Yöntem makalesi

Dijital Mekansal Profilleme için Korunmuş Morfoloji ve RNA ile Kalsifikasyon Arter Hazırlanması ve İşleme

DOI:

10.3791/69159

⸱

23 Ocak 2026

 ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, Department of Surgery, University of Washington, 2Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington, 3Division of Vascular Surgery, VA Puget Sound Health Care System

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kalsifikasyon olmuş damar örnekleri için adım adım bir iş akışı içerir: doku işleme, kalsifikasyon giderilmesi, RNA doğrulama, kalsifikasyon seviyesi tespiti ve Nanostring GeoMx Dijital Mekansal Profiler (DSP) üzerinde ilgi alanı seçim stratejileri. Amaç, güvenilir mekansal transkriptomik analiz için damar dokusu morfolojisi ve RNA'nın korunmasına yönelik kapsamlı bir yöntem sunmaktır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mekansal transkriptomik, tüm transkriptom profillerini doğrudan doku kesitlerine haritalar; hücresel komşuluklar ile gen ifadesi ile bu aktivitelerin sağlık ve hastalığı nasıl etkilediğini korelasyon yapar. Bu yaklaşım onkoloji, sinirbilim, immünoloji, gelişim bilimleri ve birçok alanı dönüştürmüş olsa da, damar hastalıkları dünya çapında ölüm nedenlerinden biri olmaya devam etmesine rağmen, damar biyolojisinde daha az yaygın olarak kullanılmıştır. İki engel öne çıkar: arterler ve damarlar kesitleme için çok az düz yüzey sunar ve genellikle aterosklerotik, trombozlu, plak yüklü veya kalsifiklenmiş hasta örnekler, morfoloji ve RNA bütünlüğünü tehlikeye atan dekalsifikasyon gibi sert tedaviler gerektirir. Ancak aynı damarlar, konsantrik intima, ortam ve adventisiya katmanlı yapılarıyla birlikte, her katman duvar boyunca etkileşime giren farklı hücre tipleri ve gen programlarına ev sahipliği yaptığı için mekansal analiz için idealdir.

Damar dokularının mekansal transkriptomik için nasıl hazırlanacağına dair birkaç ayrıntılı protokol vardır. Bu eksiklik, araştırmacıların tekniğin tam potansiyelini kullanma yeteneğini sınırlamaktadır. Boşluğu kapatmak için, gelişmiş lezyonlara sahip insan tibial arterleri için optimize edilmiş adım adım bir iş akışı sunuyoruz. Protokol, doku işleme, fiksasyon ve doğru kalsifikasyonu kapsayarak yapı ve RNA kalitesini koruyor; ardından kalsifikasyon şiddetini derecelendirmek için histolojik boyama yapılır. Ayrıca, NanoString GeoMx Dijital Uzamsal Profilleyici (DSP) üzerinde parti etkilerini ve ilgi alanı (ROI) seçim stratejilerini azaltmak için doku mikrodizisi (TMA) yapısını da açıklıyoruz.

Teknik engelleri azaltarak, bu protokol damar araştırmacılarının güvenilir mekansal transkriptomik veriler üretmesini ve sağlıklı ve hastalıklı damarlarda katman spesifik transkripsiyon aktivitelerini incelemelerini sağlar. Kalsifikasyon, iltihaplanma, intimal ateroskleroz ve diğer damar patolojilerinin altında yatan mekanizmaların keşfini hızlandıracağını ve damar biyolojisinde mekansal transkriptomiklerin daha geniş benimsenmesini teşvik edeceğini öngörüyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son on yılda, yeni nesil dizileme ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme, dokubölümleri 1,2'de her transkriptin kesin konumunu koruyarak tüm transkriptomun nicelendirilmesini sağlayan mekansal transkriptomikleri ilerletmek için birleşmiştir. Hızla olgunlaşan tek hücreli RNA dizileme (scRNA-dizi) alanıyla birleştiğinde, mekansal yaklaşımlar gen imzalarını bir doku veya organ içindeki belirli hücre tipleri, durumlar ve nişlerle bağlamak için verimli bir yol sunar ve hastalık mekanizmalarını anlamamızıbüyük ölçüde zenginleştirir 3,4,5,6,7 . 10X Visium, NanoString GeoMx ve CosMx, Slide-seq ve DBiT-seq gibi birçok ticari platform geliştirilmekte olup, her biri tümör ve beyin dokusu gibi yumuşak, yüksek hücreli dokular için optimize edilmiş protokollerle desteklenmektedir. Alan patlayıcı bir büyüme yaşıyor; PubMed 2023'te yaklaşık 150, 2024'te yaklaşık 300 yayın indeksliyor ve 2025'te 500'ü aşma yolunda ilerliyor. Bu artışa rağmen, damar biyolojisi kanser, sinirbilim ve immünoloji ile karşılaştırıldığında hâlâ az temsil edilmektedir.

