kontrolünün dikkatli olması delokalizasyonu azaltabilir ve böylece veri çözünürlüğünün artmasına yol açabilir.
    6. Sürgüleri gece boyunca kurutma için bir kurutucuya koyun.
    7. Slaytları %70 etanole 1 dakika boyunca koyun, yeniden nemlendirin. Kaydırakları DI suya 3 dakika koy. DI su yıkamayı taze DI suyla tekrarlayın.
    8. Sürgüleri 10 dakika boyunca ya da tamamen kuruyana kadar kurutarak kurutun.
  3. Enzim uygulaması için slaytların hazırlanması
    1. Metal rafın altına DI suyla ıslatılmış bir kağıt havlu yerleştirerek kuluçka için bir HTX nem odası hazırlayın. Odayı 37 °C inkubatöre yerleştirin.
    2. Su deposunu musluk suyla doldurarak bir gıda buharlaştırıcısı hazırlayın. Cihazı açmak için zamanlayıcıyı 60 dakikaya ayarlayın.
    3. 50 mL HPLC kalitesinde su, 25 μL sitrakonik anhidrit ve 2 μL 12 M HCl ekleyerek 50 mL Falcon tüpüne sitrakonik tampon hazırlayın. Çözeltiyi 10 saniye girdabla karıştırın. Her 50 mL'lik sitrakonik tampon santrifüj tüpü dört slayt için yeterlidir. Çözeltinin pH'ının 3.0 olduğunu (kabul edilebilir aralık: 2.5-3.5) doğrulayın.
    4. Her posta gönderisini hazırlanmış sitrakonik tampon ile doldurun. Kaydırı, doku içe bakacak şekilde yerleştirin, böylece dokunun yanlara değmesini engelleyin ve etkili antijen alınmasını sağlayabilirsiniz. Her posta için iki slayt kullanılabilir; her iki slaytın da dokuları içe bakan iki kenar pozisyonu kullanılır.
    5. Gıda buharlaştırıcısından buhar çıkardığını kontrol edin. Postaları yiyecek buharlaştırıcısına koyun ve 30 dakika kuluçka yapın.
    6. Postaları 5 dakika boyunca DI su banyosuna aktarın. Posta kutusundaki sitrakonik tamponun yarısını DI suyla değiştirin ve 5 dakika daha bekletin. Bu seyreltmeyi iki kez daha tekrarlayın.
    7. Tüm çözücüleri çıkarın ve slaytları slayt postuna %100 DI su ekleyerek ve ardından DI suyunu çıkararak yıkayın. Laboratuvar mendiliyle doku bulunmayan bölgeleri kurutabilirsiniz.
    8. Her slaytın arkasına bir daire ve bir üçgen çizerek iç standart konumları işaretleyin. Slaytın önüne 1 μL 1 mg/mL Adanturp Peroksidaz (HRP; daire) ve 1 μL 10 mg/mL tavşan karaciğeri glikojen (üçgen) uygulayın.
    9. Slaytları tamamen kuruması için 15 dakika boyunca kurutucuya yerleştirin.
  4. Enzim püskürtme ve sindirim
    1. 100 μg liyofilize PNGase F (500 birim/μg) ve 3 birim izoamilaza bir tüp çıkarın ve 10 dakika boyunca çözülmesine izin verin. Mikrosantrifüj tüpünde ~2000 x g hızında 5 saniye boyunca spin tüpleri. Bu, 4 slayt püskürtmek için yeterli enzimdir.
    2. Her liyofilize PNGase F tüpüne 50 μL DI su pipetleyin, 10 saniye boyunca nazikçe girdabda geçirin ve ~2000 x g hassasiyetinde mikrofugda 5 saniye boyunca çevirin. 50 μL PNGase F çözeltisini doğrudan izoamilaza tüpüne pipetleyin. HPLC suyunu 1 mL nihai hacme ekleyin.
    3. Çift enzimli mikrosantrifüj tüpünü 10 saniye girdabla döndürün ve ~2000 x g ile 5 saniye boyunca aşağı döndürün.
