Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Neuregulin1-ERBB4 Sinyalizasyonu, Omurilik Yaralanması Sıçanlarında Akupunkturda Miyelin Rejenerasyonunu Teşvik Eden Sönükler

450 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69166

⸱

20 Şubat 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency and Intensive Care Unit, Beijing Anzhen Nanchong Hospital of Capital Medical University & Nanchong Central Hospital, 2Department of Neurology, Beijing Anzhen Nanchong Hospital of Capital Medical University & Nanchong Central Hospital, 3Department of Emergency and Intensive Care Unit, First Affiliated Hospital, Kunming Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, elektroakupunkturun bir SCI fare modelinde miyelin rejenerasyonu üzerindeki etkilerini araştırmayı ve Neuregulin1 (NRG1)-ErbB4 sinyal yolunun bu süreçte rol oynayıp oynamadığını doğrulamayı amaçlamaktadır.

Özet

Omurilik yaralanması (SCI) genellikle ciddi nörolojik işlev bozukluğuna yol açar ve miyelin onarımı nörolojik fonksiyonun iyileşmesinde kritik bir adımdır. Elektroakupunktur (EA), geleneksel akupunkturu elektriksel uyarımla birleştiren terapötik bir yöntemdir ve sinir onarımı alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, EA'da yer alan spesifik sinyal yolları tam olarak açıklanmamıştır. Bu çalışma, EA'nın SCI sıçanlarında miyelin rejenerasyonu üzerindeki etkilerini araştırmayı ve Neuregulin1 (NRG1)-ErbB4 sinyal yolunun bu süreçte rol oynayıp oynamadığını doğrulamayı amaçlamaktadır. SCI sıçanları, T10 omurga segmentinde anevrizma klipsi yaralanmasıyla indüklenmiştir. Bir polietilen (PE) kateter, L5-6 omurgalar arası boşluklar arasındaki omurga kanalına yerleştirildi ve uzun süreli ilaç dağıtım sistemi oluşturmak için deri altı olarak sabitlendi. Dıştan gelen NRG1 ve antagonisti, her enjeksiyonda 20 μL hacmi olan PE kateteri aracılığıyla her iki günde bir uygulandı. EA tedavisi, Dazhui (GV14) ve Mingmen (GV4) akupunktur noktalarında her iki günde bir uygulandı; her seans 4 hafta boyunca 30 dakika sürdü. Sonuçlar, EA tedavisinin omurilik dokusunda miyelin baziz proteininin (MBP) ekspresyonunu önemli ölçüde artırdığını ve sıçanlarda arka uzuv motor fonksiyonunu iyileştirdiğini gösterdi. Ayrıca, dıştan çıkan NRG1, EA'ya benzer etkiler yaratmıştır. Sonuç olarak, NRG1-ErbB4 sinyal yolu, SCI sıçanlarında EA kaynaklı miyelin rejenerasyonunda önemli bir rol oynar.

Giriş

SCI, genellikle motor bozukluk, duyu kaybı ve otonom disfonksiyon ile kendini gösteren ciddi nörolojik bozukluklara yol açan travmatik bir durumdur ve yıllık sıklık oranı dünya genelinde yaklaşık 40-80 vaka olarak 1,2. Yaralanma sonrası, aksonal yırtma ve miyelin kaybı, sinir sinyal iletimini engelleyen başlıca patolojiközelliklerdir 3. Miyelin, merkezi sinir sistemindeki (MSS) oligodendrositler ve periferik sinir sistemindeki (PNS) Schwann hücreleri tarafından oluşur ve bütünlüğü sinir impulslarının hızlı iletimi için kritiköneme sahiptir 4. Ancak, SCI sonrası yerel mikro ortamda inflamatuar yanıt, oksidatif stres ve glial skar oluşumu, miyelin yenilenmesini önemli ölçüde engeller ve kronik nörolojik işlevbozukluğuna yol açar. Aynı zamanda, SCI sonrası oligodendrositlerin (OL) ölümü, aksonların demyelinizasyonuna yol açar; bu süreç kronik ve kalıcı olarak gelişir. Çalışmalar, hem insan hem hayvan modellerinde aksonal demyelinizasyonun miyelin rejenerasyonu ile etkili şekilde onarılabilirolduğunu göstermiştir 6. Bu nedenle, miyelin onarımını teşvik etmek için stratejileri araştırmak, SCI tedavisinde temel yönlerden biridir.

Akupunktur, eski geleneksel bir tıbbi teknik olarak, Çin, Kore ve Japonya dahil olmak üzere birçok ülkede klinik uygulamadayaygın olarak uygulanmıştır 7,8. Geleneksel akupunkturu elektriksel uyarımla birleştiren EA, klinik ortamlarda yaygın olarak benimsenmiştir. Artan kanıtlar, EA'nın özellikle omurilik yaralanması sonrası miyelin yenilenmesini teşvik etmede çeşitli hastalıklar üzerinde terapötik etkileri olduğunu göstermektedir. EA tedavisi sırasında GV14 ve GV49 gibi akupunktur noktalarının seçimi kritik öneme sahiptir. GV14, 7. servikal omurun omura sürecinin altında, omurganın orta hattına yakın konumdadırken, GV4 ise 2. ve 3. bel omurlarının dikenli süreçleri arasında yer alır. Önceki çalışmalar, inflamatuar sinyal yolları, oksidatif stres, nörotrofik faktörler ve otofajinin EA kaynaklı miyelin onarımında roloynadığını göstermiştir 10,11,12. Ayrıca, artan kanıtlar, GV14 ve GV4 gibi spesifik akupunktur noktalarının, EA tedavisi sırasında miyelin yenilenmesini teşvik etmede aktif rol oynadığınıgöstermektedir 13,14,15. Ancak, omurilik hasarı sonrası EA'nın miyelin rejenerasyonunu nasıl düzenlediği moleküler mekanizmalar tam olarak açıklanmamıştır.

