Yöntem makalesi

Otizmle İlişkili Bozulmuş Nöronal Uyarılabilirliği Araştırmak için Dinamik Kelepçe Yöntemleri

1.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69155

⸱

17 Ekim 2025

 , 
1Department of Biology, Miami University

Bu makalede

Özet

Dinamik kelepçe elektrofizyolojisi, nöronal ateşleme eksiklikleri ile iyon kanalı disfonksiyonu arasında nedensel bağlantılar kurabilir. Fare serebellar Purkinje nöronlarında dinamik kelepçe yöntemlerini ve protokollerini açıklıyoruz, faydalı kaynaklara ve teknik hususlara dikkat çekiyoruz. Temsili bir çalışmada, tekrarlayan ateşlemeyi kurtarmak için Tsc1-/- Purkinje nöronlarına modellenmiş sodyum iletkenliği ekliyoruz.

Özet

Otizm spektrum bozukluğu (OSB), çok çeşitli genetik ve çevresel faktörlerden kaynaklanır. Çok sayıda ASD'ye bağlı mutasyon, sinaps gelişimini veya plastisiteyi bozarken, artan sayıda voltaj kapılı iyon kanallarının ekspresyonunu ve işleyişini değiştirdiği ve bunun da nöronal içsel uyarılabilirlikte eksikliklere yol açtığı gösterilmiştir. ASD ile ilişkili mutasyonların iyon kanalı fonksiyonunu nasıl etkilediğini karakterize etmek için tüm hücre voltaj kelepçesi kayıtları kullanılabilir. Bununla birlikte, bu deneyler, değiştirilmiş bir iyonik iletkenliğin nöronal aksiyon potansiyeli ateşlemesini nasıl etkilediğini doğrudan değerlendirmede başarısız olur. Dinamik kelepçe elektrofizyolojisi, kullanıcı tanımlı iyonik iletkenliklerin canlı nöronlara gerçek zamanlı enjeksiyonunu sağlayarak bu boşluğu doldurur. Bu, iyon kanalı özelliklerindeki değişikliklerin belirli bir hücre tipinin elektriksel aktivitesini nasıl etkilediğinin nedensel olarak test edilmesine olanak tanır. Bu yöntem makalesinde, akut olarak hazırlanmış serebellar beyin dilimlerinde fizyolojik koşullar altında kaydedilen yetişkin fare Purkinje nöronlarında dinamik kelepçe elektrofizyolojisinin nasıl uygulanacağını açıklıyoruz. Purkinje nöronları, tekrarlayan, yüksek frekanslı (20-100 Hz) aksiyon potansiyellerini ateşlemek için içsel bir kapasiteye sahip oldukları ve sürekli olarak ASD ile ilişkili serebellar devre disfonksiyonunda rol oynadıkları için bu çalışma için özellikle uygun bir modeldir. Fonksiyon kaybı mutasyonları OSB'nin en yaygın monogenik nedenleri arasında yer alan bir gen olan Tsc1'e odaklanıyoruz. Fare Purkinje nöronlarında, Tsc1 delesyonu, azaltılmış voltaj kapılı sodyum (Nav) kanal ekspresyonu ile de ilişkilendirilmiştir. Purkinje nöronu Nav iletkenlik özelliklerini simüle etmek ve yeniden üretmek için Markov kinetik durum modellerini kullanıyoruz ve Nav iletkenliğindeki değişikliklerin sağlam serebellar Purkinje nöronlarının içsel ateşlemesini nasıl etkilediğini doğrudan değerlendirmek için dinamik kelepçe kullanmaya devam ediyoruz. İyonik iletkenlik modellerini değiştirmek ve ayarlamak için talimatlar ve kaynaklar sağlıyoruz. İyonik iletkenlik modellemesini, dinamik kelepçeyi ve geleneksel yama-kelepçe tekniklerini entegre eden bu yaklaşım, genetik bozulmaları OSB ile ilgili nöronlardaki fizyolojik sonuçlara bağlamak için güçlü ve esnek bir çerçeve sağlar.

Giriş

Otizm spektrum bozukluğunun (ASD) moleküler ve hücresel itici güçleri üzerine yapılan önceki araştırmalar, genellikle sinaptik disfonksiyonun bozukluğun patofizyolojisinin merkezinde olduğunu vurgulamıştır 1,2. Çok sayıda çalışma, OSB modellerinde uyarıcı sinaps yoğunluğununarttığını 2,3,4, sinaptik budamanın bozulduğunu 5 ve postsinaptik yoğunluk proteinlerinde 6,7 değişiklikler olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, son çalışmalar, içsel nöronal uyarılabilirlikteki değişikliklerin de OSB patolojisinin itici güçleri olduğunu göstermiştir. Örneğin, ASD transgenik fare modelleri ve hastadan türetilen hücre hatları, serebellar Purkinje 8,9,10 ve kortikal piramidal nöronlarda11 bozulmuş aksiyon potansiyeli üretiminin yanı sıra kortikal piramidal nöronların12 alt sınıflarında zayıflatılmış dendritik uyarılabilirlik ve sinaptik entegrasyon ortaya çıkarmıştır. Voltaj kapılı sodyum (Nav) kanalı Nav1.2 gözenek oluşturan α alt birimini kodlayan SCN2A'da fonksiyon kaybı mutasyonlarını içeren kanalopatiler, artık ASD13'ün iyi bilinen bir monogenik nedenidir ve çeşitli merkezi nöron sınıflarının içsel uyarılabilirliğinde eksikliklere neden olduğu gösterilmiştir 14,15,16,17. Bu tür araştırmalar ilerledikçe, iyonik iletkenliklerdeki patojenik değişiklikler ile bu değişikliklerin nöron ve devre fonksiyonu üzerindeki etkileri arasında nedensel bağlantılar kurmak önemlidir. Dinamik kelepçe elektrofizyolojisi bu görev için etkili bir yaklaşım sağlar. Sharp ve ark. (1992 ve 1993)18,19, Robinson ve Kawai (1993)20 ile birlikte, başlangıçta, voltaja bağlı özelliklere sahip olsun veya olmasın, simüle edilmiş doğrusal olmayan bir iyonik iletkenliğin canlı nöronlara enjekte edildiği/eklendiği dinamik kelepçe yöntemlerini tanımladı ve araştırmacıların, voltaj kapılı bir iyonik iletkenlikteki özelliklerin veya varsayılan değişikliklerin nöronal ateşlemeyi nasıl etkilediğini gerçek zamanlı olarak değerlendirmesine olanak tanıdı21, 22.

Dinamik kelepçe deneylerinin uygulanması, RTXI23, QuB 24,25 ve StdpC26 gibi ücretsiz olarak kullanılabilen çeşitli yazılım sistemleri tarafından kolaylaştırılmıştır; Bununla birlikte, son gelişmeler, model iletkenliklerinin tek bir bilgisayarda ve tek bir yazılım paketi içinde geliştirilmesini, değiştirilmesini ve uygulanmasını sağlayan ticari tak ve çalıştır sistemleriyle dinamik kelepçe uygulamasını basitleştirmiştir. Burada, bir Sutter dPatch sistemi27 kullanarak dinamik kelepçe gerçekleştirmek için protokoller sağlıyoruz ve ASD28 için yaygın bir mutasyon lokusu olan tüberoskleroz 1'in (Tsc1)9 hedeflenen silinmesinin, voltaj kapılı sodyum iletkenliği8'in ekspresyonundaki değişikliklerin bir sonucu olarak serebellar Purkinje nöronlarının içsel ateşlemesini nasıl etkilediğini test ettiğimiz örnek bir araştırma sağlıyoruz.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Miami Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi yönergeleri (Protokol #1044) tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirildi. Deneylerde erkek ve dişi vahşi tip C57BL/6J fareler ve C57BL/6J suş geçmişine sahip transgenik hatlar kullanıldı. Elektrofizyolojik deneyler için hayvanlar 6-7 haftalıktı. Tüm kayıtlar serebellar vermisteki 5, 6 veya 7 numaralı lobüllerdeki Purkinje nöronlarından alınmıştır.