    4. HTX M5 püskürtücüsünü açın ve HTX M5 yazılımını açın. Sistem sekmesinin altında tepsi türünün Ambient olarak olduğundan emin olun.
    5. Knauer pompasını ön sağ taraftaki durdurma düğmesine basarak kapatın. Dış şırınga pompasını arka panelindeki anahtarla çalıştırın.
    6. HTX yazılımında, Yöntemler sekmesi altında, çift enzimli püskürtme için uygun yöntemi seçin. Parametreler 45 °C nozul sıcaklığı, 15 geçiş, 0,025 mL/dakika akış hızı, 1200 mm/dakika hız, 3 mm ray aralığı, CC desen, 10 psi basınç ayarlanmalı, gaz akış hızı 3 L/dakika ve nozul yüksekliği 40 mm olarak ayarlanmalıdır.
    7. Sıcaklık sekmesine gidin ve sprey nozul sıcaklığını 45 °C'ye ayarlayın. Püskürtme hattını üst konnektöre taşımak için anahtar kullanın.
    8. Ultra yüksek saflıkta azot gazı valfini açın ve püskürtücünün basıncının 10 psi olduğundan emin olun. Şırınga pompasında akış hızını 95 μL/dakika olarak ayarlayın.
    9. Taze bir şırınga ve iğne kullanarak 4 mL HPLC suyla doldurun. Tüm baloncukları çıkarın. 2 mL suyu püskürtücü hattının ~6 inçlik bölümünden atık beakerine geçirin.
    10. Şırıngayı püskürtücüye takın ve şırıngaya pompasından suyu 95 μL/dakika çalıştırarak 5 dakika boyunca çalıştırın.
    11. Şırınga pompasını sıkarken, slaytları ısıtılan tepsinin sol alt köşesine metal hizalama kılavuzu kullanarak bantlayın; böylece dokunun sprey alanında olduğundan emin olun. Numune sekmesi altında, sprey bölgesi için X ve Y parametrelerini tanımlayın; hafif bir aşırı sprey ile tam kayma kapanmasını sağlayabilirsiniz.
    12. 5 dakika sonra pompayı durdurun, şırıngayı ayırın, içine hava çekin ve ardından kalan suyu temizlemek için sıçrama hattından hava itin. Gerekirse tekrarlayın.
    13. Çift enzimli çözeltiyi yeni bir şırıngaya yükleyin ve pompaya bağlayın, böylece hiç baloncuk kalmadığından emin olun.
    14. Şırıngayı püskürtücü hattına takın. Şırınga pompasında, akış hızını 25 μL/d'ye ayarlayın.
    15. Sprey nozulu 45 °C'ye ulaştığında, Döngü sekmesinin altında Start tuşuna basın. Knauer pompasını açmak istendiğinde Hayır'a tıklayın. Spreyi başlatmak için şırınga pompasının Start tuşuna basın.
    16. Görünür enzim sprey biriktirilmesini doğrulamak için sprey nozulunun altına boş bir sürgü koyun. Gözlemlendikten sonra, yazılımda Devam et' tuşuna tıklayın, cam kapağı püskürtücüye yerleştirin ve spreyin uygulanmasını eşit şekilde izleyin; bu uygulama eşit şekilde gösterilir.
    17. Püskürtme döngüsü tamamlandığında, pompada durdurma tuşuna basın, azot gazını kapatın ve Valf yükü onay düğmesine tıklayın. Püskürtücünün hattını ve aşamasını temizleyin ve püskürtücüyü kapatın, böylece Knauer pompasının tekrar çalıştığından emin olun.
    18. Slaytları HTX nem odasında 37 °C'de 2 saat boyunca kuluçka edin, kaydıraklar yukarıya bakacak şekilde yerleştirilin. Tamamlandıktan sonra, slaytları 15 dakika boyunca kurutucuya koyun. Slaytlar kurutucuda gece boyunca kalabilir veya protokol devam ettirilebilir.
