Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Osteolitik Hastalık Modellerinde Çentik Sinyal Modülasyonu Yoluyla LY90009 Yoluyla Osteoklastogenezin İnhibisyonu

500 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69178

⸱

7 Ekim 2025

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University, 2Department of Geriatrics, Feicheng People's Hospital, 3Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

Bu makalede

Özet

Burada, γ-sekretaz inhibitörünün kemik iliği kaynaklı makrofajlarda RANKL ile indüklenen osteoklastogenez üzerindeki inhibitör LY900009 etkilerini değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Protokol, osteolitik hastalıkların terapötik gelişimindeki uygulamalarla birlikte sitotoksisite değerlendirmesini, fonksiyonel analizleri, moleküler analizleri ve murin osteolitik modelinde in vivo doğrulamayı içerir.

Özet

Düzensiz osteoklast aktivitesi, osteolitik hastalığın ilerlemesine derinden katkıda bulunur, ancak terapötik müdahale yöntemlerinin kapsamı yan etkilerle sınırlıdır. Bu çalışma, bir γ-sekretaz inhibitörü olan LY900009'yi ve Notch sinyalinin modülasyonu yoluyla RANKL ile indüklenen osteoklastogenezi baskılama kapasitesini araştırdı. Kemik iliğinden türetilen makrofajları kullanarak sitotoksisite, farklılaşma ve fonksiyonel testlerin kapsamlı in vitro değerlendirmelerini gerçekleştirdik. Altta yatan moleküler mekanizmaları aydınlatmak için qPCR ve western blotlama kullanılarak gen ve protein ekspresyon analizleri kullanıldı. İn vivo etkinlik, murin lipopolisakkarit kaynaklı kemik rezorpsiyon modeli kullanılarak doğrulandı. LY900009, terapötik konsantrasyonlarda sitotoksisite olmaksızın doza bağlı bir şekilde RANKL ile indüklenen osteoklast oluşumunu ve rezorptif fonksiyonu inhibe etti. Bu tedavi, TRAP pozitif osteoklastların sayısını önemli ölçüde azalttı, aktin kemer oluşumunu bozdu ve kemik matriks bozulmasını baskıladı. NFATc1, c-Fos, katepsin K ve TRAP dahil olmak üzere osteoklast belirteçlerinin ekspresyonu belirgin şekilde aşağı regüle edildi. Mekanik olarak LY900009, Notch sinyalizasyonunu ve aşağı akış MAPK/Akt yollarını bozdu. İn vivo uygulama, LPS'nin neden olduğu kemik yıkımını önemli ölçüde azalttı, kemik parametrelerini iyileştirdi ve osteoklast varlığını azalttı. Bu bulgular, LY900009'nin Notch/MAPK/Akt sinyal eksenini modüle ederek osteoklastogenezi ve kemik rezorpsiyonunu etkili bir şekilde inhibe ettiğini ve bu da onu osteolitik bozukluklar için umut verici bir terapötik aday haline getirdiğini göstermektedir.

Giriş

Kemik homeostazı, omurgalılarda, osteoblast aracılı kemik oluşumu ile osteoklast güdümlü kemik rezorpsiyonu arasındaki hassas denge ile uyumlu hale getirilmiş, zarif bir şekilde düzenlenmiş bir fizyolojik paradigma oluşturur1. Bu karmaşık denge, kişinin yaşamı boyunca iskelet bütünlüğünü, biyomekanik esnekliği ve metabolik sadakati korur, mekanik taleplere, endokrin bozulmalara ve patolojik zorluklara dinamik olarak yanıt verir2. Kemik yeniden şekillenme döngüsü, her biri hücresel aktivitelerin uzay-zamansal senkronizasyonunu sağlayan karmaşık moleküler kaskadlar tarafından yönetilen sıralı aktivasyon, rezorpsiyon, geçiş, oluşum ve sonlandırma aşamalarını içerir3.

Bu homeostatik mekanizmanın, özellikle aşırı osteoklast aktivitesi veya yetersiz osteoblast fonksiyonu yoluyla bozulması, çok sayıda osteolitik bozukluğun özelliği olan patolojik kemik kaybını hızlandırır 4,5. Bu durumlar, menopoz sonrası ve yaşlanan osteoporoz, romatoid artrit, inflamatuar artrit, neoplastik kemik tutulumu, Paget hastalığı ve periodontal bozukluklar dahil olmak üzere geniş bir hastalık yelpazesini kapsar6. Aşırı kemik rezorpsiyonunun klinik belirtileri arasında artmış kırık riski, iskelet deformitesi, kronik ağrı, fonksiyonel sakatlık ve önemli bir sağlık yükü yer alır 6,7. Çağdaş epidemiyolojik ölçümler, osteoporozun tek başına dünya çapında 200 milyondan fazla kişiyi etkilediğini ve ilişkili kırıkların önemli morbidite, mortalite ve yılda milyarlarca doları aşan ekonomik maliyetlerle sonuçlandığını göstermektedir 7,8.

Osteoklastlar, mononükleer fagosit soyunun hematopoietik öncülerinden, özellikle kemik iliğinden türetilen makrofajlardantüretilen oldukça özelleşmiş çok çekirdekli dev hücreler olarak kendini gösterir 9. Oluşumları, hücre dışı sinyallerin, hücre içi sinyal kaskadlarının ve transkripsiyonel programların hassas koordinasyonunu gerektiren karmaşık çok adımlı bir süreci temsil eder10. Osteoklastogenezi yöneten temel sitokinler, farklılaşma programlarını başlatmak için ilgili reseptörleri RANK ve c-Fms'ye bağlanan nükleer faktör κB ligandının (RANKL) reseptör aktivatörünü ve makrofaj koloni uyarıcı faktörü (M-CSF) içerir11. RANKL-RANK etkileşimi, mitojenle aktive olan protein kinazlar (MAPK'ler), nükleer faktör κB (NF-κB), fosfoinositid 3-kinaz/protein kinaz B (PI3K/Akt) ve osteoklastogenezin ana transkripsiyonel düzenleyicisi olan aktive edilmiş T hücreleri sitoplazmik 1'in (NFATc1) nükleer faktöründe birleşen kalsiyum/kalsinörin yolları dahil olmak üzere çoklu aşağı akış sinyal yollarının aktivasyonunu tetikler 10,11,12.

