Bu makale, postmenopozal osteoporozda RANKL/OPG eksen modülasyonu yoluyla egzersize bağlı kemik koruma aracısı olarak kardiyotrofin benzeri sitokin faktör 1'in (CLCF1) araştırılması için kapsamlı bir protokol sunmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bu makale, postmenopozal osteoporozda RANKL/OPG eksen modülasyonu yoluyla egzersize bağlı kemik koruma aracısı olarak kardiyotrofin benzeri sitokin faktör 1'in (CLCF1) araştırılması için kapsamlı bir protokol sunmaktadır.
Son çalışmalar, kardiyotrofin benzeri sitokin faktör 1'i (CLCF1), kas-iskelet sistemi yararlarına aracılık eden, ancak yaşla birlikte azalan, egzersize bağlı bir "gençlik molekülü" olarak tanımlamıştır. Bu protokol, CLCF1'in bağışıklık-kemik karışma mekanizmaları yoluyla egzersiz aracılı kemik korumasındaki düzenleyici rolünü araştırmak için sistematik bir yaklaşımı açıklamaktadır. Metodoloji, CLCF1'in nükleer faktör-κB ligandı (RANKL)/osteoprotegerin (OPG) sinyal ekseninin reseptör aktivatörü üzerindeki etkisini aydınlatmak için klinik numune analizini, moleküler karakterizasyon tekniklerini ve fonksiyonel analizleri kapsar. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), western blotlama, CRISPR/Cas9 gen düzenleme ve ko-kültür sistemleri aracılığıyla bu protokol, CLCF1'in STAT1 aracılı osteoklast inhibisyonu ve STAT3 aracılı osteoblast promosyonu yoluyla ikili kemik koruyucu etkilerini gösterir. Açıklanan yöntemler, CLCF1 ekspresyon paternlerinin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesini, kemik mineral yoğunluğu parametreleriyle korelasyon analizlerini ve potansiyel egzersiz-mimetik tedavi müdahalelerinin mekanik değerlendirmesini sağlar. Öncelikle osteoklastları hedef alan geleneksel antirezorptif tedavilerin aksine, CLCF1 bazlı müdahaleler, rezorpsiyonu inhibe ederken aynı anda kemik oluşumunu teşvik etme gibi benzersiz bir avantaj sunabilir. Bu protokol, araştırmacılara kemik metabolizmasının egzersize bağlı sitokin aracılı düzenlenmesini araştırmak için standartlaştırılmış prosedürler sağlar ve yaşa bağlı kemik bozuklukları için hedefe yönelik terapötik müdahalelerin geliştirilmesini kolaylaştırır.
Postmenopozal osteoporoz (PMOP), bağışıklık sistemi düzensizliğinin patolojik kemik kaybını hızlandırdığı yaşa bağlı kas-iskelet sistemi düşüşünün paradigmatik bir örneğini temsil eder 1,2,3. Egzersiz, yaşa bağlı kemik bozulmasını önlemek için en etkili farmakolojik olmayan müdahale olarak yaygın olarak kabul edilse de, egzersize bağlı kemik korumasının altında yatan kesin moleküler mekanizmalar yakın zamana kadar belirsizliğini korumuştur4. Çağdaş kemik metabolizması anlayışı, iskelet homeostazını yöneten karmaşık ost....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu protokol kurumsal araştırma etik kurulu tarafından onaylanmıştır (Protokol #2024-CHSD-0156) ve Helsinki Bildirgesi ilkelerine uygundur. Tüm hayvan prosedürleri, kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi yönergelerine (Protokol #2024-037) uygundur. Tüm katılımcılar yazılı bilgilendirilmiş onam verdi.
