Yöntem makalesi

İmmün Hücre Profili Oluşturma için Nekrotizan Enterokolit ve Lamina Propria İzolasyonunun Yenidoğan Fare Modeli

DOI:

10.3791/69233

⸱

19 Eylül 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, nekrotizan enterokolitin (NEC) yenidoğan fare modelini ve ardından yenidoğan murin ince bağırsağından lamina propria bağışıklık hücrelerinin izolasyonunu özetlemektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nekrotizan enterokolit (NEC), yenidoğan bağırsağının ciddi bir inflamatuar hastalığıdır ve öncelikle erken doğmuş bebekleri etkiler. NEC, epitel hasarı, mikrobiyal disbiyoz ve genellikle bağırsak nekrozu ve sistemik inflamasyonla sonuçlanan düzensiz bir bağışıklık tepkisi ile karakterizedir. İnsan hastalığının temel yönlerini özetleyen deneysel fare modelleri, hastalığı yönlendiren ve terapötik gelişimi bilgilendiren mekanizmalara ilişkin anlayışımızı ilerletmede önemli olmuştur. Bu protokol, formül besleme, aralıklı hipoksi, lipopolisakkaritin (LPS) oral uygulaması ve NEC'li bir bebekten kültürlenen enterik bakterileri kullanan nekrotizan enterokolitin (NEC) köklü bir yenidoğan fare modelini tanımlar. Bu kombinasyon, insan bebeklerinde NEC ile tutarlı histolojik, transkripsiyonel ve immünolojik özellikleri güvenilir bir şekilde indükler ve bu alandaki birçok önemli keşfin temelini oluşturmuştur. Ek olarak, bu protokol, yenidoğan farelerin ince bağırsak lamina propriasından bağışıklık hücrelerinin izolasyonunu açıklar. Lamina propria hücre izolasyonu, akış sitometrisi yoluyla ayrıntılı bağışıklık hücresi profili oluşturulmasına olanak tanıyarak bağırsaktaki hem doğuştan gelen hem de adaptif hücre popülasyonlarının analizini kolaylaştırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nekrotizan enterokolit (NEC), neredeyse sadece prematüre yenidoğanları etkileyen, bağırsağın ciddi bir inflamatuar hastalığıdır. Çok düşük doğum ağırlıklı bebeklerin (<1500 g) yaklaşık %7-8'i NEC'den etkilenecektir ve cerrahi müdahale gerektiren yenidoğanlarda hastalığa bağlı ölüm oranları %50'ye yaklaşabilmektedir1. NEC'nin patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır; bununla birlikte, mevcut kanıtlar, NEC'nin olgunlaşmamış bir bağırsak bariyeri, düzensiz bağışıklık sinyali ve disbiyotik bir mikrobiyom 2,3,4 dahil olmak üzere birçok faktörün birleşiminden kaynaklandığını göstermektedir. Bu faktörlerin yakınsaması, özellikle toll benzeri reseptör 4'ün (TLR4) aktivasyonu yoluyla, bağırsakta inflamatuar yanıtları başlatabilir ve şiddetlendirebilir, bu da epitel hasarına ve apoptoz ve nekroz dahil olmak üzere çeşitli hücre ölümü türlerine neden olabilir 5,6. Bu protokolün amacı, insan yenidoğanlarında gözlenen bağırsak iltihabını ve pnömatozis intestinalis'i (bağırsak duvarı içindeki gaz) özetleyen ve hastalık patogenezinin mekanik olarak araştırılmasını sağlayan tekrarlanabilir ve fizyolojik olarak ilgili bir NEC fare modeli sunmaktır. Ek olarak, bu protokol, yenidoğan farelerin ince bağırsak lamina propriasından bağışıklık hücrelerinin izolasyonunu açıklar ve araştırmacıların akış sitometrisi yoluyla bağışıklık hücresi profili oluşturmasına olanak tanır.

