Araştırma makalesi

Sıçanlarda akut yorucu egzersizin neden olduğu tendon-kemik bileşkesinin mikro yaralanması: ultrastrüktürel değişiklikler ve mekanizma

353 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69184

⸱

14 Kasım 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation, Sichuan college of traditional Chinese medicine, 2Department of Rehabilitation, Mian-yang Orthopedic hospital, 3Sports Medicine Center, West China Hospital, Sichuan University, 4Department of Orthopedics and Orthopedic Research Institute, West China Hospital, 5Department of Geriatric Medicine, Mian-yang hospital of traditional Chinese medicine, 6Department of Rehabilitation Medicine, Sichuan Provincial Orthopedic Hospital

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada akut yorucu egzersize bağlı tendon-kemik bileşkesindeki ultrastrüktürel değişiklikler ve mekanizmalar araştırıldı. Akut kapsamlı egzersiz, tendon-kemik kavşağında mikro yaralanmaya neden olarak ER stresini ve aracılı apoptotik sinyal yollarını geçici olarak aktive eder. Bununla birlikte, bu mikro yaralanmalar ve acil servis stresi, egzersiz sonrası aşamalı olarak eski haline getirilebilir.

Özet

Tendon-kemik bileşkesinde (entez) egzersize bağlı mikro yaralanmalar tendinopatiye yol açabilir. Akut yorucu egzersizi takiben entezdeki ultrastrüktürel değişikliklerin ve mekanizmaların araştırılması, tendinopati anlayışımızı geliştirebilir ve klinik tedavilere rehberlik edebilir. Bu çalışmada, otuz altı erkek Sprague-Dawley sıçanı rastgele iki gruba ayrıldı: kontrol ve kapsamlı egzersiz. Kapsamlı egzersiz grubu ayrıca egzersiz sonrası süreye göre beş alt gruba ayrıldı: 0 saat, 6 saat, 12 saat, 24 saat ve 48 saat. Kalkaneal tendon-kemik birleşimindeki değişiklikleri incelemek için hematoksilen-eozin boyama ve elektron mikroskobu kullanıldı. Tendon-kemik birleşiminde endoplazmik retikulum stresi (ERS) ile ilişkili proteinler GRP78, CHOP ve Kaspaz-12'nin ekspresyonu, immünohistokimya (IHC) kullanılarak ölçüldü. Akut kapsamlı egzersizi takiben, kapsamlı egzersiz yapılan sıçanların tendon-kemik bağlantıları önemli yapısal değişiklikler gösterdi. Kondrositler ve kollajen lifleri, ERS'yi gösteren kayda değer ultrastrüktürel değişiklikler sergiledi. ERS protein seviyeleri egzersizden hemen sonra arttı ve 6 saatte zirveye ulaştı. Bu protein seviyeleri egzersizden 12 saat sonra düşmeye başladı ve 48 saat sonra başlangıca döndü. Sonuç olarak, akut kapsamlı egzersiz, sıçanlarda tendon-kemik bileşkesinde mikro hasara ve endoplazmik retikulum stresine neden olur, ancak geri dönüşü olmayan bir hasar ortaya çıkmaz. Bu mikro yaralanmaların zamanında tedavisi ve onarımı, aşırı hasarı ve tendinopati gelişimini önleyebilir.

Giriş

Aşil tendinopatisi, ayak bileği aşırı kullanım yaralanmalarının sık neden olduğu yaygın bir klinik durumdur. Bu bozukluk tendon şişmesi, ağrı ve işlev bozukluğu ile karakterizedir. Yaşlı bireylerde ve sporcularda, özellikle koşucularda ve jumperlarda daha yaygındır. Aşil tendinopatisi, insersiyonel olmayan ve insersiyonel tendinopati olarak kategorize edilir. İnsersiyonel olmayan tendinopati, tendonu kemik insersiyonunun 2 ila 6 cm yukarısında etkilerken, insersiyonel tendinopati tendon-kemik bileşkesinietkiler 1. Ayrıca, insersiyonel olmayan tendinopati aşırı kilolu, yaşlı ve daha az aktif kişilerde ortaya çıkma eğilimindeyken, insersiyonel tendinopati daha aktif kişilerde ortaya çıkma eğilimindedir1.

Tendonun kemiğe girdiği tendon-kemik bileşkesi, kalsifiye olmayan fibrokartilaj ve kalsifiye fibrokartilaj2 dahil olmak üzere tendon dokusundan kemik dokusuna kademeli bir geçişi içerir. Bu değişiklik, yumuşak ve esnek bir tendon dokusundan sert kemiğe geçişi sağlar. Mühendislik açısından, bu bölge, eklem hareketini kolaylaştırmak için kas gücünü ileten bir bağlantı noktası görevi görür 3,4. Bu nedenle, bu bölge stres yoğunlaşmasının olduğu bir bölgedir ve sporda yaygın olarak aşırı kullanım yaralanmalarına maruz kalır.