1. Klinik numune toplama ve egzersiz müdahalesi değerlendirmesi
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu protokolün uygulanması, CLCF1'in çoklu deneysel yaklaşımlar kullanarak immün aracılı kemik metabolizmasındaki düzenleyici rolünü başarıyla göstermektedir. Klinik doğrulama çalışmaları, Şekil 1A'da gösterildiği gibi, PMOP hastalarında sağlıklı kontrollere kıyasla CLCF1 ekspresyonunun önemli ölçüde aşağı regülasyonunu göstermektedir, periferik kan mononükleer hücrelerinin kantitatif PCR analizi, PMOP grubunda nispi CLCF1 mRN.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Burada açıklanan protokol, RANKL/OPG ekseninin sistematik bir analizi yoluyla CLCF1'in egzersize bağlı kemik koruma aracısı olarak rolünü araştırmak için kapsamlı bir metodolojik çerçeve sağlar. Son zamanlarda çığır açan araştırmalar, CLCF1'i yaşa bağlı kas-iskelet sistemi düşüşüyle mücadele eden egzersize bağlı bir faktör olarak tanımlamış ve onu egzersize bağlı kemik korumasının merkezi bir aracısı olarak konumlandırmıştır 34,35,36.<.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Yazarlar, bu çalışma için gönüllü olan katılımcılara ve Shandong Birinci Tıp Üniversitesi'ne Bağlı Merkez Hastanedeki klinik personele hasta alımı ve numune toplama konusundaki yardımlarından dolayı teşekkür eder. Hücre kültürü ve moleküler biyoloji deneylerine verdikleri destek için laboratuvar teknisyenlerine teşekkür ederiz. H.Z. çalışmayı tasarladı ve tasarladı, deneyleri gerçekleştirdi, verileri analiz etti ve makaleyi yazdı. H.L. deneysel tasarıma, veri toplamaya ve el yazması revizyonuna katkıda bulundu. Y.S. projeyi denetledi, eleştirel geri bildirim sağladı ve taslağı düzenledi. Tüm yazarlar nihai makaleyi incelendi ve gönder....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hücre Kültürü Medya & Reaktifler | |||
| Dimetil Sülfoksit (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Purpose_Application: Kriyokoruma ortamı bileşeni Specifications_Comments: Moleküler biyoloji derecesi, steril filtrelenmiş |
| DMEM ortamı | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Purpose_Application: MG-63 osteoblast kültür ortamı Specifications_Comments: L-glutamin içeren yüksek glikoz formülasyonu |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Purpose_Application: Hücre kültürü takviyesi (ısıyla inaktive edilmiş) Specifications_Comments: 56Â'de ısıyla inaktive edilmiş; & derece; C 30 dakika |
| Penisillin-Streptomisin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Purpose_Application: Steril kültür için antibiyotik takviyesi Specifications_Comments: 100X stok, nihai konsantrasyon %1 |
| Polibren (Heksadimethrin bromid) | Santa Cruz Biyoteknolojisi | SC-134220 | Purpose_Application: Lentiviral transduksiyon güçlendirici Specifications_Comments: 8 & Icirc; ¼ g/mL çalışma yoğunluğu |
| Puromisin dihidroklorür | InvivoGen | ANT-PR-1 | Purpose_Application: Transdüksiyon edilen hücreler için seçici antibiyotik Specifications_Comments: 4 & Icirc; ¼ 7 gün boyunca g/mL seçim yoğunluğu |
| RPMI-1640 orta | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | Purpose_Application: Raji B-lenfosit kültür ortamı Specifications_Comments: L-glutamin içeren, fenol kırmızısı tercih edilir |
| Trypan Blue Çözümü | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Purpose_Application: Hücre canlılığı değerlendirmesi Specifications_Comments: Dışlama testi için %0,4 çözüm |
| Kontrollü Hızlı Dondurma Konteyneri | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Purpose_Application: Kontrollü hücre dondurma (-1Â & derece; C/min) Specifications_Comments: Mr. Frosty veya -1Â için eşdeğeri; & derece; C/min soğutma |
| EDTA Kan Toplama Tüpleri | BD Biosciences | 366643 | Purpose_Application: Antikoagülant Specifications_Comments ile venöz kan toplama: 10-20 mL kapasiteli, mor üst tüpler |