Yenidoğan sıçanlar veya domuz yavruları 7,8 gibi daha büyük hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında, yenidoğan fare modelleri, daha düşük maliyet, transgenik hayvanlara daha fazla erişim ve daha büyük kohortlar üzerinde deneyler yapma yeteneği dahil olmak üzere birçok farklı avantaj sunar. Murin NEC modelleri, insan hastalardagözlenen NEC'nin karmaşık patofizyolojisini simüle etmek için öncelikle formül besleme, soğuk stres ve hipoksinin bir kombinasyonunu kullanır 7,8,9. Bununla birlikte, NEC'nin birçok fare modeli, geniş mikrobiyal stres faktörlerine veya mikrobiyotadaki yapay değişikliklere bağımlılıkları nedeniyle sınırlıdır ve bu da klinik uygunluklarını tehlikeye atabilir. Buna karşılık, bu protokolde açıklanan model, insan bebeklerdeNEC patogenezinde rol oynayan birkaç temel faktörü entegre ederek bu sınırlamaların üstesinden gelir 10,11. Spesifik olarak, bu model, bağırsak bariyeri bütünlüğünün 3,12 bozulmasında rol oynayan hipoksik stresi, bağırsak iltihabını indükleyen iyi karakterize edilmiş bir TLR4 ligandı olan lipopolisakkarit (LPS) ile takviye edilmiş bebek formülünün oral yoldan verilmesinin yanı sıra NEC totalisli bir hastadan kültürlenen enterik bakterilerle klinik olarak anlamlı disbiyom ile birleştirir. Bağırsak pan-nekrozu ile karakterize hastalığın en şiddetli şekli10,13. Modelimiz, klinik olarak ilgili ve hastalığa özgü bu stres faktörlerini entegre ederek, NEC'nin klinik ve moleküler özelliklerini doğru bir şekilde yansıtmaktadır. Ayrıca, araştırmacılara NEC patogenezinin altında yatan immün aracılı mekanizmaları sorgulamak için bir çerçeve sağlamak için bu protokol, akış sitometrisi analizi için yenidoğan murin ince bağırsağından lamina propria hücrelerinin izolasyonunu özetlemektedir. Bağırsak mukozal immün aktivitesinin ana bölgesi olan lamina propria, NEC ile ilişkili inflamasyonda merkezi bir rol oynayan yerleşik ve sızan immün hücrelerin dinamik bir repertuarını içerir14. Akış sitometrisi, bu bağışıklık hücresi popülasyonlarını yüksek çözünürlükle karakterize etmek için sağlam ve ölçeklenebilir bir platform sağlayarak hücresel fenotiplerin ayrıntılı analizini, bağışıklık tepkilerinin nicelleştirilmesini ve NEC patogenezinde yer alan immünolojik imzaların tanımlanmasını sağlar15.

Bu protokolde özetlenen murin NEC modeli, yenidoğan bağırsağının karmaşık ortamında konakçı-mikrobiyom etkileşimlerinin, bağışıklık tepkilerinin ve inflamatuar sinyalleşmenin incelenmesini sağlayarak in vitro modelleri tamamlar. NEC patogenezinin in vitro modellenemeyen temel yönlerini yeniden üretir, bu da onu hastalık mekanizmalarını aydınlatmak ve terapötik stratejileri değerlendirmek için değerli bir araç haline getirir. Türe özgü farklılıklar bir sınırlama olmaya devam etse de bu model, NEC anlayışımızı ilerletmek ve hedefe yönelik müdahalelerin geliştirilmesini hızlandırmak için sağlam ve erişilebilir bir platform sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yöntemler, Chapel Hill Tıp Fakültesi'ndeki Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından sağlanan etik yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi. Fareler, Chapel Hill Tıp Fakültesi'ndeki Kuzey Carolina Üniversitesi'nin IACUC (protokol no. 24-114) tarafından onaylanan bir çalışma önerisi kapsamında Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzunda açıklanan prosedürlere göre yetiştirildi, bakımı yapıldı ve barındırıldı. Bu çalışmada açıklanan tüm deneyler için C57BL/6J fareleri kullanıldı. Modelde yavrular doğum sonrası 4. günde, 1.8-2.3 g ağırlığında başlatıldı; Bu ağırlık aralığının dışındaki hayvanlar hariç tutuldu. Deney kohortları, tedavi edilen hayvanların yaklaşık %50'sini oluşturan erkek ve dişilerin her biri ile dengeli bir cinsiyet dağılımına sahipti. Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Murin NEC modeli

NOT: Enterik bakteri stoğu, NEC'nin en şiddetli formu olan NEC toplamı 13,16'ya sahip bir bebekten enterik içeriklerin elde edilmesiyle üretilir. Enterik içerikler gece boyunca 1 x g'da 37 °C'de 16 saat kültürlenir, 3000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjlenir ve %50 gliserol içinde yeniden süspanse edilir. 20 μL'lik alikotlar dondurarak saklama şişelerine pipetlenir ve uzun süreli depolama için -80 °C'de saklanır. Bu protokolde seçilen kültür zamanları, iş akışı verimliliği için seçilmiştir. Bu zaman noktaları, genel modeli etkilemeden bireysel laboratuvar programlarına uyum sağlamak için gerektiği gibi ayarlanabilir. Ek olarak, bu protokol maksimum 40 fare kapasitesi için optimize edilmiştir, ancak gerektiğinde ölçeklendirilebilir.

