Yöntem makalesi

Retinol İzotop Sulandırma Tekniği ile İnsan Bireylere Uygulanacak Vitamin A İzleyici Dozlarının Formülasyonu

186 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69240

⸱

31 Mart 2026

 , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Fera Science Ltd

Bu makalede

Özet

Retinol izotop seyreltme tekniği için gerekli olan stabil izotop etiketli vitamin A'nın hazırlanması, gıda güvenliği standartlarına uygun olmalıdır. Protokol, bitkisel yağda dozaj hazırlamanın, seçilen dağıtım sistemi ve uygulanan analitik platforma uygun konsantrasyonlarda gösterilir.

Özet

Retinol izotop seyreltme (RID) tekniği, izotopik olarak etiketlenmiş A vitamini izleyicilerinin insanlara uygulanmasına dayanır. Burada, araştırma ekiplerine hem araştırma çalışmaları hem de popülasyon anketleri için stabil A vitamini izotop izleyicileri nasıl hazırlanacağı konusunda rehberlik eden bir yöntem sunuyoruz. Makale, izleyicilerin insan tüketimi için güvenli olmasını sağlamak için malzemelerin hazırlanması, gerekli ekipman ve prosedürlerin hazırlanması, tedarikleri ve prosedürlere genel bir bakış sunmaktadır. Vitamin A stabil izotop izleyicileri ticari olarak elde edilebilir ve genellikle %>95 tamamen trans izomer saflığı ve %>99 izotop zenginleştirme ile ya deuteryum [2H] veya karbon-13 [13C] ile etiketlenir. A vitamini stabil izotop izleyicilerinin hazırlanması, izleyicinin sonikasyon ve ısıyla yenilebilir bitkisel yağda çözülmesini içerir. İzleyiciler, teslimat sisteminin hacimsel sınırları içinde bir konsantrasyonda hazırlanmalıdır. Son olarak, izleyici steril amber cam şişelere aliquote edilir ve izleyici konsantrasyonları spektrofotometrik olarak doğrulanır.

Giriş

Vitamin A eksikliğini azaltmaya yönelik müdahale programlarının etkili izlenmesini mümkün kılmak için, retinol izotop seyreltme (RID) yöntemi, çeşitli popülasyon gruplarında toplam vücut vitamin A depoları (TBS) hakkında bilgi sağlamak amacıyla başarılı bir şekilde uygulanmıştır 1,2,3,4. Serumretinol 5, serum retinol bağlayıcı protein (RBP)6,7,8 ve modifiye edilmiş göreli doz yanıtı (MRDR)testleri 9 genellikle vitamin A eksikliğini doğrulamak için kullanılırken, RID, tüm vücut vitamin A depolarını tam spektrum boyunca doğru şekilde niceleyen tek yöntemdir — subklinik eksikliktentoksisiteye 3,10 kadar. Bilinen bir dozda etiketlenmiş A vitamini uygulanarak ve denge sonrası plazmada seyreltilmesini ölçerek, RID yöntemi TBS ve karaciğer vitamin Arezervleri 11,12'nin kesin tahminlerini sağlar. Önemli olarak, RID yöntemi iltihaplı popülasyonlarda bile güvenilir kalır; bu da müdahale etkinliğini değerlendirmek ve örtüşen takviye ve güçlendirme programlarında toksisite risklerini değerlendirmek için vazgeçilmezhale gelir 13,14.