Klinik araştırmalar öncelikle insersiyonel olmayan tendinopatiye odaklanmıştır ve tendon-kemik bileşkesi2'de insersiyonel tendinopatiye daha az dikkat edilmiştir. Araştırmalar, aşırı kullanım yüklemesinin kollajenin düzensizliğini ve parçalanmasını, yağ dokusu infiltrasyonunu ve tendonda neovaskülarizasyonu desteklediğini göstermektedir. Ayrıca hem kalsifiye olmayan hem de kalsifiye fibrokartilaj bölgelerinde fibrokondrosit hiperplazisine, endokondral ossifikasyona ve kemik mahmuzlarına yol açar5. Bununla birlikte, son çalışmalar, kas kasılma paternlerinin insersiyonel tendinopatide egzersiz miktarından daha önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir 6,7. Bu nedenle, aşırı kullanımın tendon-kemik bağlantıları üzerindeki etkisini anlamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Önceki çalışmalar, uzun süreli atlama veya koşma gibi aşırı kullanımın bu kavşaklar üzerindeki etkilerini araştırmıştı. Bununla birlikte, çok azı akut kapsamlı egzersizin etkisini araştırmıştır. Yakın tarihli bir çalışma, akut egzersizin sıçanların böbreklerinde endoplazmik retikulum stresini indüklediğini, bunun da IL-6 sinyalleme ve ısı şoku proteinlerinin (HSP'ler) yukarı regülasyonunu ve mitokondriyal solunum kompleksi mRNA8'de bir azalmayı gösterdiğini göstermektedir. Tendon-kemik kavşaklarında bu tür değişikliklerin meydana gelip gelmediği bildirilmemiştir. Bu çalışma, akut yorucu egzersizin neden olduğu değişiklikleri ve altta yatan mekanizmaları aydınlatmak için tendon-kemik bileşkesine (entez) odaklanmaktadır. Bulgular, insersiyonel tendinopati için önleyici stratejilerin geliştirilmesine katkıda bulunmayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Sichuan Yüksek Geleneksel Çin Tıbbı Enstitüsü Bilim ve Teknoloji Departmanı tarafından belirlenen deney hayvanları için etik standartlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Onay No: 2023DS01). Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Deneysel tasarım ve prosedür

  1. Hayvan
    Otuz altı erkek, 12 haftalık CD-Sprague-Dawley sıçanı, deney süresi boyunca barındırıldı ve ad libitum beslenmesi sağlandı. Ortam, 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü ile 20-25 °C sıcaklıkta ve %50-%60 nem seviyesinde tutuldu.
  2. Grup tasarımı
    Bir haftalık adaptif beslenmeden sonra, sıçanlar rastgele bir kontrol grubuna (Con, n = 6) veya kapsamlı bir egzersiz grubuna (EE, n = 30) atandı. EE grubundaki sıçanlara üç gün boyunca 10 derece eğimli yokuş yukarı koşu bandında 15 dakika boyunca 10 m/dk hızla koşarak adaptasyon eğitimi verildi. Uyarlanabilir eğitimin ardından, EE grubu ayrıca beş zaman alt grubuna ayrıldı: 0 saat, 6 saat, 12 saat, 24 saat ve kapsamlı egzersizden sonra 48 saat.
  3. Müdahale prosedürü
    Kontrol grubundaki sıçanlar egzersiz yapmazken, EE grubundakiler 10 derecelik bir eğimle yokuş yukarı koşu bandında kapsamlı bir koşuya tabi tutuldu (Şekil 1A). Bedford protokolü9'u takiben, egzersiz yükü üç seviyeye ayrıldı: 10 m/dk'da 15 dakika Seviye 1, 15 dakika boyunca 15 m/dk'da Seviye 2 ve tükenene kadar 20 m/dk'da Seviye 3 (Şekil 1B). Tekrarlanan düşük yoğunluklu elektrik (150 V,0,5 mA alternatif akım) ve ses uyarımına (70 dB) rağmen, bir sıçan artık koşamadığında ve 1 dakika 10'dan daha kısa bir süre içinde üç kez yolda sıkışıp kaldığında yorgunluk belirlendi.