  5. MALDI matris hazırlığı ve uygulaması
    1. Matris uygulamasından önce, slaytın optik görüntüsünü tarayıcı kullanarak yakalayın.
    2. 40 mg katı CHCA'yı 15 mL'lik konik bir tüpe içine tartın. CHCA tozunu %0,1 triffloroasetik asit ve %50 asetonitril (ACN) içeren bir çözeltide 7mg/mL konsantrasyonda çözün.
    3. Matris çözümünü 90 saniye açık ve 30 saniye kapalı döngülerle 10 dakika sonikle sonikle. Tam çözünme ve homojenlik için bu adımları 5 kez tekrarlayın.
    4. HTX M5 püskürtücüsünü açın ve HTX M5 yazılımını açın. Azot gazı valfini açın ve sistem basıncını 10 psi'ye ayarlayın.
    5. HTX yazılımında, Yöntemler sekmesi altında, CHCA matris püskürtme için uygun yöntemi seçin. Parametreler 79 °C nozul sıcaklığı, 10 geçiş, 0,1 mL/dakika akış hızı, 1300 mm/dakika hız, 3 mm ray aralığı, CC desen, 10 psi basınç, gaz akış hızı 3 L/dakika ve nozul yüksekliği 40 mm olarak ayarlanmıştır.
    6. Sıcaklık sekmesine gidin, püskürtme nozulu sıcaklığını 79 °C'ye ayarlayın. Pompa sekmesi altında, akış hızını 100 μL/dakika olarak ayarlayın.
    7. Sprey alanının doğru hizalanmasını sağlamak için sürgüleri ısıtılan tepsinin sol alt köşesine metal kılavuz kullanarak bantlayın. Numune sekmesi altında, sprey bölgesi için X ve Y parametrelerini tanımlayın; hafif bir aşırı sprey ile tam kayma kapanmasını sağlayabilirsiniz.
    8. Tek kullanımlık bir şırınga ve iğne kullanarak 5.5 mL %50 ACN çekin (kabarcıkları çıkarın).
    9. Püskürtücüyü LOAD moduna ayarlayın. ACN şırıngasını yerleştirin ve ACN'yi enjekte edin. ACN şırıngasını çıkarın ve hemen yerine 5,5 mL filtrelenmiş CHCA çözeltisi içeren yeni bir şırınga ile değiştirin; kabarcık oluşmaması için enjeksiyon yapın. Spreyi SPRAY moduna ayarlayın.
    10. Sprey nozu 79 °C'ye ulaştığında, Döngü sekmesi altında Start tuşuna basın. Sorulduğunda Evet'e tıklayın.
    11. Boş bir test slaytı kullanın ve onu püskürtücünün altına yerleştirin. Görünür matris sprey biriktirmesini doğrulamak için, slaytta sarı bir matris birikintisi bulunur. Gözlemlendikten sonra Devam et'e tıklayın, cam kapağı cihazın üzerine yerleştirin ve spreyin tutarlılığını izleyin. Düzenli sprey, eşit opaklıkta bir kaydırım oluşturur.
    12. Püskürtme döngüsü tamamlandığında, püskürtücüyü LOAD moduna ayarlayın ve Valve load onay seçeneğine tıklayın.
    13. Pompayı 300 psi'ye ayarlayarak ve sıcaklığı 30 °C'ye düşürerek sprey makinesini temizleyin. Hattan iki kez 5 mL %50 asetonitril ve iki kez 5 mL %50 metanol alın ve itin. Sahneyi %100 metanol ile temizleyin. Sıcaklık 30 °C'ye ulaştığında, LOAD rejimine geçin, gazı kapatın, püskürtücüyü kapatın ve Knauer pompasının tekrar açıldığından emin olun.
    14. Slaytları matris tamamen kuruyana kadar 15 dakika boyunca kurutucuya yerleştirin. Slaytlar, uygun sinyal-gürültü ile güvenilir veri toplama sağlamak için en fazla 14 gün içinde püskürtmeden sonra mümkün olan en kısa sürede çalıştırılmalıdır.