Kemik, kıkırdak, dişler ve plak ile dolu, kalsifikleşmiş arterler veya damarlar gibi sert veya mineralize dokular ise çok daha az rahatsız edici olmuştur. Teknik engeller çok yönlü. İlk olarak, yoğun mineral matrislere sahip dokular şerasyon veya asit bazlı çıkarma gerektirir; bu da RNA'yı parçalayıp doku morfolojisini bozabilecek agresif tedavilerdir. İkinci olarak, hasta dokular, ister yaralı ister fibrotik, bol ekstrasellüler matrikslerine (ECM) gömülü az sayıda canlı hücre içerir; bu da transkript verimini azaltır ve veri normalleşmesini zorlaştırır. Ayrıca, damar dokuları ince, konsantrik bir yapıya (intima, media, adventitia) sahiptir ve boş bir lümen etrafına sarılır. Sınırlı duvar kalınlığı, özellikle tek hücreli intima, yakalama alanlarının az doku tutabileceği ve bölümlerin saatlerce boyama ve hibritleşme aşamalarında yırtılabilir veya ayrılabileceği anlamına gelir. Sonuç olarak, damar dokusunun mekansal transkriptomik çalışmaları hâlâ az kalır; kardiyovasküler hastalıklar dünya çapında sürekli olarak önde gelen ölüm ve ciddi morbidite nedenleri arasında yer almaktadır. Mevcut olan protokol makaleleri, büyük ölçüde veri işleme, görselleştirme veya NanoString GeoMx 8,9,10,11,12,13 dışındaki platformlara vurgu yapmaktadır. Bu makaleler arasında, özellikle etkilenen nüfusun giderek artan bir kısmını oluşturan diyabet hastaları için klinik olarak önemli bir damar olan periferik arter hastalığında (PAD) klinik olarak önemli bir damar olan tibial arterlerin işlemesi için laboratuvar düzeyinde yöntemler çok az tanımlıyor.

Bu boşluğu gidermek için, amputasyon geçiren PAD hastalarından alınan kalsifiye insan tibial arterleri için kapsamlı bir iş akışı sunuyoruz. Protokol şunları kapsar: (1) ameliyathane alma bölümünün hemen ardından doku kesilmesi ve diseksiyon; (2) doku morfolojisi ve RNA'nın bütünlüğünü koruyan doğru doku fiksasyonu ve kalsifikasyonu; (3) parti etkilerini en aza indirmek için maliyet tasarrufu sağlayan doku mikrodizileri (TMA) inşası; (4) RNAscope in situ hibridizasyon ve histolojik kalsiyum boyama kalite kontrolü için; ve (5) GeoMx Dijital Mekansal Profiler (DSP) platformunda kalsifiye tibial arterler için özel olarak tasarlanmış ilgi alanı (ROI) seçim stratejisi. Bu adımlar, DSP cihazında örnek toplama öncesi tüm prosedürleri, kütüphane hazırlığını, dizilemeyi ve veri analizini içerir.