1. Purkinje nöron yama-kelepçe deneyleri için kurulum ve doku hazırlığı

  1. Aşağıdakileri içeren 1 L yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) hazırlayın: 125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4 , 25 mM NaHCO3 , 2 mM CaCl2 , 1 mM MgCl2 ve pH 7.4'te (~300 mOsM / L) 25 mM dekstroz. Ayrıca aşağıdakileri içeren 250 mL 'kesme çözeltisi' hazırlayın: 240 mM sükroz, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4 , 0.5 mM CaCl2 ve 7 mM MgCl2 . Serpme (kabarcık) ACSF ve kesme çözeltilerini karbojen (%95 O2/% 5 CO2) gazı ile kullanımdan en az 20 dakika önce ve tüm deneyler boyunca sürekli olarak karıştırın.
  2. Daha sonra kullanmak üzere ACSF ile doldurulmuş bir beyin dilimi tutma odası hazırlayın. Serebellar dilimlerin (dilim odasına eklendikten sonra) serebellar dilimlerin her iki tarafı ACSF'ye maruz kalacak şekilde suya batırıldığından emin olun. Bunu, suya batırılmış dilimleri, yine suya batırılmış, sıkıca gerilmiş bir naylon ağ üzerine yerleştirerek gerçekleştirin.
  3. Ameliyat istasyonunu hazırlayın. Anestezi uygulanmış hayvanı sabitlemek için kullanılacak dört parça bant hazırlayın. Buz dolu bir kova veya buz tavasında, bir Petri kabının alt yarısını, duvarları aşağı bakacak ve Petri kabının alt kısmı yukarı bakacak şekilde buzun içine yerleştirin. Petri kabının tabanına bir filtre kağıdı (≥ 3 cm2) yerleştirin ve 2-3 mL kesme solüsyonu ile doyurun.
    NOT: Tarif edilen deneyler için, 350 μM parasagital serebellar dilimleri dilimlemek için bir komprestom vibratomu kullanılır. Sıkıştırma ile dilimleme dokusu, çevreleyen ince bir metal tüpün içinden geçen plastik bir numune tüpüne yapıştırılır. Dilimleme sırasında numune tüpü, sabit kalan metal tüpün içinden itilir. Doku numune tüpüne yapıştırıldıktan sonra doku ısıtılmış %2 agaroz içine gömülür. Komprestomun bıçağı, vibratomun koluna bağlı sabit bir tutucuya yapıştırılmıştır. Diğer vibratom türleri, ısıtılmış agaroza doku gömülmesini gerektirmez, ancak açıklanan deneyler için benzer şekilde iyi çalışmalıdır.
  4. Ayrıca buzun içine tek kenarlı bir tıraş bıçağı ve kesme solüsyonuyla dolu küçük (10 mL) bir beher yerleştirin. Isıtılmış agarozu numune tüpüne eklendikten sonra hızlı bir şekilde soğutmak için kullanılan bir soğutma bloğunun yanı sıra buz üzerinde soğutulmuş kesme solüsyonu ile doldurulmuş 30 mL'lik bir şırınga bulundurun. 30 mL'lik şırınganın, Luer lock dişi tabanlı bir iğneye (≥ 26 G) bağlı (sonlandırma ucunda) intravenöz (IV) tüpün (Luer lock erkek konik yoluyla) 30-60 cm'lik bir bölümüne bağlandığından emin olun.
  5. Kalan kesme solüsyonunu -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin. Bu kesme solüsyonu sulu buz kıvamına geldiğinde (20-25 dakika), -80 °C'lik dondurucudan çıkarın ve buzun üzerine koyun.
  6. 5-8 haftalık yetişkin bir fareyi 1 mL/kg hayvan ağırlığı ketamin (10 mg/mL)/ksilazin (0.25 mg/mL) kokteylinin intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun.
  7. 0,5 g agarozu 25 mL kesme çözeltisi içinde çözerek %2'lik bir agaroz çözeltisi yapın. Hayvan uyuşturulduktan sonra (ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermez), %2'lik agaroz çözeltisini ısıtın (mikrodalgada ~30 s) ve ısıtılmış agaroz çözeltisini 40 °C'lik bir su banyosuna aktarın.
    NOT: 1.8-1.18 numaralı adımlar acilen ve ısıtılmış agaroz katılaşmadan önce tamamlanmalıdır.
  8. Hayvanın uzuvlarını bantla ameliyat masasına sabitleyin. Makas kullanarak hayvanın göğüs boşluğunu açarak akciğerlerin ve karın organlarının kesilmemesini sağlayın. Göğüs kafesini açık tutmak ve kalbi açığa çıkarmak için kilitleme forsepsleri veya hemostatlar kullanın. Bunu başarmak için, forsepsleri sternuma kilitleyin ve dikkatlice hayvanın önüne doğru yatırın (alet parmak delikleri hayvanın başının yanında).
  9. 30 mL'lik şırıngaya bağlı iğneyi sol ventriküle sokun ve iğneyi sol intraventriküler oda içinde tutarak iğnenin etrafındaki dokuyu sıkıştırmak için forseps kullanın. Cerrahi makas kullanarak sağ atriyumda küçük bir kesim yapın ve hayvanı 25 mL soğutulmuş kesme solüsyonu ile hızla perfüze edin.
    NOT: Perfüzyonatın sol ventriküle girdiğinden ve sağ atriyumdan çıktığından ve hayvanın dolaşım sistemindeki kanı temizlediğinden emin olun.
  10. Perfüzyon tamamlandığında, hayvanın başını hızla kesin ve kafatasının yüzeyini ortaya çıkarmak için kafa derisini başın orta hattı boyunca bregmaya doğru kesin.
  11. Makas kullanarak, kafatasının arka tarafındaki bağ dokusunu çıkarın ve omuriliğin foramen magnumdan dışarı çıkmadığından emin olarak fazla omurilik dokusunu çıkarın.
  12. Bir makas bıçağını foramen magnuma yerleştirin ve kafatasının çevresi boyunca bregmaya doğru her iki zamansal açıdan kesin, bregma'da bir miktar kafatası dokusu bırakın.
  13. Foramen magnuma bir makas bıçağı veya ince forsepsin yarısını yerleştirin ve kafatasını beyinden ayırarak üst tarafa kaldırın. Kafatasını kaldırırken makas bıçağını veya forseps'i beyne itmemeye dikkat edin.
  14. Beynin altını (önden) kepçelemek için bir spatula cerrahi aleti kullanın ve beyni dikkatlice soğutulmuş kesme solüsyonu içeren 10 mL'lik behere çıkarın, beyin aktarılırken beyinciği korumaya dikkat edin. Bu aşamada temiz eldivenler giyin.
  15. Beyni dikkatlice beherden çıkarın (spatula aletini kullanarak) ve filtre kağıdının üzerine (bir Petri kabına) yerleştirin. Parasagital eksen boyunca orta hattan birkaç milimetre kesmek için tek kenarlı bıçağı kullanın. Daha küçük parasagital kesitli dokuyu atın. Ön beynin ortasında (serebellumun önünde) ikinci bir koronal kesim yapın. Serebellumun önündeki koronal olarak kesilmiş dokuyu atın.
  16. Tek kenarlı bıçağı ön beynin ön kısmının altına kaydırın ve kalan dokuyu döndürmek için kaldırın, böylece ilk parasagital kesimin tarafı aşağı bakacak (filtre kağıdı üzerinde) ve kesilmemiş serebellar hemisfer yukarı bakacak şekilde kaldırın.
  17. Numune tüpünü buza dik olarak yerleştirin ve tüp yüzeyine ince bir tabaka süper yapıştırıcı (siyanoakrilat yapıştırıcı) ekleyin. 90° bükülmüş bir spatula aleti kullanarak, doku oryantasyonunu koruyarak beyin dokusunu filtre kağıdından numune tüpünün yüzeyine dikkatlice aktarın. Kesilmemiş serebellar hemisferin yukarı bakmaya devam ettiğinden emin olun. Doku numune tüpüne yerleştirildikten/yapıştırıldıktan sonra, metal tüpü beyin dokusunu çevreleyecek şekilde yukarı doğru kaydırın.
  18. Motorlu 10 mL'lik bir pipet kullanarak numune tüpünü ısıtılmış agarozla (beyin dokusunu gömerek) doldurun. Soğutma bloğunu metal borunun etrafına ~30 saniye sıkıştırarak dokuyu (şimdi ısıtılmış agaroz içine gömülü) hızla soğutun.
  19. Numune tüpünü titreşimli banyo odasına yerleştirin ve banyoyu sulu kar kesme solüsyonuyla doldurun. Beyin dokusu dilimleme sırasında kesme solüsyonunu sürekli olarak serpin, ancak serebellar dilimleri doğrudan gaz kabarcıklarına maruz bırakmayın.
  20. 300-350 μm parasagital dilimler kesin, her dilimi hemen serpilmiş oda sıcaklığında ACSF ile doldurulmuş dilim tutma odasına aktarın. Tüm dilimler dilim haznesine yerleştirildikten sonra, dilim haznesini 33 °C'lik bir su banyosunda 25 dakika inkübe edin.
  21. Su banyosunda 25 dakika kaldıktan sonra, dilim odasını (tekrar) oda sıcaklığına yerleştirin ve serebellar dilimlerden herhangi birinden yama kayıtlarını denemeden önce en az 35 dakika daha bekleyin.

2. Dinamik kelepçede Markov tabanlı bir iletkenlik modelinin yapılandırılması

NOT: Dinamik kelepçe, modellenmiş bir iletkenliğin canlı bir hücreye gerçek zamanlı uygulanmasıdır. Membran voltajı keskin veya yama elektrot aracılığıyla kaydedilir/örneklenir ve sayısallaştırılmış sinyal, uygulanan iyonik iletkenlik model(ler)ini kullanarak örneklenen voltaj için uygun dinamik kelepçe akımı enjeksiyonunu hesaplayan dinamik kelepçe yazılımına gönderilir. Hesaplanan dinamik kelepçe akımı enjeksiyon sinyali, hücreye (elektrot aracılığıyla) enjekte edilmek üzere amplifikatöre ve ana aşamaya gönderilir. Modellenmiş bir iletkenliğin, membran voltajında hızlı geçici değişiklikleri yönlendiren aksiyon potansiyellerini ateşleyen bir hücreye uygun şekilde eklenmesi için, voltaj örnekleme frekansı yeterince yüksek olmalı ve voltaj örneği ile dinamik kelepçe akımı enjeksiyonu arasındaki gecikme (bazen gecikme olarak adlandırılır) minimum ve değişmez olmalıdır29.