4. MALDI-MSI glinomik veri toplama

  1. Veri toplamaya hazırlık
    1. Sürgünü, MALDI enstrümanının örnek tutucusuna sürgü adaptörüyle sabitleyin. Numune tutucusunu MS'ye yerleştirin ve görüntüleme için doğru şekilde oturduğundan emin olun.
    2. flexImaging yazılımını açın ve önceden kaydedilen optik slayt görüntüsünü içe aktarın, bkz. adım 3.4.1. Gerekirse, görüntü hizasını alet aşamasıyla kalibre ederek doku kesitleri ve standart noktalar bölge seçimi için doğru konumlandırılır.
    3. Yazılımda doku kesitleri için görüntüleme bölgelerini, HRP standardını, glikojen standardını ve kontrol matrisi karesini tanımlayın. Her birini ayrı bir bölge olarak belirtin.
    4. Raster adım boyutunu 50 μm olarak ayarlayın, böylece piksel çözünürlüğü 50 × 50 μm elde edilir.
    5. Cihaz kontrol yazılımında, pozitif-iyon MS modunu seçin ve tarama aralığını m/z 500 - 4000 arasında, düşük kütle kesme ile 700.00 m/z olarak ayarlayın.
    6. Enstrüman kontrol yazılımında önceden optimize edilmiş MALDI görüntüleme ayar parametre setini yükleyin (veya gerekirse değerleri manuel olarak girin). Kaynak ve iyon optik voltajlarının belirtilen değerlere ayarlandığından emin olun: MALDI Plaka Ofseti 50.0 V; Sapma 1 Delta 70.0 V; Huni 1 RF 500.0 Vpp; Huni 2 RF 500.0 Vpp; Çok kutulu RF 500.0 Vpp; İyon Enerjisi 5.0 eV. Çarpışma hücresi ve TOF zamanlama ayarlarını doğrulayın: Çarpışma Enerjisi 10.0 eV; Çarpışma RF 4000.0 Vpp; Transfer Süresi 180.0 μs; Pre Pulse Depolama 25.0 μs.
    7. Lazer sekmesi altında lazer ayarlarını onaylayın. Uygulama varsayılan olarak 50 μm görüntülemeyi seçin.
    8. Kütle spektrometresini, akort karışımı gibi harici bir kalibrasyon karışımı kullanarak kalibre edin. Kalibranı tanıtın ve cihazın kalibrasyon rutinini çalıştırın. Kalibrasyonu, kütle doğruluk hatasını %0.001 içinde ve kalibrasyon doğruluk puanını %100 olacak şekilde ayarlayın.
    9. Edinim, 10.000 Hz frekansta 320 lazer atışı patlaması yapacak şekilde ayarlandı. Lazer zayıflatması, sinyal yoğunluğunu optimal dinamik aralıkta korumak için %37'ye ayarlanmalıdır. Lazer atışlarını ve zayıflamayı gerekirse ayarlayın.
    10. Lazerin numuneye doğru odaklı olduğundan emin olmak için cihazın otomatik ışın hizalama fonksiyonu, hedef profili ayarı ve odak ayarını kullanın. Dokunun dışında bir bölgede, kontrol yazılımında Lazer sekmesinin altında Otomatik Tışın Ayarlaması uygulanarak lazeri iyon optikleriyle hizalamaktır. Bu, lazer ve aşamanın optimal veri toplama için ayarlanmasını sağlar. Son olarak, örnek taşıyıcı sekmesinde hedef profili oluşturma ve odak ayarlama ayarlamalarını gerçekleştirin.
    11. İç standart noktaların beklenen iyon zirvelerini ürettiğini doğrulayın, bu da veri toplamaya hazır olduğunuzu gösterir. HRP'nin belirgin bir glikan zirvesi 1211.42 olmalıdır. Glikojen, en yüksek yoğunluklu zirveler 1013.32, 1175.37 ve 1337.43 olmak üzere düzenli aralıklı aralıklı olarak öne çıkan zirvelere sahip olmalıdır.
      NOT: Yoğunlukla ilgili sorunlar varsa, lazer konfigürasyonunu tekrar gözden geçirin. Kütle doğruluğunda tespit edilen sorunlar varsa, kalibrasyonu tekrar gözden geçirin.
  2. MALDI-MSI veri toplama
    1. Tanımlanmış bölgeler için MALDI-MS görüntüleme alımı için görüntüleme yazılımındaki Başlat butonuna tıklayarak başlayın. Cihaz, lazeri her tanımlanmış bölgede 50 μm aralıklarla otomatik olarak raster yapar ve her pikselde pozitif iyon MS1 spektrumu (m/z 500-4000) elde eder. Bu çözünürlükte karaciğer bölümü için tipik veri toplama süresi 135 dakikadır.
      NOT: Çalışmadan sonra, cihaz elde edilen her piksel için spektrumları otomatik olarak kaydeder ve ham verilerle .d klasörü oluşturur.