Referans verilen DSP platformunda gösterilse de, prensipler 10X Visium veya diğer platformlar için doku hazırlığını yönlendirebilir ve metodoloji, ek damar yatakları veya hayvan modellerine kolayca uyarlanabilir. Bu protokol biyobanka ve ölüm sonrası dokular için uyarlanabilir, ancak başarısı doku koruma, fiksasyon ve depolama koşullarına kritik şekilde bağlıdır. Dokular, iskemik süreyi en aza indirmek için hasattan hemen sonra (ideal olarak 1 saat içinde) sabitlenmelidir. Standart %10 nötr tamponlu formalin (NBF) en az 16 saat oda sıcaklığında (RT) önerilir. Dokular fiksasyondan hemen sonra gömülmeli ve etanolde 3 günden fazla saklanmamalıdır. Önerilen koşullarda işlenen ve saklanan formalin sabitli parafin-gömülü (FFPE) bloklar, mekânsal profilleme için yaklaşık 3 yıl boyunca uygundur, ancak blok yaşıyla birlikte RNA kalitesi düşer. Buna göre, düşük hücrelilikli örnekler, 6 ay boyunca depolanan bloklar, biyobanka örnekleri ve ölüm sonrası dokular için RNA kalitesi değerlendirmesi önerilir. Minimum kabul edilebilir RNA kalitesi, seçilen teste, yatırım getirisi seçimine, istenen çözünürlüğe ve çekirdek tesis önerilerine bağlıdır. Pratikte, sağlam sonuçlar için segment başına yaklaşık 50-100 çekirdek genellikle önerilir. DSP platformu hem FFPE hem de taze dondurulmuş dokuları destekler. Bu protokolde FFPE dokularına odaklanıyoruz.

Bu çalışma mekansal transkriptomiğe odaklansa da, scRNA-seq ile kolayca entegre edilebiliyor. Yayınlanmış scRNA-seq veri setleri ve hesaplamalı uzamsal dekonvolüsyon kullanılarak, her uzamsal nokta için hücre tipi oranlar tahmin edilebilir ve scRNA-dizeq-tanımlanmış hücre durumları doku mimarisine yansıtılabilir. Hem yapı hem de RNA bütünlüğünü koruyarak, protokolümüz tek hücreli veya tek moleküllü doğrulamayı mümkün kılarak, değerli vasküler örneklerden biyolojik içgörüyü en üst düzeye çıkarır ve damar biyoloji araştırmalarında mekansal transkriptomiklerin daha geniş benimsenmesini sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan arterial örneklerinin toplanmasına yönelik tüm prosedürler, Washington Üniversitesi İnsan Denekler Bölümü Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) ve VA Puget Sound Sağlık Sistemi (Seattle, WA) IRB'si tarafından onaylanmıştır. Doku toplamadan önce hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onaylar alındı. Bu çalışma için kullanılan malzeme ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Doku kesme ve sabitleme

  1. Doku kırpımı
    1. Taşıma çantasını, iç tüp, ikincil bir konteyner, dış nakliye kutusu ve biyolojik tehlike örnek torbası içeren çok katmanlı ambalaj kullanarak hazırlayın. İç 50 mL santrifüj tüpünü 30 mL depolama ile doldurun; Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medium (DMEM) ortamı, %1 4-[2-hidroksietil]-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) ve %1 penisillin-streptomisin (P/S) içerir.
    2. Toplanan ön tibial (AT), arka tibial (PT) ve peroneal tibial (PR) arterler (ideal olarak 5 cm uzunluğunda) ayrı ayrı olarak 50 mL santrifüj tüplerine >yerleştirilin. Kutuları buz üzerindeki ameliyathaneden doku kültür odasına transfer edin.
      NOT: Toplanan örnek uzunluğunun en az 5 cm olması önerilir; böylece tekrarlar ve diğer değerlendirmeler veya doğrulamalar için yeterli doku kriyodepolanabiliyor.
    3. Her arteri, medyayla birlikte 100 mm Petri kabına aktarın. Aşırı perivasküler bağ dokularını steril makas ve forseps kullanarak çıkarın, sadece arterial duvar (adventitia içe doğru) bırakılır.
      NOT: RNA kontaminasyonunu önlemek için dokuları RNase inaktivasyon çözeltisiyle silinmiş bir biyogüvenlik kabininde tutun ve kesin. Steril bistüri ve pens kullanın; Örnekler arasında, kalıntıları çıkarmak için steril ve nükleaz içermeyen suyla durulayın ve %70 etanol ile iyice silin.
    4. Kesilen atardamarı Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile yeni bir Petri kabında kısa süreliğine durulayın. Steril bir kesme tahtası taze bir tabağın içine yerleştirin ve atardamarı üzerine taşıyın.
    5. Arteri cerrahi bir bıçakla 1 cm çapraz kesitlere kesin.
  2. Doku fiksasyonu ve depolanması
    1. İki segmenti sıvı azotta (LN2) kriyokonserve için kriyotüplerde snap-freeze ile dondurun ve gelecekteki protein/RNA çalışmaları için depolayın.
    2. Kalan segmentleri %10 NBF içeren 15 mL'lik tüplere yerleştirin ve 1 cm arterial segmentler için 24-48 saat boyunca 4 °C'de sabitlenin.
      NOT: %10 NBF kullanımı önerilir. %4 paraformaldehit (PFA) kullanıyorsanız, RNA hasarını en aza indirmek için taze hazırlayın veya kullanmadan önce nötr bir pH doğrulayın.