  1. Herhangi bir dinamik kelepçe deneyinden önce, dinamik kelepçe deneyinde kullanılacak iyonik iletkenlik(ler) için matematiksel model geliştirin veya elde edin. Bu modeller Markov kinetik durum modeli, Hodgkin-Huxley (HH) modeli veya pasif (doğrusal) iletkenlik şeklinde olabilir. Seçilen iletkenlik modelinin, amaçlanan iyonik iletkenliğin kinetik ve voltaja bağlı özelliklerini doğru bir şekilde yeniden ürettiğinden emin olun.
    NOT: Deneyciler, dinamik kelepçe deneylerinde kullanılmadan önce, modellenmiş iletkenliği test ederek modellenmiş bir iyonik iletkenliğin özelliklerini doğrulayabilirler (in silico) voltaj-kelepçe simülasyon çalışmalarında. Markov kinetik durumu ve HH iletkenlik modellerinin önemli özellikleri ve düşünceleri Tartışma bölümünde açıklanmıştır. Aşağıdaki adımlar, dinamik kelepçe yazılımında bir Markov iletkenlik modelinin kurulmasını açıklamaktadır.
  2. Dinamik kelepçe deneylerinde kullanılacak iletkenlik modeli için bir Markov durum geçiş diyagramı oluşturun veya edinin. Markov iletkenlik modelini dinamik kelepçe yazılımına (aşağıda açıklanmıştır) doğru bir şekilde monte etmek için bu diyagramı kullanın.
    NOT: SutterPatch, dPatch amplifikatör veri toplama yazılımıdır. Dinamik kelepçe deneyleri yazılım içinde gerçekleştirilebilir, bu da akım-kelepçe protokolleri sırasında akım enjeksiyonu yoluyla modellenmiş iletkenliklerin montajına ve uygulanmasına izin verir. Fare Purkinje nöronlarından alınan Nav akımı ölçümlerine dayanan modellenmiş voltaj kapılı sodyum iletkenliği için bir Markov durum geçiş diyagramı Şekil 1A'da gösterilmektedir. Bu model Ransdell ve diğerleri, 202230 tarafından geliştirilmiştir ve Purkinje nöronunun ateşlenmesinde kalıcı ve yeniden canlanan sodyum akımı bileşenlerinin rolünü araştırmak için kullanılmıştır31. Geçit durumları (C, IC, IF, IS ve O), değişkenlerle (yani S0, S3, S1, S4) gösterilen geçiş hızı sabitleri ile birbirine bağlanır. Bu model, temsili dinamik kelepçe deneylerinde kullanılır ve GitHub: https://github.com/morenomdphd/Resurgent_INa'dan indirilebilir.
  3. Veri toplama yazılımında, Dynamic Clamp Editor penceresini SutterPatch sekmesinden Dynamic Clamp Editor > veya Dashboard penceresindeki ilgili simgeye tıklayarak açın. Dinamik kelepçe düzenleyici penceresinin bölümleri Şekil 1B'de gösterilmektedir.
    NOT: Dinamik Kelepçe Düzenleyici penceresi, bir akım kelepçesi kayıt protokolü sırasında modellenen iletkenliği uygulamak için gerekli tüm ayarları içerir. İletkenlik Havuzu arayüzü (Şekil 1B, sol üst), kullanıcıların model iletkenlik gruplarını düzenlemesine ve aynı anda yüklemesine olanak tanır.
  4. İletkenlik Havuzu arayüzünde (Şekil 1B, sol üstte), Yeni'ye tıklayıp istediğiniz gibi adlandırarak bir havuz oluşturun. Bir iletkenlik havuzu seçildikten sonra, Headstage seçici arayüzündeki pencerenin sağında (Şekil 1B, sol alt), ilgili iletkenlik havuzu için model türünü seçin (Model- Markov, Hodgkin-Huxley, değişken iletkenlik, vb.) ve model iletkenliğinin/iletkenliklerinin ne zaman uygulanması gerektiği, örneğin bir rutin/protokol (Aktif Mod) sırasında. Headstage seçici arayüzü ayrıca dinamik kelepçe Güncelleme Hızı (kHz cinsinden) ve Voltage Sinyal Kaynağı (bkz. Şekil 1B, sağ). Voltage Sinyal Kaynağı için, vol kaydeden headstage'i seçintage sinyal.
  5. Headstage seçici panelinde, örnek için Nav iletkenliği Markov modeli (Şekil 1A), Model için Markov Modeli'ni, Aktif Mod için Taramalar Sırasında'yı, Güncelleme Hızı için 200 kHz'i ve Voltaj Sinyal Kaynağı için Headstage 1'i seçin. Gerilim sinyaline yanıt olarak model hesaplamalarını başlatmak ve sırasıyla herhangi bir akım pensi protokolüne dinamik pens akımı enjeksiyonu eklemek için AuxOUT1'e Uygula ve Komut Sinyalini kontrol edin (Şekil 1B, sol alt).
  6. Ana Dynamic Clamp Editor panellerinin altında durum matrisi bulunur (Şekil 1C, altta). Önce Headstage seçici arabiriminde Model Parametrelerini Düzenle'ye tıklayarak durum matrisini düzenleyin (Şekil 1B, sol altta). Düzenleyicinin yanında Dynamic Clamp Markov Model Parametreleri adlı yeni bir pencere açılacaktır. Bu panelde, Markov modeli iletkenliğini temsil eden durum matrisi denklemlerini girin.
  7. Kanal Ayarları panelinde (Şekil 1B, sağ üstte), hangi kayıtlı iletkenlik modellerinin uygulanacağını seçin (dinamik kelepçede). Alternatif olarak, boş bir kanal seçin ve yeni bir model iletkenliği oluşturmaya başlayın. Bu panelin sağında, V ters çevirme (modellenmiş iletkenlik iyon(lar)ı ters çevirme potansiyeli) girin. Sodyum iletkenliği kullanan çalışmamız için, ACSF'ye ve yama elektrot dahili çözeltisine dayalı sodyumun ters potansiyelini yansıtmak için 55.0 mV girin.
  8. Ayrıca Kanal Ayarları panelinde, seçilen iletkenliğin kinetik durumlarının sayısını sağlayın (bkz. Şekil 1B, sağ üst, kırmızı kutu). Burada, modellenen iletkenliğin 9 kinetik durumunu yansıtmak için 9 girin (bkz. Şekil 1A).
  9. Kanal Ayarları panelinin altında Durum Denklemleri paneli bulunur. Markov modelinin topolojik düzenlemesini yansıtmak için durum geçiş hızı sabiti denklemlerini geçit durumu matrisine uygun şekilde yerleştirin. Denklemleri Durum Denklemleri paneline girin ve "S0"dan başlayarak bir kimlik girin (Şekil 1B, ortada).
    NOT: Bu değişkenler Markov modelinin topolojisini yansıtacak şekilde geçit durumu matrisinde uygun şekilde doldurulduğu sürece, bu denklemlerin girilme sırası önemli değildir.
  10. Geçit durumu matrisini şimdi tanımlanmış hız sabiti değişkenleriyle doldurmak için, Durum Denklemleri panelinin sağ tarafındaki Durum Matrisini Düzenle'ye tıklayın (Şekil 1B, ortada). Her kinetik duruma 0'dan başlayan bir sayı verilir. Örneğin, X ve Y durumlarını içeren iki kinetik durum modeli için, bu durumlar "0" ve "1" olarak adlandırılacak ve a1'in 0'dan 1'e ve b1'in 1'den 0'a geçtiği iki geçiş hızı sabiti a1 ve b1'i içerecektir.
  11. Durum Matrisi Düzenleyicisini kullanarak bu denklemleri uygun şekilde bağlamak için (Şekil 1B, altta), hız sabitlerini, her ikisi de 0'dan başlayan, numaralandırılmış satırlar ve sütunlar içeren bir tabloya girin (Şekil 1C'deki örneğe bakın).
    NOT: Bir durumdan diğerine hareket, bu tablodaki "satırdan sütuna" biçimindeki konumlarına göre belirlenir. Örneğin, adım 2.1'deki iki durumlu model örneğinde, durum 0'dan durum 1'e geçiş, daha sonra satır 0, sütun 1'e yerleştirilen "a1" hız sabitine dayanır. Geçiş hızı sabiti "b1", durum 1'den durum 0'a geçişleri yönlendirir ve bu nedenle hız sabiti satır 1, sütun 0'a yerleştirilmelidir. Şekil 1C'de, örnek geçit durumu matrisi, Şekil 1A'da gösterilen Nav iletkenlik modelinin topolojisini yansıtan hız sabitlerine sahiptir. Örneğin, "S0", IC1'den IC2 kinetik durumuna geçişleri tanımlayan hız sabitidir; bu nedenle, "S0", Geçit Durum Matrisinin 0. satırı, 1. sütununa yerleştirilir (Şekil 1C). Her bir hız sabitinin değişkenini tanımlayan geçiş hızı sabiti denklemleri daha sonra bir dolu durum matrisini doldurur (Şekil 1C, alt).
  12. Hız sabiti denklemleri durum matrisi düzenleyici paneli aracılığıyla bağlandığından, bağlantılar (karşılık gelen satır ve sütun) denklemin yanındaki Bağlantılar panelini dolduracaktır (Şekil 1B, sağ orta). Bir sonraki adım için önemli olan Şekil 1C'nin (üst, kırmızı kutular) 7. satırına ve sütununa eklenen temsili sodyum iletkenlik modelindeki (Şekil 1A) Açık/İletken durumuna dikkat edin.
  13. Şekil 1B'de (sağ altta), dinamik kelepçe sırasında uygulanacak model iletkenliğinin genliğini tanımlamak için İletkenlik Denklemleri (nS) panelini kullanın. Markov modelinde açık/iletken durumları seçin ve bir iletkenlik değeri sağlayın (Şekil 1B, alt, kırmızı kutu).
  14. Bu deney için, fare Purkinje nöronları üzerinde voltaj kelepçesi çalışmalarında ölçülen tepe Nav akımlarına benzer tepe Nav akımı değerlerini ekleyen "G7" kutusuna "400 nS" girin.
  15. Yukarıdaki adımlar tamamlandıktan sonra, bir akım pensi rutini başlatıldığında modeli dinamik pens uygulamasına hazırlamak için Yükle'ye tıklayın.
  16. HH modellerini düzenlemek için benzer bir işlem kullanın; ancak, bağımsız geçit durumlarını ( Kapı Denklemlerinde) ve G maksimumunun altındaki iletkenliği tanımlamak için denklemler ekleyin.
  17. Dinamik kelepçe iletkenliği uygulamak için, önce Rutin Düzenleyiciyi kullanarak bir akım kelepçesi rutini oluşturun (Rutin Düzenleyici'> SutterPatch sekmesine tıklayın) (Şekil 1D). Bir akım kelepçesi yordamı oluşturmak için, Üst Çıkış Kanalını seçin (bu örnekte StimOut1'dir). Bu, kullanıcının yordam sırasında geçerli komut çıktısını tanımlamasına izin veren bir panel açacaktır. Kayıt Modu'nun Rutin Düzenleyici'de CC_Mode olarak ayarlandığından emin olun.
    NOT: Temsili deneylerde, bu protokol kendiliğinden ateşlenen hücrelerle çalıştığından, sıfır akım enjeksiyonuna sahip boşluksuz bir akım kelepçesi rutini / protokolü kullanılır.
  18. Rutin Düzenleyici Giriş Kanallarında (Şekil 1D, sağ üst), deneyler sırasında kaydedilen kapsam pencerelerini dolduracak giriş sinyallerini tanımlayın. Bu girişler bir voltaj sinyali içermeli ve ayrıca rutinin komut akımı enjeksiyonunun yanı sıra sırasıyla Akım1 ve AuxIN1 olarak adlandırılan dinamik kelepçe akımı enjeksiyonunu da içermelidir (Şekil 1D, sol alt).
  19. Pozitif ve/veya negatif akım enjeksiyon komutlarını içeren akım pensi rutinleri için, komut akımı enjeksiyon sinyali otomatik olarak dinamik pens akımı sinyali ile birleştirilecektir. İzole edilmiş dinamik kelepçe akımı enjeksiyonunun bir kaydı olması için komut akımı sinyalini çıkarmak için sanal bir kapsam penceresi oluşturun. Yeni sanal kapsam penceresini oluşturmak için önce Sanal1 onay kutusunu seçerek ek bir giriş kanalı seçin.
  20. Yordam Düzenleyicisi'nde, Matematik Türü altında, Denklem'i seçin ve (Kaynak Kanal altında) bu örnekte Geçerli1 olan akım-kelepçe yordamının komut giriş sinyalini seçin. Akım-pens komut sinyalini dinamik pens akımı enjeksiyon sinyalinden çıkarmak için açık alana bir denklem girin.
    NOT: Bu örnek deney için bu, t[3]-t[2] denklemi ile yapılır. Sanal1 kapsam penceresi artık dinamik kelepçe akımı enjeksiyonunu (mevcut komut sinyalinden izole edilmiş) görüntüler. Kullanıcılar, Etiket'in altına çift tıklayarak giriş veya çıkış kanallarının etiketlerini özelleştirme olanağına sahiptir.