NRG1, epidermal büyüme faktörü ailesinin bir üyesidir ve aminoterminal bölgesine göre altı tipe (I-VI)16 ayrılabilir. NRG1 ve reseptör ailesi ErbB (ErbB1/2/3/4), sinir sisteminin gelişimi ve onarımında, nöronal göç, farklılaşma, remiyelinleşme ve sinaptogenez gibi süreçlerde önemli roller oynar. PNS'nin gelişimi sırasında, Schwann hücreleri (SC'ler) çoğalır ve nöronların aksonları boyunca göç ederek mielin oluşturur ve NRG1-ErbB4 sinyal yolu, PNS Schwann öncül hücrelerinin olgunlaşmasında önemli bir roloynar 17,18. Önceki çalışmalar, NRG1 sinyal yolunun sinir kök hücrelerinin Schwann hücrelerine farklılaşmasında rol aldığını ve SCI19 sonrası sinir hücrelerinin miyelin onarımını teşvik ettiğini göstermiştir. Ayrıca, bir çalışma omurilik yaralanmasının ardından NRG1-ErbB4 sinyal yolunun oligodendrosit aprogenitör hücrelerinin (OPC) remiyelinizasyonpotansiyeli 20 olan Schwann benzeri hücrelere dönüşmesini teşvik ettiğini göstermiştir. Alex ve ark. insan tarafından indüklenen pluripotent kök hücre türeyi duyusal nöronlar ve sıçan Schwann hücrelerinden oluşan bir ortak kültür sistemi inşa ettiler ve NRG1-ErbB sinyal yolunun ilaçlarla bloke edilmesinin nöronal miyelinasyonu önemli ölçüde inhibe ettiğini buldular; bu da bu yolun insan duyusal akson miyelinleşmesini teşvik etmedeki rolünün doğrudankanıtı oldu 21. Başka bir çalışma da EA tedavisinin omurilikte NRG1 ifadesini artırabileceğini ve iltihap ağrıyı hafifletebileceğinigöstermiştir 22.

EA'nın SCI'de NRG1-ErbB4 sinyal yolu üzerindeki etkisi üzerine araştırmalar sınırlıdır ve temel mekanizmalar belirsizdir. Bu çalışma, GV14 ve GV4 akupunktur noktalarında EA uyarısının NRG1-ErbB4 sinyal iletimini düzenleyip düzenleyemeyeceğini araştırmayı ve SCI sıçanlarında miyelin yenilenmesi ve nörolojik fonksiyonun iyileşmesindeki potansiyel rolünü araştırmayı amaçlamaktadır. Bu, SCI sıçanlarında NRG1-ErbB4 sinyal yolu ile EA kaynaklı miyelin rejenerasyonu arasındaki ilişkiyi inceleyen ilk çalışmadır ve SCI için yeni ve etkili tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için deneysel kanıtlar sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Deney sırasında hayvanların acısını en aza indirmek için tüm etik kurallara uyuldu. Deneysel protokol ve tasarım, Kunming Tıp Üniversitesi Hayvan Deneyleri Komitesi tarafından onaylandı (Onay No. KMMU2021051) ve üniversitenin hayvan araştırmaları yönergelerine uygun olarak yürütülür. Yetişkin erkek Sprague-Dawley fareleri (8 haftalık, 250-270 g ağırlığında, n = 60) Kunming Tıp Üniversitesi'nden (Yunnan, Çin) elde edilmiştir.

Hayvan hazırlığı

Hayvanlar, sürekli nem, orta sıcaklık ve 12 saat ışık/karanlık döngüsü olan kontrollü bir ortamda barındırıldı. Hayvanlar rastgele olarak 11 gruba ayrıldı: Sahte operasyon grubu (S, n = 6), SCI grubu (M, n = 6), SCI ile EA tedavi grubu (M + EA, n = 6), SCI ile NRG-1β tedavi grubu (M + NRG-1β, n = 6), SCI ile %5 DMSO çözücü grubu (M + D, n = 6), SCI PD158780 inhibitörü ve NRG-1β tedavi grubu (M + PD+NRG-1β, n = 6), PD158780 inhibitörü ve EA tedavi grubu ile SCI (M + EA + PD, n = 6), çözücü ve EA tedavi grubu (M + EA + D, n = 6), shRNA ile SCI ve EA tedavi grubu (M + EA + shRNA, n = 6), hedefsiz shRNA içeren lentivirüs ve EA tedavi grubu (M + EA + NC, n = 6), SCI ile shRNA tedavi grubu (M + shRNA, n = 6), SCI ile shRNA tedavi grubu (M + shRNA, n = 6). Mevcut örneklem büyüklüğü, benzer modeller ve müdahalelerle önceki deneyimimize dayanarak belirlendi ve bu sayıda tutarlı olarak anlamlı etkiler gösterdi. Ayrıca, örneklem büyüklüğüne rağmen, temel sonuçlarda istatistiksel olarak sağlam ve anlamlı farklılıklar gözlemledik; bu da bildirilen bulgulara olan güveni güçlendirdi.