  1. Bakteri kültürü hazırlama
    1. Deney günü 0'da, saat 15:00'te, NEC totalisli bir bebekten kültürlenen 20 μL'lik bir enterik bakteri alikotunu, 2 mL Luria-Bertani (LB) suyu içeren 15 mL'lik bir kültür tüpüne ekleyin. Bakteri kültürünü, tüp kapağı havalandırmalı pozisyonda 37 ° C'de, 1 x g'da, gece boyunca 16 saat boyunca bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin ve herhangi bir LB kontaminasyonunu değerlendirmek için bir kontrol olarak aynı anda sadece 2 mL LB suyu içeren bir kültür tüpünü inkübe edin.
      1. Bakteri kültürü ile berrak, yalnızca LB kontrolü arasındaki bulanıklığı karşılaştırarak gece kültürünü görsel olarak doğrulayın; yalnızca bakteri kültürü bulanık görünüyorsa ve kontrol temiz kalırsa devam edin.
    2. Deney günü 1'de, saat 07:00'de, aşılanmış gece kültürünün 125 μL'sini, 25 mL LB suyu içeren havalandırmalı bir kapaklı bir T75 hücre kültürü şişesine ayırın. Toplamda dört T75 şişesi hazırlayın ve bakteri kültürünü genişletmek için bunları 37°C, 1 x g'da bir orbital çalkalayıcıda dik konumda 2 saat inkübe edin.
      NOT: Gece kültürleri NEC modelinin 0, 1 ve 2. deney günlerinde hazırlanır.
  2. Yavruları deney gruplarına tahsis etmek
    1. Deney günü 1: 07:00'de, doğum sonrası 4. gün yavrularını tartın.
      NOT: Optimum ağırlık aralığı 1,8-2,3 g arasındadır ve aykırı değerler deneyden çıkarılmalıdır.
    2. Deney farelerini formülle beslenen ve barajla beslenen kohortlar halinde gruplandırın ve formülle beslenen farelerin ortalama ağırlığını hesaplayın. Belirlenen formülle beslenen fareleri barajdan ayırın ve önceden 37 ° C'ye ısıtılmış bir bebek kuvözüne yerleştirilmiş yeni bir kafese yerleştirin. Barajla beslenen yavruları barajla birlikte orijinal kafeste tutun.
      NOT: Yenidoğan fareler ortam sıcaklığındaki değişikliklere karşı özellikle hassastır. Barajdan ayrıldıktan sonra tutarlı sıcaklık düzenlemesini sürdürmek için, formülle beslenen yavrular, 37 °C'ye ayarlanmış, sıcaklık kontrollü bir bebek kuvözünde tutulur. Bu yaklaşım, ek termal müdahaleler 11,17,18,19 kullanılmadan fizyolojik sıcaklığı koruyan yerleşik NEC protokolleri ile tutarlıdır.
    3. Formülle beslenen fareleri tartarak ve günlük 07:00 beslenme zaman noktasından önceki ortalama ağırlığı hesaplayarak deney 2. ve 3. günlerinde tekrarlayın.
  3. Bakteri kültürünün Optik Yoğunluğunun (OD) Ölçülmesi
    1. 37 ° C'de ve 1 x g'da 2 saatlik inkübasyondan sonra, deney günleri 1, 2 ve 3'te genişletilmiş kültüre sahip dört T75 şişesini orbital çalkalayıcıdan çıkarın. Dört T75 şişesinin içeriğini birleştirin, iyice karıştırın ve 1 mL bakteri kültürünü bir küvete pipetleyin.
      1. Bir küvete 1 mL steril LB suyu ekleyerek boş bir çözelti hazırlayın. Bakteri kültürünün optik yoğunluğunu bir spektrofotometre ile 600 nm'de (OD600nm) ölçün.
        NOT: Hedef OD600nm 0,6 ± 0,02'dir. Bakteri kültürünün OD600nm'si hedef değerin altındaysa, adım 1.3.1'de açıklandığı gibi inkübasyona devam edin. 600 ± 0.6 hedef OD 0.02nm'ye ulaşılana kadar. OD600nm 0.6'nın üzerindeyse, bakteri kültürünü steril LB suyu ile seyreltin.
    2. 80 mL bakteri kültürünü iki adet 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 3000 x g'da santrifüjleyin. Her tüpün dibinde görünür bir pelet olup olmadığını kontrol ederek başarılı kültürü onaylayın.
  4. Formül hazırlama
    1. Formül hazırlamaya 1, 2 ve 3. deneysel günlerde saat 09:00'da başlayın. 16 mL bebek maması ve 8 mL yavru köpek sütünü steril 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 2:1 oranında birleştirin.