Osteoklast biyolojisini kontrol eden çeşitli düzenleyici mekanizmalar arasında, Çentik sinyali, karmaşık ve bağlama bağlı işlevlere sahip kritik bir modülatör olarak ortaya çıkmıştır13. Notch yolu, çeşitli dokular ve gelişim aşamaları arasında hücre kaderinin belirlenmesini, farklılaşmasını, çoğalmasını ve apoptozu yöneten, evrimsel olarak korunmuş bir hücre-hücre iletişim sistemidir14. Memelilerde, dört Çentik reseptörü (Notch1-4), hücreler arası sinyalleşmeye aracılık etmek için beş kanonik ligand (Delta benzeri 1, 3 ve 4 ve Jagged 1 ve 2) ile etkileşime girer. Yol aktivasyonu, ADAM metaloproteazları ve γ-sekretaz kompleksi tarafından ligand bağlanmasını, konformasyonel değişiklikleri ve sıralı proteolitik bölünmeyi içerir, bu da sonuçta Hes ve Hey aileleri14,15 dahil olmak üzere hedef genlerin nükleer translokasyonu ve transkripsiyonel düzenlenmesi için Notch hücre içi alanını (NICD) serbest bırakır. Notch sinyalinin osteoklastogenezdeki rolü tartışmalı olmaya devam etmektedir ve spesifik reseptör alt tiplerine, ligand mevcudiyetine, hücresel mikro çevreye ve deneysel koşullara bağlı olarak hem uyarıcı hem de inhibe edici etkiler bildiren çalışmalarla büyük ölçüde bağlama bağlı görünmektedir 16,17,18.

Osteolitik hastalıklar için yaygın terapötik yaklaşımlar öncelikle bifosfonatlar, denosumab (RANKL inhibitörü), seçici östrojen reseptör modülatörleri ve kalsitonin 7,8,19 dahil olmak üzere anti-rezorptif stratejilere odaklanmaktadır. Bu tedaviler kemik erimesini ve kırık riskini etkili bir şekilde azaltsa da, gastrointestinal toksisite, çene osteonekrozu, atipik kırıklar, artan enfeksiyon riski ve uzun vadeli güvenlikle ilgili endişeler gibi önemli sınırlamalarla ilişkilidir. Ek olarak, bu ajanlar kemik döngüsünü aşırı derecede baskılayarak potansiyel olarak kemik kalitesini ve onarım mekanizmalarını tehlikeye atabilir. Sonuç olarak, yan etkileri en aza indirirken ve fizyolojik kemik yeniden şekillenme kapasitesini korurken patolojik osteoklast aktivitesini seçici olarak inhibe edebilen yeni terapötik ajanlara acil bir klinik ihtiyaç vardır 8,14.

γ-Sekretaz inhibitörleri, Notch sinyalinin14,20 modülasyonu yoluyla osteolitik hastalıklarda potansiyel uygulamaları olan umut verici bir bileşik sınıfını temsil eder. Bu ajanlar, onkoloji ve nörodejeneratif hastalık araştırmalarında kapsamlı bir şekilde incelenmiştir ve çeşitli bileşikler, Alzheimer hastalığı ve çeşitli kanserler için klinik deneylere ilerlemiştir. Güçlü ve seçici bir γ-sekretaz inhibitörü olan LY900009, ön çalışmalarda yüksek özgüllük, biyoyararlanım ve yönetilebilir bir güvenlik profili dahil olmak üzere olumlu farmakolojik özellikler göstermiştir21,22. Bununla birlikte, RANKL'nin neden olduğu osteoklastogenez üzerindeki spesifik etkileri ve osteolitik hastalıklarda potansiyel terapötik faydası tam olarak karakterize edilmemiştir. Bu çalışma, LY900009 Notch sinyallemesinin bozulması yoluyla osteoklastogenezi inhibe edip edemeyeceğini değerlendirmek ve potansiyel olarak osteolitik hastalıklar için yeni bir terapötik yaklaşım sunmak üzere tasarlanmıştır. İnflamatuar kemik kaybı modellerinde osteoklast oluşumu, kemik erimesi aktivitesi, sinyal yolları ve in vivo etkinlik üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kapsamlı protokoller geliştirdik.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri kurumsal yönergelere uygun olarak yürütüldü ve Shandong Birinci Tıp Üniversitesi'ne bağlı Merkez Hastanenin Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (onay numarası IACUC-2024-015). Çalışma, hayvanların standart kafeslerde (5 fare/kafes, 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü, ad libitum yiyecek/su) barındırılması ve gruplara randomizasyon dahil olmak üzere hayvan araştırmaları için yerleşik etik ilkelere ve ARRIVE yönergelerine bağlı kaldı