SCI fare modeli

Yasargil anevrizma klipsi (titanyum, standart kapanma kuvveti 70 g) kullanılarak bir kelepçe tipi teknikle SCI fare modeli oluşturuldu (Şekil 1A). Fareler %2 sodyum pentobarbital (30 mg/kg, intraperitoneal) ile anestezi edilip ameliyat masasına konuldu. Sırt derisinde 3-4 cm kesi yapıldı, ardından deri altı doku ve kas katman katman diseksiyon yapılarak T9-11 torasik omuruk süreçleri ve omurga kemerlerini ortaya çıkardı. T10 torakal omurga süreci ve omurga kemerini çıkarmak için damar klipsi kullanıldı ve omurilik tamamen açığa çıktı. Yasargil anevrizma klibi, tüm T10 segmenti boyunca dikey olarak konumlandırıldı ve 60 saniyelik bir bakıştan sonra hızla serbest bırakıldı. Model, aşağıdaki belirtilerden iki veya daha fazlası gözlemlendiğinde başarılı sayılırdı: (1) vücutta spazmodik titreme, (2) kuyruk sallama refleksi ve (3) omurilikte görünür siyah çimdik izleri. Yeterli hemostaz sağlandıktan sonra kesi dezenfekte edilip dikildi. Sahte ameliyat grubunda da aynı işlem uygulandı, ancak omurilik kelepçelenmedi. Ameliyat sonrası olarak, sıçanlara rehidrasyon için normal salin (intraperitoneally 3 mL) ve enfeksiyonu önlemek için sabah ve akşam bir kez (intraperitoneal) penisilin (100.000 birim, intraperitoneal) verildi. Spontan idrar geri dönene kadar (günde 2 kez) idrar yapmada manuel yardım sağlandı.

Fare intratekal tüpler ve ilaç teslimatı

Storkson ve ark.23 yöntemini takip eden şekilde, SCI model indüksiyonundan 1 hafta önce farelerde subarachnoid boşluğa bir kateter yerleştirildi. Anesteziden sonra fareler ameliyat masasına sabitlendi ve L5-6 omurgalar arası boşluğu açığa çıkarıldı. Dura mater ve araknoid membranı dikey olarak delmek için 19G iğne kullanıldı. İğne yaklaşık 1-2 mm ilerletildi ve araknoid zarı kırdıktan sonra boşluk hissi oluştu, ardından beyin omuriliğinin net akışı başarılı bir delme işareti verdi. PE-10 kateteri (polietilen, iç çapı 0,38 mm, dış çapı 1,09 mm) delme iğnesi boyunca subaraknoid boşluğa yerleştirildi. Kateter yaklaşık 3 cm uzunluğuna kadar uzatıldı ve kateter ucu L3 omurga gövdesine yakın konumlandırıldı. Yerleştirme sırasında, farelerde kuyruk sallanması ve arka uzuv seğirmesi gözlemlenmiş, kateterden serebroomurilik sıvısı akarak kateterin subaraknoid boşluktaki konumunu doğrulamıştır.

Hem NRG-1β hem de PD158780, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözündürüldü ve ardından yapay beyinomurilik sıvısı (ACSF) ile seyreltilerek nihai DMSO konsantrasyonunun %0,5'in altında kalmasını sağladı. Son çalışma konsantrasyonları NRG-1β için 20 nM, PD15878024 için ise 20 μM idi. SCI sonrası ikinci günde, M + NRG-1β grubundaki farelere her iki günde bir 20 μL NRG-1β intratekal enjeksiyonlar verildi. M + EA + PD grubundaki farelere EA tedavisinden2 saat önce, intratekal 25 saat içinde 20 μL PD158780 verildi.

EA tedavisi

Ameliyattan sonraki 3. günde , sıçanlar, elektroakupunktur (EA) tedavisi için tedavi masasında akupunktur noktaları GV14 ve GV4'te (Şekil 1B) sabitlenmiştir. Bu noktalara 3-4 mm derinlikte iki akupunktur iğnesi (0,25 mm x 13 mm) yerleştirildi. EA terapisi, seyrek-yoğun dalga desenine sahip elektroakupunktur cihazı kullanılarak uygulandı (2 Hz'de seyrek dalga, 10 Hz'de yoğun dalga, 1:5 frekans oranı)26. Çıkış yoğunluğu 30 dakika boyunca her iki günde bir 5 (yaklaşık 0,5 mA) olarak ayarlandı.

Davranışsal değerlendirme

Lokomotor fonksiyon, ameliyattan sonraki 0, 3, 7, 14, 21 ve 28 gün içinde uzuv hareketi, yürüyüş, koordinasyon ve pati yerleşimini değerlendiren Basso, Beattie ve Bresnahan (BBB)27 ölçeği kullanılarak değerlendirildi ( Şekil 2D). BBB ölçeği 0 (tam felci temsil eder) ile 21 (normal yürüyüşü gösterir) arasında değişir. Tüm değerlendirmeler, deneysel grup atamalarına kör olan iki araştırmacı tarafından bağımsız olarak gerçekleştirildi.

