Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Postmenopozal Osteoporozda RANKL/OPG Kemik Koruma Mekanizmalarının Araştırılması için CLCF1 Egzersize Bağlı Myokin Protokolü

595 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69172

⸱

7 Kasım 2025

 ,  , 
1Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

Bu makalede

Özet

Bu makale, postmenopozal osteoporozda RANKL/OPG eksen modülasyonu yoluyla egzersize bağlı kemik koruma aracısı olarak kardiyotrofin benzeri sitokin faktör 1'in (CLCF1) araştırılması için kapsamlı bir protokol sunmaktadır.

Özet

Son çalışmalar, kardiyotrofin benzeri sitokin faktör 1'i (CLCF1), kas-iskelet sistemi yararlarına aracılık eden, ancak yaşla birlikte azalan, egzersize bağlı bir "gençlik molekülü" olarak tanımlamıştır. Bu protokol, CLCF1'in bağışıklık-kemik karışma mekanizmaları yoluyla egzersiz aracılı kemik korumasındaki düzenleyici rolünü araştırmak için sistematik bir yaklaşımı açıklamaktadır. Metodoloji, CLCF1'in nükleer faktör-κB ligandı (RANKL)/osteoprotegerin (OPG) sinyal ekseninin reseptör aktivatörü üzerindeki etkisini aydınlatmak için klinik numune analizini, moleküler karakterizasyon tekniklerini ve fonksiyonel analizleri kapsar. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), western blotlama, CRISPR/Cas9 gen düzenleme ve ko-kültür sistemleri aracılığıyla bu protokol, CLCF1'in STAT1 aracılı osteoklast inhibisyonu ve STAT3 aracılı osteoblast promosyonu yoluyla ikili kemik koruyucu etkilerini gösterir. Açıklanan yöntemler, CLCF1 ekspresyon paternlerinin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesini, kemik mineral yoğunluğu parametreleriyle korelasyon analizlerini ve potansiyel egzersiz-mimetik tedavi müdahalelerinin mekanik değerlendirmesini sağlar. Öncelikle osteoklastları hedef alan geleneksel antirezorptif tedavilerin aksine, CLCF1 bazlı müdahaleler, rezorpsiyonu inhibe ederken aynı anda kemik oluşumunu teşvik etme gibi benzersiz bir avantaj sunabilir. Bu protokol, araştırmacılara kemik metabolizmasının egzersize bağlı sitokin aracılı düzenlenmesini araştırmak için standartlaştırılmış prosedürler sağlar ve yaşa bağlı kemik bozuklukları için hedefe yönelik terapötik müdahalelerin geliştirilmesini kolaylaştırır.

Giriş

Postmenopozal osteoporoz (PMOP), bağışıklık sistemi düzensizliğinin patolojik kemik kaybını hızlandırdığı yaşa bağlı kas-iskelet sistemi düşüşünün paradigmatik bir örneğini temsil eder 1,2,3. Egzersiz, yaşa bağlı kemik bozulmasını önlemek için en etkili farmakolojik olmayan müdahale olarak yaygın olarak kabul edilse de, egzersize bağlı kemik korumasının altında yatan kesin moleküler mekanizmalar yakın zamana kadar belirsizliğini korumuştur4. Çağdaş kemik metabolizması anlayışı, iskelet homeostazını yöneten karmaşık osteoimmün etkileşimleri ve egzersize bağlı miyokinleri kapsayacak şekilde geleneksel endokrinolojik çerçevelerin ötesine geçmiştir5.

Kardiyotrofin benzeri sitokin faktör 1'in (CLCF1) yaşa bağlı kas-iskelet sistemi düşüşüyle mücadele eden egzersize bağlı bir faktör olarak yakın zamanda tanımlanması, kemik-kas karışmasının6 anlaşılmasında bir paradigma değişimini temsil etmektedir. Bu çığır açan keşif, egzersizin köklü kemik koruyucu etkilerini daha önce bilinmeyen bir moleküler mekanizma yoluyla açıklıyor ve CLCF1'i egzersize bağlı osteoanabolizmanın7 anahtar aracısı olarak konumlandırıyor. CLCF1'i aşırı eksprese eden transgenik fareler, vahşi tip kontrollere6 kıyasla gelişmiş kemik oluşumu, gelişmiş glikoz toleransı ve üstün fiziksel performans gösterdi, bu da CLCF1 takviyesinin hareketsiz veya hareket bozukluğu olan popülasyonlarda egzersiz faydalarını potansiyel olarak taklit edebileceğini düşündürdü.

Egzersiz taklitçisi tedavi, egzersize bağlı CLCF1 kinetiğini kopyalayan ve moleküler yollar 8 yoluyla fiziksel aktiviteye benzer terapötik faydalar sağlayan farmakolojik müdahaleler olaraktanımlanır. Alternatif olarak nörotrofin-1 (NNT-1) veya B hücresi uyarıcı faktör-3 (BSF-3) olarak adlandırılan kardiyotrofin benzeri sitokin faktörü 1 (CLCF1), interlökin-6 (IL-6) sitokin süper ailesine aittir ve pleiotropik biyolojik fonksiyonlar sergiler8. Başlangıçta spinal motor nöronların hayatta kalması ve gelişimindeki nörotrofik özellikleriyle karakterize edilen CLCF1'in egzersize bağlı bir miyokin olarak rolü, önemli bir araştırma alanı olarak ortaya çıkmıştır. Son klinik çalışmalar, CLCF1'i kemik sağlığı durumu için bir biyobelirteç olarak doğrulamış ve periferik kan mononükleer hücrelerindeki CLCF1 protein düzeylerinin, osteoporozlu postmenopozal kadınlarda sağlıklı kontrollere kıyasla önemli ölçüde azaldığını göstermiştir9. Bu çalışmalar, CLCF1 ekspresyonu ile birden fazla iskelet bölgesinde kemik mineral yoğunluğu arasında pozitif korelasyonlar gösterdi ve CLCF1 hedefli terapötik müdahalelerin translasyonel potansiyelini güçlendiren klinik doğrulama sağladı.

Sitokinler, çeşitli hücresel tepkileri düzenlemek için çözünür siliyer nörotrofik faktör reseptörleri (sCNTFR) ve sitokin reseptörü benzeri faktör-1 (CRLF-1) dahil olmak üzere heteromerik reseptör kompleksleri aracılığıyla çalışır10,11. Son mekanik çalışmalar, CLCF1'in aynı anda kemik erimesini inhibe ettiği ve kemik oluşumunu teşvik ettiğiikili sinyal paradigmasını aydınlatmıştır 2,6,7,9. Bu ikili etki, diferansiyel sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon (STAT) yolu aktivasyonunun aktivatörü yoluyla gerçekleşir: STAT1 fosforilasyonu, nükleer faktör-κB ligandı (RANKL) ile indüklenen nükleer faktör-κB (NF-κB) sinyalinin reseptör aktivatörüne müdahale ederek osteoklast baskılanmasına aracılık ederken, osteoblastlardaki STAT3 aktivasyonu, alkalin fosfataz ve osteokalsin dahil olmak üzere kemik oluşum belirteçlerinin ekspresyonunu destekler.

Akut egzersiz tepkilerinin kronik kemik adaptasyonlarına nasıl dönüştüğünü anlamak, terapötik gelişim için kritik olmaya devam etmektedir13. Tek egzersiz nöbetlerini takiben akut CLCF1 yükselmesi mekanik bilgiler sağlarken, haftalar veya aylar boyunca tekrarlanan akut yanıtlar, kümülatif sinyalleşme ve hücresel adaptasyonlar yoluyla sürekli kemik koruyucu etkilere yol açabilir14.