1. Kemik iliği kaynaklı makrofaj izolasyonu ve kültürü

  1. 5 haftalık erkek C57BL / 6 farelerini (izolasyon başına n = 5), 5 dakika boyunca dakikada %30 oda hacmi akış hızına sahip bir CO2 odasına yerleştirerek ötenazi yapın. Servikal çıkık ile ölümü doğrulayın.
  2. Fareye %70 etanol püskürtün. Steril makas kullanarak kasıktan sternuma orta hat kesisi yapın. Femurları ve tibiaları aseptik olarak çıkarın. Kemikleri buz üzerinde steril PBS'ye yerleştirin.
  3. Steril gazlı bez kullanarak yumuşak doku kemiklerini temizleyin. Kemiklerin her iki ucunu steril makasla kesin. Fare başına 10 mL soğuk α-MEM içeren 25G'lik bir iğne kullanarak iliği yıkayın. Hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
  4. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. %10 FBS ve 33.3 ng/mL M-CSF içeren α-MEM'de peleti yeniden süspanse edin. Tripan mavisi dışlamalı bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. T75 şişelerinde 2 x 106 hücre/mL'de plaka.
  5. Kültürleri her 48 saatte bir orta değişikliklerle %5CO2 atmosferinde 37 °C'de tutun.
  6. 1x 106 hücre topla. %2 FBS içeren PBS ile yıkayın. Anti-CD11b-FITC (1:100) ve anti-F4/80-PE (1:100) ile karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. Aşağıdaki geçit stratejisini kullanarak akış sitometrisi ile analiz edin: İlk olarak, döküntüleri dışlamak ve canlı hücreleri seçmek için ileri saçılma (FSC) ve yan saçılmaya (SSC) dayalı hücreleri geçitleyin. İkincisi, canlı hücre popülasyonundan CD11b-pozitif hücreleri kapılayın. Üçüncüsü, CD11b-pozitif hücrelerden, CD11b+/F4/80+ çift pozitif makrofajları tanımlamak için F4/80-pozitif hücreleri geçitleyin. Kapıları lekesiz kontrollere ve tek renkli kontrollere göre ayarlayın. Yalnızca %>95 hücreler CD11b+/F4/80+ ise devam edin.

2. Sitotoksisite değerlendirmesi

  1. Kuyu başına 100 μL ortam kullanılarak 96 oyuklu plakalarda kuyu başına 1 x 104 hücrede tohum kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMM'ler). Hücrelerin 37 °C'de 4 saat yapışmasına izin verin.
  2. Tam ortamda LY900009 seyreltme hazırlayın: 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4, 12.8, 25.6 μM. Eski ortamı çıkarın. Kuyu başına 100 μL arıtma ortamı ekleyin. Her konsantrasyon için üç kopya hazırlayın.
  3. 24 saat, 48 saat veya 96 saat inkübe edin. Kültür ortamını tamamen çıkarın. %10 CCK-8 reaktifi içeren 100 μL taze ortam ekleyin (90 μL ortamda 10 μL CCK-8). 37 °C'de tam olarak 2 saat inkübe edin. 650 nm'de bir referansla 450 nm'de absorbansı ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın.
  4. GraphPad Prism'i kullanarak IC50'yi hesaplayın. Açık yazılım, giriş konsantrasyonu (X ekseni) ve canlılık yüzdesi (Y ekseni). Doğrusal olmayan regresyon > Doz-yanıt > İnhibisyon > log (inhibitör) vs. değişken eğimli yanıt > Analiz Et'i seçin. Kısıtlamaları ayarlayın: Alt=0, Üst=100. IC50'yi %95 güven aralığıyla kaydedin.

3. Osteoklast farklılaşması ve TRAP boyama

  1. 96 oyuklu plakalarda kuyu başına 1 x 104 hücrede tohum kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMM'ler). %10 FBS ve 33.3 ng/mL M-CSF ile α-MEM'de gece boyunca kültür.
  2. Ortamı 100 μL farklılaşma ortamıyla değiştirin: %10 FBS, 33,3 ng/mL M-CSF, 100 ng/mL RANKL ve LY900009 (0, 100, 200, 400 nM) içeren α-MEM. Her koşul için dörtlüler hazırlayın.
  3. Ortamı her 48 saatte bir yeni farklılaşma ortamıyla değiştirin. 6 gün boyunca devam edin. Osteoklast oluşumu için 100x'te ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak günlük olarak izleyin.
  4. Tüm ortamı aspirasyon yoluyla çıkarın. 200 μL PBS ile bir kez yıkayın. PBS'ye 100 μL %4 paraformaldehit ekleyin. Oda sıcaklığında tam olarak 15 dakika inkübe edin. Fiksatifi çıkarın. 200 μL PBS ile 3x yıkayın.
  5. TRAP boyama solüsyonunu hazırlayın: 50 mL 0.1 M sodyum asetat tamponu (pH 5.0), 10 mL 50 mM sodyum tartarat, dimetilformamid içinde 1 mL 5 mg/mL naftol AS-MX fosfat ve 0.5 mL 11 mg/mL Hızlı Kırmızı Menekşe LB tuzunu karıştırın. 0,22 μm'lik bir filtreden geçirin. Kuyu başına 200 μL uygulayın. Karanlıkta 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Damıtılmış su ile 3x yıkayarak reaksiyonu durdurun.
  6. Osteoklastları, üç veya daha fazla çekirdek içeren TRAP pozitif hücreler (mor/kırmızı) olarak tanımlayın. 100x büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak sayın. Kuyu başına beş rastgele alanın fotoğrafını çekin.
  7. ImageJ kullanarak ölçün. Resme tıklayın > 8 bit'e dönüştür (Görüntü > Türü > 8 bit) > Eşiği ayarla (Görüntü > > Eşiği Ayarla) > TRAP pozitif alanları seçin > Parçacıkları analiz edin (Parçacıkları Analiz Et > Analiz Et: boyut 100-Sonsuz μm2, dairesellik 0-1.0) > Sonuçları Excel 23'e aktarın.