2. Kireçlenme, doku işleme ve kesitleme

  1. Kireçsizleştirme çözeltisini hazırlayın: katı etilen-diamin-tetraasetik asidi (EDTA) RNA stabilizasyon çözeltisinde (RSS) %10 (w/v) olarak çözün. Filtreleme zorunlu değildir. EDTA'yı tamamen çözmek için sodyum hidroksit (NaOH) peletleriyle pH'ı 9.2'ye ayarlayın, ardından RSS'nin tipik çalışan pH'ı olan ve RNA bütünlüğünü korumaya yardımcı olan 10 M HCl ile 5.2'ye düşürün.
  2. PBS'de sabit dokuları kısa bir süreliğine manuel olarak durulayın. Her örneği kalsifikasyon çözeltisi içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 °C'de 72 saat boyunca karıştırın.
  3. Kireçsizasyon tamamlandığında, örnekleri PBS ile yıkayın (2 × 5 dakika). Dokuları kasetlere yerleştirin ve 4 saat işlem programı kullanarak doku işlemcisine yükleyin.
  4. Her doku bloğu için birden fazla arter segmenti gömül. Kaydırma sırtlarında kısıtlı doku alanını işaretleyin ve tüm bölümlerin bu alana ait olduğundan emin olun.
  5. Fazla parafini kesin. Blokları 5 μm aralığında mikrotom ve düşük profilli bıçaklarla kesin ve doku kesitlerini işaretlenmiş slayt alanına monte edin.
    NOT: İlk birkaç bölümü yüzleştikten sonra atın ve sonraki doku bölümlerini toplayın. RNase içermeyen fırçalar kullanın ve numune partileri arasında su banyosunu temizleyin.
  6. Farklı boyamalar ve dijital mekansal profilleme (DSP) deneyi için blok başına en az dört seri bölüm hazırlayın. Slaytları 4 °C'de kullanana kadar sakla (ideal olarak 6 ay <).