| Ficoll-Paque PLUS yoğunluk gradyenti | Cytiva (GE Healthcare) | 17144003 | Purpose_Application: PBMC izolasyonu yoğunluk santrifüjasyonu Specifications_Comments: Steril, endotoksin testli hücre ayrımı için |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | Purpose_Application: Hücre yıkama ve seyreltme tamponu Specifications_Comments: Steril, hücre kültürü derecesinde |
| RNA Çıkarımı & qPCR | |||
| Kloroform (ACS Sınıfı) | Sigma-Aldrich | C2432 | Purpose_Application: RNA ekstraksiyonunda faz ayrımı Specifications_Comments: ACS reaktif derecesi, â ‰ ¥ %99 saflık |
| Etanol (%75, moleküler kalitede) | Sigma-Aldrich | E7023 | Purpose_Application: RNA pelet yıkama Specifications_Comments: Moleküler biyoloji derecesi, taze hazırla |
| İzopropanol (moleküler derece) | Sigma-Aldrich | I9516 | Purpose_Application: RNA çökelmesi Specifications_Comments: Moleküler biyoloji derecesi, & acirc; ‰ ¥ %99,5 saflık |
| Nükleazsız Su | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | Purpose_Application: PCR reaksiyon hazırlığı Specifications_Comments: DNaz/RNase içermemiş, PCR uygulamaları için test edilmiştir |
| Optik Yapıştırıcı Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Purpose_Application: qPCR plakaları için optik mühürleme Specifications_Comments: qPCR uygulamaları için optik kalite |
| PCR Plakaları (96 kuyusu) | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | Purpose_Application: Yüksek verimlilikli qPCR Specifications_Comments için 96-kuyu formatı: Optik algılama için beyaz, şeffaf taban |
| PCR Tüp Şeritleri | Thermo Fisher Scientific | AB0451 | Purpose_Application: Küçük hacimli PCR reaksiyonları Specifications_Comments: Bireysel kapaklı 8 tüplü şeritler |
| PrimeScript RT Reagent Kit | Takara Biyografisi | RR037A | Purpose_Application: RNA'nın cDNA Specifications_Comments'a ters transkripsiyonu: genomik DNA çıkarımı için gDNA Silgisi ile |
| SYBR Yeşil Ana Karışımı | Uygulamalı Biyosistemler | 4309155 | Purpose_Application: Gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu ve tespiti Specifications_Comments: Normalizasyon için ROX referans boyası ile |
| TRIzol Reaktifi (RNA Lizi) | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Purpose_Application: Hücre lizisi ve RNA ekstraksiyonu Specifications_Comments: 4Â'te depola; & derece; C, 6 ay içinde kullanın |
| Protein Analizi - Western Blot | |||
| Akrilamid/Bis-akrilamid (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | Purpose_Application: SDS-PAGE jel polimerizasyonu Specifications_Comments: %30 akrilamid stok çözeltisi |
| BCA Protein Test Kiti | Thermo Fisher Scientific | 23225 | Purpose_Application: Protein konsantrasyonu niceliklendirme Specifications_Comments: Doğru nicelendirme için indirgenç uyumlulukla |
| Gelişmiş Kemilyünesans (ECL) Substratı | Thermo Fisher Scientific | 32106 | Purpose_Application: Kemilyünesan protein tespiti Specifications_Comments: Femtogram hassasiyet tespiti |
| Yağsız Kuru Süt | Laboratuvar Bilimsel | 170-6404 | Purpose_Application: Western blot engelleme ajanı Specifications_Comments: Engelleme derecesi, düşük arka plan |
| Fosfataz İnhibitörü Kokteyli | Roche Uygulamalı Bilimler | 4906845001 | Purpose_Application: Protein defosforilasyonunu önleme Specifications_Comments: Okadaik asit ve kalikülin A içerir |
| Prestained Protein Merdiveni | Bio-Rad | 1610394 | Purpose_Application: Moleküler ağırlık referans standartları Specifications_Comments: 10-250 kDa aralığında 11 bant ile |
| Proteaz İnhibitörü Kokteyli | Roche Uygulamalı Bilimler | 11697498001 | Purpose_Application: Lizi Specifications_Comments sırasında protein bozulmasını önleme: Metal bağımlı fosfatazlar için EDTA-dan bağımsız |
| PVDF Zarları (0.45 & Icirc; ¼ m) | Millipore Sigma | IPVH00010 | Purpose_Application: Protein transfer zarı (0.45 & Icirc; ¼ m gözenek) Specifications_Comments: Düşük floresans arka plan |
| RIPA Liz Tamponu | Hücre Sinyal Teknolojisi | 9806S | Purpose_Application: Tam hücre protein ekstraksiyonu Specifications_Comments: Deterjanlı kullanıma hazır lizis tamponu |