Örnek koleksiyonu

Deneyin sona ermesinin ardından, anestezi altındaki fareler doku toplamak için bir diseksiyon platformuna sabitlendi. Karın boşluğu, damar yaralanmasını önlemek için diyaframın tamamen açığa çıkması için diyaframın tamamen açığa çıkması için dikkatlice kesildi. Kaburga kafesi daha sonra her iki kostal kenar boyunca kesilerek kalbi açığa çıkardı, ardından sol ventrikülün zirvesine bir iğne yerleştirildi ve yaklaşık 300-400 mL önceden soğutulmuş PBS hızla perfüze edilip sistemik kan temizlenerek sağ atriyumdan berrak sıvı akmaya başladı. Moleküler protein analizi için perfüzyon bu aşamada durduruldu ve omurilik kolonu disseksiye edildi. Bitişik kaburgalar ve kaslar çıkarılarak omurular ortaya çıktıktan sonra, T10 segmenti bulundu ve yaklaşık 1 cm rostral ve T10'a kadar kuyruk boylu bir omurilik segmenti iris makası kullanılarak toplandı, ardından sıvı azotta dondurularak -80 °C'de saklandı. Morfolojik inceleme için, PBS sonrası perfüzyon %4 paraformaldehit olarak değiştirildi ve başarılı fiksasyon kas kasısı ve gövdenin sertliği ile gösterildi. Aynı omurga segmenti daha sonra doku mimarisini korumak için dikkatlice disekize edildi ve 4 °C'de 48 saat boyunca %4 paraformaldehit ile sabitlendi.

Hematoksilin ve eozin boyama

Omurilik parafin bölümleri 60 °C fırında 30 dakika önceden ısıtma için kondu. Mumdan arındırma: Ksilen I 15 dakika ve ardından 15 dakika Ksilen II. Rehidrasyon: 2 dakika %100 etanol, ardından 2 dakika %95 etanol, ardından 2 dakika %80 etanol, ardından 2 dakika %70 etanol ile işlendi, ve son olarak 5 dakika damıtılmış su. Hematoksilin boyama işlemi 7 dakika yapıldı, ardından kalan lekelenme çözeltisi gidermek için damıtılmış suyla durulandı. %1 hidroklorik asit alkolünde 3 saniye diferensiya yapıldı, ardından kalıntı lekelenme çözeltisi gidermek için damıtılmış suyla durulandı. %5 amonyaklı suyla 2 dakika bulaştırıldı, ardından kalan mavileme çözeltisi yıkandı. 30 saniye eozin boyama yapıldı, ardından kalan lekelenme çözeltisi gidermek için damıtılmış suyla durulandı. Bölümlerin kurutulması %70 etanol ile 10 saniye, %80 etanol ile 10 saniye ve son olarak %100 etanol ile 30 saniye yapıldı. Temizleme işlemi 5 dakika boyunca Ksilen ile tedavi edilerek yapıldı. Montajdan sonra slaytlar hava kurutuldu ve kuruduktan sonra görüntüler çekildi.

Luxol hızlı mavi boyama

Bölümler 10 dakika boyunca 2 kez ksilenle mumdan arındırıldı, ardından LFB miyelin boyama çözeltisiyle boyandı ve gece boyunca 37 °C'de kuluçka geçirildi. Ertesi gün, fazla boyama çözeltisi %90 etanol kullanılarak çıkarıldı. Kesimler, 10 saniye (C0631S) boyunca Luxol farklılaştırma çözeltisinde ayrılmış, ardından gri madde berrak görünene kadar %75 etanol içinde 30 saniye daldırılmıştır. Son olarak, bölümler 1 dakika boyunca eosin boyama çözeltisiyle karşı boyandı.

Western blotting

Protein örnekleri 5 dakika suda kaynatıldı. Önce elektroforez jeline toplam 5 μL protein belirteci yüklendi, ardından test protein örnekleri ardışık olarak yüklendi. Elektroforez 80 V'da başlatıldı, işaretleyici bantlar net bir şekilde ayrılana kadar, ardından voltaj 130 V'a çıkarıldı ve elektroforez tamamlanana kadar sürdürüldü. Önceden kesilmiş PVDF membranları metanolde 1 dakika aktive edildi, ardından filtre kağıdına yerleştirildi ve hazırlanan jelle üzerine kondu. Protein transferi, moleküler ağırlığına göre ayarlanmış (± 10 dakika) sabit akımda 300 mA akımda gerçekleştirilmiştir. Transferden sonra, PVDF zarı bir kuluçka kutusuna konur, TBST tamponu ile 5 dakika durulanır ve ardından oda sıcaklığında %5 yağsız sütle 2 saat boyunca bir shaker üzerinde tıkanır. Zar daha sonra TBST tamponu ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkandıktan sonra GAPDH (1:2000), Tubulin (1:2000), NRG1 (1:1000), ErbB4 (1:1000) ve MBP (1:1000) gibi birincil antikorlarla inkubasyon yapıldı ve gece boyunca 4 °C'de hafif sallanma yapıldı. Ertesi gün, zar TBST tamponu ile 3 kez 5 dakika boyunca yıkandı, ardından ikincil antikor olan keçi anti-tavşan (1:4000) ile oda sıcaklığında 2 saat boyunca bir shaker'da inkübe edildi. TBST ile yıkamadan sonra, protein bantları kemilyünüminesans kullanılarak görselleştirildi. WB görüntüsünü ImageJ yazılımına aktarın ve 50 piksellik yuvarlanan top yarıçapı kullanarak arka plan çıkarma işlemi yapın. Eğimli bantlar için, bantları düzleştirmek için Segmented Line aracı kullanın. Dikdörtgen aracını kullanarak hedef bantları seçin ve Plot Lanes'i seçerek yoğunluk profili oluşturarak bantların gri tonlu değerlerini görselleştirin. Zirveleri segmentlere ayırmak ve gri tonlama değerlerini çıkarmak için Magic Wand aracını kullanın. Verileri kaydettikten sonra, GraphPad Prism yazılımını kullanarak çubuk grafikler oluşturun.