Osteoimmün patofizyolojide CLCF1'i araştırmanın mantığı, B-lenfosit regülasyonundaki yerleşik rolünden ve B hücrelerinin hem RANKL hem de osteoprotegerin (OPG)12,13'ün önemli üreticilerini oluşturduğunun tanınmasından kaynaklanmaktadır. Nükleer faktör-κB ligandı (RANKL)/osteoprotegerin (OPG) ekseninin reseptör aktivatörü, osteoklast farklılaşması ve kemik rezorpsiyonu için merkezi düzenleyici mekanizma görevi görür 14,15. Kemik yeniden şekillenme modülasyonu yoluyla iskelet homeostazı üzerinde düzenleyici kontrol gösteren diğer IL-6 ailesi üyelerinin aksine, CLCF1'in benzersiz ikili kemik koruyucu mekanizması üstün terapötik potansiyelsunar 16,17,18.

Bu protokolün mevcut metodolojilere göre avantajları arasında, CLCF1 aracılı kemik metabolizması düzenlemesine ilişkin translasyonel bilgiler sağlamak için hem klinik korelasyon analizini hem de mekanik hücresel çalışmaları birleştiren, egzersiz osteoimmün araştırmasına yönelik kapsamlı yaklaşımı yer almaktadır. Bu protokolün klinik önemi, CLCF1 düzeylerinin yaşam tarzı müdahaleleri yoluyla modüle edilebileceğine dair ortaya çıkan kanıtlarla daha da artırılmakta ve bu da onu yaşa bağlı kemik bozuklukları için uygulanabilir bir terapötik hedef olarak konumlandırmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol kurumsal araştırma etik kurulu tarafından onaylanmıştır (Protokol #2024-CHSD-0156) ve Helsinki Bildirgesi ilkelerine uygundur. Tüm hayvan prosedürleri, kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi yönergelerine (Protokol #2024-037) uygundur. Tüm katılımcılar yazılı bilgilendirilmiş onam verdi.

1. Klinik numune toplama ve egzersiz müdahalesi değerlendirmesi

  1. Katılımcı alımı ve egzersiz geçmişi değerlendirmesi
    1. Menopoz sonrası süresi en az 1 yıl olan 55-75 yaş arası menopoz sonrası kadınları işe alın.
    2. Standartlaştırılmış fiziksel aktivite anketlerini kullanarak son 6 aydaki fiziksel aktivitenin sıklığı, yoğunluğu, türü ve süresi dahil olmak üzere ayrıntılı egzersiz geçmişini değerlendirin.
    3. Katılımcıları, DSÖ egzersiz kılavuzlarına göre hareketsiz (haftada < 150 dakika), orta derecede aktif (haftada 150-300 dakika) ve oldukça aktif (haftada > 300 dakika) gruplara ayırın.
    4. İlaç incelemesi ve komorbidite taraması dahil olmak üzere kapsamlı tıbbi geçmiş değerlendirmesi ve fizik muayene yapın.
    5. APEX yazılımı v4.5 ile Hologic Discovery A dansitometresini kullanarak çift enerjili X-ışını absorpsiyometrisi (DXA) ölçümleri elde edin. Omurga fantomu ile günlük kalibrasyon yapın. Hastayı, Uluslararası Klinik Dansitometri Derneği (ISCD) yönergelerine göre bir konumlandırma bloğu üzerinde bacakları yüksekte olacak şekilde sırtüstü konumlandırın.
    6. Katılımcıları Dünya Sağlık Örgütü osteoporoz kriterlerine göre sınıflandırın (T-skoru ≤ -2.5 SD).
    7. Dışlama kriterlerini uygulayın: 12 ay içinde önceden anti-osteoporotik tedavi, immünosupresif tedaviler, metabolik kemik hastalıkları, sekonder osteoporoz veya egzersiz testine kontrendikasyonlar.
  2. Egzersize bağlı CLCF1 yanıt değerlendirmesi
    1. EDTA tüplerinde 8 saat gece aç kaldıktan sonra 00:10-00:12 saatleri arasında temel kan örneklerini toplayın.
    2. Standartlaştırılmış akut egzersiz protokolünü uygulayın: Maksimum kalp atış hızının %65-70'inde 45 dakika orta yoğunlukta yürüyüş. Karvonen formülünü (220 yaş) kullanarak maksimum kalp atış hızını hesaplayın19. Göğüs kemeri monitörü aracılığıyla sürekli kalp atış hızı izleme özelliğine sahip motorlu bir koşu bandında egzersiz yapın. Hedef kalp atış hızına ulaşmak için eğim ayarıyla yürüme hızını 3.5-4.5 km/s'de tutun.
    3. CLCF1 kinetiğini değerlendirmek ve tutarlı toplama koşullarını korumak için egzersiz sonrası kan örneklerini 1 saat, 4 saat ve 24 saat zaman noktalarında toplayın.
    4. Sonraki CLCF1 miktar tayini için serum alikotlarını -80 °C'de saklayın. 31.2-2000 pg / mL algılama aralığına sahip İnsan CLCF1 ELISA Kitini kullanın. Numuneleri tahlil seyrelticisinde 1:2 oranında seyreltin. 2 kat seri seyreltme kullanarak 7 noktalı standart bir eğri hazırlayın. Örnekleri iki kopya halinde çalıştırın. 540 nm dalga boyu düzeltmesi ile 450 nm'de plakaları okuyun. Kopyalar arasında %20'< varyasyon katsayısını (CV) kabul edin.
  3. Boyuna egzersiz müdahale protokolü
    1. Haftada üç seans ile 12 haftalık aşamalı bir egzersiz programı tasarlayın.
    2. CLCF1 yörünge analizi için başlangıçta, 4, 8 ve 12. haftalarda kan örnekleri toplayın.
    3. Başlangıç ve bitiş noktasında VO2 max testini kullanarak kondisyon iyileştirmelerini değerlendirin.
    4. CLCF1 değişikliklerini, 12 haftada DXA ile ölçülen KMY iyileşmeleri ile ilişkilendirin.
    5. Egzersiz toleransı ve toparlanma modelleri de dahil olmak üzere eğitim uyarlamalarını belgeleyin.

2. Geliştirilmiş periferik kan mononükleer hücre (PBMC) izolasyonu ve işlenmesi

  1. CLCF1 analizi için optimize edilmiş PBMC izolasyonu
    1. Steril koşullar altında EDTA içeren tüplerde (tüp başına 5 mL EDTA) 20 mL venöz kan örneği toplayın.
    2. Optimum hücre canlılığı ve CLCF1 ekspresyonunun korunması için numuneleri toplandıktan sonraki 2 saat içinde işleyin.
      1. Kan örneklerini oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin (PBS) ile 1:1 oranında seyreltin. 20 mL kanı 20 mL PBS ile karıştırın.
      2. 50 mL'lik konik tüplerde yoğunluk gradyan ortamı üzerinde seyreltilmiş kan tabakası. 20 mL seyreltilmiş kan başına 15 mL yoğunluk gradyan ortamı kullanın (1:1.33 oranı).
    3. 400 × g'da oda sıcaklığında 30 dakika frensiz santrifüjleyin.
    4. Steril bir Pasteur pipeti kullanarak plazma-Ficoll arayüzündeki PBMC katmanını dikkatlice aspire edin.
    5. Hücreleri, %2 fetal sığır serumu (FBS) içeren PBS ile 300 × g'da 10 dakika santrifüj ederek iki kez yıkayın.
  2. Hücre canlılığı değerlendirmesi ve CLCF1 temel ölçümü
    1. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak hücre canlılığını belirleyin (hedef> %95 canlılık)20.
    2. İzolasyondan hemen sonra temel hücre içi CLCF1 ekspresyonunu değerlendirin.
    3. Hücre konsantrasyonunu uygun ortamda 1 × 106 hücre/mL'ye ayarlayın.
    4. Hücreleri aşağı akış uygulamaları için tahsis edin veya sıvı nitrojende saklayın. PBMC'leri %90 FBS + %10 DMSO içeren dondurma ortamında dondurun. -1 °C/dk ile -80 °C arasında kontrollü hızda bir dondurma kabı kullanın. 1 mL alikotları (5 × 106 hücre/şişe) dondurarak saklama şişelerinde saklayın.