3. Parasagital serebellar dilimlerdeki fare Purkinje nöronlarından akım kelepçesi kayıtlarının alınması

  1. Elektrofizyoloji teçhizatını, fizyolojik sıcaklığa (34-36 °C) yakın ısıtılan ACSF ile perfüze edilmiş (yerçekimi) bir doku dilim odası ile donatın. Dilim odasına dikkatlice bir parasagital serebellar dilim yerleştirin ve serebellar dilimi batık ve sabit bir konumda tutmak için bir dilim arp kullanın. Klorürlü bir toprak elektrodunun ve sıcaklık probunun da serebellar dilim odası içinde suya daldırıldığından ve stabil olduğundan emin olun.
  2. 40x daldırma objektif merceği kullanarak Purkinje nöron katmanını bulun. Purkinje nöronları büyük ve gözyaşı damlası şeklindedir. Sağlıklı Purkinje hücrelerinin plazma zarı tipik olarak pürüzsüz görünür ve çekirdek görünmez.
  3. Sağlıklı bir Purkinje nöronu tanımlandıktan ve yama-kelepçe kaydı için hedeflendikten sonra, mikroskop objektif merceğini yukarı doğru ayarlayın. Bir elektrot tutucuya ve headstage'e bağlı bir cam mikroelektrotun ucunu konumlandırın ve odaklanın. Headstage/mikroelektrodu 3 eksenli robotik bir mikromanipülatör ile kontrol edin.
    NOT: Bu deneyler için, mikroelektrotların 2-4 MΩ direnç değerlerine sahip olduğundan ve uygun bir akım pensi dahili çözeltisi ile doldurulduğundan emin olun. Temsili deneylerde kullanılan dahili çözelti şunları içerir: 144 mM K-glukonat, 0.2 mM EGTA, 3 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 4 mM Mg-ATP ve 0.5 mM Na-GTP.
  4. Hedef Purkinje nöronuna yaklaşmadan önce, elektrot tutucu basınç portuna 2-3 mL pozitif hava basıncı ekleyin.
  5. Amplifikatör kontrol panelinde VC moduna geçin ve elektrot kompanzasyonu ve elektrot voltajı ofset işlevlerini uygulayın. Buradaki örnekte, elektrot telafisi ve voltaj ofseti seçeneklerinin yanındaki Otomatik'e tıklayarak bunu yapın.
  6. Sürekli bir membran sızdırmazlık testi protokolü başlatın ( Membran Testi'ne tıklayın). Membran testi parametrelerini 5 mV veya 10 mV'luk bir adımla 5 ms'lik taramalarda (veya yakınında) ayarlayın. Tutma potansiyelini (V-tutma) 0 mV olarak ayarlayın.
  7. Odağı elektrotun ucunda veya biraz altında tutacak şekilde ayarlayarak mikroelektrodu hedef hücreye doğru hareket ettirin. Elektrodu hedeflenen hücrenin plazma zarının biraz üzerine yerleştirin. Yüzey zarını 'temizleyerek' hücre dışı kalıntıları hedef hücre somasından uzaklaştırmak için mikromanipülatörü ve elektrot ucundan gelen pozitif basıncı kullanın.
  8. Hedef hücre hücre dışı kalıntılardan temizlendikten sonra, elektrodu, aksonun hücre gövdesinden uzandığı Purkinje nöron somasının geniş ucundaki zarın yüzeyine yakın bir yere yavaşça yerleştirin. Elektrot ucu membrana indirildiğinde, membran yüzeyinde muhtemelen bir çukur görünecektir (elektrotun pozitif basıncı nedeniyle). Bu noktada, pozitif basıncı serbest bırakın ve az miktarda negatif basınç uygulamak için ağızdan emmeyi kullanın.
  9. Amplifikatör Kontrol panelinde, V tutma potansiyelini -80 mV (0 mV'den) olarak değiştirin. Membran sızdırmazlık testinin izlenmesi, pipet direnci ≥ 1 GΩ'a ulaştığında, negatif basıncı artırın ve membranı yırtmak ve tam hücreli bir yama-kelepçe konfigürasyonu elde etmek için Membran Sızdırmazlık Testi panelindeki Zap işlevine tıklayın.
  10. Amplifikatör kontrol paneli aracılığıyla akım kelepçesi moduna geçmeden önce membran pasif özelliklerini (kapasitans ve giriş direnci değerleri) ölçmek için kısa bir voltaj kelepçesi protokolü kullanın.
  11. Akım kelepçesi moduna geçtikten sonra, %70'≥ kadar bir köprü denge telafisi uygulayın.
  12. Bir yama elektrodu ile dinamik bir kelepçe iletkenliği uygulamadan önce, bağlantı potansiyeli hatasını düzeltin (elektrot iç ve ACSF çözeltilerinin bileşimine göre hesaplanır). Temsili deneylerdeki çözümler için 17,5 mV'luk bir bağlantı potansiyeli düzeltmesi uygulayın. Dinamik kelepçe çalışmalarında, dinamik kelepçe akımı enjeksiyonlarını hesaplamak için iletkenlik modeli/modelleri tarafından doğru bir voltaj sinyalinin kullanılması için doğru bir bağlantı potansiyeli düzeltmesi kritik öneme sahiptir.

4. Dinamik kelepçe iletkenliğinin uygulanması

  1. Purkinje nöronları tekrarlayan aksiyon potansiyellerini kendiliğinden ateşlediğinden, hücre sağlığını test etmek ve membran uyarılabilirliğinin temel özelliklerini ölçmek için modellenmiş bir iyonik iletkenlik eklemeden (veya çıkarmadan) önce ateşleme özelliklerini kaydedin. Dynamic Clamp ayarları penceresinde Yükle'ye tıklayarak modellenmiş iletkenliği uygulayın. Artık dPatch denetleyicisinde CC'nin üzerinde küçük bir DynC etiketi görünecektir (bkz. Şekil 1D, kırmızı kutular).
  2. Dinamik pens açıldıktan/yüklendikten sonra, bir akım pensi rutini/protokolü etkinken dinamik pens iletkenliği otomatik olarak uygulanır. AuxIN1 seçilen giriş sinyaline karşılık gelen kapsam penceresinde dinamik kelepçe akımı enjeksiyonunu görüntüleyin.
    NOT: Dinamik kelepçe aracılı iletkenliklerin uygulanmasıyla ve uygulanmadan spontan ateşlemenin alternatif kayıtları, uygulanan model iletkenliğinin uyarılabilirliği nasıl etkilediğini belirlemek ve temel uyarılabilirlik seviyelerinin deney boyunca kararlı/tutarlı olup olmadığını belirlemek için önemlidir.