Sıçanlar, belirtilen zamanlarda (0 saat, 6 saat, 12 saat, 24 saat ve 48 saat egzersiz sonrası) aşırı intraperitoneal %3 sodyum pentobarbital (200 mg/kg) enjeksiyonu yoluyla sakrifiye edildi. Kalkaneusun deri ve deri altı dokuları dikkatlice diseke edildi ve Aşil tendonu oftalmik makasla kalkaneusun 2 cm yukarısından kesildi. Sağ kalkaneus (bağlı Aşil tendonu dahil), histopatolojik inceleme ve immünohistokimyasal testler için %4 paraformaldehit içinde korundu. Ek olarak, sol taraftan rastgele üç numune, ultrastrüktürel değişiklikleri incelemek için elektron mikroskobu için %2 paraformaldehit-%2.5 glutaraldehit çözeltisinde saklandı ( Şekil 1C).

2. Tendon-kemik bileşke histolojisi

Numuneler 48 saat boyunca %4 paraformaldehit içinde sabitlendi ve oda sıcaklığında (20-25 °C) 4 hafta boyunca %15 EDTA ile kireçten arındırıldı ve çözelti günlük olarak değiştirildi. Dekalsifikasyon işlemi, kemiğin herhangi bir kuvvet uygulanmadan bir iğne ile kolayca delinebildiği zaman sona erdi. Dekalsifikasyonun ardından numuneler, kademeli bir dizi etanol ve ksilen içeren otomatik bir işlemle dehidrasyona tabi tutuldu ve ardından PBS ile üç yıkama yapıldı. Numuneler sagital olarak parafine gömüldü ve 5 μm'de kesitlendi. Hematoksilen-eozin boyaması standart prosedürlere göre yapıldı ve görüntüler Panthera dijital trioküler mikrokamera sistemi ile ×20 ve ×40 büyütmede çekildi.

3. Elektron Mikroskobu taraması

Soldaki numunelere 48 saat boyunca %2 paraformaldehit-%2,5 glutaraldehit ön eki getirildi, daha sonra bir dizi aseton çözeltisi içinde kurutuldu, epoksi kürleme analizörüne sızdı ve sagital olarak gömüldü. Yarı ince kesitler, tendon-kemik bileşme bölgesini belirlemek için metilen mavisi kullanılarak boyandı. Yaklaşık 60-90 nm kalınlığındaki ultra ince kesitler elmas bıçak kullanılarak kesildi. Bu kesitler 10-15 dakika uranil asetat ile boyandı, ardından 1-2 dakika kurşun sitrat uygulandı. Kesitler, Transmisyon Elektron Mikroskobu altında 6000×,12000× ve 25000× büyütmelerde incelendi.

4. İmmünohistokimyasal test

Tendon-kemik bileşkesi rutin olarak dekalsifiye edildi ve daha önce tarif edildiği gibi kesitlendi. 10 dakika boyunca bir sitrat tampon antijen elde etme solüsyonu ile inkübasyondan sonra, numuneler endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için 10 dakika boyunca% 3 H2O2 ile muamele edildi, ardından 25 ° C'de 20 dakika boyunca normal keçi serumu ile bloke edildi. CHOP (1:100 ) ve Kaspaz-12 (1:100). Daha sonra numuneler 25 °C'de 2 saat boyunca ikincil antikorlarla inkübe edildi. Renk gelişimi, 25 °C'de 8 dakika boyunca DAB kullanılarak sağlandı ve kahverengi-sarı pozitif bir sinyalle sonuçlandı. Çekirdekler 3 dakika boyunca Hematoksilen ile yeniden boyandı. Ortalama yoğunluğu analiz etmek için Image-Pro Plus 6.0 yazılımı kullanıldı. Analiz için tendon-kemik bileşke bölgesinin üç ilgi alanı (tendon, fibrokartilaj ve mineralize fibrokartilaj) seçildi ve ortalama değer hesaplandı.