RID yöntemini uygulamak için, izotopik olarak etiketlenmiş A vitamini, çoğu durumda yenilebilir bitkisel yağda çözünmüş retinil asetat olan ağızdan retinil ester dozu olarak verilmelidir. Çoğu laboratuvar, ticari tedarikçilerden izotop etiketli Avitamini temin eder: 1,3,7,15,16,17,18,19,20,21,22. Neredeyse tüm ticari olarak mevcut olan vitamin A izotopları karbon-13 [13C] veya döteryum [2H] gibi stabil izotoplarla etiketlenmiştir (Tablo 1). Uygulanan izotop dozunun seçimi, kütle etiketli retinolün serum veya plazma konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan analitik alete bağlıdır. Gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS) ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) hem [13C] hem de [2H]22,23,24,25,26,27 analiz edebilirken, gaz kromatografisi-yanma-izotop oranı kütle spektrometrisi (GC-C-IRMS) yalnızca [13C] etiketli retinol izleyicileri 4,25 analiz edebilir,28. Seçilen analitik aletin tespit sınırları, hedef grup (çocuklar veya yetişkinler) ve inceleme süresi, uygulanması gereken dozun boyutunubelirleyecektir 3,25,29. Bugüne kadar, uygulanan izotop dozları çocuklarda 0,3 - 4,3 mg retinol eşdeğeri (RE; 1 - 15 μmol RE eşdeğer)ve yetişkinlerde 0,6 - 10,0 mg RE (2 - 35 μmol RE)arasında değişmiştir (2,3,31). Daha yeni çalışmalar ise çocuklarda 0,3 - 0,6 mg RE (1 - 3 μmol RE) ve yetişkinlerde 0,6 - 2,0 mg RE (2 - 7 μmol RE) arasında daha düşük dozlar uygulamıştır. Dozdaki yüksek bir vitamin A kütlesinin vitamin A'nın temel kinetik sistemini bozabileceği endişeleri ortaya çıksa da, bölümsel modelleme kullanılarak yapılan yakın tarihli bir analiz, çocuklar için 7 μmol RE veya yetişkinler için 14 μmol RE kadar yüksek izotop dozlarının TBS tahminlerinin doğruluğunu etkilememesigerektiğini doğruladı 29. Burada, RID yöntemi için ağız uygulaması için izotop etiketli bir izleyicinin nasıl hazırlanacağını göstereceğiz; gıda güvenliği endişeleri dikkate alınarak ve doğru doz konsantrasyonları elde edilecektir. İzotop doz hazırlanması, RID yöntemi için hayati öneme sahiptir.

Protokol

Çalışma 1, Birleşik Krallık Klinik Araştırma Ağı (UKCRN: 7413) ile kayıt yapılmadan önce Ulusal Araştırma Etik Servisi, Kuzeydoğu Sunderland Komitesi (REC 09/H0904/20) tarafından onaylandı. Çalışma 2, Filipinler Üniversitesi Manila Araştırma Etik Kurulu (IRB ID: UPMREB 2016-282-01), UC Davis'teki Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB ID: 903681-2) tarafından onaylanmış ve ClinicalTrials.gov (ID: NCT03030339) olarak kaydedilmiştir. Çalışma 2, Bill ve Melinda Gates Vakfı tarafından finanse edilen GloVitAS projesinin bir parçasıydı (OPP1115464: Büyük ölçekli gıda takviyesi ve diğer müdahaleler nedeniyle vitamin A toksisitesi riskinin değerlendirilmesi). Georg Lietz, GloVitAS projesinin baş araştırmacıydı ve saha çalışmasının uygulanmasını denetledi. Çalışma protokolünün genel bir özeti Şekil 1'de verilmiştir.

1. Dahil etme ve dışlama kriterleri

  1. Çalışma 1 için verilen kriterler şunlardı: Dahil etme kriterleri: 18-45 yaş aralığında sağlıklı erkek ve kadın gönüllüleri içermek. Dışlama kriterleri: Hamilelik, sigara içen, yüksek tansiyon, diyabet, BMI >30, karaciğer/böbrek/gastrointestinal hastalıklar, lipid metabolik bozuklukları ve çalışmanın başlamasından 3 ay önce multivitamin (A, C, E vitaminleri içeren) veya β-karoten takviyesi tüketen gönüllüleri hariç tutun.
  2. 2. çalışmada verilen kriterler şunlardı: Dahil etme kriterleri: Çalışma süresince çalışma alanında kalan 12-18 aylık çocukları dahil etmek. Dışlama kriterleri: Çocuklar yüksek doz A vitamini takviyesi almamışsa ve yerel pazarlarda A vitamini takviyesi ile güçlendirilmiş gıdalara maruz kalmamış bölgelerde yaşıyorsa dışlanın.

2. RID için kararlı izotop izleyicisinin toplam miktarının belirlenmesi

  1. Her deneğe izomer saflığı dikkate alınarak ne kadar kararlı izotop izleyici alması gerektiğine karar verin. Biyolojik aktivite ve metabolik yolların geometrik izomerler arasında önemli farklılıklar göstermesi nedeniyle, %>95 tamamen trans saflıkta vitamin A stabil izotopların kullanılması önerilir. Retinol karşılığı (RE) temelinde doz seviyesini hesaplayın. Bunun nasıl hesaplandığına dair bir örnek Tablo 2'de verilmiştir.
  2. Doz seviyesini toplam denek sayısıyla çarp. Güç hesaplamalarında gerekli örneklem büyüklüğüne göre temel toplam denek sayısı (örneğin Tablo 2'ye bakınız). Pipetleme kayıplarını %20'ye kadar hesaba katarak toplam izleyici miktarını artırın.
    NOT: Kural olarak, izotop hazırlığında fazladan bir miktar içermelidir, çünkü tüm materyali şişeden geri almak mümkün değildir. Pipet ucunun dışında kalan yağın viskozitesi nedeniyle kayıplar da meydana gelir. Teslimat sırasında dozun doğru hacmini elde etmek için, pipet ucunun dışındaki fazla yağın silinmesi gerekir. Operatörler, pipet ucu yağa çok derin batırılmazsa pipet kayıplarını en aza indirebilirler.