4. Fonksiyonel kemik rezorpsiyon testi

  1. BMM'leri 24 saat boyunca M-CSF ile altı oyuklu plakalarda (2 x 105 hücre/kuyu) kültürleyin. 3 gün boyunca osteoklast öncesi oluşumu indüklemek için RANKL (100 ng/mL) ekleyin.
  2. Hücreleri 37 °C'de 5 dakika boyunca %0.25 tripsin-EDTA kullanarak hasat edin. Tam ortam ile nötralize edin. Tripan mavisi kullanarak canlı hücreleri sayın.
  3. Tohum: Hidroksiapatit kaplı 96 oyuklu plakalar üzerinde kuyucuk başına 1 x 104 pre-osteoklast. 4 saat boyunca bağlanmaya izin verin.
  4. 4 gün boyunca M-CSF (33.3 ng/mL), RANKL (100 ng/mL) ve LY900009 (0, 100, 200, 400 nM) ile tedavi edin. Ortamı 2 günde bir değiştirin.
  5. 10 dakika boyunca %10 çamaşır suyu kullanarak hücreleri çıkarın. Damıtılmış su ile 5x yıkayın. Tamamen havayla kurutun.
  6. 4x büyütmede otomatik bir görüntüleme okuyucusu kullanarak emilim çukurlarını görselleştirin. Tüm kuyu alanını yakalayın. ImageJ'yi kullanarak emilen alanı toplam alanın yüzdesi olarak ölçün.

5. İmmünofloresan mikroskobu

  1. Adım 3'te açıklandığı gibi 5-7 gün boyunca 24 oyuklu plakalarda cam lameller üzerinde kültür osteoklastları.
  2. 15 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile sabitleyin. PBS'de %0.1 Triton X-100 ile 10 dakika geçirgenleştirin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de% 1 BSA ile bloklayın.
  3. Karanlıkta oda sıcaklığında 45 dakika boyunca bloke edici tamponda rodamin-phalloidin (1:200) ile inkübe edin. Çekirdekleri 10 dakika boyunca DAPI (1 μg/mL) ile boyayın.
  4. Lamelleri, solmayı önleyen montaj ortamı kullanarak slaytlara monte edin. 200x büyütmede bir floresan mikroskobu kullanarak inceleyin. ImageJ'yi kullanarak aktin halkası alanını ölçün.

6. Kantitatif gerçek zamanlı PCR analizi

  1. Bir RNA ekstraksiyon reaktifi kullanarak 2 x 106 hücreden toplam RNA'yı çıkarın. Pipetleme ile homojenize edin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  2. 200 μL kloroform ekleyin. 15 saniye kuvvetlice çalkalayın. 3 dakika inkübe edin. 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin.
  3. Sulu fazı yeni tüpe aktarın. 500 μL izopropanol ekleyin. Yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin.
  4. Peletleri 1 mL %75 etanol ile yıkayın. 10 dakika havayla kurutun. 30 μL RNaz içermeyen suda çözün. Spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçün (A260/A280 oranı >1.8) gerektirir).
  5. Üreticinin protokolüne göre ters transkripsiyon kiti ile 1 μg RNA kullanarak cDNA'yı sentezleyin.
  6. qPCR reaksiyonlarını hazırlayın: 10 μL Master Mix, 1 μL cDNA, her primerden 0.5 μL (10 μM), 8 μL su. Gerçek zamanlı PCR sisteminde çalıştırın: 10 dakika boyunca 95 °C, ardından 15 saniye boyunca 95°C'lik 40 döngü ve 60 saniye boyunca 60 °C. Referans gen olarak GAPDH ile 2-ΔΔCt yöntemini kullanarak bağıl ekspresyonu hesaplayın.

7. Western blot analizi

  1. Proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren RIPA tamponundaki liz hücreleri, 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir. 4 °C'de 15 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin.
  2. Üreticinin talimatlarına göre BCA testini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Yükleme tamponunda 30 μg protein numuneleri hazırlayın. 5 dakika kaynatın.
  3. Numuneleri %10 SDS-PAGE jellerine yükleyin. 80 V'ta 30 dakika, ardından 120 V'ta 90 dakika çalıştırın. Soğuk transfer tamponunda 90 dakika boyunca 100 V'ta PVDF membranlarına aktarın.
  4. Membranları %0.1 Tween-20 (TBST) içeren Tris-Buffered Salin içinde %5 yağsız sütle oda sıcaklığında 1 saat boyunca hafifçe sallayarak bloke edin.
  5. Malzeme Tablosunda (1:1000) ayrıntıları verilen birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de hafifçe sallayarak inkübe edin. TBST ile her biri 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  6. HRP konjuge ikincil antikorlarla (1:5000) oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. TBST ile 3x yıkayın.
  7. Üreticinin talimatlarına göre ECL reaktifi kullanarak tespit edin. Kızılötesi görüntüleme sistemi kullanarak görüntü yakalayın. ImageJ'yi kullanarak bant yoğunluğunu ölçün.

8. İn Vivo LPS kaynaklı kemik rezorpsiyon modeli

  1. G*Power 3.1 kullanarak örneklem büyüklüğünü hesaplayın (etki büyüklüğü=0.8, α=0.05, güç=0.80, n=5/grup verimi). 7-8 haftalık erkek C57BL / 6 farelerini rastgele bir sayı üreteci kullanarak gruplara rastgele tahsis edin. 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü, sıcaklık 22 ± 2 °C, nem %55 ± %10, standart yemek ve suya ad libitum erişim ile kafes başına 5 fare barındırın.
  2. İntraperitoneal pentobarbital sodyum enjeksiyonu (50 mg / kg) kullanarak fareleri uyuşturun. Ayak parmağı sıkıştırma refleksi ile anesteziyi onaylayın.
  3. Araç kontrolünü hazırlayın: %1 DMSO içeren PBS. Araçta LY900009 hazırlayın: Düşük doz (2,5 mg/kg) ve Yüksek doz (5 mg/kg). 14 gün boyunca günde 27G'lik bir iğne kullanarak calvaria üzerine deri altından 100 μL enjekte edin. LPS'yi (10 mg/kg) 1. ve 8. günlerde enjekte edin.
  4. Fareleri sıkıntı belirtileri açısından günde 2 kez izleyin. İnsancıl uç noktaları tanımlayın: kilo kaybı >%20, yürüyememe, kambur duruş, azaltılmış bakım. Uç noktalara ulaşılırsa hemen ötenazi yapın.
  5. 15. günde pentobarbital doz aşımı (intraperitoneal olarak 100 mg / kg) kullanarak ötenazi yapın. Calvariae'yi hasat edin. 4 °C'de 48 saat boyunca %4 paraformaldehit içinde sabitleyin.