5. MALDI-MSI veri analizi

  1. Veri ithalat ve dışa aktarma
    1. Veri setini SCiLS Lab'a veya eşdeğer MSI analiz yazılımına aktararak glycome'un doku kesitleri boyunca iyon yoğunluk haritalarını görselleştirebilirsiniz.
    2. SCiLS Laboratuvarını açın. Yeni seç. MALDI çalıştırmasından .mis dosyasını seçin.
    3. .mis dosyası SCiLS'te açıldığında, Sonraki'ye tıklayın. m/z Aralığı için Otomatik Aralık seçin. Eksen Parametreleri için otomatik ekseni seçin. Mutlak kutu boyutunu seçin. Sonrasında Sonra'ya tıklayın ve sonra İçe Aktar'a tıklayın. Dosyanın kaydedileceği klasörü seçin.
    4. İç aktarma işlemi tamamlandıktan sonra yeni .slx dosyasını açın.
    5. Dosya, İtare Aktarma seçeneğine tıklayın ve dosyadan özellikler listesini seçin. Glycome açıklamalarını içe aktarın ve ion görselleri oluşturun; özellik listesi paneline gidip doğru listeyi seçip ion görüntüleri oluştur butonuna tıklayın.
      NOT: N-glikanlar 16,18,19 ve glikojen13 için sağlam özellik listeleri mevcuttur.
    6. Veriyi uygun şekilde normalleştirin. Toplam İyon Sayısı (TIC) en yaygın kullanılan normalizasyondur.
    7. İyon görüntüleri yüklendikten sonra, özellik listesini inceleyip doğru tepe entegrasyonunu sağlayın; tepenin tam entegre olmadığı özellikler için manuel olarak ayarlama yapın. Ayarlama için, shift tuşunu basılı tutarken zirveye sol tıklayın. Zirve entegre edildikten sonra, klavyede kontrol ve boşluk tuşuna bas. Bu, ayarlanmış zirve için yeni bir iyon görüntüsü üretecektir.
    8. Özellik listesinin geri kalanı için tekrar ettikten sonra, ion görüntü panelinde Özellikler Kaydet listesini seçin, listeyi adlandırın ve Kaydet'e tıklayın.
    9. Dosya, özellik tablosuna gidin ve az önce kaydedilen özellik listesi tablosunu açın. Sıralayın m/z'ye. Düzeltilmiş özellikler, isim sütununda boş bir hücreyle birlikte görünecektir. Düzeltilmiş zirvelerin adını yeniden adlandırmak, adı kopyalayıp yapıştırmak ve özellik tablosunun üst ortasına yakın yer alan 'özellik listesinden seçilen satırı kaldır' butonunu seçerek orijinal zirveyi kaldırmaktır.
    10. Tüm isimler ayarlandıktan sonra, nihai açıklamalı zirve listesi elde edilir. Silme butonunun yanında bulunan yoğunluk ekleme düğmesine tıklayın. Buradan, ilgi gören örnekleri seçerek görsellenen her bölge için notlu özelliklerin ortalama yoğunluğunu dışa aktarın.
    11. Normalizasyon için Peak Area aralıklı işlem modunu ve Toplam İyon Sayısını seçtiğinizden emin olun. Tamam'a tıklayın. Karşılık gelen verilerle birlikte yeni sütunlar belirir. Veriyi dışa aktarmak için, dışa doğru işaret eden oku seçin ve .csv olarak kaydedin.

Sonuçlar

Vahşi tip bir fareden karaciğerin dikkatli işlenmesi, tam enine kesit (Şekil 1A) kesilmesi dahil, glycome'un MALDI-MSI tarafından tanımlanmasına olanak sağladı; çeşitli glikojen kaynaklı oligosakkaridler ve N-bağlı glikanlar m/z aralığında kullanıldı (Şekil 1B). Glikojen, karaciğer hepatositlerinde geniş bir şekilde lokalize olmuş ve beklendiği gibi portal traktlarda damarlar ve bağ dokusu eksikliği yaşamıştır (Şekil 1C,D). Önemli olarak, MALDI-MSI verileri hem glikojenin mekansal dağılımının hem de normal metabolizma ve hastalık durumlarında glikojenin temel özelliği olan zincir uzunluğu dağılımının ölçülmesine olanak sağladı (Şekil 1D). Ayrıca, çeşitli N-bağlantılı glikanlar çeşitli organizasyonlar gösterir. Gözlemlenen mekânsal dağılım, hepatositlerde yaygın olarak dağılım (Şekil 1E) ile karaciğerin sinüzoidal organizasyonuyla uyumlu bölgesel odaklara (Şekil 1F) ve portal trakt elemanlarının özel etiketlenmesine (Şekil 1G-I) kadar uzanır.

figure-results-1
Şekil 1: Fare karaciğerinin MALDI-MSI glycome analizi. (A) Örnek hazırlama, veri toplama ve analizde kritik yöntemler için şema. (B) Yaklaşımdan elde edilen örnek kütle spektrumları. Kırmızı oklar, glikogenden türetilen düzenli aralıklı oligosakkaritleri gösterir ve bu farklar bir glukoz monosakkarit fark eder. Mavi oklar, spektrumlar boyunca dağılmış olarak bulunan N-glikanları gösterir. Karaciğerde, özellikle yüksek m/z değerlerinde, glikojen zirveleri genellikle daha belirgindir. (C) Karaciğerdeki glikogenden türetilen maltohexaozun (DP6) mekansal dağılışı. (D) Karaciğerdeki glikojen zincir uzunluklarının dağılımı. (E-G) Karaciğerde farklı N-bağlantılı glikan türlerinin mekansal dağılımı. (H) Odaklı merkezi bölge için hematoksilin ve Eosin (H&E) boyamaları, ayrıca anatomik notasyonlar. (I) Portal trakt elemanlarında ek N-bağlı glikanın (Hex5dHex1HexNAc5) mekansal lokalizasyonunu gösteren karşılık gelen odaklı inset. Ölçek çubukları: 500 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

MALDI-MSI, glycome mekânsal biyolojisi için ortaya çıkan bir araçtır. Önemli olarak, bu protokol belirli donanım kullanarak veri toplamaya odaklansa da, birden fazla üreticiden MALDI-MSI platformlarına kolayca uyarlanabilir13. Örnek işleme yöntem 4'e kadar aynıdır, ancak bazı üreticiler özel slaytlar kullanmayı gerektirebilir. MALDI-MSI platformuna özgü parametreler kullanılarak veri toplama değişiklikleri, bu protokolün hızlı adaptasyonunu mümkün kılar. Veri işleme için satıcıya özgü yazılımlar kullanılabilir, 5. adımda detaylandırıldığı gibi, ya da alternatif olarak, titiz ve tekrarlanabilir MALDI-MSI veri işleme platformlarıkullanılabilir 19.