3. RNAscope Yerinde hibridizasyon (ISH) ve histolojik boyama

  1. RNAscope ISH
    1. Slaytlara dokunun yapışmasını artırmak için gece boyunca 60 °C sıcaklıkta kuru fırında pişirilir.
    2. Deparafinizasyon: Ksilen (3 × 5 dakika) içine daldırılır, ardından %100 etanol (2 × 3 dakika) uygulanır. 60 °C'de 7 dakika kuru kaydır.
    3. Üreticinin protokolüne göre RNAscope 2.5 HD Red ISH testini yapın. Endogen peroksidazı, RT'de 10 dakika boyunca %3H 2O 2 ile blokleyin; Damıtılmış (DI) suyla durulayın.
    4. Slaytları önceden ısıtılmış, 100 °C alma tamponunda (DI suda 1:10 seyreltilmiş şekilde) 15 dakika boyunca kuluçka yapın (buharlı gemede 24 slaytlı raf için 200 mL toplama tamponu kullanın), %100 etanol 5 kez batırın ve 60 °C'de 7 dakika kurutun. Hidrofobik bariyer PAP kalemi kullanarak dokunun etrafındaki çözeltiler için hidrofobik bir bariyer oluşturun.
    5. Slaytları hibritizasyon fırın rafına yerleştirin, her slayta 200 μL sindirim enzimi takviyesi (satıcı tarafından damlalı şişelerde önceden seyreltilmiş) ekleyin ve 40 °C'de 15 dakika kuluçka yapın. Slaytları DI suyla iki kez durulayın.
    6. Slaytlara pozitif kontrol probu Human Ppib uygulayın ve 40 °C'de 2 saat kuluçka yapın. Sürgüleri yıkama tamponunda 2 kez yıkayın.
    7. Sıralı amplifikasyon yapın: AMP1'i 40 °C'de 30 dakika boyunca; AMP2 40 °C'de 15 dakika boyunca; AMP3 40 °C'de 30 dakika boyunca; AMP4 40 °C'de 15 dakika boyunca; RT rejiminde AMP5 30 dakika kaldı; ve RT'de 15 dakika boyunca AMP6 çalıştırdı. Arada 2 x 2 dakika yıka.
    8. Fast Red çalışan çözüm ekleyin, RT'de 10 dakika kuluçka yapın. Kaydırakları boşaltın, kaydırakları DI suyuna batırın, ardından 5 kez taze DI suya daldırın. Ppib pozitif kontrol noktalarının ayrı ve noktalı kırmızı noktalar olarak göründüğünü doğrulayın.
    9. Gill'in 1 hematoksiliniyle karşı boyama yapın, 5 kez DI suyuna 2 kez batırın, %0,02 amonyum hidroksitle mavi ve 2 kez DI suyuna 5 kez batırın. Çekirdeklerin mavi leke ve doku morfolojisinin korunduğunu doğrulayın. Kaydırakların gece boyunca kurumasına izin verin ve montaj ortamıyla örtün.
  2. Alizarin Red S boyama
    1. Ek seri kesitler için, Adımlar 3.1.2'de deparafinizasyon ve rehidrasyonu tekrarlayın.
    2. Alizarin Red S çalışma çözeltisi pH 4.1-4.3 olduğunu doğrulayın.
    3. Slaytları Alizarin Red S'ye 30-60 saniye veya kalsiyum birikimleri turuncu-kırmızı renk kazanana kadar daldırın.
    4. Aşırı boyayı silkeleyin. 20 hızlı %100 aseton daldırarak kurutun, ardından aseton:ksilen (1:1) ile 20 kez daldırın.
    5. Slaytları iki taze ksilen banyosuyla, her biri 3 dakikalık olarak temizleyin. Kaplama ve montaj ortamı.