9. Mikro-BT ve histolojik analiz

  1. Aşağıdaki parametrelere sahip bir mikro-CT tarayıcı kullanarak sabit kalvaryaları tarayın: 70 kV, 114 μA, 0,5 mm alüminyum filtre, 9 μm çözünürlük, 0,4°'lik adımlarla 180° dönüş.
  2. NRecon yazılımını kullanarak görüntüleri yeniden oluşturun. CTAn yazılımını kullanarak analiz edin. İlgilenilen bölgeyi sagital sütür üzerinde ortalanmış 3 x 3 mm'lik bir alan olarak tanımlayın. BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th'yi hesaplayın.
  3. Numuneleri günlük değişikliklerle 14 gün boyunca %10 EDTA'da (pH 7.4) kireçten arındırın. Kalsiyum oksalat testi24 kullanılarak dekalsifikasyon testinin tamamlanması.
  4. Parafin gömme işlemi: dereceli alkolle kurutun, ksilen içinde berraklaştırın, parafin ile sızın. Mikrotom kullanılarak 4 μm kalınlığında kesit.
  5. Körlemeyi sağlayın: Tüm örnekleri rastgele üç basamaklı sayılar kullanarak kodlayın. Kod anahtarını bir iş arkadaşınızın korumasını sağlayın. Tedavi grupları hakkında bilgi sahibi olmadan tüm analizleri yapın. Yalnızca veri toplama tamamlandıktan sonra kod çözün.
  6. H&E boyama yapın: deparafinleştirin, rehidrate edin, hematoxylin ile 5 dakika boyayın, asit alkolde farklılaştırın, eozin ile 2 dakika boyayın, dehidrate edin ve monte edin.
  7. TRAP boyamayı adım 3.5'teki gibi gerçekleştirin. Kemik yüzeyi boyunca TRAP pozitif çok çekirdekli hücreleri sayın. Kemik çevresi mm başına sayı olarak ifade edin.

10. İstatistiksel analiz

  1. G*Power 3.1'i kullanarak gerekli örneklem büyüklüğünü hesaplayın: Girdi etkisi büyüklüğü f=0.8, α=0.05, güç=0.80, grup sayısı. Grup başına minimum n'yi kaydedin.
  2. SPSS 28.0'da Shapiro-Wilk testini kullanarak normalliği test edin. p > 0.05'i normal dağılım olarak düşünün. Levene testini kullanarak varyans homojenliğini test edin. p > 0.05'i eşit varyanslar olarak düşünün.
  3. Dağılıma dayalı uygun testleri uygulayın: Eşit varyanslara sahip normal veriler için parametrik testler kullanın. İki grup için, eşleştirilmemiş Öğrenci t-testini uygulayın. Birden çok grup için tek yönlü ANOVA kullanın.
  4. Post hoc analiz gerçekleştirin: Anlamlı ANOVA (p<0.05) için, tüm ikili karşılaştırmalar için Tukey'in dürüstçe anlamlı fark testini uygulayın.
  5. Normal olmayan veriler için parametrik olmayan alternatifler kullanın: İki grup için Mann-Whitney U testini ve birden fazla grup için Dunn'ın post hoc'u ile Kruskal-Wallis testini uygulayın.
  6. Etki büyüklüklerini hesaplayın: t-testleri için Cohen'in d'si, ANOVA için kısmi eta karesi.
  7. Tam p değerlerini üç ondalık basamağa ve %95 güven aralığına kadar raporlayın. Normal verileri ortalama ± standart sapma olarak, normal olmayan verileri medyan (çeyrekler arası aralık) olarak sunun.
  8. p < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı kabul edin. Birden fazla karşılaştırma yapıldığında Bonferroni düzeltmesini uygulayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, LY900009 birbirine bağlı çoklu mekanizmalar yoluyla osteoklast oluşumu ve işlevi üzerinde güçlü inhibitör etkiler gösterdiğini ortaya koymuştur. Kemik iliği kaynaklı makrofajlarda ilk sitotoksisite değerlendirmesi, 24 saat,48 saat ve 96 saatte sırasıyla 4.44 μM, 3.66 μM ve 2.93 μM hesaplanan IC 50 değerleri ile toksisitede zamana bağlı artışlar göstermiştir (Şekil 1A,B). Daha da önemlisi, bu sitotoksik konsantrasyonl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mevcut araştırma, kemikle ilgili bozukluklar için γ-sekretaz inhibitörlerine artan ilgi ile tutarlı olarak, osteoklastogenezin güçlü ve seçici inhibisyonu yoluyla osteolitik hastalıklar için umut verici bir terapötik ajanı temsil LY900009 ikna edici kanıtlar sunmaktadır 14,20,21. Bulgular, bu γ-sekretaz inhibitörünün, Notch, MAPK, PI3K/Akt ve NF-κB kaskadları dahil olmak üzere çoklu kritik sinya...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir finansal çıkar veya çıkar çatışması beyan etmemektedir. Hiçbir yazarın bu çalışmada adı geçen ticari kuruluşlarla herhangi bir mali ilişkisi yoktur. Tüm yazarlar ICMJE açıklama formlarını doldurmuştur.