3. Kararlı izotop izleyicisini çözmek için gereken bitkisel yağ miktarının belirlenmesi

  1. Hangi bitkisel yağı kullanacağınıza ve denek başına doz hacmine karar verin (Tablo 2). Katılımcıların dozlanması sırasında kullanılan teslimat sistemiyle eklenen yağ miktarını belirleyin.
    NOT: Ayçiçeği yağı, yüksek E vitamini içeriği nedeniyle kullanıyoruz; bu da A vitaminipreparatının 32,33 stabilitesini artırır. Ancak, yerel diyet normlarını karşılamak için diğer gruplar tarafından başka bitkisel yağlar da kullanılmıştır. RID, stabil izotop etiketli izleyicilerin doğru teslimatına dayandığından, yenilebilir yağda hazırlanmış doz uygulaması için pozitif yer değiştirmeli pipet kullanılması önerilir. Son çalışmaların çoğu, özellikle doz 1,7,23 numaralı çocuklara verildiğinde 250 μL'ye kadar hacimler kullanmıştır.
  2. [mg/mL] bitkisel yağda stabil izotop izleyicisinin doz konsantrasyonunu hesaplayın. Toplam bitkisel yağ hacmini belirleyin. Hesablanan hacmi ve bitkisel yağın göreceli yoğunluğuna dayanarak gereken yağın ağırlığını hesaplayın (örnek için Tablo 2'ye bakınız).
    NOT: Doğruluk için, stabil izotop izleyici hazırlamak için yağın tartılması önerilir. Gerekli yağın toplam hacmi hesaplandıktan sonra, kararlı izotop etiketli izleyici sipariş edilebilir. İzotop izleyicisinin, araştırma ekibinin bitkisel yağı doğrudan izotop etiketli izleyiciyi içeren şişeye tartmasını sağlayacak yeterli hacimli bir şişede gönderilmesini talep etmek önemlidir.