3. Kapsamlı kantitatif gen ekspresyonu analizi

  1. CLCF1'e özgü hususlarla RNA Ekstraksiyonu ve saflaştırma
    1. İzolasyondan sonraki 1 saat içinde 1 mL RNA lizis reaktifi içinde 10× 6 PBMC'yi öldürün.
    2. 200 μL kloroform ekleyin, kuvvetlice vorteks yapın ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
    3. Faz ayrımını sağlamak için 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüjleyin.
    4. Sulu fazı taze bir tüpe aktarın, eşit hacimde izopropanol ekleyin.
    5. RNA'yı 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüjleme yoluyla çökeltin.
    6. RNA peletini %75 etanol ile yıkayın, havayla kurutun ve nükleaz içermeyen suda çözün.
    7. Agaroz jel elektroforezi veya biyoanalizör (hedef RIN >7.0) kullanarak RNA bütünlüğünü değerlendirin.
  2. Güncellenmiş primer setleri ile ters transkripsiyon ve kantitatif PCR
    1. Spektrofotometrik analiz kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün (hedef A260/A280 oranı 1.8-2.2).
    2. Ters transkripsiyon reaktif kiti ile 1 μg toplam RNA kullanarak ters transkripsiyon gerçekleştirin.
    3. qPCR reaksiyonlarını hazırlayın: 10 μL Master Mix, her primerden 0,8 μL (10 μM stok, son 400 nM), 2 μL cDNA şablonu (50 ng), 6,4 μL nükleaz içermeyen su içeren 20 μL reaksiyonlar hazırlayın. Üçlü çalıştırın. Gerçek zamanlı bir PCR sistemi kullanın.
    4. Doğrulanmış primer dizilerini kullanın:
      1. CLCF1 ileri: 5'-CCTCCTGCTTCTTGCCTACC-3',
        ters: 5'-TGCCACCATGTTTGTTTCCT-3'
      2. CRLF1 ileri: 5'-TGAAGCTCATCCTGCAGTTC-3',
        ters: 5'-CAGCATCTCCTCCTTGATGC-3'
      3. STAT1 ileri: 5'-CAGCTTCAGCAGCTTGACTC-3',
        ters: 5'-AAGGTCAGCGATGTCTTCAG-3'
      4. STAT3 ileri: 5'-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3',
        ters: 5'-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3'
    5. qPCR protokolünü yürütün: 10 dakika boyunca 95 °C, ardından 15 saniye boyunca 95 °C'lik 40 döngü ve 1 dakika boyunca 60 °C.
    6. β-aktinnormalizasyonu 21 ile 2(-ΔΔCt) yöntemini kullanarak sonuçları analiz edin.
  3. Egzersiz-yanıt gen paneli analizi
    1. Egzersize duyarlı genleri dahil edin: IL-6, TNF-α, IL-1β, BDNF, IGF-1 ve miyostatin.
    2. Doğrulanmış primer dizilerini kullanın:
      1. IL-6 ileri: 5'-AGCCACTCACCTCTTCAGAAC-3',
        ters: 5'-GCCTCTTTGCTGCTTTCACAC-3';
      2. TNF-α ileri: 5'-CCCAGGGACCTCTCTCTAATC-3',
        ters: 5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3';
      3. IL-1β ileri: 5'-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3',
        ters: 5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3';
      4. BDNF ileri: 5'-TAACATGGCTGCGCGTGTGTGT-3',
        ters: 5'-CGAGTGGGTCACAGCGGCAG-3';
      5. IGF-1 ileri: 5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGTGGA-3',
        ters: 5'-GCCTCCTTAGATCACAGCTCC-3';
      6. Miyostatin ileri: 5'-AGTGACGGGCTCTTTGGAAGA-3',
        ters: 5'-GTTTCAGAGGCCGGTCAAGT-3'.
    3. CLCF1'deki egzersize bağlı değişiklikleri diğer miyokin ekspresyon modelleriyle ilişkilendirin.
    4. CLCF1/CRLF1 birlikte ekspresyon oranlarını fonksiyonel sitokin kompleksi oluşumunun göstergeleri olarak değerlendirin.

4. STAT yolu odaklı gelişmiş protein ekspresyonu analizi

  1. STAT analizi için protein ekstraksiyonu ve miktar tayini
    1. Proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteylleri ile desteklenmiş lizis tamponundaki (150 mM NaCl, %1 NP-40, %0.5 sodyum deoksikolat, %0.1 SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0) Lyse PBMC'leri.
    2. Kullanımdan hemen önce bazı spesifik fosfataz inhibitörleri ekleyin: sodyum ortovanadat (1 mM) ve sodyum florür (50 mM).
    3. Lizatları buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin ve her 10 dakikada bir orta hızda periyodik girdap yapın.
    4. Hücresel kalıntıları gidermek için 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüjleyin.
    5. Bradford tahlili veya BCA yöntemi22 kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.
    6. Protein konsantrasyonlarını bir numune tamponunda 2 μg/μL'ye ayarlayın ve western blot uygulamaları için daha fazla analize kadar -80 °C'de saklayın.
  2. STAT sinyal odaklı kapsamlı western blot analizi
    1. Standart akrilamid/bisakrilamid çözeltileri kullanarak 10 mL% 10 SDS-PAGE jelleri hazırlayın.
    2. Önceden boyanmış moleküler ağırlık belirteçlerinin yanı sıra şerit başına 20 μg protein yükleyin ve 90 dakika boyunca 120 V'ta çözün.
    3. Transfer tamponu (25 mM Tris, 192 mM glisin, %20 metanol) kullanarak proteinleri 4 °C'de 2 saat boyunca 100 V'ta PVDF membranlarına aktarın.
    4. Membranları %0.1 Tween-20 (TBST) ile Tris tamponlu salin içinde 50 mL %5 yağsız kuru süt ile bloke edin.
    5. Birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de inkübe edin: Anti-CLCF1 (1:1.000); CRLF1 karşıtı (1:1,000); Anti-OPG (1:1,000); RANKL karşıtı (1:1,000); JAK2 karşıtı (1:1,000); Anti-fosfo-JAK2 (Tyr1007/1008, 1:1.000); Anti-STAT1 (1:1,000); Anti-fosfo-STAT1 (Tyr701, 1:1.000); Anti-STAT3 (1:1,000); Anti-fosfo-STAT3 (Tyr705, 1:1.000); Anti-β-aktin (1:1.000)
    6. Membranları her biri 15 mL TBST ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca uygun ikincil antikorlarla inkübe edin.
    7. Gelişmiş kemilüminesans substratı kullanarak protein bantlarını tespit edin. Otomatik pozlama optimizasyonuna sahip kemilüminesans görüntüleme sistemini kullanan görüntü. ImageJ v1.53 jel analiz aracıyla dansitometrik analiz kullanarak ölçüm yapın.
  3. STAT1/STAT3 ikili yol analizi
    1. ImageJ/Fiji yazılım sürümü 1.54f'yi kullanarak fosfo-STAT1/toplam STAT1 ve fosfo-STAT3/toplam STAT3 oranlarını hesaplayın.
    2. CLCF1 fonksiyonel aktivitesinin göstergesi olarak STAT1/STAT3 aktivasyon dengesini değerlendirin.
    3. STAT aktivasyon modellerini RANKL/OPG ekspresyon oranlarıyla ilişkilendirin.
    4. CLCF1 tedavisinden 0, 15, 30, 60, 120 ve 240 dakika sonra Western blot yoluyla STAT1/STAT3 fosforilasyonunu değerlendirin. Dansitometri kullanarak fosfo-proteini toplam protein seviyelerine normalleştirin.