Teşekkürler

Yazarlar, bu çalışma süresince teknik destek ve yardımları için Shandong Birinci Tıp Üniversitesi'ne Bağlı Merkez Hastane ve Feicheng Halk Hastanesi personeline teşekkür eder. Laboratuvar meslektaşlarımızın değerli tartışmaları ve hayvan deneyleri konusundaki yardımları için de katkılarını takdir ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
24 oyuklu hücre kültürü plakalarıCorning3524İmmünofloresan mikroskobu
6 oyuklu hücre kültürü plakalarıCorning3516Hücre kültürü ve western blot
%70 EtanolSigma-AldrichE7023 (İngilizce)Sterilizasyon ve dezenfeksiyon
%75 EtanolSigma-AldrichE7148 (İngilizce)RNA yıkama tamponu
96 oyuklu hücre kültürü plakalarıCorning3596Hücre kültürü ve tahlilleri
Alüminyum filtre (0,5 mm)BrukerYOKMikro-CT tarama filtresi
Anti-CD11b-FITC antikoruBiyolojik Efsane101206Akış sitometrisi - makrofaj belirteci
Bölünme önleyici Notch1 antikoru (tavşan monoklonal)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi4147SWestern blot - Çentik sinyali
Anti-F4/80-PE antikoruBiyolojik Efsane123108Akış sitometrisi - makrofaj belirteci
Solmayı önleyen montaj ortamıVektör LaboratuvarlarıH-1000 SerisiFloresan mikroskobu montajı
Anti-Hes1 antikoru (tavşan monoklonal)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi11988'LERWestern blot - Çentik aşağı akış hedefi
Anti-NFATc1 antikoru (fare monoklonal)Santa Cruz BiyoteknolojiSC-7294 SerisiWestern blot - osteoklast ana regülatörü
Anti-fosfo-Akt (Ser473) antikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi4060'LARWestern blot - PI3K/Akt sinyali
Anti-fosfo-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) antikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi4370'LERWestern blot - MAPK sinyali
Anti-fosfo-NF-κ B p65 (Ser536) antikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi3033SWestern blot - NF-κ B sinyali
Anti-fosfo-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) antikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi4511'LERWestern blot - p38 MAPK sinyali
Anti-β-aktin antikoru (fare monoklonal)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi4970'LERWestern blot yükleme kontrolü
Otomatik görüntüleme okuyucuMoleküler CihazlarImageXpress MikroEmilim çukuru miktar tayini
BCA Protein Test KitiPierce/Thermo Fisher23225Protein konsantrasyonu tayini
Çamaşır suyu (%10 sodyum hipoklorit)Sigma-Aldrich425044Emilim plakalarından hücre çıkarılması
BSA (Sığır Serum Albümini)Sigma-AldrichA7906 Serisiİmmünofloresan için bloke edici tampon
C57BL/6 fareler (erkek, 5-8 haftalık)Charles Nehri Laboratuvarları27İn vitro BMM izolasyonu ve in vivo çalışmalar
Kalsiyum oksalat test reaktifiSigma-AldrichC0350 SerisiDekalsifikasyon tamamlama testi
CCK-8 reaktifi (Hücre Sayım Kiti-8)Dojindo Moleküler TeknolojilerCK04Hücre canlılığı değerlendirmesi
Hücre süzgeci (70 μ m)BD Şahini352350Kemik iliği hücre filtrasyonu
Santrifüj (soğutmalı)Eppendorf Belediyesi5424R SerisiHücre ve numune hazırlama
KloroformSigma-AldrichC2432 (İngilizce)RNA ekstraksiyon fazı ayrımı
CO2 odasıEuthanex ŞirketiEX-075Hayvan ötenazisi
CTAn yazılımıBrukerSürüm 1.20Mikro-CT görüntü analizi
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)Sigma-AldrichD9542 SerisiNükleer karşı boyama
Dimetilformamid (DMF)Sigma-AldrichD4551 SerisiTRAP boyama solventi
DMSO (Dimetil sülfoksit)Sigma-AldrichD2650 SerisiAraç kontrol hazırlığı
ECL Western Blotlama SubstratıPierce/Thermo Fisher32106Western blot'ta protein tespiti
EDTA (%10, pH 7,4)Sigma-AldrichE6758 (İngilizce)Kireç çözme çözeltisi
Eozin YSigma-AldrichE4009H& E histolojik boyama
Hızlı Kırmızı Menekşe LB tuzuSigma-AldrichF3381 SerisiTRAP boyama kromojeni
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco/Termo Balıkçı16140-071Hücre kültürü takviyesi
Akış sitometresiBD Biyolojik BilimlerFACSCaliburBMM karakterizasyonu
Floresan mikroskobuOlympusIX73İmmünofloresan görüntüleme