5. İstatistiksel analiz

Verileri analiz etmek ve grafikler oluşturmak için GraphPad Prism 8 kullanıldı. Tüm veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir. Farklı gruplar arasında karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA kullanılarak yapıldı ve ikili karşılaştırmalar için En Az Anlamlı Fark (LSD) testi kullanıldı. < 0.05'lik bir P değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 2A'da gösterildiği gibi, kontrol grubunda, tendon-kemik bileşkesindeki kondrositler ve kollajen fibrositler düzenli olarak düzenlenir ve fibrokartilaj ile mineralize fibrokartilaj arasında gelgit işareti (sarı oklar) olarak bilinen düzgün mavi bir çizgi vardır. Kapsamlı egzersiz gruplarında tendon-kemik bileşkesinde ultrastrüktürel değişiklikler meydana geldi. Değişiklikler, kondrositlerde bir art?...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Entezler veya yerleştirme bölgeleri olarak da bilinen tendon-kemik birleşimi, tendonların kemiğe yerleştirilmesine izin verir ve bağların ve tendonların kemiğebağlandığı bir stres konsantrasyonu bölgesidir 4. Bir bağlantı noktası olarak ayak bileği hareketini kolaylaştırır, baldır kası kasılma kuvvetini ayak bağlarına ve tendonlarına iletir ve ayak bileği ve ayak hareketine katılır2. Tendon-kemik bileşkesi ar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (Hibe No. 23ZRYB03), Araştırma ve İnovasyon Ekibi Projesi'nden (TD-2022-04), Klinik Tıp Bilimi ve Eğitiminde İnovasyon Grubu ve Sichuan Geleneksel Çin Tıbbı Koleji'nin yanı sıra Sichuan Geleneksel Çin Tıbbı Eyalet İdaresi tarafından finanse edilen 2025 araştırma projesinden (25MSZX329) aldıkları destek için içten şükranlarını sunmak isterler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%2 paraformaldehit-%2,5 glutaraldehit çözeltisiMKBio, ÇinMM1515, Elektron mikroskopi taraması
Anti-Caspase12AntibodyHangzhou Huaan Biyoteknoloji A., Ltd.HA500144İmmünohistokimyasal test
Anti-CHOP AntikorHangzhou Huaan Biyoteknoloji A., Ltd.ET1703-05İmmünohistokimyasal test
Anti-GRP78 AntikorHangzhou Huaan Biyoteknoloji A., Ltd.ER1706-50İmmünohistokimyasal test
BiyomikroskopiMotic Industrial Group Co., Ltd. ÇİNBA210DigitalTendon-kemik birleşimi histolojisi için biyomikroskopi İmmünohistokimyasal test
CD-Sprague-Dawley fareleriPekin Vital River Laboratuvarı Hayvan Teknolojisi Şirketi, Ltd.SCXK2021-0007 CD
Sitrat tampon antijen geri alma çözümüZSGB-Bio, ÇinZLI-9065, İmmünohistokimyasal test
DAB   ZSGB-Bio, ÇinZLI-9018 İmmünohistokimyasal test
EDTASinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009717Hematoksilin-eozin boyama 
Epox 812Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.XW00000020Elektron mikroskopi taraması
Etanol Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009218Hematoksilin-eozin boyama 
GraphPad Prism 8 GraphPad Yazılımı, Inc.  GraphPad Prism 8 İstatistiksel analiz
H2O2 Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.011092708İmmünohistokimyasal test
Image-Pro Plus 6.0Media Cybernetics Co., Ltd. ABDImage-Pro Plus 6.0İmmünohistokimyasal test
Paraformaldehit Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.20230408Hematoksilin-eozin boyama  İmmünohistokimyasal test
PBSZSGB-Bio, ÇinZLI-9062Elektron mikroskopi taraması
Geçirim elektron mikroskobuJAPAN ELEKTRON OPTIK LABORATUVARI ŞIRKETI, LTDJEM-1400Flash, JaponyaElektron mikroskopi taraması
Rat & için Koşu Bandı FareBioMed Easy Technologies Co., Ltd  ÇİNSA101Koşu bandında kapsamlı egzersizler yaptım
KsilenSinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10023418Hematoksilin-eozin boyama 