5. Doğrulama ile gelişmiş CRISPR/Cas9 aracılı gen nakavtı

  1. Geliştirilmiş lentiviral vektör yapısı
    1. CLCF1 gen dizisini hedefleyen tek kılavuzlu RNA (sgRNA) tasarlayın:
      TTGAAGTCTGGCTCGTTGAA-3'.
    2. Geliştirilmiş nakavt verimliliği için ek sgRNA dizileri ekleyin:
      GCTTGAACGAGCCAGACTTC-3'.
    3. Standart moleküler klonlama tekniklerini kullanarak sgRNA'ları lentiviral vektöre klonlayın.
    4. DNA dizileme analizi yoluyla yapı bütünlüğünü doğrulayın.
    5. T7 endonükleaz I tahlili23'ü kullanarak sgRNA kesme verimliliğini değerlendirin.
    6. İnhibitörler kullanılarak yol özgüllüğü doğrulamasını dahil edin: AG490 (JAK2, 50 μM), fludarabin (STAT1, 10 μM) ve Statik (STAT3, 5 μM).
    7. Yol gerekliliğini doğrulamak için yapısal olarak aktif STAT yapılarını kullanarak kurtarma deneyleri gerçekleştirin.
  2. Optimize edilmiş lentiviral transdüksiyon protokolü
    1. RPMI-1640 ortamında (500 mL) kültür Raji hücreleri, %10 FBS ile desteklenmiştir. Tüm hücre kültürlerini %5CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de tutun. Kültür ortamını kullanmadan önce en az 30 dakika önceden dengeleyin.
    2. Transdüksiyon verimliliğini artırmak için hücrelere polibren (8 μg/mL) ön işlemi uygulayın.
    3. Kalsiyum fosfat transfeksiyonu yoluyla ambalajlı HEK293T hücreleri ve zarf plazmitleri kullanarak lentivirüs üretin. Titreyi p24 ELISA ile belirleyin (> 108 TU/mL gereklidir). BSL-2 muhafaza prosedürleriniizleyin 23.
    4. Hücreleri lentivirüs ile 100 enfeksiyon çokluğunda (MOI) dönüştürün. Transdüksiyondan 24 saat sonra ortamı değiştirin. 7 gün boyunca puromisin (4 μg/mL) kullanarak dönüştürülmüş hücreleri seçin, ardından aşağıdaki PCR koşullarını kullanarak hedef bölgeyi kapsayan 500 bp'lik bir bölgeyi amplifiye edin: 95 °C'de 3 dakika boyunca ilk denatürasyon, ardından 30 saniye boyunca 95 °C'de 35 döngü denatürasyon, 60 °C'de 30 saniye tavlama ve 72 °C'de 30 saniye uzatma, 72 °C'de 5 dakika boyunca son bir uzatma ile. T7 endonükleaz tahlili için, PCR ürünlerini denatüre edin ve yeniden tavlayın, 37 ° C'de 30 dakika boyunca T7E1 endonükleaz ile sindirin, ardından ürünleri% 2'lik bir agaroz jel üzerinde analiz edin.
    5. Western blotlama ve Sanger dizilimi24,25 yoluyla gen nakavt etkinliğini doğrulayın.
    6. GUIDE-seq veya benzer bir metodoloji kullanarak hedef dışı analiz gerçekleştirin26.
      NOT: Son kanıtlar, CLCF1 sekresyon etkinliğinin CRLF1 şaperon proteini ile birlikte ekspresyon gerektirdiğini göstermektedir. Tam fonksiyonel ablasyon27 için ikili nakavt yaklaşımlarını düşünün.

6. Egzersiz taklitçileri ile kapsamlı ortak kültür sistemi

NOT: Translasyonel doğrulama için, 4 hafta boyunca günde 10 μg / kg ip'de rhCLCF1 uygulayarak yumurtalıklı fare modellerine uyum sağlayın ve BMD'yi mikro-BT ile değerlendirin.

  1. Gelişmiş Raji-MG-63 ortak kültür kurulumu
    1. MG-63 osteoblast benzeri hücreleri, 24 oyuklu plaka alt odalarında, 2 × 104 hücre/kuyu yoğunluğunda, 37 °C'de %5CO2 ve %95 nem ile nemlendirilmiş bir inkübatörde tohumlayın. Kullanmadan önce ortamı inkübatörde 30 dakika önceden dengeleyin. Gelişmiş çeviri için, ticari kaynaklardan birincil insan osteoblastları (yoğunluk 1 × 104/kuyu) ile değiştirin.
    2. MG-63 hücreleri içeren kuyucuklara 0,4 μm gözenek boyutunda membran ekleri yerleştirin.
    3. Tohum Raji hücreleri (vahşi tip, CLCF1-nakavt veya CLCF1-aşırı ekspresyon) üst odacıklarda 1 × 105 hücre/kuyu yoğunluğunda.
    4. Ko-kültürleri tam RPMI-1640 ortamında (alt bölmede 2 mL, üst bölmede 1.5 mL) belirtilen deney periyotları (7, 14, 21 gün) 37 °C'de %5 CO ilekoruyun2.
    5. Doz-yanıt ilişkilerini değerlendirmek için rekombinant CLCF1 (5-10 ng/mL) tedavi gruplarını dahil edin.
  2. Egzersiz-mimetik CLCF1 tedavi protokolü
    1. Ko-kültür sistemlerini, egzersize bağlı seviyelere göre fizyolojik rekombinant CLCF1 konsantrasyonları (5-10 ng / mL) ile tedavi edin.
    2. Pulsatil CLCF1 tedavi rejimini uygulayın: CLCF1'i 1. günde 0, 8 ve 16 saatte 2 saatlik darbeler için uygulayın, ardından 24 saat boyunca sürekli maruz bırakın, ardından döngüyü tekrarlayın. Toplam tedavi süresi: 9 toplam atım ile 7 gün.
    3. Tedaviye bağlı etkileri tedaviden 1 saat, 4 saat, 24 saat ve 7 gün sonra değerlendirin.
    4. Her iki hücre popülasyonunda STAT1/STAT3 fosforilasyon kinetiğini Western blot yoluyla 0, 15, 30, 60 dakikada izleyin. İnhibitörlerle tampon (500 μL) içindeki liz hücreleri, toplam STAT1/3 ve β-aktine normalleşir.
  3. Gelişmiş osteojenik farklılaşma değerlendirmesi
    1. Askorbik asit (50 μg/mL), β-gliserofosfat (10 mM) ve deksametazon (10 nM) içeren standart osteojenik ortam kullanarak osteojenik farklılaşmayı indükleyin. Her 3 günde bir osteojenik ortamı değiştirin (2 mL alt odacık, 1.5 mL üst odacık). Her değişiklik için taze askorbik asit çözeltisi hazırlayın; β-gliserofosfat ve deksametazon stabil kalır.
    2. 7, 14 ve 21. günlerde kolorimetrik enzim tahlili kullanarak alkalin fosfataz (ALP) aktivitesini değerlendirin28. 500 μL ekstraksiyon hacmi kullanın. 405 nm'de okuyun. Toplam protein içeriğine normalleştirin. Beklenen renk aralığı: açık sarı (düşük) ila koyu sarı (yüksek).
    3. 21. günde Alizarin Red S boyama ve miktar tayini yoluyla kalsiyum birikimini değerlendirin. 540 nm'de okunan 500 μL setilpiridinyum klorür içeren ekstrakt, beklenen renk aralığı: açık pembe (düşük mineralizasyon) ila koyu kırmızı (yüksek mineralizasyon).
    4. Setilpiridinyum klorür ekstraksiyonundan sonra 540 nm'de absorbansı ölçerek mineralizasyonu ölçün.
    5. Osteojenik gen ekspresyonunu analiz edin: RUNX2, ALP, COL1A1, OCN ve OPG, adım 3.2'de açıklanan qPCR protokollerini kullanarak.
    6. Osteoklastla ilgili belirteçleri değerlendirin: MG-63 hücrelerinde TRAP, katepsin K ve RANKL.