İmmünoflüoresans

Parafin bölümleri 10 dakika boyunca 2 kez ksilenle mumdan arındırıldı ve derecelendirilmiş etanol serisi ile yeniden nemlendirildi. Antijen toplama, bölümlerin %5 limon asit çözeltisinde 15 dakika kaynatılması ve ardından %10 keçi serumuyla 2 saat bloklanmasıyla gerçekleştirildi. Bölümler daha sonra 4 °C'de aşağıdaki birincil antikorlarla gece boyunca kuluçka edildi: fare monoklonal NRG-1 (1:200), tavşan monoklonal ErbB4 (1:300) ve insan monoklonal MBP (1:300). Her biri 10 dakika boyunca %0,1 Triton X-100 (PBST) içeren fosfatlı tuzlu salinle üç yıkamadan sonra, bölümler aşağıdaki ikincil antikorlarla karanlıkta 1 saat kuluçka altına alındı: FITC etiketli keçi anti-fare IgG (1:500), FITC etiketli keçi anti-tavşan IgG (1:500) ve FITC etiketli keçi anti-insan IgG (1:500). Bölümler PBST ile 3 kez 10 dakika boyunca yıkandı, ardından antiifade reaktifiyle sabitlenip floresan sinyalleri korumak için monte edildi. Slaytlar karanlıkta 4 °C sıcaklıkta saklanıyordu. Hedef hücreleri floresan mikroskobu kullanarak 10x objektif lens altında konumlandırdıktan sonra, floresans görüntüsünü yakalamak için 40x lens lense geçin.

Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)

ErbB4 ve referans gen GAPDH için primerler NCBI web sitesi kullanılarak tasarlandı. Primerlerin dizileri şöyleydi: ErbB4 ileri primer: ACAGCCCTCCTCCTGCCTAC; ErbB4 ters primer: ATCTCAGCCGTTGCACCCT; GAPDH ön planı: CCCAGCTTAGGTTCATCATCAGGT; GAPDH ters primeri: TACGCCAAATCCGTTCACA. Yaklaşık soya fasulyesi büyüklüğünde omurilik dokusu 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirildi ve toplam RNA ekstraksiyon reaktifi 600 μL eklendi. Doku iyice homojenize edilip 5 dakika buzda kuluçka geçirildi, ardından 12.000 x g sıcaklığında 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapıldı. Süpernatant yeni bir 1,5 mL tüpe aktarıldı ve 400 μL kloroform eklendi. Karışım iyice karıştırıldı ve 12.000 x g sıcaklığında 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjlendi. Süpernatant tekrar yeni bir tüpe aktarıldı ve 400 μL izopropanol eklendi. Çözelti oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya geçirildi, ardından 12.000 x g ile 10 dakika santrifüjlendi. Süpernatant atıldı ve RNA pelleti %75 etanol içeren 400 μL ile yıkandı. 7.500 x g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjlendikten sonra süpernatant atıldı ve tüp tersle temiz bir yüzeyde hava kurutması için tersedildi. RNA peleti 60 μL RNA-sız suda çözündü, iyice karıştırıldı ve RNA konsantrasyonu ölçüldü. RNA'nın saflığı ve konsantrasyonu, 260 nm ve 280 nm soğurma ölçümüyle kaydedildi ve 260/280 oranı yaklaşık 2.0 oldu. cDNA sentezi için, Reaksiyon 1 (gDNA Silgisi vb. içerir) ve Reaksiyon 2 (ters transkriptaz vb.) iyice karıştırılır ve karışım 95 °C'de 15 dakika kuluçka şeklinde alınmıştır. Floresans PCR reaksiyon sistemi, cDNA sentez kiti talimatlarına göre hazırlandı. 23 μL PCR reaksiyon karışımına 2 μL örnek eklendi ve floresans nicel PCR kiti protokolüne göre amplifikasyon yapıldı. Tavlama sıcaklığı 60 °C'ye ayarlandı ve amplifikasyon koşulları şu şekildeydi: Denatürasyon öncesi: 30 saniye 95 °C, 1 döngü; PCR reaksiyonu: 3 saniye 95 °C, 30 saniye 60 °C, 40 döngü; Dissosiyasyon eğrisi analizi şu şekilde yapıldı: 5 saniye için 95 °C, 30 saniye için 60 °C, ardından sürekli floresans sinyal alımıyla 60 °C'den 95 °C'ye kademeli bir artış yapıldı. CT değerleri Bio-Rad bilgisayar yazılımı kullanılarak ölçülüp hesaplandı, göreli mRNA seviyeleri ise 2-ΔΔCt yöntemiyle belirlendi.

Güvenlik ve kullanım kuralları

Paraformaldehit fiksasyonu: Paraformaldehiti sadece iyi havalandırılan bir buhar davlumbazında kullanın. Her zaman maske, eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanları (PPE) takın. Paraformaldehit çözeltiyi sıkı kapalı bir kapta, doğrudan güneş ışığı ve ısı kaynaklarından uzakta sakla. Atık paraformaldehiti Kunming Tıp Üniversitesi laboratuvar güvenlik yönergelerine uygun olarak tehlikeli atık konteynerine yerleştirerek bertaraf edin.