4. GeoMx DSP slayt hazırlığı ve ROI seçimi

  1. Başlamadan önce, tüm ekipman ve kapları RNA etkisiz hale getiren çözeltiyle temizleyin ve RNA kirlenmesini önlemek için DEPC'le arındırılmış suyla kurutun veya durulayın. Uzaysal RNA profilleme testi için talimatları takip edin.
  2. Slaytlara dokunun yapışmasını artırmak için gece boyunca 60 °C sıcaklıkta kuru fırında pişirilir.
  3. Deparafinizasyon ve rehidrasyon: Ksilen (3 × 5 dakika) içinde slaytlar, ardından %100 etanol (2 × 5 dakika) ve %95 etanol DEPC ile arıtılmış suda 5 dakika boyunca sulandırılır. Slaytları 1 dakika boyunca 1× PBS'ye aktarın.
  4. Slaytları önceden ısıtılmış, 100 °C Tris/EDTA pH 9.0 antijen toplama tamponunda 20 dakika kuluçka yapın ve slaytları RT'de 5 dakika boyunca 1× PBS ile aktarın.
  5. Slaytları önceden ısıtılmış 1.0 μg/ml Proteinaz K ile 15 dakika kuluçka yapın ve 1× PBS ile RT'de 5 dakika durulayın.
  6. Slaytları %10 NBF (her slayt başına 200 μL) ile 5 dakika RT'de bırakın ve PBS'de 5 dakika yıkayın.
  7. PBS'den slaytları çıkarın, kağıt havluya dokunun, mendilin etrafındaki fazla sıvıyı Kimwipe ile silin ve hibritizasyon boyama rafına koyun.
  8. Her slayta 200 μL hibridizasyon çözeltisi (Buffer W'de 1:10 seyreltilmiş hal) ekleyin ve hibritizasyon kağıdı uygulanır. Hibritleşme odasını kapatın, fırına yerleştirin ve gece boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.
  9. Slaytları tuzlu-sodyum sitrat tamponuna (SSC, 2×) daldırın ve hibritleşme sliplerinin 5 dakika içinde kendi kendiliğinden kaymasına izin verin.
  10. Slaytları, 4× SSC ve deiyonize formamidden oluşan eşit parçalardan oluşan sıkı yıkama tamponu ile 37 °C'de, her yıkamada 25 dakika boyunca yıkayın. Sürgüleri 2× SSC tamponda, her yıkamada 2 dakika yıkayın.
  11. Sürgüleri RT tampon W ile 30 dakika boyunca bloklayın.
  12. Dokuyu primer antikor çözeltisi (Rabbit anti-CD45) ile RT'deki nem odası sürgü kutusunda 1 saat boyunca örtün, 2× SSC tamponu ile 3 kez yıkayın.
  13. İkincil antikor çözeltisi (keçi anti-tavşan IgG-AF647) 1 saat boyunca uygulayın ve 2× SSC tamponunda yıkayın.
  14. Dokuyu etiketli antikorla (Fare anti-SMA-AF488) RT'deki nem odası sürgü kutusunda 1 saat boyunca kaplayın. 2× SSC tamponunda yıkayın.
  15. Slaytları 10 dakika boyunca 2 μM Syto83 nükleer işaretleyicide 10 dakika boyunca Buffer W ile seyreltirilmiş şekilde boyandırın.
  16. Morfolojik işaretleyici boyamanı görselleştirmek için slaytları RNA profilleme cihazıyla taran. Her arter dokusunun kalsifikasyona yakın ve distal ROI'larını seçin, her bir ROI'nin katman-spesifik konumunu belirterek.
    NOT: Hibridizasyon kabarığını doku kesitlerine uygularken hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için dikkatli olun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada belirtilen protokol, araştırmacıları tibial arterlerin alınmasından hem morfolojiyi hem de RNA bütünlüğünü koruyan TMA slaytlarının oluşturulmasına kadar uzanan transkriptomik analizi için yönlendirir. Ayrıca arterlerdeki kalsiyum birikintilerinin görselleştirilmesi, morfolojik işaretleyici boyama ve yatırım getirisi (ROI) seçim stratejileri için histolojik yöntemleri de detaylandırmaktadır.