7. Gelişmiş istatistiksel analiz ve veri yorumlama

  1. Kapsamlı istatistiksel metodoloji
    1. Tüm sürekli değişkenler için Shapiro-Wilk testini kullanarak normallik testi gerçekleştirin29. Normallik varsayımları ihlal edildiğinde parametrik olmayan testler kullanın (p < 0.05).
    2. Gruplar arasında parametrik olmayan karşılaştırmalar için Mann-Whitney U testi uygulanır30.
    3. CLCF1 seviyeleri ve klinik parametreler arasındaki ilişki çalışmaları için Spearman korelasyon analizi yapın31.
    4. KMY'nin bağımsız belirleyicilerini değerlendirmek için çoklu regresyon analizi yapın.
    5. Egzersiz müdahalesi zaman seyri analizi için tekrarlanan ölçümler ANOVA'yı kullanın32.
    6. Çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni düzeltmesini uygulayın33.
    7. Tüm analizler için istatistiksel anlamlılık eşiğini p < 0.05 olarak ayarlayın.
  2. Gelişmiş veri sunumu ve analizi
    1. Sürekli verileri ortalama ± standart sapma veya çeyrekler arası aralıkla medyan olarak sunun.
    2. İstatistikler için GraphPad Prism v9'u, dansitometri için ImageJ v1.53'ü kullanarak CLCF1 ekspresyonu ile BMD, lenfosit sayıları ve egzersiz parametreleri için korelasyon grafikleri oluşturun. Özel komut dosyalarına gerek yoktur. Prism'in yerleşik aracı aracılığıyla ROC oluşturun; Prism'de Spearman aracılığıyla korelasyonlar.
    3. Egzersize bağlı CLCF1 yanıt kinetiği için zaman kursu grafikleri oluşturun.
    4. Osteoporoz biyobelirteci olarak CLCF1 için alıcı çalışma karakteristiği (ROC) eğrileri geliştirin.
      NOT: Temsili western blot görüntüleri kantitatif dansitometrik analiz kullanılarak oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolün uygulanması, CLCF1'in çoklu deneysel yaklaşımlar kullanarak immün aracılı kemik metabolizmasındaki düzenleyici rolünü başarıyla göstermektedir. Klinik doğrulama çalışmaları, Şekil 1A'da gösterildiği gibi, PMOP hastalarında sağlıklı kontrollere kıyasla CLCF1 ekspresyonunun önemli ölçüde aşağı regülasyonunu göstermektedir, periferik kan mononükleer hücrelerinin kantitatif PCR analizi, PMOP grubunda nispi CLCF1 mRN...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan protokol, RANKL/OPG ekseninin sistematik bir analizi yoluyla CLCF1'in egzersize bağlı kemik koruma aracısı olarak rolünü araştırmak için kapsamlı bir metodolojik çerçeve sağlar. Son zamanlarda çığır açan araştırmalar, CLCF1'i yaşa bağlı kas-iskelet sistemi düşüşüyle mücadele eden egzersize bağlı bir faktör olarak tanımlamış ve onu egzersize bağlı kemik korumasının merkezi bir aracısı olarak konumlandırmıştır 34,35,36.<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, bu çalışma için gönüllü olan katılımcılara ve Shandong Birinci Tıp Üniversitesi'ne Bağlı Merkez Hastanedeki klinik personele hasta alımı ve numune toplama konusundaki yardımlarından dolayı teşekkür eder. Hücre kültürü ve moleküler biyoloji deneylerine verdikleri destek için laboratuvar teknisyenlerine teşekkür ederiz. H.Z. çalışmayı tasarladı ve tasarladı, deneyleri gerçekleştirdi, verileri analiz etti ve makaleyi yazdı. H.L. deneysel tasarıma, veri toplamaya ve el yazması revizyonuna katkıda bulundu. Y.S. projeyi denetledi, eleştirel geri bildirim sağladı ve taslağı düzenledi. Tüm yazarlar nihai makaleyi incelendi ve gönderilmek üzere onayladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücre Kültürü Medya & Reaktifler
Dimetil Sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD2650Purpose_Application:  Kriyokoruma ortamı bileşeni
Specifications_Comments: Moleküler biyoloji derecesi, steril filtrelenmiş
DMEM ortamıThermo Fisher Scientific11965092Purpose_Application:  MG-63 osteoblast kültür ortamı
Specifications_Comments: L-glutamin içeren yüksek glikoz formülasyonu
Fetal Sığır Serumu (FBS)Thermo Fisher Scientific16000044Purpose_Application:  Hücre kültürü takviyesi (ısıyla inaktive edilmiş)
Specifications_Comments: 56Â'de ısıyla inaktive edilmiş; & derece; C 30 dakika
Penisillin-StreptomisinThermo Fisher Scientific15140122Purpose_Application:  Steril kültür için antibiyotik takviyesi
Specifications_Comments: 100X stok, nihai konsantrasyon %1
Polibren (Heksadimethrin bromid)Santa Cruz BiyoteknolojisiSC-134220Purpose_Application:  Lentiviral transduksiyon güçlendirici
Specifications_Comments: 8 & Icirc; ¼ g/mL çalışma yoğunluğu
Puromisin dihidroklorürInvivoGenANT-PR-1Purpose_Application:  Transdüksiyon edilen hücreler için seçici antibiyotik
Specifications_Comments: 4 & Icirc; ¼ 7 gün boyunca g/mL seçim yoğunluğu
RPMI-1640 ortaThermo Fisher Scientific11875093Purpose_Application:  Raji B-lenfosit kültür ortamı
Specifications_Comments: L-glutamin içeren, fenol kırmızısı tercih edilir
Trypan Blue ÇözümüThermo Fisher Scientific15250061Purpose_Application:  Hücre canlılığı değerlendirmesi
Specifications_Comments: Dışlama testi için %0,4 çözüm
Kontrollü Hızlı Dondurma KonteyneriThermo Fisher Scientific5100-0001Purpose_Application:  Kontrollü hücre dondurma (-1Â & derece; C/min)
Specifications_Comments: Mr. Frosty veya -1Â için eşdeğeri; & derece; C/min soğutma
EDTA Kan Toplama TüpleriBD Biosciences366643Purpose_Application:  Antikoagülant
Specifications_Comments ile venöz kan toplama: 10-20 mL kapasiteli, mor üst tüpler
Ficoll-Paque PLUS yoğunluk gradyentiCytiva (GE Healthcare)17144003Purpose_Application:  PBMC izolasyonu yoğunluk santrifüjasyonu
Specifications_Comments: Steril, endotoksin testli hücre ayrımı için