DMSO çözümü: DMSO, deri yoluyla emilebilir ve vücuda girebilir. Kullanım sırasında eldiven ve koruyucu gözlük dahil olmak üzere uygun PPE giyin. DMSO'yu oda sıcaklığında, güçlü oksitleyici maddelerden uzakta, kapalı bir kapta sakla. Atık DMSO'yu Kunming Tıp Üniversitesi laboratuvar güvenlik yönergelerine uygun olarak tehlikeli atık konteynerine yerleştirerek bertaraf edin.

Pentobarbital anestezi: Pentobarbital kontrollü bir maddedir ve yalnızca yetkili personel tarafından ele alınmalıdır. Kullanım sırasında kazara maruz kalmadan kaçının ve kullanım sırasında uygun havalandırmayı sağlayın. Uygun koruyucu ekipman giyin. Pentobarbital, yetkili personelin gözetimi altında, oda sıcaklığında kilitli bir dolapta saklanın. Pentobarbital atıkları, Kunming Tıp Üniversitesi'nin kontrollü maddeler yönergelerine uygun olarak bertaraf et, uygun kullanım yetkisi ve atık bertaraf prosedürlerini garanti eder.

Genel atık bertarafı: Tüm tehlikeli kimyasallar ve reaktifler, Kunming Tıp Üniversitesi'nin laboratuvar yönetim yönergelerine uygun olarak bertaraf edilmelidir. Tüm atık maddelerin doğru şekilde etiketlendiğinden ve güvenli bertaraf için uygun kaplara yerleştirildiğinden emin olun.

İstatistiksel analiz

Tüm deneyler üçlü veya daha fazla şekilde yapıldı. Hedef proteinlerin bant yoğunluk değerleri, gruplar arasında karşılaştırmaları kolaylaştırmak için kontrol grubununkiyle normalleştirildi. Veriler, ortalama (çeyreklerarası aralık) veya ortalama ± standart sapma olarak sunulur; n fare sayısını temsil eder. Normal dağılımlı veriler için, gruplar arasındaki anlamlı farklılıklar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak değerlendirildi. Normal dağılım olmayan veriler için, grupları karşılaştırmak için Kruskal-Wallis H testi uygulanmıştır. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 olarak belirlendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

H&E boyama ve BBB puanlama, EA'nın SCI sıçanları üzerindeki koruyucu etkilerini göstermektedir

H&E boyama, omuriliğin arka boynuz hücrelerinin morfolojisi ve yapısını incelemek için kullanılmıştır (Şekil 2D). H&E sonuçları, grup S'de arka boynuz hücrelerinin düzgün düzenlendiğini, hücre hatlarının iyi tanımlanmış ve çekirdeklerinin merkezi konumda olduğunu ortaya koydu. Buna karşılık, grup M'de arka boynuz hücre s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, EA tedavisinin SCI sonrası omurilik kavitasyonunu ve demyelinizasyonu hafiflettiğini, MBP protein ekspresyonunun yukarı regulasyonu yoluyla remiyelinasyonu teşvik ettiğini ve dolayısıyla farelerde arka uzuv motor fonksiyonunu iyileştirdiğini göstermektedir. Ayrıca, NRG-1/ErbB4 sinyal yolunun nöronal remiyelinleşmenin kritik bir aracısı ve EA'nın SCI sıçanlarında remiyelinasyonu ve arka uzuv motor fonksiyonunun iyileşmesini teşvik eden potansiyel bir terapötik mekanizması oldu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını belirtirler.

Teşekkürler

Yazarlara bu çalışmaya katkıları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC 81960817, 82260387) ve Yunnan Eyalet Bilim ve Teknoloji Departmanı Bilim ve Teknoloji Planı'nın Temel Araştırma Özel Programı (202301AS070020) tarafından maddi olarak desteklenmiştir. Kuzey Sichuan Tıp Fakültesi Bilimsel Araştırma ve Geliştirme Projesi (CBY22-QNA20)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BCA Protein Tespit Kiti Beyotime BiyoteknolojisiP0012SNicel protein analizi
Elektroakupunktur cihazıHuatuo Elektroakupunktur Enclatı, SDZ-V, Suzhou—Terapötik ekipmanlar
FITC etiketli keçi anti-insan IgGBeyotimeA0556Floresan ikincil antikor
FITC etiketli keçi fare karşıtı IgGBeyotimeA0568Floresan ikincil antikor
FITC etiketli keçi anti-tavşan IgGBeyotimeA0562Floresan ikincil antikor
Flüoresans mikroskobuOlympus——
İnsan monoklonal MBPAbcamAB209328Spesifik antikor
LFB miyelin boyama çözeltisiSolarbioG3240Miyelin kılıfı boyama
Millipore ECLMilliporeWBKLS0100Tespit reaktifleri
Fare monoklonal NRG-1  Santa CruzSC-57384Spesifik antikor
Nanodrop ND-1000LabTech—
NRG1-1 betaNovoprotein Teknoloji ŞirketiC753Rekombinant insan NRG1-1 beta
PD158780GlpBio TeknolojisiGC15925Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) tirozin kinaz inhibitörü
PE-10 kanalıBecton, Dickinson ve Şirketi427401Intratekal enjeksiyon
Enjeksiyon için penisilin sodyumHarbin Zhongjing Biyoteknoloji Şirketi80451182Ameliyat sonrası antienfeksiyon tedavisi
Tavşan monoklonal ErbB4AbcamAB109273Spesifik antikor
RNAiso Plus KitiTakara9109RT-PCR reaktifleri
RT Reaktif KitiTakaraRR037ART-PCR reaktifleri
İkincil antikorBeyotime Biyoteknolojisi—Spesifik antikor
Sodyum pentobarbitalSigma-Aldrich69020100Hayvan anestezisi
Yaşargil anevrizması klipiRebstock Instruments GmbH—Bir sıçan omurilik yaralanması modelinin inşası