Sonuçlar

Sunulan deneylerde, dinamik kelepçe kullanarak, parasagital serebellar dilim preparasyonunda akut olarak izole edilen yetişkin (6-7 haftalık) fare serebellar Purkinje nöronlarına modellenmiş voltaj kapılı sodyum (Nav) iletkenliği uyguluyoruz. Çalışmalar, serebellar Purkinje nöronlarından tüberoskleroz 1'i (Tsc1) seçici olarak silmek için Cre-loxP rekombinasyonunun kullanıldığı vahşi tip (kontrol) fareler ve transgenik fareler üzerinde gerçekleştirilir. Tüberoskleroz kompleksi (TSC), TSC1 veya TSC2'deki fonksiyon kaybı mutasyonlarının neden olduğu multisistem bir hastalıktır 32,28,33. TSC'li bireylere genellikle epilepsi bozuklukları, bilişsel bozukluk ve otizm spektrum bozukluğu tanısı konur34,35. Burada Tsc1mut/mut olarak adlandırılan Purkinje nörona özgü Tsc1 delesyonuna sahip fareler, motor fonksiyon, sosyal etkileşim davranışı ve seslendirmelerdeki bozuklukların yanı sıra abartılı tekrarlayan davranışlar da dahil olmak üzere OSB ile ilişkili çeşitli davranışsal fenotipler sergiler 9,36. Tsc1mut/mut Purkinje nöronlarının ayrıca, önemli ölçüde azaltılmış Nav akımı genlikleri (Şekil 2C) ve Tsc1mut/mut Purkinje nöronlarının8 akson başlangıç segmentlerinde Nav kanalı ekspresyonu ile bağlantılı olan zayıflatılmış aksiyon potansiyeli ateşlemesine (Şekil 2A,B) sahip olduğu gösterilmiştir. Tsc1mut/mut Purkinje nöronlarındaki nav akımları, vahşi tip Purkinje nöronları8 ile benzer kinetik ve voltaja bağlı özelliklere sahiptir. Bu transgenik Tsc1mut/mut fare modelinde, Tsc1mut/mut Purkinje nöronlarına Nav iletkenliği eklemenin tekrarlayan ateşlemeyi kurtarıp kurtaramayacağını test etmek için dinamik kelepçe kullandık. Vahşi tip Purkinje nöronlarında Nav iletkenliğinin çıkarılmasının, Tsc1mut/mut Purkinje nöronlarında ölçülen Purkinje nöron ateşlemesinde benzer bir zayıflamaya neden olup olmadığını test etmeye devam ediyoruz (Şekil 2B). Yerel olarak ifade edilen Nav iletkenliğini çıkarmak için, dinamik kelepçe kullanarak Nav iletkenliğini uyguladık; ancak iletkenliğin polaritesi tersine çevrilir.

Purkinje nöronu Nav iletkenliğini simüle etmek için kullanılan Markov kinetik durum modeli (Şekil 1A), sekizi iletken olmayan, kapalı (C1, C2 ve C3), inaktive edilmiş-kapalı (IC1 ve IC2), hızlı inaktive edilmiş (IF1 ve IF2) ve yavaş inaktive edilmiş (IS) olarak etiketlenen dokuz kinetik durum içerir. Bir açık/iletken (O) kinetik durum30,31 vardır. Etiketli kinetik durumlar arasında gösterilen geçiş hızı sabitleri (Şekil 1A), her bir kinetik durumu işgal eden simüle edilmiş kanalların/iletkenliğin oranını belirler. Membran voltajı, modelin hız sabitlerinin her birini etkiler. Simüle edilmiş voltaj kelepçesi deneylerinde bu model tarafından (in silico) üretilen simüle edilmiş Nav akımları, siyahla gösterilen akut olarak izole edilmiş Purkinje nöronlarından ölçülen Nav akımlarının sağında (kırmızı renkle) gösterilir (Şekil 1A, alt). Bu simüle edilmiş (kırmızı) ve Purkinje nöronu (siyah) Nav akımlarını çağrıştıran voltaj komutu, akım izlerinin üzerinde siyah olarak sunulur. Voltaj komutunda, bir ilk depolarizasyon adımının (0 mV'a kadar) hızlı geçici bir içe doğru sodyum akımı ile sonuçlandığına dikkat edin, bu da simüle edilmiş izde, iletken olmayan kapalı durumlardan açık kinetik duruma geçen kanalları yansıtır ve açık durum kanalları hızlı inaktive edilmiş (IF1 ve IF2) kinetik durumlara birikmeden önce kısa bir iç akıma izin verir. Bu depolarize edici voltaj adımı kısadır (5 ms) ve membran potansiyeli daha sonra potansiyelin 80 ms boyunca tutulduğu -45 mV'luk bir ara repolarize voltaja yükseltilir (Şekil 1A, alt). Bu repolarizasyon voltajı adımı sırasında, yeniden canlanan sodyum akımı (INaR) olarak adlandırılan bir akım bileşeni olan içe doğru sodyum akımının yeniden canlanması dikkat çekicidir. -80 mV'ye giden bu 45 ms'lik adım sırasında, INaR, genlikte yavaş (INaT'ye kıyasla) bir bozulma sergiler ve sonunda kalıcı Nav akımı bileşeni (INaP) olan sabit bir içe doğru akım durumuna ulaşır. Membran repolarizasyonu sırasında modellenmiş INaR'nin (Şekil 1A, alt, kırmızı) aktivasyonu, hızlı inaktive edilmiş (IF1 + IF2) kinetik durumlardan açık/iletken duruma geri dönen simüle edilmiş kanalları yansıtır. Zamanla (-45 mV'de tutarak), açık durumu işgal eden simüle edilmiş kanalların bir kısmı, INaR bozunması olarak yansıtılan emici bir yavaş inaktive (IS) kinetik durumda birikir ve bu kanalların bir kısmı, kararlı durum INaP akım bileşeni30,31 olarak yansıtılan açık/iletken durumda kalır.

Temsili deneylerde/sonuçlarda, akut izole serebellar dilimlerdeki yetişkin Purkinje nöronlarına Nav Markov iletkenlik modeli (Şekil 1A) eklendi. Bu deney düzeneğinin bir karikatür tasviri Şekil 3A'da sunulmuştur. Modellenen Nav iletkenliğini dinamik kelepçe akımı enjeksiyonu yoluyla uygulamak için, tam entegre analogdan dijitale (A/D) ve dijitalden analoğa (D/A) dönüşüme sahip dPatch amplifikatör sistemini ( Şekil 3B'de gösterilmiştir) kullandık. Bu sistem ayni zamanda entegre ARM çekirdek islemcileri (PC'nin disi) araciligiyla sinyal dönüşümlerini de yönetir ve giris sinyallerinin neredeyse aninda islenmesini ve akim enjekte eden elektrot27'ye geri besleme (çikis sinyallerinin gönderilmesi) saglayan entegre bir FPGA (sahada programlanabilir dizi) devresine sahiptir. Buradaki deneyler, 500 kHz'e kadar akım enjeksiyon güncelleme hızlarıyla uygulayabildiğimiz karmaşık bir Markov iletkenlik modelinin (dinamik kelepçede) uygulanmasını içeriyordu.

Simüle edilmiş Nav iletkenliğinin (400 nS) eklenmesi Tsc1mut/mut Boşluksuz akım kelepçesi kayıtları sırasında Purkinje nöronları, hücrelerin tekrarlayan ateşleme frekanslarında net artışlarla sonuçlandı (Şekil 3C1, D1), bu hücrelere Nav iletkenliğinin eklenmesinin Tsc1mut/mut Purkinje nöron uyarılabilirliğindeki eksiklikleri kurtarmak için yeterli olabileceğini gösterir, ancak Tsc1mut/mut'ta bildirilen eksikliklerin tam repertuarını incelemedik Purkinje nöron uyarılabilirliği8. Şekil 3C2'de (üstte) gösterilen temsili izlerden de anlaşılacağı gibi, vahşi tip Purkinje nöronları, yüksek frekanslarda tekrarlayan aksiyon potansiyellerini ateşlemek için içsel bir kapasiteye sahiptir. Dinamik kelepçe kullanarak, modellenmiş Nav iletkenliğini ters (negatif) bir polarite (-400 nS) ile uygulayarak vahşi tip Purkinje nöronlarından modellenmiş Nav iletkenliğini çıkardık. Modellenen Nav iletkenliğinin çıkarılması, tekrarlayan ateşlemede ani ve belirgin bir azalma ile sonuçlandı (Şekil 3C2, alt), bu aynı zamanda Tsc1mut/mut Purkinje nöronlarında ölçülen azaltılmış Nav akımlarının bu hücrelerde ölçülen zayıflatılmış ateşleme özelliklerine katkıda bulunduğu hipoteziyle tutarlıdır8. Birkaç Tsc1mut/mut veya vahşi tip Purkinje nöronunda, Nav iletkenliğinin sırasıyla eklendiği veya çıkarıldığı bu dinamik kelepçe deneyleri, ateşleme frekansı üzerinde tutarlı etkilerle sonuçlandı. Nav iletkenliğinin eklenmesi önemli ölçüde (P = 0.029) arttı Tsc1mut/mut Purkinje nöron ateşleme frekansı (Şekil 3D1) ve vahşi tip Purkinje nöronlarında, Nav iletkenliğinin çıkarılması önemli ölçüde (P = 0.031) ateşleme frekansını azalttı (Şekil 3D2) (Student's paired t-testi).