    2. Peletlenmiş bakteri kültürü içeren iki adet 50 mL'lik santrifüj tüpünden süpernatanı çıkarın (adım 1.3.2).
    3. İki peletin her birini 2 mL formül karışımında iyice yeniden süspanse edin ve 24 mL NEC formülü yapmak için yeniden süspansiyonu formül karışımına aktarın.
      NOT: NEC formülündeki nihai bakteri konsantrasyonu 4 ila 5 x 109 CFU / mL arasında olmalıdır.
    4. Altı besleme zaman noktasının (10:00, 13:00, 16:00, 19:00, 22:00, 07:00) her biri için altı adet 50 mL'lik santrifüj tüpünü etiketleyin.
    5. Etiketli her tüpe 4 mL NEC formülü pipetleyin.
    6. Altı adet tek kullanımlık LPS (5 mg/mL) stoğu hazırlayın ve -20°C'de düşük bağlayıcı mikrotüplerde saklayın. Her zaman noktasında beslemeden hemen önce NEC formülüne LPS ekleyin (konsantrasyon için NOT'a bakın).
      NOT: NEC formülüne eklenen LPS miktarı, yavruların vücut ağırlığının gramı başına 5 μg LPS dozu kullanılarak her gün saat 07:00'de hesaplanan formülle beslenen yavruların ortalama vücut ağırlığına dayanmaktadır. Nihai LPS konsantrasyonu vücut ağırlığına göre değişir. Örneğin, 80 μL'lik bir besleme hacmi ve 2 gramlık ortalama yavru kohort ağırlığı ile formüldeki LPS konsantrasyonu 0,125 mg/mL olacaktır.
  5. Besleme
    NOT: Deney 1. gününde, NEC modeline yerleştirilecek fareler, barajlarından ayrıldıktan sonra 3 saat aç bırakılır. İlk NEC formül beslemesi saat 10:00'dadır ve 22:00'ye kadar her 3 saatte bir devam eder. Deney 2. ve 3. günlerde fareler 07:00, 10:00, 13:00, 16:00, 19:00 ve 22:00'de beslenir. Fareler deney 4. gününde beslenmez.
    1. Fareleri beslemeden hemen önce, 15 saniye boyunca LPS'nin bir kısmını çözün ve girdap yapın. Farelerin ortalama ağırlığına göre uygun miktarda LPS'yi hazırlanmış 4 mL'lik NEC formülü tüpüne ekleyin (hesaplama için adım 1.4.6'ya bakın) ve pipetleme yoluyla iyice karıştırın.
    2. 1 mL'lik bir şırıngayı NEC formülü ile doldurun ve yenidoğan periferik olarak yerleştirilmiş bir santral kateter (PICC) hattı takın. Şırıngada veya PICC hattında kabarcık veya hava olmadığından emin olun.
    3. NEC formülünü PICC hattı ile oral gavaj yoluyla yavrulara uygulayın.
      1. Her yavruyu boynunun tabanındaki gevşek deriden nazikçe tutun ve fareyi dik konumda tutun. Forseps kullanarak, PICC hattının distal ucunu orofarenks ve yemek borusuna yönlendirin ve PICC hattının ucunu mide içinde konumlandırın.
        NOT: PICC çizgisinin yerleştirme mesafesi, ağız köşesinden midedeki süt noktasının tepesine kadar olan mesafeye eşittir. Optimum ekleme noktası daha sonra kalıcı bir işaretleyici kullanılarak PICC çizgisi üzerinde açıkça işaretlenmelidir.
      2. PICC hattının yerleştirilmesi sırasında önemli bir direnç hissedilirse, PICC hattını çıkarın, yeniden konumlandırın ve yerleştirmeyi dikkatlice yeniden deneyin.
      3. 8 μL NEC formülünü mideye yavaşça dağıtın ve yavruyu beslenme boyunca aspirasyon belirtileri açısından yakından izleyin. Başarılı mide doğumunu doğrulamak için beyaz süt lekesinin görünümünü gözlemleyin.
      4. PICC hattını çıkarın. Yavruyu herhangi bir nefes darlığı veya kusma açısından gözlemleyin. Yavru formülü kusarsa, ağzını ve burnunu az tüy bırakan bir laboratuvar mendiliyle kurulayın.
    4. Bu işlemi her besleme zaman noktasında tekrarlayın.
    5. Günde iki kez, yavruları 13:00 ve 19:00 beslenme saatlerinden hemen sonra 10 dakika hipoksiye maruz bırakın.
      1. Günde iki beslemeden sonra, yavruları %95 nitrojen ve %5 oksijen içeren bir gaz tankına bağlı bir hipoksi odasına yerleştirin. Tank vanasını açın ve el tipi bir monitör kullanarak kapalı hipoksi odasındaki oksijen seviyelerini izleyin. Hipoksi odası %5± %0,5 oksijene ulaştığında, yavruları 10 dakika boyunca bu oksijen seviyesinde tutun.