Kaynaklar

  1. McDonald, J. W., Sadowsky, C. Spinal-cord injury. Lancet. 359 (9304), 417-425 (2002).
  2. Mohammadi, E., Villeneuve, L. M., Smith, Z. A. Spinal Cord Injury: The Global Incidence, Prevalence, and Disability From the Global Burden of Disease Study 2019. Spine. 48 (24), 1767(2023).
  3. Anjum, A., et al. Spinal Cord Injury: Pathophysiology, Multimolecular Interactions, and Underlying Recovery Mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 7533(2020).
  4. Fang, M., Chen, L., Tang, T., Qiu, M., Xu, X. The committed oligodendrocyte precursor cell, a newly-defined intermediate progenitor cell type in oligodendroglial lineage. Glia. 71 (11), 2499-2510 (2023).
  5. Hellenbrand, D. J., et al. Inflammation after spinal cord injury: a review of the critical timeline of signaling cues and cellular infiltration. J Neuroinflammation. 18 (1), 284(2021).
  6. Pukos, N., et al. Chronic demyelination and myelin repair after spinal cord injury in mice: A potential link for glutamatergic axon activity. Glia. 71 (9), 2096-2116 (2023).
  7. Birch, S., Robinson, N. Acupuncture as a post-stroke treatment option: A narrative review of clinical guideline recommendations. Phytomedicine. 104, 154297(2022).
  8. Jiang, K., Sun, Y., Chen, X. Mechanism Underlying Acupuncture Therapy in Spinal Cord Injury: A Narrative Overview of Preclinical Studies. Front Pharmacol. 13, 875103(2022).
  9. Wang, X., et al. Electroacupuncture at Dazhui (GV14) and Mingmen (GV4) protects against spinal cord injury: the role of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Neural Regen Res. 11 (12), 2004-2011 (2016).
  10. Li, S. S., et al. Electroacupuncture treatment improves motor function and neurological outcomes after cerebral ischemia/reperfusion injury. Neural regen res. 17 (7), 1545-1555 (2022).
  11. Liu, C., et al. Electroacupuncture promotes oligodendrocyte differentiation and myelin repair in a rat model of vascular dementia: Investigation of the mechanism from NF-κB-mediated inflammation. Neuroscience. 572, 21-34 (2025).
  12. Tong, T., et al. Electroacupuncture ameliorates chronic unpredictable mild stress-induced depression-like behavior and cognitive impairment through suppressing oxidative stress and neuroinflammation in rats. Brain Res Bull. 206, 110838(2024).
  13. Ahn, S. M., et al. Electroacupuncture ameliorates memory impairments by enhancing oligodendrocyte regeneration in a mouse model of prolonged cerebral hypoperfusion. Sci Rep. 6, 28646(2016).
  14. Kong, Y., Yang, J., Fan, Y. Q., Wang, W. S., Zhang, Y. T. "Huayu Tongluo" moxibustion improves learning-memory ability and promotes myelin regeneration by regulating Sonic Hedgehog signaling pathway in vascular dementia rats. Zhen Ci Yan Jiu. 48 (6), 578-584 (2023).
  15. Chen, W. C., et al. Influence of electroacupuncture of Dazhui (EX-B2) and Mingmen (GV4) on NR2B expression in anterior horns of spinal cord in rats with acute spinal cord injury. Zhen Ci Yan Jiu. 44 (2), 95-101 (2019).
  16. Mei, L., Nave, K. A. Neuregulin-ERBB signaling in the nervous system and neuropsychiatric diseases. Neuron. 83 (1), 27-49 (2014).
  17. Birchmeier, C., Bennett, D. L. Neuregulin/ErbB Signaling in Developmental Myelin Formation and Nerve Repair. Curr Top Dev Biol. 116, 45-64 (2016).
  18. Chen, S., et al. Neuregulin 1-erbB signaling is necessary for normal myelination and sensory function. J Neurosci. 26 (12), 3079-3086 (2006).
  19. Bartus, K., et al. ErbB receptor signaling directly controls oligodendrocyte progenitor cell transformation and spontaneous remyelination after spinal cord injury. Glia. 67 (6), 1036-1046 (2019).
  20. Tao, F., et al. Role of neuregulin-1/ErbB signaling in stem cell therapy for spinal cord injury-induced chronic neuropathic pain. Stem cells. 31 (1), 83-91 (2013).
  21. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
  22. Wan, C., et al. Neuregulin1-ErbB4 Signaling in Spinal Cord Participates in Electroacupuncture Analgesia in Inflammatory Pain. Front Neurosci. 15, 636348(2021).
  23. Tseropoulos, G., et al. Immobilized NRG1 Accelerates Neural Crest like Cell Differentiation Toward Functional Schwann Cells Through Sustained Erk1/2 Activation and YAP/TAZ Nuclear Translocation. Adv Sci (Weinh). 11 (33), e2402607(2024).
  24. Luo, M., et al. Neuronal activity-dependent myelin repair promotes motor function recovery after contusion spinal cord injury. Brain Res Bull. 166, 73-81 (2021).
  25. Hesp, Z. C., Goldstein, E. Z., Miranda, C. J., Kaspar, B. K., McTigue, D. M. Chronic oligodendrogenesis and remyelination after spinal cord injury in mice and rats. J Neurosci. 35 (3), 1274-1290 (2015).