MALDI-MSI, farklı organlar, dokular ve hücrelerin glycome'ları için farklı kalıplara sahip olması nedeniyle biyolojiyi anlamak için özellikle faydalı bir araçtır. Karaciğer, yüksek glikojen seviyeleri ve çeşitli N-bağlı glikanlara sahip olması nedeniyle glycome analizi için uygundur13. Diğer organlarda N-bağlı glikan seviyeleri ve çeşitliliği daha yüksek, glikojen13 seviyeleri ise daha düşüktür. Önemli olarak, glycome organizmanın metabolik ve hastalık durumuna bağlı olarak farklı organlarda değişir, bu yüzden glycome zengin bir biyolojik bilgikaynağı sağlar 5,14,15,20. MALDI-MSI analizi için benzersiz karbonhidrat-aktif enzimlerin sürekli geliştirilmesi, glycome analizini glycome'daki ek ortogonal biyomoleküllere genişletmeyi vaat ediyor.

Birçok avantajı olmasına rağmen, MALDI-MSI şu anda mekânsal biyolojide kullanılan diğer araçlara kıyasla çözünürlük açısından sınırlıdır. Bu protokol, 50 μm çözünürlüklü veri toplama kullanıyordu. Fizyolojik analiz için mükemmel olsa da, tek hücre çözünürlüklü veriler alanı önemli ölçüdeilerletecektir 21. Özellikle, delokalizasyon, enzim püskürtme ve sonrasında nemli koşullarda kuluçka kullanan yöntemlerde çözünürlüğün artması için önemli bir engel olabilir. Örnek işleme donanımı, örnek işleme metodolojileri, veri toplama donanımı, seçici etiketleme kullanımı ve veri işleme alanlarındaki son gelişmeler, MALDI-MSI veri toplama seviyelerininhücresel çözünürlüğe 22,23'e yaklaşmasını sağlamaktadır. Ancak, çözünürlük ile sinyal-gürültü arasında uzlaşmalar ve MALDI için mevcut örnek hazırlama yöntemlerine dayalı doğal sınırlamalar göz önünde bulundurulması gerekir. Çok spesifik uygulamalar, hem örnek işleme24 hem de yeni algoritmalarda yenilikler kullanarak tek hücre çözümlü MALDI-MSI hedefine ulaşmaktadır; bu da bu sorunlara genel çözümlerin ulaşılabilirolduğunu gösteriyor 25,26,27.

Veri toplandıktan sonra, slayt Histolojik açıklama amacıyla H& E ile boyanabilir. Ancak, hücresel ve doku hasarı MALDI-MSI veri toplama ile ilişkilidir, bu nedenle bu strateji hücresel açıklamanın kapsamını sınırlar. Alternatif olarak, H&E için ardışık doku dilimleri de kullanılabilir. Bu strateji yüksek kaliteli veri sağlar, ancak ayrık örnek kesimlerinin hizalanmasını ve entegrasyonunu gerektirir.

Dikkate değer ki, formalin sabitli parafin-gömülü (FFPE) dokular, örnek hazırlama protokolünde küçük değişikliklerle MALDI-MSI tarafından glycome analizi için çok uygundur13. Ancak, FFPE dokusu metabolomik ve benzeri analizler için etkili bir şekilde kullanılamaz, bu nedenle burada detaylandırıldığı gibi, taze dondurulmuş örnekler multiomikyaklaşımlar için tercih edilir 28. Örnek hazırlama, değişken biyomoleküller için herhangi bir MSI boru hattının kritik bir bileşenidir ve örneklerin hasadı ve işlenmesiiçin özel yaklaşımlar gerektirir 17,29,30.

MALDI-MSI tabanlı yaklaşımların genelliğini ve yaygın kullanımını genişletme metodolojileri, donanım ve yazılımda önemli gelişmelerle hızlailerlemektedir19. Ayrıca, son dönemde geliştirilen ileri teknoloji multiomik28 vemultimodal 21 yaklaşımları, makine öğrenimi ve yapay zeka ile birleşerek bu son derece karmaşık veri setlerini yönetmek için özellikle umutvericidir 31.