Kaynaklar

  1. Li, H. Y., Hua, Y. H. Achilles tendinopathy: Current concepts about the basic science and clinical treatments. Biomed Res Int. 2016, 6492597 (2016).
  2. Tits, A., et al. Local anisotropy in mineralized fibrocartilage and subchondral bone beneath the tendon-bone interface. Sci Rep. 11 (1), 16534 (2021).
  3. Doschak, M. R., Zernicke, R. F. Structure, function and adaptation of bone-tendon and bone-ligament complexes. J Musculoskelet Neuronal Interact. 5 (1), 35-40 (2025).
  4. Benjamin, M., et al. Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites ('entheses') in relation to exercise and/or mechanical load. J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).
  5. Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
  6. Ozone, K., et al. Structural and pathological changes in the enthesis are influenced by the muscle contraction type during exercise. J Orthop Res. 40 (9), 2076-2088 (2022).
  7. Ozone, K., et al. Eccentric contraction-dominant exercise leads to molecular biological changes in enthesis and enthesopathy-like morphological changes. J Orthop Res. 41 (3), 511-523 (2023).
  8. da Silva, A. S. R., et al. Interleukin-6 modulates endoplasmic reticulum stress signaling and mitochondrial protein complexes in the kidney following acute exhaustive exercise. Cell Stress Chaperones. 30 (5), 100111 (2025).
  9. Wang, Y., et al. Effect of one-time high load exercise on skeletal muscle injury in rats of different genders: oxidative stress and mitochondrial responses. Acta Cir Bras. 37 (8), e370805 (2022).
  10. Świątkiewicz, M., et al. Increases in brain 1 H-MR glutamine and glutamate signals following acute exhaustive endurance exercise in the rat. Front Physiol. 8, 19 (2017).
  11. Sun, Y., et al. Reconstruction of large chronic rotator cuff tear can benefit from the bone-tendon composite autograft to restore the native bone-tendon interface. J Orthop Translat. 24, 175-182 (2020).
  12. Gögele, C., Hahn, J., Schulze-Tanzil, G. anatomical tissue engineering of the anterior cruciate ligament entheses. Int J Mol Sci. 24 (11), 9745 (2023).
  13. Sartori, J., et al. Three-dimensional imaging of the fibrous microstructure of Achilles tendon entheses in Mus musculus. J Anat. 233 (3), 370-380 (2018).
  14. Wang, L., et al. VEGF and BFGF expression and histological characteristics of the bone-tendon junction during acute injury healing. J Sports Sci Med. 13 (1), 15-21 (2014).
  15. Benjamin, M., Rufai, A., Ralphs, J. R. The mechanism of formation of bony spurs (enthesophytes) in the Achilles tendon. Arthritis Rheum. 43 (3), 576-583 (2000).
  16. Luo, J., et al. Animal model for tendinopathy. J Orthop Translat. 42, 43-56 (2023).
  17. Cook, J. L., et al. Revisiting the continuum model of tendon pathology: What is its merit in clinical practice and research. Br J Sports Med. 50 (19), 1187-1191 (2016).
  18. Yu, C., et al. Exercise effects on the biomechanical properties of the Achilles tendon: A narrative review. Biology (Basel). 11 (2), 172-184 (2022).
  19. Lu, H., et al. Treadmill running initiation times and bone-tendon interface repair in a murine rotator cuff repair model. J Orthop Res. 39 (9), 2017-2027 (2021).
  20. Schwarz, D. S., Blower, M. D. The endoplasmic reticulum: Structure, function and response to cellular signaling. Cell Mol Life Sci. 73 (1), 79-94 (2016).
  21. Oakes, S. A., Papa, F. R. The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology. Annu Rev Pathol. 10, 173-194 (2015).
  22. Celik, C., Lee, S. Y. T., Yap, W. S., Thibault, G. Endoplasmic reticulum stress and lipids in health and diseases. Prog Lipid Res. 89, 101198 (2023).
  23. Almanza, A., et al. Endoplasmic reticulum stress signaling - from basic mechanisms to clinical applications. FEBS J. 286 (2), 241-278 (2019).
  24. Huang, J., et al. Endoplasmic reticulum stress associates with the development of intervertebral disc degeneration. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1094394 (2023).
  25. Murata, N., et al. Insulin reduces endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis by decreasing mitochondrial hyperpolarization and caspase-12 in INS-1 pancreatic β-cells. Physiol Rep. 12 (12), e16106 (2024).
  26. Chen, Y., et al. Single-cell integration analysis of heterotopic ossification and fibrocartilage developmental lineage: Endoplasmic Reticulum Stress Effector Xbp1 transcriptionally regulates the notch signaling pathway to mediate fibrocartilage differentiation. Oxid Med Cell Longev. 2021, 7663366 (2021).
  27. Yao, Z., et al. Hydroxycamptothecin inhibits peritendinous adhesion via the endoplasmic reticulum stress-dependent apoptosis. Front Pharmacol. 10, 967 (2019).
  28. Yao, Z., et al. Hydroxycamptothecin prevents fibrotic pathways in fibroblasts in vitro. IUBMB Life. 71 (5), 653-662 (2019).
  29. Li, J., et al. Extracellular vesicles from hydroxycamptothecin primed umbilical cord stem cells enhance anti-adhesion potential for treatment of tendon injury. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 500 (2020).
  30. Liu, Y. C., et al. Alda-1, an activator of ALDH2, ameliorates Achilles tendinopathy in cellular and mouse models. Biochem Pharmacol. 175, 113919 (2020).
  31. Liu, C., et al. Tendon microstructural disruption promotes tendon-derived stem cells to express chondrogenic genes by activating endoplasmic reticulum stress. J Orthop Res. 41 (2), 290-299 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

JoVESay 225 te Bu Ay

İlgili makaleler