Şekil 1'de, arterler %10 NBF (ad...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, NanoString GeoMx DSP üzerinde mekansal transkriptomik profilleme için kalsifikasyona sahip insan tibial arterlerinin hazırlanması için gereken adımları detaylandırır. Tibial arterler, tüm damarlar gibi, konsantrik intima, media ve adventitia katmanlarına sahiptir; her biri yaralanma ve onarımı organize eden ayrı hücre popülasyonlarına sahiptir. Bu katmanların mimarisini korumak, katman çözümlü transkriptomik analizler için gereklidir, ancak sıklıkla gözden kaçan birkaç hazır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, VA Puget Sound tarafından alınan tohum hibesi, VA Merit Ödülü I01 BX004975-02 ve VA Puget Sound Sağlık Bakım Merkezi'ndeki kaynaklar ve tesislerin kullanımı ile desteklenmiştir.  Çalışma yazarlara aittir ve mutlaka Gaziler İşleri Bakanlığı'nın veya Amerika Birleşik Devletleri hükümetinin tutumunu veya politikasını yansıtmaz.  Washington Üniversitesi Histoloji ve Görüntüleme Merkezi (HIC) tarafından sağlanan görüntüleme hizmetini teşekkür etmek isteriz.  Washington Üniversitesi'ndeki DSP deneyleri ve MANTIS Labs: UW Spatial Biology Core grubundaki Dr. Shreeram Akilesh'e teşekkür etmek isteriz.  Ayrıca Washington Üniversitesi Diyabet Araştırma Merkezi'nden Nishi Ivanov'u histolojik boyama için teşekkür etmek isteriz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), yüksek glikoz, piruvat Thermo Fisher Scientific11995065
4-(2-hidroksietil)-1-piperazineethanesülfonik asit (HEPES) tampon çözeltisi, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Penisillin-Streptomisin (P/S), 10.000 U/mLThermo Fisher Scientific15140122
%10 Nötr Tamponlu Formalin (NBF)Millipore Sigma65346-M
Etilen-diamin-tetraasetik asit (EDTA)Millipore Sigma3620
RNAlater Stabilizasyon ÇözümüThermo Fisher ScientificAM7024RNA stabilizasyon çözümü (RSS)
Hidrojen peroksit (H2O2)İleri Hücre Teşhisi, Inc.322335
Hedef geri alma çözümüİleri Hücre Teşhisi, Inc.322001
Proteaz Plusİleri Hücre Teşhisi, Inc.322331Sindirim enzimi takviyesi
DapB (negatif kontrol)İleri Hücre Teşhisi, Inc.310043
RNAscope yıkama tamponu (RNAscope 2.5 HD Red ISH test kiti)İleri Hücre Teşhisi, Inc.320058
AMP1İleri Hücre Teşhisi, Inc.324511
AMP2İleri Hücre Teşhisi, Inc.324512
AMP3İleri Hücre Teşhisi, Inc.324513
AMP4İleri Hücre Teşhisi, Inc.324514
AMP5 Redİleri Hücre Teşhisi, Inc.324515
AMP6 Redİleri Hücre Teşhisi, Inc.324516
Hızlı Kırmızı Aİleri Hücre Teşhisi, Inc.324517
İnsan Ppibİleri Hücre Teşhisi, Inc.313901
Gill' s hematoksilinMillipore SigmaGHS132
Antijen alımı, Tris/EDTA pH 9Thermo Fisher Scientific00-4956-58
Proteinaz KThermo Fisher ScientificAM2546
Hibritizasyon çözümü-Hs WTANanostring121401102
HybrislipHibritleşme kayması
Hibridizasyon çözümü-Buffer RNanostring121300313
Tavşan anti-CD45 Hücre Sinyalizasyonu1317
Buffer WNanostring121300313
Keçi karşıtı tavşan IgG-AF647Jackson Immunoresearch111-605-144
Fare anti-SMA-AF488 Thermo Fisher Scientific53-9760
Syto83 Thermo Fisher ScientificS11364
Cerrahi bıçakBD Biosciences371110
Superfrost  Plus Mikroskop SlaytlarıThermo Fisher Scientific1255015
ImmEdge kalem
Mikrotom bıçaklarıThermo Fisher Scientific22-500-125
RNase AWAYRNase-inaktive edici çözüm
Ekipman
HybEZ hibritizasyon fırını İleri Hücre Teşhisi, Inc.321710
GeoMx Dijital Mekansal ProfilleyiciNanostring Model: GeoMx DSP
Veri erişim platformu: GeoMx DSP Kontrol Merkezi (Sürüm 3.1.2.12)		Kanal tarama ayarı: FITC için patlama süresi 300 ms, florofor ise AlexaFluro 488; kanal Cy3 için pozlama süresi 50 ms, florofor ise Syto83'tür; ve kanal Cy5 için pozlama süresi 300 ms, florofor ise AlexaFluor 647'dir.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, A., Barkley, D., França, G. S., Yanai, I. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  2. Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
  3. Schmitd, L. B., et al. Spatial and transcriptomic analysis of perineural invasion in oral cancer. Clin Cancer Res. 28 (16), 3557-3572 (2022).