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)Thermo Fisher Scientific14190144Purpose_Application:  Hücre yıkama ve seyreltme tamponu
Specifications_Comments: Steril, hücre kültürü derecesinde
RNA Çıkarımı & qPCR
Kloroform (ACS Sınıfı)Sigma-AldrichC2432Purpose_Application:  RNA ekstraksiyonunda faz ayrımı
Specifications_Comments: ACS reaktif derecesi, â ‰ ¥ %99 saflık
Etanol (%75, moleküler kalitede)Sigma-AldrichE7023Purpose_Application:  RNA pelet yıkama
Specifications_Comments: Moleküler biyoloji derecesi, taze hazırla
İzopropanol (moleküler derece)Sigma-AldrichI9516Purpose_Application:  RNA çökelmesi
Specifications_Comments: Moleküler biyoloji derecesi, & acirc; ‰ ¥ %99,5 saflık
Nükleazsız SuThermo Fisher ScientificAM9930Purpose_Application:  PCR reaksiyon hazırlığı
Specifications_Comments: DNaz/RNase içermemiş, PCR uygulamaları için test edilmiştir
Optik Yapıştırıcı FilmThermo Fisher Scientific4311971Purpose_Application:  qPCR plakaları için optik mühürleme
Specifications_Comments: qPCR uygulamaları için optik kalite
PCR Plakaları (96 kuyusu)Thermo Fisher ScientificN8010560Purpose_Application:  Yüksek verimlilikli qPCR
Specifications_Comments için 96-kuyu formatı: Optik algılama için beyaz, şeffaf taban
PCR Tüp ŞeritleriThermo Fisher ScientificAB0451Purpose_Application:  Küçük hacimli PCR reaksiyonları
Specifications_Comments: Bireysel kapaklı 8 tüplü şeritler
PrimeScript RT Reagent KitTakara BiyografisiRR037APurpose_Application:  RNA'nın cDNA
Specifications_Comments'a ters transkripsiyonu: genomik DNA çıkarımı için gDNA Silgisi ile
SYBR Yeşil Ana KarışımıUygulamalı Biyosistemler4309155Purpose_Application:  Gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu ve tespiti
Specifications_Comments: Normalizasyon için ROX referans boyası ile
TRIzol Reaktifi (RNA Lizi)Thermo Fisher Scientific15596026Purpose_Application:  Hücre lizisi ve RNA ekstraksiyonu
Specifications_Comments: 4Â'te depola; & derece; C, 6 ay içinde kullanın
Protein Analizi - Western Blot
Akrilamid/Bis-akrilamid (29:1)Bio-Rad1610146Purpose_Application:  SDS-PAGE jel polimerizasyonu
Specifications_Comments: %30 akrilamid stok çözeltisi
BCA Protein Test KitiThermo Fisher Scientific23225Purpose_Application:  Protein konsantrasyonu niceliklendirme
Specifications_Comments: Doğru nicelendirme için indirgenç uyumlulukla
Gelişmiş Kemilyünesans (ECL) SubstratıThermo Fisher Scientific32106Purpose_Application:  Kemilyünesan protein tespiti
Specifications_Comments: Femtogram hassasiyet tespiti
Yağsız Kuru SütLaboratuvar Bilimsel170-6404Purpose_Application:  Western blot engelleme ajanı
Specifications_Comments: Engelleme derecesi, düşük arka plan
Fosfataz İnhibitörü KokteyliRoche Uygulamalı Bilimler4906845001Purpose_Application:  Protein defosforilasyonunu önleme
Specifications_Comments: Okadaik asit ve kalikülin A içerir
Prestained Protein MerdiveniBio-Rad1610394Purpose_Application:  Moleküler ağırlık referans standartları
Specifications_Comments: 10-250 kDa aralığında 11 bant ile
Proteaz İnhibitörü KokteyliRoche Uygulamalı Bilimler11697498001Purpose_Application:  Lizi
Specifications_Comments sırasında protein bozulmasını önleme: Metal bağımlı fosfatazlar için EDTA-dan bağımsız
PVDF Zarları (0.45 & Icirc; ¼ m)Millipore SigmaIPVH00010Purpose_Application:  Protein transfer zarı (0.45 & Icirc; ¼ m gözenek)
Specifications_Comments: Düşük floresans arka plan
RIPA Liz TamponuHücre Sinyal Teknolojisi9806SPurpose_Application:  Tam hücre protein ekstraksiyonu
Specifications_Comments: Deterjanlı kullanıma hazır lizis tamponu
Örnek Yükleme Tamponu (4X)Bio-Rad1610747Purpose_Application:  SDS-PAGE
Specifications_Comments için protein örneği hazırlanması: Î ile boya yüklenmesi; ²-merkaptoetanol
SDS-PAGE Çalıştırma TamponuBio-Rad1610732Purpose_Application:  Protein elektroforezi
Specifications_Comments: Tris-glisin-SDS tampon sistemi
Sodyum FlorürSigma-Aldrich201154Purpose_Application:  Ek fosfataz inhibisyonu
Specifications_Comments: 50 mM çalışma yoğunluğu
Sodyum OrtovanadatSigma-AldrichS6508Purpose_Application:  JAK2/STAT fosforilasyon koruma
Specifications_Comments: 1 mM çalışma konsantrasyonu, taze hazırlanın
Transfer Tamponu KonsantreBio-Rad1704156Purpose_Application:  Yarı kuru protein transferi
Specifications_Comments: 10X konsantre, kullanmadan önce seyreldin
Tween-20 ile Tris-Buffered Salin (TBST)Hücre Sinyal Teknolojisi9997SPurpose_Application:  Zar yıkama ve antikor seyreltme
Specifications_Comments: %0,1 Tween-20, pH 7,6
CRISPR/Gen Düzenleme
Kalsiyum Fosfat Transfeksiyon KitiPromegaE1200Purpose_Application:  Ambalaj hücrelerine DNA transfeksiyonu
Specifications_Comments: Lentivirüs üretiminde yüksek transfeksiyon verimliliği
DNA Jel Çıkarma KitiQiagen28706Purpose_Application:  Dizileme için PCR ürün arıtma
Specifications_Comments: Sütun tabanlı arıtma sistemi
GV371 Lentiviral VektörGeneChem Co., LtdGV371Purpose_Application:  CRISPR/Cas9 ifadesi gen knockout için
Specifications_Comments: Kullanıma hazır CRISPR/Cas9 lentiviral sistemi
HEK293T Hücre HattıATCCCRL-3216Purpose_Application:  Lentiviral paketleme hücre hattı
Specifications_Comments: Yüksek derecede transfekte edilebilir ambalaj hücre hattı
Sanger Dizileme HizmetiMacrogen Inc.TörePurpose_Application:  Knockout doğrulama ve hedef dışı analiz
Specifications_Comments: Özel primerlerle standart dizileme