4. Gıda hazırlığı için özel alanlarda kararlı izotop etiketli izleyicinin hazırlanması

  1. Önceden belirlenmiş kararlı izotop izotop izleyicisinin toplam miktarını içeren amber şişenin kapağını dikkatlice açın ve bunu analitik bir trebe üzerine yerleştirin; bu tuzak sıfıra kadar katarlanmıştır.
  2. Yağı damla damla ekleyin ve istenen ağırlık elde edilene kadar (± 0,1 g hassasiyetle) steril 10 mL bir şırınga ile elde edile.
    NOT: Bazı retinil-asetat kristalleri kehribar şişenin kapağının içinde sıkışmış olabileceğinden, şişe çok dikkatli açılmalıdır. Bitkisel yağı kehribar şişeye eklendikten sonra, kapağı dikkatlice şişeye geri konur, ardından kapağın içinde kalan retinil asetat kristalleri tekrar askıya alınmak için elle dikkatlice silkelenir.
  3. Şişeyi ultrasonik güçte 14 W/L ve çalışma frekansı: 44 kHz olan sonikasyon su banyosuna yerleştirin. Su ile şişedeki yağ seviyesinin üzerinde, kapak seviyesinin altında doldurun, böylece suyun yanlışlıkla hazırlanmaya girmesini önleyin.
  4. Şişeyi 15 dakika sonikle geçirin, ardından dikkatlice elle karıştırın, ardından 15 dakika daha sonikasyon yapın. Sonikasyon su banyosunun sıcaklığının 50 °C'yi aşmaması dikkat edilmelidir.
    NOT: Hazırlık için ayçiçeği yağı kullanarak, doz 30 dakika boyunca 50 °C'ye maruz kaldığında cis retinoidlere izomerizasyonun gerçekleşmediğini tespit ettik (bkz. Şekil 2). Ancak, preparatlar HPLC ile termal izomerizasyonun boyutunu değerlendirmek için analiz edilmelidir.
  5. Şişeyi 50 °C'de ısıtılmış su banyosuna 30 dakika boyunca koyun, böylece mikrokristaller tamamen çözülür.
  6. Laboratuvarda ışık mikroskobu altında 200x büyütme ile mikrokristallerin olup olmadığını kontrol etmek için 20 μL yağ örneği alın. Mikrokristaller varsa, sonikasyon ve ısıtma prosedürünü tekrarlayın.
  7. Tam çözünürme sağlandıktan sonra, toplam yağ preparatını 2 - 4 mL steril cam amber şişelere aliquot yapın. Bu işlem için çapraz kontaminasyonu önlemek için pozitif yer değiştirmeli pipetler kullanın.
    NOT: Cam amber şişelere eklenen kararlı izotop izleyici hacmi, günlük toplama oranına göre yönlendirilebilir; örneğin, günde 5 denek alınıyorsa ve doz hacmi 150 μL ise, şişenin 5 doz artı pipetleme kayıplarını karşılayacak kadar hacmi içermesi gerekir: 5 x 150 μL x 1.2 = 900 μL.
  8. Üçlü olarak kararlı izotop konsantrasyonunu belirleyin. Sabit izotopun etiketli izotopu hazırlama sırasında ayrı 2 mL amber şişelerde 200 μL saf bitkisel yağı (spektrofotometrik boşluk hazırlamak için kullanılır) ve 200 - 350 μL stabil izotop dozunu ayrı 2 mL amber şişelerde rezerve edin.
    1. Doz konsantrasyonu 0,5 mg RE ≤ ise, stabil izotopun 350 μL'sini ayrı bir 2 mL amber şişede rezerve edin. 0,5 mg RE > doz konsantrasyonları için, stabil izotop dozundan 200 μL ayrı bir 2 mL amber şişede rezerve edin.
  9. Şişeleri, izotop etiketli izleyicinin potansiyel oksidasyonunu geciktirmek için inert bir gaz (Ar) ile örtün, sıkıca kapatın ve izotop konsantrasyonu, doz hacmi (sonradan belirlenen), hazırlanma tarihi ve proje adı ile etiketlenmiş bir kriyoboxta saklanın. Kriyokutuyu -20 °C sıcaklığında dondurucuda saklayın, ta ki sevkiyata kadar. Bu koşullar altında, iz dozu en az 2 yıl stabil kalır.

5. Laboratuvarda kararlı izotop izleyici konsantrasyonunun belirlenmesi

  1. Stabil izotop izleyicisini n-heksan ile 3 hacimsel şişede seyreltirin. İzleyici dozunu eklemeden önce hacimli termosları n-heksan ile kalibrasyon çizgisinin 1 cm altına kadar doldurun.
    1. Stabil izotop izleyicisinin izleyici doz konsantrasyonu ile seyreltmesini belirleyin. Stabil izotop izleyicisinin doz konsantrasyonu 0,5 mg RE ≤ ise, stabil izotop dozunun 100 μL'sini 50 mL hacimsel bir şişede n-heksanlı seyreltin. Doz konsantrasyonu 0,5 - 2 mg RE arasındaysa, stabil izotop dozunun 50 μL ve n-heksan içeren 50 mL hacimli şişede alınır. Doz konsantrasyonu >2 mg RE ise, 100 mL hacimli bir şişede n-heksan içeren stabil izotop dozunun 50 μL'si kullanılır.
    2. Heksana doğrudan 50 veya 100 μL yağ verilir ve termos 50 veya 100 mL hacme ulaşır, ayrıca cam Pasteur pipeti kullanılarak ek heksan kullanılır. Yağı heksan ile karıştırmak için matayı 10 kez ters çevirin.
      DIKKAT: Heksan, uygun PPE giyilmiş bir duman dolabında tutulmalıdır. Atık heksan, onaylı bir müteahhit tarafından özel bir konteynerde toplanarak özel bertaraf edilir.
  2. Spektrofotometrik boş termos, stabil izotop izleyici (50 veya 100 μL) hacmindeki bitkisel yağı pipetleyip heksana dağıtarak hazırlayın. Uygulanan seyreltme (50 veya 100 mL) kararlı izotop izleyiciyle aynı olduğundan emin olun. Yağı heksan ile karıştırmak için matayı 10 kez ters çevirin.
    NOT: Stabil izotop izleyicisi veya saf yağ pipetlenmesinde 100 μL pozitif yer değiştirmeli pipet kullanılır. Doğru hacimlerin pipetlenmesini sağlamak için, ucun tüy içermeyen kağıtla aşağıya doğru silinmesi ve ucunun dışındaki kalıntı izleyici/yağ çıkarılması kritik öneme sahiptir. Doğrudan yedek pipet ucunu silerken dikkatli olunmalıdır; böylece kağıt uç açıklığına temas etmesin, çünkü yağ uç içinden çekilecektir.
  3. Spektrofotometre ile 325 nm dalga boyuna ayarlanmış bir spektrofotometre ile bir kuvars küvetinde kararlı izotop izleyici konsantrasyonlarını, spektrofotometrik boşluk olarak heksandaki bitkisel yağı kullanarak ölçün (örnek için Tablo 3'e bakınız).
    1. Ölçmelere heksan içindeki bitkisel yağı spektrofotometrik boşluk olarak kullanarak başlayın. Her ölçüm arasında kuvars UV küvetini 3 kez n-heksan ile durulayarak temizleyin. Tüm örnekler ölçüldükten sonra, küveti saf n-heksan ile dikkatlice temizleyin.
  4. Ortalama AU okumalarıyla kararlı izotop izleyicisinin konsantrasyonunu belirleyin ve Beer-Lambert yasası kullanılarak izotopa özgü azı sönme katsayısı uygulanır. Bundan, doz başına gereken hazırlanmış stabil izotop izotörünün hacmini hesaplayın (aşağıdaki örneklerde ve Tablo 3'te örneklere bakınız).