        NOT: Akış hızı, 2 dakikalık bir süre boyunca sabit, kontrollü bir oranda %20'den %5 oksijene düşecek şekilde optimize edilmelidir.
    6. Fare yavrularını beslemeler arasında herhangi bir solunum sıkıntısı, soluk renk değişikliği veya apne belirtisi açısından izleyin. Bu belirtiler mevcutsa, etkilenen yavruyu hipoksi odasından çıkarın, iyileşmeyi dikkatlice izleyin ve gerekirse yavrulara IACUC politikasına uygun olarak ötenazi yapın.
    7. NEC modelinin 72 saatlik süresinin tamamı boyunca planlanan zaman noktalarında oral gavaj beslemesine ve hipoksiye maruz kalmaya devam edin.
      NOT: Deney günü 1 Pazartesi günü saat 10:00'da başlarsa, 72 saatlik bitiş noktası Perşembe günü saat 10:00'da gerçekleşecektir. Bu, modelin 4. günü olarak belirlenmiştir. Fareler, modelin 4. gününde saat 07:00'de beslenmez ve doku toplama için bu son 10:00 zaman noktasında ötenazi yapılır.
  6. Hayvanlara ötenazi yapmak ve doku toplamak
    1. Modelin 4. gününün sabahında, her yavrunun cinsiyetini tartın ve kaydedin, ardından IACUC yönergelerine göre ötenazi yapın.
    2. Ötenaziyi takiben, her yavrudan kanı pıhtı aktivatörü ve jel içeren bir serum ayırıcı tüpe alın.
    3. Serumu ayırmak için 4 °C'de 20 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. Serumu etiketli 1,7 mL'lik tüplere pipetleyin ve -80 °C'de saklayın.
    4. Gastrointestinal sistemi ortaya çıkarmak için karın duvarı ve peritondan 1-2 cm'lik bir orta hat kesisi yapın. Açıkta kalan bağırsağı, şişkinlik, eritem, bağırsak duvarında gaz birikmesi (pnömatozis intestinalis) ve görünür hava kabarcıkları dahil olmak üzere NEC'nin ayırt edici özellikleri açısından inceleyin.
    5. Duodenumu distal rektumdan tanımlayın ve rezeke edin. Mendili buz üzerinde bir Petri kabına yerleştirin. Bağırsağı durulamak için buz gibi Fosfat Tamponlu Salin (PBS) kullanın.
    6. Çekumu tanımlayın ve çekum ve kolonu ince bağırsaktan ayırmak için proksimal olarak kesin. Distal ileumdan başlayıp jejunuma doğru ilerleyen parçaları ayırın. Transkripsiyonel analiz için 1 cm'lik bir parçayı RNA lizis tamponu ve 1,5 mm zirkonyum oksit boncukları içeren bir tüpe buz üzerine yerleştirin.
      1. 1,5 cm'lik bir parçayı 24 G'lik künt uçlu bir iğneye bağlı PBS içeren bir şırınga ile yıkayın ve ardından 1 mL %4 paraformaldehit (PFA) içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. 1 cm'lik bir bağırsak parçasını dondurun ve protein analizi için -80 °C'de saklayın. 1 cm'lik bir bağırsak parçasını dondurun ve ek tahliller için -80 °C'de saklayın.
    7. Dokuyu homojenize etmek için bir boncuk çırpıcıda (5.50 m/s, 1.0 dk., döngü = 1.0, duraklama: 10 sn, 4 °C) RNA lizis tamponuna toplanan dokuyu işleyin, ardından -80 °C'de saklayın.
  7. Doku fiksasyonu
    1. %4 PFA'da toplanan doku parçalarını 24 saat sabitlemek için 4 °C'de bir külbütör üzerine yerleştirin. 24 saat sonra, her tüpten %4 PFA'yı çıkarın ve dokuyu yıkamak için 1 mL PBS ile değiştirin. Tüpleri 4 °C'de 15 dakika boyunca külbütöre geri koyun. PBS yıkamasını bir kez tekrarlayın.
      1. PBS'yi çıkarın ve her tüpe 1 mL %50 etanol ekleyin ve tüpleri 15 dakika boyunca 4 °C'de külbütöre geri koyun. %50 etanolü çıkarın ve 1 mL %70 etanol ekleyin ve doku parafin histoloji bloklarına işlenene kadar 4 °C'de saklayın.
        NOT: Daha fazla analiz için gerektiğinde ek bağırsak segmentleri veya dışkı örnekleri toplanabilir.