G*Power yazılımıHeinrich Heine ÜniversitesiSürüm 3.1İstatistiksel güç analizi
Cam lameller (22 × 22 mm)Fisher Bilimsel12-541-Bİmmünofloresan mikroskobu
GraphPad PrizmasıGraphPad YazılımıSürüm 9.0IC50 hesaplama ve grafik oluşturma
HematoksilenSigma-AldrichH3136 SerisiH& E histolojik boyama
HemositometreHausser Bilimsel3200Hücre sayımı
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon KitiUygulamalı Biyosistemler4368814RNA'dan cDNA sentezi
HRP konjuge anti-fare IgGHücre Sinyalizasyon Teknolojisi7076'LARWestern blot ikincil antikoru
HRP konjuge anti-tavşan IgGHücre Sinyalizasyon Teknolojisi7074'LERWestern blot ikincil antikoru
Hidroksiapatit kaplı 96 oyuklu plakalarCorning BioCoat354651Kemik erimesi fonksiyonel testi
ResimJNIHSürüm 1.53eGörüntü analizi ve niceleme
Kuluçka Makinesi (CO2)Termo Balıkçı51033058Hücre kültürü bakımı
Kızılötesi görüntüleme sistemiBiyo-RadChemiDoc MilletvekiliWestern blot tespiti
Ters mikroskopOlympusCKX41 SerisiHücre kültürü izleme, TRAP sayımı
İzopropanolSigma-AldrichI9516RNA çökelmesi
LPS (E. coli'den Lipopolisakkarit)Sigma-AldrichL4391İn vivo inflamatuar kemik rezorpsiyonu
LY900009 (&gama;-sekretaz inhibitörü)Selleck KimyasallarıS7999 SerisiTest bileşiği - osteoklast inhibitörü
M-CSF (Makrofaj Koloni Uyarıcı Faktör)R& D Sistemleri416-ML-010 SerisiMakrofaj sağkalımı ve osteoklast farklılaşması
Mikro CT tarayıcıBrukerGökyüzü Taraması 1272Kemik mikromimarisi analizi
Mikroplaka okuyucuBioTekSinerji H1Absorbans ölçümleri (CCK-8)
MikrotomLeicaRM2255 SerisiHistolojik kesit alma
Naftol AS-MX fosfatSigma-AldrichN5000 SerisiTRAP boyama substratı
İğneler (25G, 27G)BD305122, 305109Kemik iliği yıkama, enjeksiyonlar
NRecon yazılımıBrukerSürüm 1.7Mikro-CT görüntü rekonstrüksiyonu
Parafin mumuSigma-AldrichP3683Doku gömme
Paraformaldehit (%4)Sigma-AldrichP6148Hücre ve doku fiksasyonu
PBS (Fosfat Tamponlu Salin)Gibco/Termo Balıkçı14190-144Hücre yıkama ve tampon hazırlama
Pentobarbital sodyumSigma-AldrichP3761Hayvan anestezisi ve ötenazi
Fosfataz inhibitörü kokteyliRoche4906837001Fosforilasyonun korunması
PowerUp SYBR Yeşil Ana KarışımUygulamalı BiyosistemlerA25742 SerisiKantitatif gerçek zamanlı PCR
Proteaz inhibitör kokteyliRoche11697498001Protein bozunmasının önlenmesi
PVDF membran (0.45 μ m)Biyo-Rad1620177Western blot protein transferi
RANKL (NF-&kappa'nın Reseptör Aktivatörü; B Ligand)R& D Sistemleri462-TEC-010Osteoklast farklılaşma indüksiyonu
Gerçek zamanlı PCR sistemiUygulamalı Biyosistemler7500 HızlıKantitatif gen ekspresyon analizi
Rodamin-falloidinInvitrogen/Thermo FisherR415 SerisiF-aktin görselleştirme
RIPA arabelleğiHücre Sinyalizasyon Teknolojisi9806'LARProtein ekstraksiyonu
RNaz içermeyen suAmbion/Termo FisherAM9937 SerisiRNA çözünmesi ve PCR
SDS-PAGE jelleri (%10)Biyo-Rad4561036Western blot protein ayrımı
Yağsız süt tozuBiyo-Rad1706404Western blot engelleme
Sodyum asetat tamponu (0,1 M, pH 5,0)Sigma-AldrichS2889TRAP boyama tamponu
Sodyum tartarat (50 mM)Sigma-AldrichS4297TRAP boyama özgüllüğü
SpektrofotometreTermo BalıkçıNano Damla 2000RNA/protein konsantrasyonu ölçümü
SPSS DergisiIBM ŞirketiSürüm 28.0İstatistiksel analiz
Şırıngalar (1 mL, 10 mL)BD309659, 309604Kemik iliği yıkama, enjeksiyonlar
T75 hücre kültürü şişeleriCorning430641Birincil BMM kültürü
TBST (%0,1 Tween-20 ile Tris Tamponlu Salin)Biyo-Rad1706531Western blot yıkama tamponu
Aktarım arabelleğiBiyo-Rad1704270Western blot protein transferi
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Hücre geçirgenliği
TRIzol reaktifiInvitrogen/Thermo Fisher15596026Toplam RNA ekstraksiyonu
Tripan mavisi (%0,4)Sigma-AldrichT8154 SerisiHücre canlılığı değerlendirmesi
Tripsin-EDTA (%0,25)Gibco/Termo Balıkçı25200-056Hücre toplama ve ayırma
Western blot transfer sistemiBiyo-RadTrans-Blot TurboMembrana protein transferi
KsilenSigma-AldrichX3750 SerisiDoku işleme ve temizleme
α-MEM (Alfa Minimum Temel Ortam)Gibco/Termo Balıkçı12561-056Hücre kültürü ortamı