Açıklamalar

R.C.S., M.S.G. ve C.W.V.K., Florida Üniversitesi'nde İleri Uzamsal Biyomolekül Araştırma Merkezi'nin (CASBR) eş direktörleridir ve Sugar3 LLC'nin kurucu ortaklarıdır. R.C.S., Maze Therapeutics'ten araştırma desteği ve/veya danışmanlık ücretleri almıştır. M.S.G., Maze Therapeutics, Valerion Therapeutics, Ionis Pharmaceuticals, PTC Therapeutics ve Aro Biotherapeutics'ten araştırma desteği, araştırma bileşikleri veya danışmanlık ücretleri almıştır. M.S.G., Chelsea'nin Hope, Glut1-Deficiency Syndrome Foundation ve Yetişkin Poliglukosan Vücut Hastalıkları Vakfı'nın bilim danışma kurulu üyesidir.

Teşekkürler

Vander Kooi, Sun ve Gentry laboratuvarlarının verimli tartışmaları için üyelerini teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Kentucky Üniversitesi Markey Kanser Merkezi'nin Biyonumune Alım ve Translasyonel Patoloji Paylaşılan Kaynak Tesisi, P30CA177558 D.B.A., R01AG066653, R01CA266004, R01AG078702, R01CA288696, RM1NS133593 R.C.S., R35NS116824 M.S.G., R01DC019054 C.W.V.K. ve Florida Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne verdiği hibelerle desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Emici alt padDenville ScientificB1623
Asetonitril (ACN)Sigma-Aldrich34851-4X4L
Alüminyum folyoFisher Scientific 15078292
Sitrakonik anhidritSigma-Aldrich125318
Konik tüp (15mL)Alkali ScientificCW5600
Coplin KavanozlarıDWK Yaşam Bilimleri900570
Cryostat LeicaCM1860
Kriyostat çakmasıLeica14041926491
KurutucuBel ArtF424004131
Diyaliz kupasıThermo Fisher88400
EtanolFisher Scientific 22032601
Gıda buharlaştırıcısıRival CKRVSTLM21   
Cam iç (70 mm)Gel CompanyLGI50
GlikojenSigma-AldrichG8876Standart
Dağ Renkli Peroksidaz (HRP)Sigma-AldrichP8125Standart
HPLC suyuSigma-Aldrich270733-4X4L
HTX SpreyHTX TeknolojileriM5
Hidroklorik asitFisher Scientific A144-500
İzoamilazaMegazymeE-ISAMY
Knauer pompasıKnauerP 4.1 S
Düşük profilli bıçakElektron Mikroskopi Bilimleri63059-01
M1 montaj ortamıEpredia1310
Kütle SpektrometresiBruker DaltonicstimsTOF fleX
Microfuge tüpü (1.5mL)Alkali ScientificCN3016
İğneBD305109
Nötr tamponlu formalin NBFMillipore sigmaHT501128-4L
Azot gazıAirgasNIUHP300
PBSFisher Scientific SH30256. FS
PCR tüpleriMedSupply Ortakları62-1091-1
PNGase F PRIME -LY ULTRA Bulldog BiyografisiNZPULT10LY
SCiLS LaboratuvarıBruker Daltonics1889000
ShakerTermo Bilimsel88882007
Slide   Elektron Mikroskobu Bilimleri71873-02
Slayt postasıRPI ürünleri212620A
Sonikater (Bioruptor Pico)Diyagen düğümüB01080010
Steril PensepsDR EnstrümanlarıS08098
Steril SstürpelWPIWPI-500240
Steril MakasGüzel Bilim Araçları14084-08
Şırınge   Grainger19G342
Şırınga pompasıYeni DönemNE-300
BantFisher Scientific 15-901-R
İnce fırçaAnezus#00
Trifluoroasetik asitSigma-AldrichT6508-1L
Tune Mix, ESI düşük konsantrasyon.ÇevikG1969-85000
Ağırlık tekneleriSigma-AldrichHS120882
KsilenSigma-Aldrich534056
α-siyano-4-hidroksisinamik asit (CHCA)Cayman Kimya Şirketi15254