2. Lamina propria bağışıklık hücresi izolasyonu

NOT: Bu protokol, lamina propria hücrelerinin yaklaşık bir haftalıkken yenidoğan farelerden izolasyonu için optimize edilmiştir. Spektral akış sitometrisi için referans numunelere ihtiyaç duyulursa, sütten kesilenler (doğum sonrası 3-4. haftalar) kullanılabilir. Sütten kesme numuneleri için, protokolde belirtilen tüm reaktif hacimlerini iki katına çıkarın.

  1. Reaktiflerin hazırlanması
    1. 10mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) içerenCa2+ veMg2+ (HBSS W/O) içermeyen 1x Hank's dengeli tuz çözeltisi hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
    2. %5 sığır serum albüminini (BSA) PBS + 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içinde çözerek floresanla aktive olan hücre ayırma (FACS) tamponunu hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
    3. Lamina propria hücre izolasyonu gerçekleştirmeden bir gün önce, HBSS W/O'ya 5 mM EDTA, %5 fetal sığır serumu (FBS) ve 1 mM ditiyotreitol (DTT) ekleyerek ön sindirim solüsyonu hazırlayın.
    4. Roswell Park Memorial Institute 1640 ortamını (RPMI) %10 FBS ve mg/mL kollajenaz IV ile destekleyerek lamina propria hücre izolasyonunu gerçekleştirmeden hemen önce sindirim solüsyonu hazırlayın.
      NOT: HBSS W/O önceden hazırlanabilir ve oda sıcaklığında saklanabilir. FACS tamponu önceden hazırlanmalı ve 4 °C'de saklanmalıdır. Ön sindirim ve sindirim çözeltileri, lamina propria izolasyonu yapılmadan hemen önce taze olarak hazırlanmalı ve buz üzerinde tutulmalıdır.
  2. Bağırsak dokusunun toplanması ve sindirim için hazırlanması
    1. Çekumu bulun ve çekum ve kolonu çıkarmak için proksimalde kesin. Distal ince bağırsağın (ileum) 2-3 cm'lik kısmını çıkarın ve bir petri kabında buz gibi soğuk HBSS W/O'ya yerleştirin (adım 1.6.5'ten devam ederek).
    2. Bir şırıngaya bağlı 24 G'lik künt uçlu bir iğne kullanarak, dokuyu forseps ile stabilize ederken bağırsak lümenini buz gibi soğuk HBSS W/O ile tamamen yıkayın. Yıkamadan sonra bağırsak lümeninin dışkı içermediğini görsel olarak onaylayın.
    3. İnce forseps veya makas kullanarak bağırsak segmentinden kalan bağ dokusunu dikkatlice çıkarın.
    4. Bağırsağı açmak için uzunlamasına kesin, ardından enine 1-1 cm segmentlere ayırın.
  3. Lamina propria ayrışması
    1. Bağırsak segmentlerini, buz üzerinde soğutulmuş 1 mL ön sindirim solüsyonu içeren 1 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
    2. Doku ayrışmasını kolaylaştırmak için numuneyi 37 °C'de 20 dakika boyunca sürekli rotasyonla inkübe edin.
    3. Tüpü hafifçe döndürün, ardından içeriği 5 mL'lik bir santrifüj tüpü üzerine yerleştirilmiş 10 μm'lik bir hücre süzgecinden dökün.
      NOT: 10 μm süzgeçten toplanan süzüntü intraepitelyal lenfositler (IEL'ler) içerir ve istenirse aşağı akış analizi için kullanılabilir.
    4. Doku parçalarını, 37 °C'ye kadar önceden ısıtılmış 10 mL sindirim solüsyonu içeren 15 mL'lik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, numuneyi sürekli rotasyonla 37 °C'de 40 dakika inkübe edin.
    5. Tüm numuneyi otomatik bir doku ayrışma tüpüne aktarın ve saat yönünde ve saat yönünün tersine değişen her biri 15 saniyelik dört dönüş döngüsünden oluşan ayrışma programını çalıştırın.
      NOT: Otomatik doku ayrıştırıcıya bir alternatif, iki mikroskop lamının buzlu uçlarını kullanarak bağırsak dokusunu manuel olarak öğütmektir. Bu yöntemi kullanıyorsanız, aşırı mekanik stresi önlemek için hafif, eşit basınç uygulayın, çünkü bu hücre canlılığını önemli ölçüde azaltabilir.
    6. Hücre süspansiyonunu yavaşça vorteksleyin, ardından numuneleri doku ayrışma tüpünde 300 × g'da 5 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
    7. Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin, ardından hücreleri mL buz gibi soğuk FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
    8. 5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 10 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Yeniden süspanse edilmiş hücre süspansiyonunu filtreden geçirin, ardından filtreyi ek bir mL buz gibi soğuk FACS tamponu ile yıkayın.
    9. Hücreleri sayın ve tripan mavisi veya canlılık boyası kullanarak canlılığı değerlendirin. Akış sitometrisi için gereken hacmi 30 × g'da 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin. Canlılığı ve işaretleyici ifadesini korumak için aşağı akış uygulamaları için hücreleri hemen kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde açıklanan NEC'nin yenidoğan fare modeli, hastalığın temel özelliklerini çoğaltır. Kaplan-Meier sağkalım analizi (Şekil 1A), NEC tedavi grubunda barajla beslenen kontrollere kıyasla sağkalımda önemli bir azalma olduğunu ortaya koydu (9/21'e karşı 8/8; p = 0.0063). Modele tabi tutulan farelerden alınan bağırsakların brüt muayenesi (Şekil 1B), bağırsak şişkinliği, hava kabarcıkları ve görünür pnömatozis i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, NEC'nin fizyolojik olarak ilgili bir yenidoğan fare modelini lamina propria immün hücre izolasyonu ile bütünleştirerek, bağırsak iltihabı sırasında mukozal immün tepkileri araştırmak için kapsamlı bir platform sağlar. İnsan NEC vakalarından enterik mikrobiyom, hipoksik stres ve formül besleme gibi klinik olarak ilgili maruziyetleri birleştirerek, bu model insan hastalığındagözlenen karmaşık ve çok faktörlü patogenezi özetlemektedir 10,13