figure-results-1
Şekil 1: Dinamik kelepçe yazılımında bir Markov modelinin kurulması. (A) Fare serebellar Purkinje nöronlarında30 ölçülen Nav iletkenlik özelliklerini yeniden üreten bir model için bir Markov durum geçiş diyagramı gösterilmiştir. Bu model dokuz kinetik durum içerir. Bunlardan 8'i iletken olmayan durumlardır: üçü kapalı (C), ikisi inaktive edilmiş-kapalı (IC), ikisi hızlı inaktive edilmiş (IF) ve biri yavaş inaktive edilmiş (IS). Model, iletken olan bir açık (O) kinetik durum içerir. Bitişik kinetik durumlar arasında, zaman içinde geçiş yapan bağlantılar/durum doluluğu, S0-S15 olarak gösterilen geçiş hızı sabitleri ile tanımlanır. Her kinetik duruma ayrıca sayısal bir değer (kırmızı) atandığını unutmayın, bu da kullanıcıların Markov modelini ve kinetik durum topolojisini bir geçit durumu matrisinde tanımlamasına olanak tanır (panel C'de gösterilmiştir, aşağıda açıklanmıştır). (B) Kullanıcıların SutterPatch Dynamic Clamp Editor'da birlikte çalıştığı paneller/grafik arayüzler sunulmaktadır. Bu Dynamic Clamp Editor panellerinin düzeninin, dinamik kelepçe yazılımında göründüğü şekliyle düzenlemeyle tutarlı olmadığını unutmayın. Ayrıca, Dynamic Clamp Editor ile ilişkili tüm paneller gösterilmez. (C) (üst panel) Geçit durumu matrisinin bir örneği, panel A'da gösterilen durum geçiş diyagramının topolojisine karşılık gelen değişkenler girilerek gösterilir. Geçit durumu matrisindeki kırmızı kutular, modelin açık (O) kinetik durumuna karşılık gelen satırı ve sütun 7'yi vurgular. Sütun 7'de, açık (O) kinetik duruma geçişleri tanımlayan tüm hız sabitleri listelenir ve satır 7'de, açık (O) kinetik durumdan çıkan geçişleri tanımlayan tüm hız sabitleri listelenir. Bu organizasyonla, geçit durumu matrisi, modelin kinetik durumlarının sayısını, hız sabiti değişkenlerini ve topolojisini (kinetik durumlar arasındaki bağlantılar) tanımlar. (D)'de gösterilenler, dinamik kelepçe iletkenlik modellerinin yüklenmesiyle ilişkili SutterPatch panelleri/kullanıcı arayüzleri ve akım kelepçe rutinlerinin oluşturulmasında yer alan arayüzlerdir. Bu modellerle kullanıcı etkileşimleri, Protokol adımları 2.17-2.20'de açıklanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Tsc1mut/mut Purkinje nöronları, vahşi tip kontrollere kıyasla zayıflatılmış membran uyarılabilirliğine sahiptir. (A) Vahşi tip (üst, siyah) ve Tsc1mut/mut (alt, mavi) Purkinje nöronlarından tam hücre akım kelepçesi kayıtları, Tsc1 mutant hücresinde zayıflatılmış ateşlemeyi ortaya çıkarır. (B) Vahşi tip kontrollere kıyasla Tsc1mut/mut Purkinje nöronlarında azaltılmış ateşleme frekansları, hücreler arasında tutarlıdır. Ortalama (±± SEM) spontan ateşleme frekansı Tsc1mut/mutPurkinje nöronlar önemli ölçüde (P < 0.0001) vahşi tip hücrelere kıyasla daha düşüktür (Welch'in eşleşmemiş t-testi; kontrol N = 13, n = 32; Tsc1mut/mut N = 6, n = 21). (C) Yetişkin Purkinje nöronlarındaki Nav akımlarının voltaj kelepçesi ölçümleri, ortalama (±± SEM) hızlı geçici Nav akımı (INaT) tepe noktasının, vahşi tip kontrollere kıyasla Tsc1mut/mut hücrelerinde önemli ölçüde azaldığını ortaya koymaktadır. (P = 0.007, RM iki yönlü ANOVA; vahşi tip kontrolü: N = 6, n = 22, siyah; Tsc1mut/mut: N = 6, n = 16, mavi kareler). -35 mV'luk bir depolarizasyon adımıyla uyandırılan ÖrnekI NaT kayıtları, C panelinin sağında bir iç panel olarak gösterilir . Veriler daha önce Brown ve ark.'da yayınlanmıştır.8. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: İyonik iletkenliğin Purkinje nöronunun uyarılabilirliği üzerindeki etkilerini belirlemek için dinamik kelepçe kullanılması. Dinamik kelepçe, membran voltajının örneklenmesini (bir kayıt elektrodu aracılığıyla) ve örneklenen voltaja dayalı olarak bir model iletkenliğinin akım çıkışının hesaplanmasını içerir. Hesaplanan akım daha sonra akım enjekte eden bir elektrot kullanılarak biyolojik bir hücreye uygulanır. Panel (A) bu deneysel düzenlemeyi göstermektedir. Voltaj örneklemesi yeterli bir frekansta gerçekleştirilirse ve voltaj örneklemesi ile hesaplanan akımın uygulanması arasında minimum gecikme (gecikme) varsa, bu teknik, modellenmiş bir iletkenliğin eklenmesinin veya çıkarılmasının nöronal ateşlemeyi ve membran uyarılabilirliğini nasıl etkilediğini değerlendirmek için kullanılabilir. (B) Temsili deneylerde, SutterPatch yazılımı ve dPatch amplifikatör sistemi kullanılarak dinamik kelepçe kayıtları elde edildi. dPatch, harici sinyal işlemcilerine ve tam entegre bir sayısallaştırıcıya sahip bir yama kelepçeli amplifikatördür, bu da onu dinamik kelepçe kayıtları için çok uygun hale getirir (bkz. (C) Modellenmiş Nav iletkenliğinin 400 nS'sini eklemek veya çıkarmak için dinamik kelepçe kullanılmadan önce ve sonra spontan Purkinje nöron ateşlemesinin temsili akım kelepçe kayıtları ( Şekil 1A'da sunulmuştur). C1'de (solda), kayıtlar zayıflatılmış ateşlemeli bir Tsc1mut/mut Purkinje nöronundan alınmıştır. 400 nS Nav iletkenliğinin eklenmesi, bu hücrenin ateşleme frekansında net bir artışa neden olur. Alternatif olarak, C2'de kayıtlar vahşi tip bir Purkinje nöronundan alınmıştır. Bu deneyde, modellenen Nav iletkenliği, ters bir polarite (-400 nS) ile uygulanır, bu da Nav iletkenliğinin çıkarılmasıyla sonuçlanır ve tekrarlayan ateşleme frekansında net bir azalma olur. Gri renkle gösterilen dinamik kelepçe akımı enjeksiyon kayıtları, siyahla gösterilen aksiyon potansiyeli ateşleme (voltaj) kayıtlarının altında sunulur. (D) Tsc1mut/mut Purkinje nöronlarına Nav iletkenliği eklendikten sonra kendiliğinden ateşleme frekansındaki değişiklikler olarak sunulan bu dinamik kelepçe deneylerinden elde edilen sonuçlar (D1, n = 3) veya vahşi tip Purkinje nöronlarından Nav iletkenliği çıkarıldı (D2, n = 3), bu iletkenliğin Tsc1mut/mut (P = 0.029) ve vahşi tip (P = 0.031) hücre, sırasıyla (eşleştirilmiş Öğrenci t-testi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Serebellar devreler propriyosepsiyon ve motor kontroldeişlev görür 37,38, ancak aynı zamanda sosyal etkileşimler ve duygusal işleme 39,40,41 gibi karmaşık davranışlar için de kritik öneme sahiptir. Serebellar yapı ve fonksiyondaki patoloji genellikle OSB 42,43,44,45,46 ile bağlantılıdır. Serebellar devrelerin47 basit mimarisi ve serebellumun OSB patolojisindeki açık rolü, onu OSB davranış eksikliklerinin moleküler ve hücresel itici güçlerinin yanı sıra potansiyel terapötikleri araştırmak için çekici bir beyin bölgesi haline getirir. Dinamik kelepçe elektrofizyolojisi, bu araştırmalar için önemli bir araç sunarak, araştırmacıların iyon kanalı özelliklerindeki/iyonik iletkenliklerdeki OSB ile ilgili değişiklikler ile serebellar nöronların ateşlenmesi arasındaki nedensel ilişkileri doğrudan test etmelerini sağlar. Dinamik kelepçe yöntemleri, nöronal uyarılabilirlikteki OSB ile ilişkili değişikliklerin araştırılması için özellikle uygun olsa da, bu teknik, uyarılabilir zarlara sahip hücreleri etkileyen bir dizi patolojik mekanizmanın araştırılması için uygundur. Ek olarak, dinamik kelepçe, nöronların ve kas hücrelerinin uygun aksiyon potansiyeli ateşlemesini düzenlediği ve sürdürdüğü karmaşık süreçleri incelemek için mükemmel bir araç olmaya devam etmektedir.

Dinamik kelepçe deneylerinin doğru şekilde yürütülmesi, teknik parametrelerin dikkatli bir şekilde kontrol edilmesini gerektirir. Spesifik olarak, deneyciler, genellikle titreşim29 olarak adlandırılan voltaj örneklemesi ve akım enjeksiyonu arasındaki gecikmedeki potansiyel değişkenliğin yanı sıra elektrot pasif özelliklerinin, boşluk kelepçesi sınırlamalarının ve araştırılan deneysel hazırlığın fizyolojik doğruluğunun sonuçlarını bilmeli ve anlamalıdır. Bettencourt ve ark. (2008)48 ve Butera ve ark. (2001)29 daha önce, en az 50 kHz'lik yüksek örnekleme hızlarına ulaşmanın, hızlı iyonik iletkenlikleri doğru bir şekilde yakalamak için kritik olduğunu ve geri besleme gecikmelerinin ideal olarak örnekleme aralığının %25'inin (≤ 5 μs) altında tutulduğunu göstermişti. Ticari sistemler, özellikle Windows tabanlı platformlar tarafından bildirilen nominal örnekleme oranları yanıltıcı olabilir; bu nedenle, Milescu ve ark. (2008)25 ve Clausen ve ark. (2012)49. Özellikle karmaşık morfolojilere ve izopotansiyel olmayan membran özelliklerine sahip bozulmamış nöronlarla çalışırken, boşluk kelepçesi kısıtlamaları da dikkate alınmalıdır. Örneğin, AIS gibi entegre bölgenin distalinde olan bir elektrotla bir iletkenlik uygulamaya (veya çıkarmaya) çalışmak, uygulanan iletkenliğin etkilerinin yanlış bir şekilde tasvir edilmesine neden olacaktır. Zayıf (yüksek) elektrot direnci, yetersiz kapasitans telafisi ve/veya bağlantı potansiyeli hatasının düzeltilememesi de voltaj ölçümlerinin (giriş sinyali) yanlış beyan edilmesine ve sonuç olarak modellenmiş iyonik iletkenliklerin50,51 yanlış uygulanmasına neden olabilir.

Binlerce Markov ve HH modeli, sırasıyla İnsan Beyni Projesi ve Nöral Mikro Devre Laboratuvarı tarafından desteklenen ModelDB52 ve Channelpedia53 gibi çevrimiçi veritabanlarında araştırmacıların kullanımına ücretsiz olarak sunulmaktadır. Bu veritabanları, öncelikle NEURON, MATLAB veya Python ile yazılmış sinaptik iletkenlikler, iyon kanalı iletkenlikleri ve iletkenlik tabanlı nöron modelleri için modeller içerir. Veritabanı dosyaları tipik olarak gerekli model denklemlerinin yanı sıra hücre tip(ler)i ve modeli bilgilendiren deneyler hakkında çeşitli bilgiler sağlar.