  26. Levy, G., et al. Gtf2i-encoded transcription factor Tfii-i regulates myelination via Sox10 and Mbp regulatory elements. Nat Commun. 16 (1), 8518(2025).
  27. Cescon, M., et al. Gut microbiota depletion delays somatic peripheral nerve development and impairs neuromuscular junction maturation. Gut Microbes. 16 (1), 2363015(2024).
  28. Ayar, Z., et al. The effect of low-level laser therapy on pathophysiology and locomotor recovery after traumatic spinal cord injuries: a systematic review and meta-analysis. Laser Med Sci. 37 (1), 61-75 (2022).
  29. Ghane, N., Beigi, M. H., Labbaf, S., Nasr-Esfahani, M. H., Kiani, A. Design of hydrogel-based scaffolds for the treatment of spinal cord injuries. J Mater Chem B. 8 (47), 10712-10738 (2020).
  30. Laskin, J. J., Waheed, Z., Thorogood, N. P., Nightingale, T. E., Noonan, V. K. Spinal Cord Stimulation Research in the Restoration of Motor, Sensory, and Autonomic Function for Individuals Living With Spinal Cord Injuries: A Scoping Review. Arch Phys Med Rehabil. 103 (7), 1387-1397 (2022).
  31. Li, G., et al. Epidural Spinal Cord Stimulation Promotes Motor Functional Recovery by Enhancing Oligodendrocyte Survival and Differentiation and by Protecting Myelin after Spinal Cord Injury in Rats. Neurosci Bull. 36 (4), 372-384 (2020).
  32. Csomó, K. B., et al. A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats. J Vis Exp. (181), e63534(2022).
  33. Li, J. J., et al. Animal Models for Treating Spinal Cord Injury Using Biomaterials-Based Tissue Engineering Strategies. Tissue eng part b-re. 28 (1), 79-100 (2022).
  34. Coman, I., Barbin, G., Charles, P., Zalc, B., Lubetzki, C. Axonal signals in central nervous system myelination, demyelination and remyelination. J Neurol Sci. 233 (1-2), 67-71 (2005).
  35. Inouye, H., Kirschner, D. A. Evolution of myelin ultrastructure and the major structural myelin proteins. Brain Res. 1641 (Pt A), 43-63 (2016).
  36. Chen, X., Li, H. Neuronal reprogramming in treating spinal cord injury. Neural Regen Res. 17 (7), 1440-1445 (2022).
  37. Huang, S., et al. Protective Effect of Electroacupuncture on Neural Myelin Sheaths is Mediated via Promotion of Oligodendrocyte Proliferation and Inhibition of Oligodendrocyte Death After Compressed Spinal Cord Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1870-1881 (2015).
  38. Kang, Z., et al. Electroacupuncture promotes regeneration and repair of myelin sheath of corpus callosum in demyelination mice. Zhen Ci Yan Jiu. 45 (1), 1-7 (2020).
  39. Zhu, K., et al. Electroacupuncture Promotes Remyelination after Cuprizone Treatment by Enhancing Myelin Debris Clearance. Front Neurosci. 10, 613(2017).
  40. Lu, J. Y., et al. Effects of electroacupuncture at different acupoints on the histomorphology of neurogenic bladder and the expression of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels in interstitial cells of Cajal in a rat model of suprasacral spinal cord injury. Ann Palliat Med. 9 (6), 3830-3838 (2020).
  41. Tu, W. Z., et al. The regulatory effect of electro-acupuncture on the expression of NMDA receptors in a SCI rat model. Life Sci. 177, 8-14 (2017).
  42. Ding, Z., et al. Neuregulin-1 converts reactive astrocytes toward oligodendrocyte lineage cells via upregulating the PI3K-AKT-mTOR pathway to repair spinal cord injury. Biomed Pharmacother. 134, 111168(2021).
  43. Kataria, H., et al. Neuregulin-1 promotes remyelination and fosters a pro-regenerative inflammatory response in focal demyelinating lesions of the spinal cord. Glia. 66 (3), 538-561 (2018).
  44. Schmitd, L. B., et al. Deletion of murine Sarm1 results in a microenvironment that delays peripheral nerve regeneration after injury. Sci Transl Med. 17 (819), eadp9155(2025).
  45. Hu, X., et al. Pan-ErbB inhibition impairs cognition via disrupting myelination and aerobic glycolysis in oligodendrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (45), e2405152121(2024).
  46. Størkson, R. V., Kjørsvik, A., Tjølsen, A., Hole, K. Lumbar catheterization of the spinal subarachnoid space in the rat. J Neurosci Methods. 65 (2), 167-172 (1996).
  47. Rahimi-Movaghar, V., Jazayeri, S. B. When do we start Basso, Beattie, and Bresnahan assessment after experimental spinal cord injury. Acta Med Iran. 51 (8), 5183(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Elektroakupunktur TedavisiSinir OnarımıMiyelin Temel ProteiniArka Uzuv FonksiyonuAkupunktur NoktalarıEkzojen NRG1Sinyal Yolağı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.