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu makale ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale R01DK124614, R01HD105301, DP1DK140012, 2022-316749 numaralı Chan Zuckerberg Girişimi Hibesi, Yang Biyomedikal Akademisyen Ödülü ve Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi Pediatri Bölümü tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL Syringe-Tuberculin Slip TipBecton Dickinson309659Formül besleme şırıngası
1.5 mL semi-micro Disposable CuvettesBRAND GMBH + CO KG759085D
1.7 ml Microtubes ClearAxygen - Corning Inc.MCT-175-CNonpryogenic & Rnase-/Dnase-free
5% Oxygen, Balance Nitrogen Certified Reference Material, Size 200 High Pressure Steel Cylinger, CGA 580AirgasX02NI95C2003186
Anti-Mo CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-85
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-86
APC anti-mouse Ly-6C Clone: HK1.4 Isotype: Rat IgGcBioLegend128015
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222
BB515 Rat Anti-CD11b Clone: M1/70BD Biosciences564455
BB700 Rat Anti-Mouse CD4 Clone: RM4-5BD Biosciences566408
BD Microtainer SSTBecton Dickinson365867Serum Tüpü
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p1200Fisher Scientific12-111-365
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p20Fisher Scientific12-111-366
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p200Fisher Scientific12-111-362
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563795
BUV615 Rat Anti-Mouse Ly-6G Clone: 1A8BD Biosciences751263
BV650 Rat Anti-Mouse I-A/I-E Clone: M5/114.15.2BD Biosciences563415
C57BL/6J Neonatal MiceThe Jackson Laboratory000664
CD45-VioGreen mouseMiltenyi Biotec 130-102-412
CD64 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 770, REAfinity Clone REA286Miltenyi Biotec 130-119-659
CFX Opus Real-Time PC Systems Bio-Rad12011319
Collagenase Type 4Worthington Biochemical Corporation LS004188
DL-dithiothreitol SigmaD9779-5g
eBioscience FOXP3/Transcription Factor Staining Buffer SetLife Technologies Corp. 00-5523-00
EDTA (0.5M), pH 8.0Quality Biological Inc351-027-721
Esbilac Puppy Milk ReplacerPet-Ag, Inc.99502-1Köpek Yavrusu Süt Ürünü
Fisherbrand Disposable CuvettesFisher Scientific14-955-127
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 10mLFisher Scientific13-678-11E
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 25mLFisher Scientific13-678-11
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 50mLFisher Scientific13-678-11F
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 5mLFisher Scientific13-678-11D
Genie Temp-Shaker 300USA Scientific, Inc.SI-G1600
gentleMACS Dissociator (protocol; m_intestine-01)Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS  C TubesMiltenyi Biotec 130096334
Ghost Dye Red 780 Viability DyeTonbo Biosciences13-0865-T100
Glycerol ReagentPlusSigma-AldrichG7757-500ML
GraphPad Prims Software, Version 10.0GraphPadN/A
Greiner Bio-One Round Bottom Polypropylene Culture Tube with Two-Position Vent StopperFisher Scientific07-000-212
Handi+ Oxygen analyzerMaxtecN/A
Hanks' Balanced Salt SolutionGibco141650-095
HEPES BufferMediatech, Inc. 25-060-CI
Hypoxia ChamberBillups-Rothenburg, Inc.N/A
ImageJSchneider et al., 2012N/A
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 10.2cmFisher Scientific12-460-655
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 9cmFisher Scientific12-460-598
Integra Miltex™ Swiss Jeweler-Style ForcepsFisher Scientific12-460-110
Isolette Infant IncubatorAir-Shields VickersC100-200-2 Series 02Fare için inkübatör
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task WipesKimberly-Clark34120
LPSSigma-AldrichL3129-10mg
Luria Broth Broth, Miller Molecular Genetics PowderFisher ScientificBP1426-500
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec 130-091-376
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec 130-090-753
Microcentrifuge TubesThermo Scientific34511.5 ml, clear, graduated, sterile
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermoFisher ScientificND-ONEC-W
Ohaus scout portable balanceFisher Scientific3025302