Hem Markov hem de HH iletkenlik modelleri, iletken (simüle edilmiş kanallar-açık/aktif) ve iletken olmayan (simüle edilmiş kanallar-kapalı) geçit durumlarını/değişkenlerini içerir. Bununla birlikte, bu model türleri, örneklenen her voltajda iletkenlik değerinin hesaplanma biçiminde farklılık gösterir, Markov modelleri daha fazla hesaplama gücü gerektirir, ancak simüle edilmiş kanalların geçit özelliklerinde daha fazla ayrıntı sağlar. Örneğin, HH modellerinde, iletken ve iletken olmayan durumlar, her biri ilgili durumun54,55 voltaj girişi ve geçit kinetiği tarafından belirlenen bağımsız değişkenlerdir. Markov modellerinin aksine, HH modelleri, voltaj kapılı bir sodyum iletkenlik modeli25'te simüle edilmiş kanalların aktif/açık kinetik durumdan doğrudan hızlı inaktive edilmiş kinetik duruma geçişi gibi geçit durumları arasındaki geçişleri simüle etmez veya kısıtlamaz. Bu, HH modellerini hesaplama açısından daha az karmaşık hale getirir54,55 ve araştırmacıların yüksek örnekleme ve güncelleme oranlarını korurken aynı anda birden fazla hızlı iletkenliğe sahip HH modeli eklemesine olanak tanır.

Markov kinetik durum modelleri, iletken olabilen veya olmayan ayrık kinetik durumlardan oluşur ve bu durumlar sabit bir topolojide birbirine bağlıdır. Markov modeli simülasyonlarında, iletken kinetik durum(lar)ı işgal eden simüle edilmiş kanalların oranı ile örneklenen her voltajda iletkenlik hesaplanır. Her kinetik durumu (zaman içinde) işgal eden simüle edilmiş kanalların oranı, durum doluluğunun bir kinetik durumdan diğerine geçiş hızını yöneten parametreler olan hız sabitleri tarafından belirlenir. Hız sabitleri, birim zaman başına bir geçiş olasılığını temsil eden ters saniye (s-1) birimlerine sahiptir. Modele bağlı olarak hız sabiti değerleri voltaj veya sıcaklık gibi dinamik faktörlere bağlı olabilir.

Markov modellerinde, her kinetik durumun zamana bağlı doluluğunu tanımlamak için adi diferansiyel denklemler kullanılır. Bu denklemler, geçiş hızı sabitlerine dayalı olarak her durumda olma olasılığının zaman içinde nasıl geliştiğini yönetir. Bu, Q:figure-discussion-1 56 oran matrisi ile temsil edilir. Yukarıda tartışıldığı gibi, durumlar arasındaki hareketi belirleyen geçiş hızı sabitleri (r), giriş voltajından (V) ve voltajlar arasındaki iletkenliğin kinetiğini yansıtan α ve β parametrelerinden etkilenebilir. Bu denklemler şu şekilde tanımlanabilir: figure-discussion-2ve modelin 56,57,58 her kinetik durumuna giren ve çıkan bağlantıları (geçiş hızı sabitleri) içeren grafikler şeklinde görsel olarak temsil edilebilir. Markov modellerinin gelişimi ve topolojisi hakkında faydalı bir tartışma Schoening ve Silva'da (2024)56 bulunabilir.

Doğrusal olmayan iyonik iletkenliklerin modellendiği ve canlı hücrelere gerçek zamanlıolarak uygulandığı (akım enjekte eden elektrot aracılığıyla) mevcut formunda dinamik kelepçenin başlangıcından bu yana 19,59, bu tekniğin yöntemleri ve kaynakları gelişti ve mikrodenetleyici tabanlı, düşük maliyetli sistemler60 ve ücretsiz, açık kaynaklı yazılım23 gibi yenilikler nedeniyle giderek daha erişilebilir ve uygun maliyetli hale geldi. 25,26. Sutter Instrument'ın dPatch'i veya Cytocybernetics'in Cybercyte'ı gibi ticari sistemler, entegre donanım ve yazılım çözümleri aracılığıyla dinamik kelepçe deneylerinin hızlı bir şekilde uygulanmasını daha da kolaylaştırır27,61.

Dinamik kelepçenin çok yönlülüğü, sanal kimyasal ve elektriksel sinapsların oluşturulması, gerçek nöronların yapay ağlara gömülmesi (veya tam tersi) ve sanal iyon kanallarının eklenmesi dahil olmak üzere çeşitli uygulamalara olanak tanır62. Daha da önemlisi, uygulanan bir iletkenliğin voltaja bağımlılığı, kinetik özellikleri ve genlikleri hızlı bir şekilde ayarlanabilir, bu da araştırmacıların bir veya daha fazla parametrenin ölçeklendirilmesinin aksiyon potansiyeli ateşlemesini ve membran uyarılabilirliğini nasıl etkilediğini doğrudan test etmelerine olanak tanır31. Günümüzün sistemleri, hızlı geçici iletkenliklerin doğru bir şekilde uygulanmasını sağlayan yüksek örnekleme oranları sunar ve geleneksel elektrofizyolojik ekipman60,63 ile kolayca entegre edilebilir, dinamik kelepçeyi nöronal fonksiyon ve işlev bozukluğu anlayışımızı ilerletmek için ideal bir yöntem olarak sağlamlaştırır.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Teknik soruşturmalardaki yardımları için Sutter Instrument'tan Telly Galiatsatos ve Josh Stanford'a teşekkür ederiz. Ayrıca dPatch dinamik kelepçe çalışmalarının başlatılmasındaki yardımlarından dolayı Jan Dolzer'e teşekkür ediyor ve teşekkür ediyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CaCl2Fisher ChemicalC79-500 Reaktif
Kapiller cam boru borosilit standart duvar OD 1.5 mm ID 0.86 mm uzunluk 10 cmWarner Instruments64-0793Ekipman
CleanBenchTMC63-9090EEkipman
Compresstome VF-500-Z vibratomu Öncülük Aletlerihttps://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/Ekipman
Dell OptiPlex 7080Dellhttps://www.dell.com/en-us/shop/desktop-computers/optiplex-7080-tower-and-small-form-factor/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffusEkipman
DekstrozFisher ChemicalD16-500 Reaktif
dPatch amplifikatör sistemiSutter EnstrümanıFG-DPATCHEkipman
EGTAEMD Millipore324626-25GMReaktif
HEPESFisher Chemical7365-45-9Reaktif
Sıralı ısıtıcıWarner Instruments64-0102Ekipman
KartalFisher ChemicalP330-500 Reaktif
KetaminDechra Veteriner Ürünleri193.40620.3 Reaktif
K-glukonatTCI KimyasallarıG0040Reaktif
LinLab yazılımıScientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2Ekipman
LSE 6L Su BanyosuCorning6783Ekipman
Mg-ATPSigma-Aldrich74804-12-9Reaktif
MgCl2Fisher Chemical012288.A9Reaktif
Model P-1000 Pipet çekicisiSutter EnstrümanıFG-P1000Ekipman
NaClFisher ChemicalS271-500 Reaktif
Na-GTPMP Biyomedikal56001-37-7Reaktif
NaH2PO4J.T. Baker02-004-220&NBSP;Reaktif
NaHCO3Fisher ChemicalS233-500 Reaktif
Okuler yazılımDigital Optics Limitedhttps://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-softwareEkipman
Jilet bıçağıPersonna60-0139-CTNEkipman
Dilim arpWarner Instruments64-0255Ekipman
SliceScope Pro 3000Scientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000Ekipman
Süper yapıştırıcıLoctite8040-00-142-9193Ekipman
SutterPatch yazılımıSutter Enstrümanıhttps://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatchEkipman
Sıcaklık kontrolörüWarner Instruments64-2400Ekipman
KsilazinMP Biyomedikal158307Reaktif