T7 Endonükleaz INew England BiolabsM0302SPurpose_Application:  CRISPR kesme verimliliği doğrulama
Specifications_Comments: CRISPR doğrulaması için uyumsuzluğa özgü endonükleaz
ELISA & İmmünotestler
ELISA Plakaları (96 kuyulu, düz taban)Corning3590Purpose_Application:  ELISA substrat reaksiyonu
Specifications_Comments: ELISA için yüksek bağlı, düz tabanlı
İnsan CLCF1 DuoSet ELISAR& D SistemleriDY1234Purpose_Application:  CLCF1 protein nicelenmesi (31.2-2000 pg/mL)
Specifications_Comments: Tespit aralığı: 31.2-2000 pg/mL, CV & 10%
p24 ELISA Kiti (Lentiviral titre)ZeptoMetrix Corporation801111Purpose_Application:  Lentiviral titre belirleme
Specifications_Comments: Lentiviral titre belirleme için (>10â ¸ TU/mL)
Fonksiyonel Testler
Alizarin Red S Boyama KitiSigma-AldrichA5533Purpose_Application:  Kalsiyum biriktirme görselleştirme
Specifications_Comments: Distile suda %2 çözelti sıvı, pH 4.1-4.3
Alkalin Fosfataz Aktivite KitiAbcamab83369Purpose_Application:  ALP enzimatik aktivite ölçümü
Specifications_Comments: Kolorimetrik test, 405 nm'de okundu
Askorbin Asit (L-Askorbin Asit)Sigma-AldrichA4544Purpose_Application:  Osteojenik ortam bileşeni
Specifications_Comments: 50 & Icirc; ¼ g/mL nihai yoğunlaştırma
Setilpiridiniyum klorürSigma-AldrichC9002Purpose_Application:  Nicel için Alizarin Red S ekstraksiyonu
Specifications_Comments: boya ekstraksiyonu için %10 çözelti
DeksametazonSigma-AldrichD4902Purpose_Application:  Osteojenik ortam bileşeni
Specifications_Comments: 10 nM nihai konsantrasyon
Î ²-GlikerofosfatSigma-AldrichG9422Purpose_Application:  Osteojenik ortam bileşeni
Specifications_Comments: 10 mM nihai konsantrasyon
Osteojenik Farklılaşma OrtamıPromoCellC-28010Purpose_Application:  Osteoblast farklılaşma indüksiyonu
Specifications_Comments: Kullanıma hazır tam osteojenik ortam
Transwell Hücre Kültürü Insertleri (0.4 Î ¼ m)Corning3470Purpose_Application:  0.4 ve Icirc ile birlikte kültür sistemi; ¼ m ayrıma
Specifications_Comments: Polietilen tereftalat zarı, steril
Equipment - Ana Enstrümanlar
Santrifüj (Yüksek hızlı, soğutucu)Eppendorf5430RPurpose_Application:  Numune işleme ve hücre ayrımı
Specifications_Comments: Soğutulmuş, maksimum 30.000 x g
Kemilyünesans Görüntüleme SistemiBio-Rad Laboratuvarları12003154Purpose_Application:  Western Blot görüntüleme ve nicel
Specifications_Comments: Jel dokümantasyonu ve Western blot görüntülemesi
CO2 Kuluçka Makinesi (Nemlenmiş)Thermo Fisher Scientific51030287Purpose_Application:  Hücre kültürünün korunması (37Â & derece; C, %5 CO2)
Specifications_Comments: Üçlü gaz (CO2/O2/N2), nem kontrolü
Kalp Atış Hızı Monitörü (Göğüs Kemeri)Polar ElectroH10Purpose_Application:  Sürekli kalp atış hızı izleme
Specifications_Comments: Bluetooth bağlantısı & Acirc; ± 1 bpm doğruluk
Hologic Discovery Bir DXA TarayıcısıHologic Inc.Keşif APurpose_Application:  Kemik mineral yoğunluğu ölçümü
Specifications_Comments: APEX yazılımı v4.5 ile günlük kalite kontrolü gereklidir
Mikroplaka Okuyucu (Çok modlu)BioTek InstrumentsSynergy H1Purpose_Application:  ELISA plaka okuma ve soğurma ölçümü
Specifications_Comments: UV-Vis, floresans, lüminesans algılama
Motorlu Koşu BandıYaşam Fitness95TiPurpose_Application:  Standart egzersiz müdahalesi
Specifications_Comments: Değişken hız 0-16 km/s, %0-15 derece,
Gerçek zamanlı PCR Sistemi (CFX96 veya eşdeğeri)Bio-Rad Laboratuvarları1855195Purpose_Application:  Gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu ve tespiti
Specifications_Comments: 96 kuyuklu blok, gradyan yeteneği
Yazılım & Analiz Araçları
APEX Software v4.5 (DXA Analizi)Hologic Inc.v4.5Purpose_Application:  DXA tarama analizi ve BMD hesaplaması
Specifications_Comments: Referans veritabanı ile BMD analizi
Bio-Rad CFX MaestroBio-Rad LaboratuvarlarıCFX MaestroPurpose_Application:  qPCR veri analizi ve CT belirleme
Specifications_Comments: Gerçek zamanlı PCR analizi ve veri ihracatı
GraphPad Prism v9.0GraphPad Yazılımıv9.0Purpose_Application:  İstatistiksel analiz ve grafik oluşturma
Specifications_Comments: Grafik üretimiyle istatistiksel yazılım
ImageJ/Fiji v1.53Ulusal Sağlık Enstitüleriv1.53Purpose_Application:  Western Blot densitometrisi ve görüntü analizi
Specifications_Comments: Ölçüm araçlarıyla görüntü analizi
Microsoft Excel 365Microsoft Corporation365Purpose_Application:  Veri organizasyonu ve temel hesaplamalar
Specifications_Comments: Veri organizasyonu ve temel istatistiksel fonksiyonlar
sarf malzemeleri & Plastik eşyalar< güçlü>
1.5 mL Mikrosantrifüj TüpleriEppendorf22363204Purpose_Application:  Küçük hacimli numune depolama ve işleme
Specifications_Comments: DNaz/RNase içerme, düşük bağlanma
15 mL Konik BorularCorning430766Purpose_Application:  Orta hacimli örnek işleme
Specifications_Comments: Polipropilen, dereceli, kapaklı
24-Fine Hücre Kültür PlakalarıCorning3524Purpose_Application:  Ortak kültür ve fonksiyonel test kurulumu
Specifications_Comments: Doku kültürü işlenmiş, düz taban
50 mL Konik BorularCorning430829Purpose_Application:  Büyük hacimli örnek toplama ve işleme
Specifications_Comments: Polipropilen dereceli, kapaklı
Kryovialler (1 mL)Thermo Fisher Scientific375418Purpose_Application:  Uzun süreli hücre ve örnek depolama, -80Â & derece; C
Specifications_Comments: Dış diş, O-ring contası, -196Â & derece; C dereceli
Pasteur Pipettes (Steril)Fisher Scientific13-678-20APurpose_Application:  Steril numune toplama ve transfer
Specifications_Comments: Bireysel sarılmış, steril