Kaynaklar

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Buchberger, A. R., Delaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: A review of emerging advancements and future insights. Anal Chem. 90 (1), 240-265 (2018).
  3. Ouedraogo, R., Daumas, A., Capo, C., Mege, J. L., Textoris, J. Whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry is an accurate and rapid method to analyze different modes of macrophage activation. J Vis Exp. 82, e50926(2013).
  4. Khalil, S. M., Cappuccio, G., Li, F., Maletic-Savatic, M. Molecular imaging of human brain organoids using mass spectrometry. J Vis Exp. 211, e66997(2024).
  5. Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metab. 33 (7), 1404-1417 (2021).
  6. Aichler, M., Walch, A. Maldi imaging mass spectrometry: Current frontiers and perspectives in pathology research and practice. Lab Invest. 95 (4), 422-431 (2015).
  7. Conroy, L. R., et al. High-dimensionality reduction clustering of complex carbohydrates to study lung cancer metabolic heterogeneity. Adv Cancer Res. 154, 227-251 (2022).
  8. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
  9. Powers, T. W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry workflow for spatial profiling analysis of N-linked glycan expression in tissues. Anal Chem. 85 (20), 9799-9806 (2013).
  10. Drake, R. R., Powers, T. W., Norris-Caneda, K., Mehta, A. S., Angel, P. M. In situ imaging of N-glycans by MALDI imaging mass spectrometry of fresh or formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Curr Protoc Protein Sci. 94 (1), e68(2018).
  11. Stanback, A. E., et al. Regional n-glycan and lipid analysis from tissues using MALDI-MS imaging. STAR Protoc. 2 (1), 100304(2021).
  12. Hawkinson, T. R., Sun, R. C. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging of glycogen in situ. Methods Mol Biol. 2437, 215-228 (2022).
  13. Young, L. E. A., et al. In situ mass spectrometry imaging reveals heterogeneous glycogen stores in human normal and cancerous tissues. EMBO Mol Med. 14 (11), e16029(2022).
  14. Conroy, L. R., et al. Spatial metabolomics reveals glycogen as an actionable target for pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 2759(2023).
  15. Clarke, H. A., et al. Glycogen drives tumor initiation and progression in lung adenocarcinoma. Nat Metab. 7 (5), 952-965 (2025).
  16. Wallace, E. N., et al. An N-glycome tissue atlas of 15 human normal and cancer tissue types determined by MALDI imaging mass spectrometry. Sci Rep. 14 (1), 489(2024).
  17. Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. J Vis Exp. 166, e62008(2020).
  18. Mcdowell, C. T., et al. Imaging mass spectrometry and lectin analysis of N-linked glycans in carbohydrate antigen-defined pancreatic cancer tissues. Mol Cell Proteomics. 20, 100012(2021).
  19. Palmer, A., et al. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry. Nat Methods. 14 (1), 57-60 (2017).
  20. Colpaert, M., et al. Neurological glycogen storage diseases and emerging therapeutics. Neurotherapeutics. 21 (5), e00446(2024).
  21. Taylor, M. J., Lukowski, J. K., Anderton, C. R. Spatially resolved mass spectrometry at the single cell: Recent innovations in proteomics and metabolomics. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 872-894 (2021).
  22. Chan, Y. H., et al. Gel-assisted mass spectrometry imaging enables sub-micrometer spatial lipidomics. Nat Commun. 15 (1), 5036(2024).
  23. Lim, M. J., et al. Maldi Hiplex-IC: Multiomic and multimodal imaging of targeted intact proteins in tissues. Front Chem. 11, 1182404(2023).
  24. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J Am Soc Mass Spectrom. 18 (9), 1646-1652 (2007).
  25. Rappez, L., et al. Spacem reveals metabolic states of single cells. Nat Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  26. Grgic, A., Cuypers, E., Dubois, L. J., Ellis, S. R., Heeren, R. M. A. Maldi MSI protocol for spatial bottom-up proteomics at single-cell resolution. J Proteome Res. 23 (12), 5372-5379 (2024).
  27. Dressman, J. W., Bayram, M. F., Angel, P. M., Drake, R. R., Mehta, A. S. Single-cell multiomic MALDI-MSI analysis of lipids and N-glycans through affinity array capture. Anal Chem. 97 (24), 12493-12502 (2025).
  28. Clarke, H. A., et al. Spatial mapping of the brain metabolome, lipidome, and glycome. Nat Commun. 16 (1), 4373(2025).
  29. Juras, J. A., et al. In situ microwave fixation provides an instantaneous snapshot of the brain metabolome. Cell Rep Methods. 3 (4), 100455(2023).
  30. Cantrell, A. R., et al. Protocol for high-power, brain-focused microwave fixation to define rodent metabolism. STAR Protoc. 6 (2), 103794(2025).
  31. Ma, X., et al. An AI-driven framework to map the brain metabolome in three dimensions. Nat Metab. 7 (4), 842-853 (2025).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Glikom HaritalamaK tle Spektrometrisi G r nt lemeMALDI MSIN Ba l GlikanlarGlikojen LokalizasyonuDoku Enzim SindirimiFare Karaci er Glikomi iKarbonhidrat Aktif EnzimlerUzamsal Glikomik Heterojenite
Glycome'in Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Mekânsal Moleküler Görüntülemesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.