| Örnek Yükleme Tamponu (4X) | Bio-Rad | 1610747 | Purpose_Application: SDS-PAGE Specifications_Comments için protein örneği hazırlanması: Î ile boya yüklenmesi; ²-merkaptoetanol |
| SDS-PAGE Çalıştırma Tamponu | Bio-Rad | 1610732 | Purpose_Application: Protein elektroforezi Specifications_Comments: Tris-glisin-SDS tampon sistemi |
| Sodyum Florür | Sigma-Aldrich | 201154 | Purpose_Application: Ek fosfataz inhibisyonu Specifications_Comments: 50 mM çalışma yoğunluğu |
| Sodyum Ortovanadat | Sigma-Aldrich | S6508 | Purpose_Application: JAK2/STAT fosforilasyon koruma Specifications_Comments: 1 mM çalışma konsantrasyonu, taze hazırlanın |
| Transfer Tamponu Konsantre | Bio-Rad | 1704156 | Purpose_Application: Yarı kuru protein transferi Specifications_Comments: 10X konsantre, kullanmadan önce seyreldin |
| Tween-20 ile Tris-Buffered Salin (TBST) | Hücre Sinyal Teknolojisi | 9997S | Purpose_Application: Zar yıkama ve antikor seyreltme Specifications_Comments: %0,1 Tween-20, pH 7,6 |
| CRISPR/Gen Düzenleme | |||
| Kalsiyum Fosfat Transfeksiyon Kiti | Promega | E1200 | Purpose_Application: Ambalaj hücrelerine DNA transfeksiyonu Specifications_Comments: Lentivirüs üretiminde yüksek transfeksiyon verimliliği |
| DNA Jel Çıkarma Kiti | Qiagen | 28706 | Purpose_Application: Dizileme için PCR ürün arıtma Specifications_Comments: Sütun tabanlı arıtma sistemi |
| GV371 Lentiviral Vektör | GeneChem Co., Ltd | GV371 | Purpose_Application: CRISPR/Cas9 ifadesi gen knockout için Specifications_Comments: Kullanıma hazır CRISPR/Cas9 lentiviral sistemi |
| HEK293T Hücre Hattı | ATCC | CRL-3216 | Purpose_Application: Lentiviral paketleme hücre hattı Specifications_Comments: Yüksek derecede transfekte edilebilir ambalaj hücre hattı |
| Sanger Dizileme Hizmeti | Macrogen Inc. | Töre | Purpose_Application: Knockout doğrulama ve hedef dışı analiz Specifications_Comments: Özel primerlerle standart dizileme |
| T7 Endonükleaz I | New England Biolabs | M0302S | Purpose_Application: CRISPR kesme verimliliği doğrulama Specifications_Comments: CRISPR doğrulaması için uyumsuzluğa özgü endonükleaz |
| ELISA & İmmünotestler | |||
| ELISA Plakaları (96 kuyulu, düz taban) | Corning | 3590 | Purpose_Application: ELISA substrat reaksiyonu Specifications_Comments: ELISA için yüksek bağlı, düz tabanlı |
| İnsan CLCF1 DuoSet ELISA | R& D Sistemleri | DY1234 | Purpose_Application: CLCF1 protein nicelenmesi (31.2-2000 pg/mL) Specifications_Comments: Tespit aralığı: 31.2-2000 pg/mL, CV & 10% |
| p24 ELISA Kiti (Lentiviral titre) | ZeptoMetrix Corporation | 801111 | Purpose_Application: Lentiviral titre belirleme Specifications_Comments: Lentiviral titre belirleme için (>10â ¸ TU/mL) |
| Fonksiyonel Testler | |||
| Alizarin Red S Boyama Kiti | Sigma-Aldrich | A5533 | Purpose_Application: Kalsiyum biriktirme görselleştirme Specifications_Comments: Distile suda %2 çözelti sıvı, pH 4.1-4.3 |
| Alkalin Fosfataz Aktivite Kiti | Abcam | ab83369 | Purpose_Application: ALP enzimatik aktivite ölçümü Specifications_Comments: Kolorimetrik test, 405 nm'de okundu |
| Askorbin Asit (L-Askorbin Asit) | Sigma-Aldrich | A4544 | Purpose_Application: Osteojenik ortam bileşeni Specifications_Comments: 50 & Icirc; ¼ g/mL nihai yoğunlaştırma |
| Setilpiridiniyum klorür | Sigma-Aldrich | C9002 | Purpose_Application: Nicel için Alizarin Red S ekstraksiyonu Specifications_Comments: boya ekstraksiyonu için %10 çözelti |
| Deksametazon | Sigma-Aldrich | D4902 | Purpose_Application: Osteojenik ortam bileşeni Specifications_Comments: 10 nM nihai konsantrasyon |
| Î ²-Glikerofosfat | Sigma-Aldrich | G9422 | Purpose_Application: Osteojenik ortam bileşeni Specifications_Comments: 10 mM nihai konsantrasyon |
| Osteojenik Farklılaşma Ortamı | PromoCell | C-28010 | Purpose_Application: Osteoblast farklılaşma indüksiyonu Specifications_Comments: Kullanıma hazır tam osteojenik ortam |