Kaynaklar

  1. Rachner, T. D., Khosla, S., Hofbauer, L. C. Osteoporosis: now and the future. Lancet. 377 (9773), 1276-1287 (2011).
  2. Chen, X., et al. Association of cardiotrophin-like cytokine factor 1 levels in peripheral blood mononuclear cells with bone mineral density and osteoporosis in postmenopausal women. BMC Musculoskelet Disord. 22 (1), 62(2021).
  3. Ilesanmi-Oyelere, B. L., et al. Inflammatory markers and bone health in postmenopausal women: a cross-sectional overview. Immun Ageing. 16, 15(2019).
  4. Ahn, N., Kim, K. Effects of 12-week exercise training on osteocalcin, high-sensitivity C-reactive protein concentrations, and insulin resistance in elderly females with osteoporosis. J Phys Ther Sci. 28 (8), 2227-2231 (2016).
  5. Graves, D. T., Li, J., Cochran, D. L. Inflammation and uncoupling as mechanisms of periodontal bone loss. J Dent Res. 90 (2), 143-153 (2011).
  6. Kang, J. S., et al. Exercise-induced CLCF1 attenuates age-related muscle and bone decline in mice. Nat Commun. 16 (1), 4743(2025).
  7. Sims, N. A. Cardiotrophin-like cytokine factor 1 (CLCF1) and neuropoietin (NP) signalling and their roles in development, adulthood, cancer and degenerative disorders. Cytokine Growth Factor Rev. 26 (5), 517-522 (2015).
  8. Oliveira, M. C., Vullings, J., van de Loo, F. A. J. Osteoporosis and osteoarthritis are two sides of the same coin paid for obesity. Nutrition. 70, 110486(2020).
  9. Yokota, S., et al. Cardiotrophin-like cytokine factor 1 alleviates bone loss in osteoporosis mouse models by suppressing osteoclast differentiation through activating interferon signaling and repressing the nuclear factor-κB signaling pathway. Bone. 153, 116140(2021).
  10. Ponzetti, M., Rucci, N. Updates on osteoimmunology: what's new on the cross-talk between bone and immune system. Front Endocrinol (Lausanne). 10, 236(2019).
  11. Larsen, J. V., et al. Cytokine-like factor 1, an essential facilitator of cardiotrophin-like cytokine:ciliary neurotrophic factor receptor α signaling and sorLA-mediated turnover. Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).
  12. de Vries, T. J., et al. What are the peripheral blood determinants for increased osteoclast formation in the various inflammatory diseases associated with bone loss. Front Immunol. 10, 505(2019).
  13. Weitzmann, M. N. The role of inflammatory cytokines, the RANKL/OPG axis, and the immunoskeletal interface in physiological bone turnover and osteoporosis. Scientifica (Cairo). 2013, 125705(2013).
  14. Srivastava, R. K., Dar, H. Y., Mishra, P. K. Immunoporosis: immunology of osteoporosis-role of T cells. Front Immunol. 9, 657(2018).
  15. Ming, J., Cronin, S. J. F., Penninger, J. M. Targeting the RANKL/RANK/OPG axis for cancer therapy. Front Oncol. 10, 1283(2020).
  16. Sobacchi, C., Menale, C., Villa, A. The RANKL-RANK axis: a bone to thymus round trip. Front Immunol. 10, 629(2019).
  17. Wang, T., He, C. TNF-α and IL-6: the link between immune and bone system. Curr Drug Targets. 21 (3), 213-227 (2020).
  18. Jones, S. A., Jenkins, B. J. Recent insights into targeting the IL-6 cytokine family in inflammatory diseases and cancer. Nat Rev Immunol. 18 (12), 773-789 (2018).
  19. Villafaina, S., Biehl-Printes, C., Parraca, J. A., de Oliveira Brauner, F., Tomas-Carus, P. What mathematical models are accurate for prescribing aerobic exercise in women with fibromyalgia. Biology (Basel). 11 (5), 704(2022).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  21. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(−ΔΔC(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  22. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (4), 102269(2020).
  23. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Sci Rep. 8 (1), 888(2018).
  24. Mousavi Kahaki, S. A., Ebrahimzadeh, N., Fahimi, H., Moshiri, A. Development of an optimized protocol for generating knockout cancer cell lines using the CRISPR/Cas9 system, with emphasis on transient transfection. PLoS One. 19 (11), e0310368(2024).
  25. Eren, K., Taktakoğlu, N., Pirim, I. DNA sequencing methods: from past to present. Eurasian J Med. 54 (Suppl1), 47-56 (2022).
  26. Wienert, B., Wyman, S. K., Yeh, C. D., Conklin, B. R., Corn, J. E. CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq. Nat Protoc. 15 (5), 1775-1799 (2020).
  27. Crisponi, L., Buers, I., Rutsch, F. CRLF1 and CLCF1 in development, health and disease. Int J Mol Sci. 23 (2), 992(2022).
  28. Ansari, S., Ito, K., Hofmann, S. Alkaline phosphatase activity of serum affects osteogenic differentiation cultures. ACS Omega. 7 (15), 12724-12733 (2022).
  29. Ghasemi, A., Zahediasl, S. Normality tests for statistical analysis: a guide for non-statisticians. Int J Endocrinol Metab. 10 (2), 486-489 (2012).
  30. Rousseaux, C. G., Gad, S. C. Haschek and Rousseaux's handbook of toxicologic pathology. , 3rd ed, Academic Press. (2013).
  31. Spiegelman, D. Commentary: some remarks on the seminal 1904 paper of Charles Spearman: the proof and measurement of association between two things. Int J Epidemiol. 39 (5), 1156-1159 (2010).
  32. Cleophas, T. J., Zwinderman, A. H., van Ouwerkerk, B. M. Methods for analyzing cardiovascular studies with repeated measures. Neth Heart J. 17 (11), 429-433 (2009).
  33. Haynes, W. Encyclopedia of systems biology. , Springer. New York. (2013).
  34. Kang, J. S., et al. Exercise-induced CLCF1 attenuates age-related muscle and bone decline in mice. Nat Commun. 16 (1), 4743(2025).
  35. Zhao, C., Gong, Y., Zheng, L., Zhao, M. Untargeted metabolomic reveals changes in muscle metabolites of mice during exercise recovery and mechanisms of whey protein and whey protein hydrolysate in promoting muscle repair. Food Res Int. 184, 114261(2024).
  36. Koltun, K. J., et al. Effect of acute resistance exercise on bone turnover in young adults before and after concurrent resistance and interval training. Physiol Rep. 12 (3), e15906(2024).
  37. Li, J. JAK-STAT and bone metabolism. JAK-STAT. 2 (3), e23930(2013).
  38. Sims, N. A. The JAK1/STAT3/SOCS3 axis in bone development, physiology, and pathology. Exp Mol Med. 52 (8), 1185-1197 (2020).
  39. Zhao, X., et al. Puerarin alleviates osteoporosis in rats by targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway. Biomol Biomed. 24 (6), 1651-1661 (2024).
  40. Terpos, E., Ntanasis-Stathopoulos, I., Gavriatopoulou, M., Dimopoulos, M. A. Pathogenesis of bone disease in multiple myeloma: from bench to bedside. Blood Cancer J. 8 (1), (2018).
  41. Okamoto, K., et al. Osteoimmunology: the conceptual framework unifying the immune and skeletal systems. Physiol Rev. 97 (4), 1295-1349 (2017).
  42. Sims, N. A. Influences of the IL-6 cytokine family on bone structure and function. Cytokine. 146, 155655(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

CLCF1 MiyokiniEgzersiz Kaynakl SitokinRANKL OPG Sinyalizasyonumm n Kemik Etkile imiqPCR AnaliziWestern BlotlamaCRISPR Gen D zenlemeOsteoklast nhibisyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.