  4. Bassiouni, R., et al. Spatial transcriptomic analysis of a diverse patient cohort reveals a conserved architecture in triple-negative breast cancer. Cancer Res. 83 (1), 34-48 (2023).
  5. Hirz, T., et al. Dissecting the immune suppressive human prostate tumor microenvironment via integrated single-cell and spatial transcriptomic analyses. Nat Commun. 14 (1), 663(2023).
  6. Wang, F., et al. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 9 (24), eadf5464(2023).
  7. Eyers, M., et al. Digital spatial profiling of the microenvironment of muscle invasive bladder cancer. Commun Biol. 7 (1), 737(2024).
  8. Del Rossi, N., Chen, J. G., Yuan, G. C., Dries, R. Analyzing spatial transcriptomics data using giotto. Curr Protoc. 2 (4), e405(2022).
  9. Sona, S., Bradley, M., Ting, A. H. Protocols for single-cell RNA-seq and spatial gene expression integration and interactive visualization. STAR Protoc. 4 (1), 102047(2023).
  10. Ibarra-Lopez, V., et al. Spatial profiling of protein and rna expression in tissue: An approach to fine-tune virtual microdissection. J Vis Exp. (185), e62651(2022).
  11. Mancinelli, L., Schoedel, K. E., Weiss, K. R., Intini, G. Methods to enable spatial transcriptomics of bone tissues. J Vis Exp. (207), e66850(2024).
  12. Sun, P., Li, M., Ye, K. Protocol to decipher complex spatial transcriptomics data using stminer. STAR Protoc. 6 (2), 103838(2025).
  13. Luo, Z., Schmitz, R. J. Protocol for preparing fresh frozen soybean tissues for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 6 (2), 103790(2025).
  14. Li, B., et al. Spatial gene expression of human coronary arteries revealed the molecular features of diffuse intimal thickening in explanted hearts. Int J Mol Sci. 26 (5), 1949(2025).
  15. Pelisek, J., et al. Swiss vascular biobank: Evaluation of optimal extraction method and admission solution for preserving RNA from human vascular tissue. J Clin Med. 12 (15), 5109(2023).
  16. Nam, S. K., et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 48 (1), 36(2014).
  17. Juwayria,, et al. Microarray integrated spatial transcriptomics (MIST) for affordable and robust digital pathology. NPJ Syst Biol Appl. 10 (1), 142(2024).
  18. Wang, H., et al. Systematic benchmarking of imaging spatial transcriptomics platforms in ffpe tissues. bioRxiv. , (2023).
  19. Smith, K. D., et al. Rigor and reproducibility of spatial transcriptomics performed on clinically sourced human tissues. Lab Invest. 104190, (2025).
  20. Amancherla, K., et al. Dynamic responses to rejection in the transplanted human heart revealed through spatial transcriptomics. bioRxiv. , (2025).
  21. Bolen, M., Xue, Q. -S., Tansey, M. G. Ffpe tissue microarray protocol. , (2024).
  22. Wisner, L., Larsen, B., Maguire, A. Manual construction of a tissue microarray using the tape method and a handheld microarrayer. J Vis Exp. (184), e63086(2022).
  23. Zhao, P., et al. Single-cell RNA-seq reveals a critical role of novel pro-inflammatory endothelial cells in mediating adverse remodeling in coronary artery-on-a-chip. Sci Adv. 7 (34), eabg1694(2021).
  24. Fu, M., et al. Single-cell RNA sequencing of coronary perivascular adipose tissue from end-stage heart failure patients identifies SPP1+ macrophage subpopulation as a target for alleviating fibrosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 43 (11), 2143-2164 (2023).
  25. Mao, A., et al. Single-cell RNA-seq reveals coronary heterogeneity and identifies CD133+ TRPV4high endothelial subpopulation in regulating flow-induced vascular tone in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (3), 653-665 (2024).
  26. Li, C., et al. Single-cell RNA sequencing of the carotid artery and femoral artery of rats exposed to hindlimb unloading. Cell Mol Life Sci. 82 (1), 50(2025).
  27. Deroo, E., et al. A vein wall cell atlas of murine venous thrombosis determined by single-cell RNA sequencing. Commun Biol. 6 (1), 130(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Uzamsal TranskriptomikRNA KorumaDoku DekalsifikasyonuRNAscope HibridizasyonuHistolojik BoyamaAlizarin K rm z BoyamaDoku Mikro dizisilgi B lgesi

İlgili makaleler