| Transwell Hücre Kültürü Insertleri (0.4 Î ¼ m) | Corning | 3470 | Purpose_Application: 0.4 ve Icirc ile birlikte kültür sistemi; ¼ m ayrıma Specifications_Comments: Polietilen tereftalat zarı, steril |
| Equipment - Ana Enstrümanlar | |||
| Santrifüj (Yüksek hızlı, soğutucu) | Eppendorf | 5430R | Purpose_Application: Numune işleme ve hücre ayrımı Specifications_Comments: Soğutulmuş, maksimum 30.000 x g |
| Kemilyünesans Görüntüleme Sistemi | Bio-Rad Laboratuvarları | 12003154 | Purpose_Application: Western Blot görüntüleme ve nicel Specifications_Comments: Jel dokümantasyonu ve Western blot görüntülemesi |
| CO2 Kuluçka Makinesi (Nemlenmiş) | Thermo Fisher Scientific | 51030287 | Purpose_Application: Hücre kültürünün korunması (37Â & derece; C, %5 CO2) Specifications_Comments: Üçlü gaz (CO2/O2/N2), nem kontrolü |
| Kalp Atış Hızı Monitörü (Göğüs Kemeri) | Polar Electro | H10 | Purpose_Application: Sürekli kalp atış hızı izleme Specifications_Comments: Bluetooth bağlantısı & Acirc; ± 1 bpm doğruluk |
| Hologic Discovery Bir DXA Tarayıcısı | Hologic Inc. | Keşif A | Purpose_Application: Kemik mineral yoğunluğu ölçümü Specifications_Comments: APEX yazılımı v4.5 ile günlük kalite kontrolü gereklidir |
| Mikroplaka Okuyucu (Çok modlu) | BioTek Instruments | Synergy H1 | Purpose_Application: ELISA plaka okuma ve soğurma ölçümü Specifications_Comments: UV-Vis, floresans, lüminesans algılama |
| Motorlu Koşu Bandı | Yaşam Fitness | 95Ti | Purpose_Application: Standart egzersiz müdahalesi Specifications_Comments: Değişken hız 0-16 km/s, %0-15 derece, |
| Gerçek zamanlı PCR Sistemi (CFX96 veya eşdeğeri) | Bio-Rad Laboratuvarları | 1855195 | Purpose_Application: Gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu ve tespiti Specifications_Comments: 96 kuyuklu blok, gradyan yeteneği |
| Yazılım & Analiz Araçları | |||
| APEX Software v4.5 (DXA Analizi) | Hologic Inc. | v4.5 | Purpose_Application: DXA tarama analizi ve BMD hesaplaması Specifications_Comments: Referans veritabanı ile BMD analizi |
| Bio-Rad CFX Maestro | Bio-Rad Laboratuvarları | CFX Maestro | Purpose_Application: qPCR veri analizi ve CT belirleme Specifications_Comments: Gerçek zamanlı PCR analizi ve veri ihracatı |
| GraphPad Prism v9.0 | GraphPad Yazılımı | v9.0 | Purpose_Application: İstatistiksel analiz ve grafik oluşturma Specifications_Comments: Grafik üretimiyle istatistiksel yazılım |
| ImageJ/Fiji v1.53 | Ulusal Sağlık Enstitüleri | v1.53 | Purpose_Application: Western Blot densitometrisi ve görüntü analizi Specifications_Comments: Ölçüm araçlarıyla görüntü analizi |
| Microsoft Excel 365 | Microsoft Corporation | 365 | Purpose_Application: Veri organizasyonu ve temel hesaplamalar Specifications_Comments: Veri organizasyonu ve temel istatistiksel fonksiyonlar |
| sarf malzemeleri & Plastik eşyalar< güçlü> | |||
| 1.5 mL Mikrosantrifüj Tüpleri | Eppendorf | 22363204 | Purpose_Application: Küçük hacimli numune depolama ve işleme Specifications_Comments: DNaz/RNase içerme, düşük bağlanma |
| 15 mL Konik Borular | Corning | 430766 | Purpose_Application: Orta hacimli örnek işleme Specifications_Comments: Polipropilen, dereceli, kapaklı |
| 24-Fine Hücre Kültür Plakaları | Corning | 3524 | Purpose_Application: Ortak kültür ve fonksiyonel test kurulumu Specifications_Comments: Doku kültürü işlenmiş, düz taban |
| 50 mL Konik Borular | Corning | 430829 | Purpose_Application: Büyük hacimli örnek toplama ve işleme Specifications_Comments: Polipropilen dereceli, kapaklı |
| Kryovialler (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | Purpose_Application: Uzun süreli hücre ve örnek depolama, -80Â & derece; C Specifications_Comments: Dış diş, O-ring contası, -196Â & derece; C dereceli |
| Pasteur Pipettes (Steril) | Fisher Scientific | 13-678-20A | Purpose_Application: Steril numune toplama ve transfer Specifications_Comments: Bireysel sarılmış, steril |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.