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of necrotizing enterocolitis: A systematic review and meta-analysis. BMC Pediatr. 20 (1), 344(2020).
  2. Warner, B. B., Tarr, P. I. Necrotizing enterocolitis and preterm infant gut bacteria. Semin Fetal Neonatal Med. 21 (6), 394-399 (2016).
  3. Rose, A. T., Patel, R. M. A critical analysis of risk factors for necrotizing enterocolitis. Semin Fetal Neonatal Med. 23 (6), 374-379 (2018).
  4. Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: Modeling the innate immune response. Am J Pathol. 185 (1), 4-16 (2015).
  5. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair1. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  6. Hackam, D. J., Sodhi, C. P. Toll-like receptor-mediated intestinal inflammatory imbalance in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 6 (2), 229-238.e1 (2018).
  7. Sulistyo, A., Rahman, A., Biouss, G., Antounians, L., Zani, A. Animal models of necrotizing enterocolitis: Review of the literature and state of the art. Innov Surg Sci. 3 (2), 87-92 (2018).
  8. Lopez, C. M., et al. Models of necrotizing enterocolitis. Semin Perinatol. 47 (1), 151695(2023).
  9. Jilling, T., et al. The roles of bacteria and TLR4 in rat and murine models of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 177 (5), 3273-3282 (2006).
  10. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A mouse model of necrotizing enterocolitis. Methods Mol Biol. 2321, 101-110 (2021).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protoc. 2 (4), 100951(2021).
  12. Kaplina, A., et al. Necrotizing enterocolitis: The role of hypoxia, gut microbiome, and microbial metabolites. Int J Mol Sci. 24 (3), 2471(2023).
  13. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus hn001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: Evidence in mice for a role of TLR9. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  14. Denning, T. L., Bhatia, A. M., Kane, A. F., Patel, R. M., Denning, P. W. Pathogenesis of nec: Role of the innate and adaptive immune response. Semin Perinatol. 41 (1), 15-28 (2017).
  15. Yu, Y. -R. A., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLOS ONE. 11 (3), e0150606(2016).
  16. Mihi, B., et al. Interleukin-22 signaling attenuates necrotizing enterocolitis by promoting epithelial cell regeneration. Cell Rep Med. 2 (6), 100320(2021).
  17. Bautista, G. M., Cera, A. J., Chaaban, H., Mcelroy, S. J. State-of-the-art review and update of in vivo models of necrotizing enterocolitis. Front Pediatr. 11, 1161342(2023).
  18. Sodhi, C. P., et al. The human milk oligosaccharides 2'-fucosyllactose and 6'-sialyllactose protect against the development of necrotizing enterocolitis by inhibiting toll-like receptor 4 signaling. Pediatr Res. 89 (1), 91-101 (2021).
  19. Blum, L., Vincent, D., Boettcher, M., Knopf, J. Immunological aspects of necrotizing enterocolitis models: A review. Front Immunol. 15, 1434281(2024).
  20. Nolan, L. S., et al. Indole-3-carbinol-dependent aryl hydrocarbon receptor signaling attenuates the inflammatory response in experimental necrotizing enterocolitis. Immunohorizons. 5 (4), 193-209 (2021).
  21. Valle-Noguera, A., Gómez-Sánchez, M. J., Girard-Madoux, M. J. H., Cruz-Adalia, A. Optimized protocol for characterization of mouse gut innate lymphoid cells. Front Immunol. 11, 563414(2020).
  22. Booth, J. S., et al. Characterization and functional properties of gastric tissue-resident memory T cells from children, adults, and the elderly. Front Immunol. 5, 294(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ba rsak EnflamasyonuAk Sitometrisimm n H cre zolasyonuEpitelial HasarMikrobiyal DisbiyozAdaptif mm n H creler

İlgili makaleler