Kaynaklar

  1. Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), a009886-a009886 (2012).
  2. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nat Commun. 5 (1), 4742(2014).
  3. Connor, S. A., et al. Altered cortical dynamics and cognitive function upon haploinsufficiency of the autism-linked excitatory synaptic suppressor MDGA2. Neuron. 91 (5), 1052-1068 (2016).
  4. Pagani, M., et al. mTOR-related synaptic pathology causes autism spectrum disorder-associated functional hyperconnectivity. Nat Commun. 12 (1), 6084(2021).
  5. Tang, G., et al. Loss of mTOR-dependent macroautophagy causes autistic-like synaptic pruning deficits. Neuron. 83 (5), 1131-1143 (2014).
  6. Fatemi, S. H., Eschenlauer, A., Aman, J., Folsom, T. D., Chekouo, T. Quantitative proteomics of dorsolateral prefrontal cortex reveals an early pattern of synaptic dysmaturation in children with idiopathic autism. Cereb Cortex. 34 (13), 161-171 (2024).
  7. Deneault, E., et al. Complete disruption of autism-susceptibility genes by gene editing predominantly reduces functional connectivity of isogenic human neurons. Stem Cell Rep. 11 (5), 1211-1225 (2018).
  8. Brown, S. P., Jena, A. K., Osko, J. J., Ransdell, J. L. Tsc1 deletion in Purkinje neurons disrupts the axon initial segment, impairing excitability and cerebellar function. Neurobiol Dis. 207, 106856(2025).
  9. Tsai, P. T., et al. Autistic-like behaviour and cerebellar dysfunction in Purkinje cell Tsc1 mutant mice. Nature. 488, 647-651 (2012).
  10. Sundberg, M., et al. Purkinje cells derived from TSC patients display hypoexcitability and synaptic deficits associated with reduced FMRP levels and reversed by rapamycin. Mol Psychiatry. 23, 2167-2183 (2018).
  11. Brumback, A., Sohal, V. Intrinsic excitability defects in specific subtypes of medial prefrontal cortex pyramidal neurons in a mouse model of autism. Neurology. 82 (10), I4-1.010(2014).
  12. Mitchell, D. E., Miranda-Rottmann, S., Blanchard, M., Araya, R. Altered integration of excitatory inputs onto the basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons in a mouse model of Fragile X syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (2), e2208963120(2023).
  13. Sanders, S. J., et al. De novo mutations revealed by whole-exome sequencing are strongly associated with autism. Nature. 485, 237-241 (2012).
  14. Ben-Shalom, R., Keeshen, C. M., Berrios, K. N., An, J. Y., Sanders, S. J., Bender, K. J. Opposing effects on NaV1.2 function underlie differences between SCN2A variants observed in individuals with autism spectrum disorder or infantile seizures. Biol Psychiatry. 82 (3), 224-232 (2017).
  15. Spratt, P. W. E., et al. The autism-associated gene Scn2a contributes to dendritic excitability and synaptic function in the prefrontal cortex. Neuron. 103 (4), 673-685.e5 (2019).
  16. Nelson, A. D., et al. Physical and functional convergence of the autism risk genes Scn2a and Ank2 in neocortical pyramidal cell dendrites. Neuron. 112 (7), 1133-1149.e6 (2024).
  17. Zhang, J., et al. Severe deficiency of the voltage-gated sodium channel NaV1.2 elevates neuronal excitability in adult mice. Cell Rep. 36 (5), 100858(2021).
  18. Sharp, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. Artificial electrical synapses in oscillatory networks. J Neurophysiol. 67 (6), 1691-1694 (1992).
  19. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16 (10), 389-394 (1993).
  20. Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49 (3), 157-165 (1993).
  21. Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27 (4), 218-224 (2004).
  22. Muñiz, C., Arganda, S., Rodríguez, F. B., De Polavieja, G. G. Realistic stimulation through advanced dynamic-clamp protocols. Computational Methods in Neural Modeling. Mira, J., Álvarez, J. R. , Springer. Berlin. 95-105 (2005).
  23. Ortega, F. A., Butera, R. J., Christini, D. J., White, J. A., Dorval, A. D. Dynamic clamp in cardiac and neuronal systems using RTXI. Methods Mol Biol. 1183, 327-354 (2014).
  24. Milescu, L. S., Tabak, J. Dynamic clamp on a Windows PC. Methods Mol Biol. 2188, 157-177 (2021).
  25. Milescu, L. S., Yamanishi, T., Ptak, K., Mogri, M. Z., Smith, J. C. Real-time kinetic modeling of voltage-gated ion channels using dynamic clamp. Biophys J. 95 (1), 66-87 (2008).
  26. Kemenes, I., et al. Dynamic clamp with StdpC software. Nat Protoc. 6 (3), 405-417 (2011).
  27. Dolzer, J. Patch clamp technology in the twenty-first century. Methods Mol Biol. 2188, 21-49 (2021).
  28. Crino, P. B., Henske, E. P. New developments in the neurobiology of the tuberous sclerosis complex. Neurology. 53 (7), 1384-1390 (1999).
  29. Butera, R. J., Wilson, C. G., DelNegro, C. A., Smith, J. C. A methodology for achieving high-speed rates for artificial conductance injection in electrically excitable biological cells. IEEE Trans Biomed Eng. 48 (12), 1460-1470 (2001).
  30. Ransdell, J. L., Moreno, J. D., Bhagavan, D., Silva, J. R., Nerbonne, J. M. Intrinsic mechanisms in the gating of resurgent Na+ currents. eLife. 11, e70173(2022).
  31. Brown, S. P., Lawson, R. J., Moreno, J. D., Ransdell, J. L. A reinterpretation of the relationship between persistent and resurgent sodium currents. J Neurosci. 44 (29), e2396232024(2024).
  32. European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium. Identification and characterization of the tuberous sclerosis gene on chromosome 16. Cell. 75 (7), 1305-1315 (1993).
  33. Henske, E. P., Jóźwiak, S., Kingswood, J. C., Sampson, J. R., Thiele, E. A. Tuberous sclerosis complex. Nat Rev Dis Primers. 2 (1), 16036(2016).
  34. Wiznitzer, M. Autism and tuberous sclerosis. J Child Neurol. 19 (9), 675-679 (2004).
  35. Jeste, S. S., Sahin, M., Bolton, P., Ploubidis, G. B., Humphrey, A. Characterization of autism in young children with tuberous sclerosis complex. J Child Neurol. 23 (5), 520-525 (2008).
  36. Lawson, R. J., et al. Selective deletion of Tsc1 from mouse cerebellar Purkinje neurons drives sex-specific behavioral impairments linked to autism. Front Behav Neurosci. 18, 1474066(2024).
  37. Sherrington, C. S. The Integrative Action of the Nervous System. , Yale University Press. New Haven. (1911).
  38. Russell, J. S. R., Horsley, V. A. H. II Experimental researches into the functions of the cerebellum. Proc R Soc Lond. 55, 57-60 (1894).
  39. Rudolph, S., et al. Cognitive-affective functions of the cerebellum. J Neurosci. 43 (45), 7554-7564 (2023).
  40. Schmahmann, J. D. The cerebellum and cognition. Neurosci Lett. 688, 62-75 (2019).
  41. Beuriat, P. -A., Cristofori, I., Gordon, B., Grafman, J. The shifting role of the cerebellum in executive, emotional and social processing across the lifespan. Behav Brain Funct. 18 (1), 6(2022).
  42. Stoodley, C. J. Distinct regions of the cerebellum show gray matter decreases in autism, ADHD, and developmental dyslexia. Front Syst Neurosci. 8, 92(2014).
  43. Bruchhage, M. M. K., Bucci, M. -P., Becker, E. B. E. Cerebellar involvement in autism and ADHD. Handb Clin Neurol. 155, 61-72 (2018).
  44. Mosconi, M. W., Wang, Z., Schmitt, L. M., Tsai, P., Sweeney, J. A. The role of cerebellar circuitry alterations in the pathophysiology of autism spectrum disorders. Front Neurosci. 9, 296(2015).
  45. Weber, A. M., Egelhoff, J. C., McKellop, J. M., Franz, D. N. Autism and the cerebellum: evidence from tuberous sclerosis. J Autism Dev Disord. 30 (6), 511-517 (2000).
  46. Wang, S. S. -H., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83 (3), 518-532 (2014).
  47. Ransdell, J. L., Nerbonne, J. M. Voltage-gated sodium currents in cerebellar Purkinje neurons: functional and molecular diversity. Cell Mol Life Sci. 75 (19), 3495-3505 (2018).
  48. Bettencourt, J. C., Lillis, K. P., Stupin, L. R., White, J. A. Effects of imperfect dynamic clamp: computational and experimental results. J Neurosci Methods. 169 (2), 282-289 (2008).
  49. Clausen, C., Valiunas, V., Brink, P. R., Cohen, I. S. MATLAB implementation of a dynamic clamp with bandwidth of >125 kHz capable of generating INa at 37°C. Pflugers Arch. 465 (4), 497-507 (2013).
  50. Preyer, A. J., Butera, R. J. The effect of residual electrode resistance and sampling delay on transient instability in the dynamic clamp system. Annu Int Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2007, 430-433 (2007).
  51. Preyer, A. J., Butera, R. J. Causes of transient instabilities in the dynamic clamp. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17 (2), 190-198 (2009).
  52. McDougal, R. A., et al. Twenty years of ModelDB and beyond: building essential modeling tools for the future of neuroscience. J Comput Neurosci. 42 (1), 1-10 (2017).
  53. Ranjan, R., et al. Channelpedia: an integrative and interactive database for ion channels. Front Neuroinform. 5, 36(2011).
  54. Carbonell-Pascual, B., Godoy, E., Ferrer, A., Romero, L., Ferrero, J. M. Comparison between Hodgkin-Huxley and Markov formulations of cardiac ion channels. J Theor Biol. 399, 92-102 (2016).
  55. Andreozzi, E., Carannante, I., D'Addio, G., Cesarelli, M., Balbi, P. Phenomenological models of NaV1.5. A side by side, procedural, hands-on comparison between Hodgkin-Huxley and kinetic formalisms. Sci Rep. 9 (1), 17493(2019).
  56. Schoening, M. E., Silva, J. R. Creating Computational Models of Ion Channel Dynamics. Potassium Channels: Methods and Protocols. , Springer. New York. (2024).
  57. Mangold, K. E., et al. Identification of structures for ion channel kinetic models. PLoS Comput Biol. 17 (8), e1008932(2021).
  58. Silva, J. R., Cooper, P., Nichols, C. G. Modeling KATP-dependent excitability in pancreatic islets. Biophys J. 107 (9), 2016-2026 (2014).
  59. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69 (3), 992-995 (1993).
  60. Desai, N. S., Gray, R., Johnston, D. A dynamic clamp on every rig. eNeuro. 4 (5), (2017).
  61. Han, L., et al. Reconciling computer models and stem cell models of human cardiac repolarization: reply. Cardiovasc Res. 106 (1), 6-7 (2015).
  62. Wilders, R. Dynamic clamp: a powerful tool in cardiac electrophysiology. J Physiol. 576 (2), 349-359 (2006).
  63. Kullmann, P. H. M., Wheeler, D. W., Beacom, J., Horn, J. P. Implementation of a fast 16-bit dynamic clamp using LabVIEW-RT. J Neurophysiol. 91 (1), 542-554 (2004).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Otizm Spektrum Bozuklu uVoltaj KenetlemePurkinje N ronlaryon Kanal FonksiyonuYama KenetlemeSodyum KanalSerebeller Beyin DilimleriKond ktans Modellemesi
Otizmle İlişkili Bozulmuş Nöronal Uyarılabilirliği Araştırmak için Dinamik Kelepçe Yöntemleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.