Kaynaklar

  1. Langdahl, B., Ferrari, S., Dempster, D. W. Bone modeling and remodeling: potential as therapeutic targets for the treatment of osteoporosis. Ther Adv Musculoskeletal Dis. 8 (6), 225-235 (2016).
  2. Shah, M. A. A., et al. Functional morphology of trabecular system in human proximal femur: a perspective from P45 sectional plastination and 3D reconstruction finite element analysis. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  3. Shah, M. A. A., et al. Microvasculature and trabecular bone in beagle proximal femur: Microstructural insights. Ann Anatomy. 258, 152368(2025).
  4. Mukherjee, K., Chattopadhyay, N. Pharmacological inhibition of cathepsin K: A promising novel approach for postmenopausal osteoporosis therapy. Biochem Pharmacol. 117, 10-19 (2016).
  5. Bertuglia, A., et al. Osteoclasts are recruited to the subchondral bone in naturally occurring post-traumatic equine carpal osteoarthritis and may contribute to cartilage degradation. Osteoarth Cartilage. 24 (3), 555-566 (2016).
  6. Alami, S., Hervouet, L., Poiraudeau, S., Briot, K., Roux, C. Barriers to Effective Postmenopausal Osteoporosis Treatment: A Qualitative Study of Patients' and Practitioners' Views. PLoS One. 11 (6), e0158365(2016).
  7. Hiligsmann, M., et al. A Systematic Review of Cost-Effectiveness Analyses of Drugs for Postmenopausal Osteoporosis. PharmacoEconomics. 33 (3), 205-224 (2014).
  8. Hadji, P., et al. Persistence, adherence, and medication-taking behavior in women with postmenopausal osteoporosis receiving denosumab in routine practice in Germany, Austria, Greece, and Belgium: 12-month results from a European non-interventional study. Osteoporosis Int. 26 (10), 2479-2489 (2015).
  9. Udagawa, N., et al. Osteoblasts/stromal cells stimulate osteoclast activation through expression of osteoclast differentiation factor/RANKL but not macrophage colony-stimulating factor. Bone. 25 (5), 517-523 (1999).
  10. Lee, K., et al. Selective Regulation of MAPK Signaling Mediates RANKL-dependent Osteoclast Differentiation. Int J Biol Sci. 12 (2), 235-245 (2016).
  11. Huang, H., et al. Osteoclast differentiation requires TAK1 and MKK6 for NFATc1 induction and NF-κB transactivation by RANKL. Cell Death Diff. 13 (11), 1879-1891 (2006).
  12. Matsumoto, Y., et al. RANKL coordinates multiple osteoclastogenic pathways by regulating expression of ubiquitin ligase RNF146. J Clin Investigat. 127 (4), 1303-1315 (2017).
  13. Lai, E. C. Notch signaling: control of cell communication and cell fate. Development. 131 (5), 965-973 (2004).
  14. Chen, X., et al. LY411575, a potent γ-secretase inhibitor, suppresses osteoclastogenesis in vitro and LPS-induced calvarial osteolysis in vivo. J Cellular Physiol. 234 (11), 20944-20956 (2019).
  15. Chen, S., Lee, B. H., Bae, Y. Notch Signaling in Skeletal Stem Cells. Calcified Tiss Int. 94 (1), 68-77 (2013).
  16. Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), (2012).
  17. Duan, L. Notch is activated in RANKL-induced osteoclast differentiation and resorption. Front Biosci. (13), 7064(2008).
  18. Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
  19. Hough, F. S., et al. The safety of osteoporosis medication. South African Med J. 104 (4), 279(2013).
  20. Espinosa, L. S., Inglés-Esteve, J., Robert-Moreno, A., Bigas, A. IκBα and p65 Regulate the Cytoplasmic Shuttling of Nuclear Corepressors: Cross-talk between Notch and NFκB Pathways. Mol Biol Cell. 14 (2), 491-502 (2003).
  21. Wang, Z., Li, Y., Sarkar, F. Notch Signaling Proteins: Legitimate Targets for Cancer Therapy. Curr Prot Peptide Sci. 11 (6), 398-408 (2010).
  22. Zhou, Z., et al. PP121 suppresses RANKL-Induced osteoclast formation in vitro and LPS-Induced bone resorption in vivo. Exp Cell Res. 388 (2), 111857(2020).
  23. Shah, M. A. A., et al. Regional distribution of microvasculature within the canine femoral head: a study of plastinated tissue histology and 3D reconstruction. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  24. Clayden, E. C. Practical Section Cutting and Staining. , Churchill. (1955).
  25. McHorney, C. A., Schousboe, J. T., Cline, R. R., Weiss, T. W. The impact of osteoporosis medication beliefs and side-effect experiences on non-adherence to oral bisphosphonates ates. Curr Med Res Opin. 24 (3), 707-708 (2008).
  26. Canalis, E. Notch in skeletal physiology and disease. Osteoporosis Int. 29 (12), 2611-2621 (2018).
  27. Zanotti, S., Canalis, E. Notch Signaling and the Skeleton. Endocrine Rev. 37 (3), 223-253 (2016).
  28. Grevers, L. C., et al. Immune complex-induced inhibition of osteoclastogenesis is mediated via activating but not inhibitory Fcγ receptors on myeloid precursor cells. Ann Rheumatic Dis. 72 (2), 278-285 (2013).
  29. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  30. Weber, J. M., Calvi, L. M. Notch signaling and the bone marrow hematopoietic stem cell niche. Bone. 46 (2), 281-285 (2010).
  31. Kovtonyuk, L. V., Fritsch, K., Feng, X., Manz, M. G., Takizawa, H. Inflamm-Aging of Hematopoiesis, Hematopoietic Stem Cells, and the Bone Marrow Microenvironment. Front Immunol. 7, (2016).
  32. Khosla, S., Hofbauer, L. C. Osteoporosis treatment: recent developments and ongoing challenges. Lancet Diabet Endocrinol. 5 (11), 898-907 (2017).
  33. Reid, I. R. Efficacy, effectiveness and side effects of medications used to prevent fractures. J Inter Med. 277 (6), 690-706 (2015).
  34. Cosman, F., et al. Clinician's Guide to Prevention and Treatment of Osteoporosis. Osteoporosis Int. 25 (10), 2359-2381 (2014).
  35. Chen, Y. H., et al. Melatonin protects against lipopolysaccharide-induced intra-uterine fetal death and growth retardation in mice. J Pineal Res. 40 (1), 40-47 (2005).
  36. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. J Clin Investigat. 100 (6), 1557-1565 (1997).
  37. Black, D. M., Rosen, C. J. Postmenopausal Osteoporosis. New Engl J Med. 374 (3), 254-262 (2016).
  38. Eastell, R., et al. Pharmacological Management of Osteoporosis in Postmenopausal Women: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metabol. 104 (5), 1595-1622 (2019).
  39. Leder, B. Z. Optimizing Sequential and Combined Anabolic and Antiresorptive Osteoporosis Therapy. JBMR Plus. 2 (2), 62-66 (2018).
  40. Grey, A., Bolland, M., Cundy, T. Maintaining Order in Osteoporosis Treatments. Journal of Bone Miner Res. 32 (5), 1147-1147 (2017).
  41. McClung, M. R. Role of bone-forming agents in the management of osteoporosis. Aging Clin Exp Re. 33 (4), 775-791 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Osteoklastogenezin İnhibisyonuLY900009RANKL ile İndüklenen OsteoklastlarKemik ResorpsiyonuKemik İliği MakrofajlarıWestern BlotTRAP BoyamaMAPK Akt Yolağı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.