Sonuçlar

Toplam izotop izleyici doz boyutu hesaplaması
100 denek içeren bir örneklem büyüklüğü çalışması için, [13C10] retinil asetat miktarı, sentezlenmesi gereken [13C10] retinil asetat miktarını belirlemek için hesaplandı (Tablo 2). Bu miktar, gerekli örnek büyüklüğü (n = 100), beklenen kayıp (n=15; %15 kayıp), pipetleme kayıpları (%20) ve [13C10] retinil asetat konsantrasyonu (0,4 mg RE; uygulanan kütle spektrometresinin hassasiyeti, deneyin süresi ve denek yaş grubuna dayanarak) için güç hesaplamalarına dayanmaktadır. Elde edilen toplam RE miktarı (55,2 mg RE), [13C 10] retinil asetat (63 mg) için gerekli ağırlığına dönüştürülür.

[13C10] retinil asetatı istenen konsantrasyonda çözmek için gereken ayçiçeği yağı hacmini hesaplamak için, önce doz teslimat hacmini 150 μL/doz (0,15 mL/doz) olarak ayarlıyoruz. Bunun ardından, 1 mL ayçiçeği yağındaki [13C10] retinil asetat konsantrasyonu hesaplanır (Tablo 2). [13C10] retinil asetat (63 mg) için gerekli ağırlığı gerekli doz konsantrasyonuna bölersek, ihtiyaç duyulan toplam ayçiçeği yağı hacmi elde edilir. Son olarak, ayçiçeği yağının ağırlığı, ayçiçeği yağının göreceli yoğunluğu kullanılarak belirlenir.

Yağda [13C 10] retinil asetatın doğru hedef doz konsantrasyonu, Beer-Lambert yasasına dayalı bir spektrofotometre kullanılarak stabil izotop iz konsantrasyonları ölçülerek doğrulandı (Tablo 3). Ölçüm sırasında stabil izotop izleyicisinin seyreltilmesi (500 seyrelme faktörü) dikkate alındığında, yağda 2.58 μmol/μL [13C10] retinil asetat konsantrasyonu elde edilir. Bu nedenle, 0,4 mg RE dozu için gereken hazırlanmış stabil izotop izleyicisinin son hacmi 155 μL olarak belirlenmiştir (Tablo 3).

İzleyici dozunun potansiyel izomerizasyonu kontrol ediliyor
Elde edilen iz dozunun izomer saflığı, Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC; Şekil 2). Bunu yapmak için, 5.1.2. adımdan alınan seyreltilmiş iz çözeltisinden alınan bir örnek azot gazı altında kurutulmuş ve kalıntı enjeksiyon için %100 etanole yeniden çözünmüştür. 3 tekrarlayan örnek üzerinde HPLC analizi, herhangi bir cis-izomerizasyon olup olmadığını kontrol etmek için Liu ve ark.34 yöntemiyle gerçekleştirilmiştir (bkz. Şekil 2). İzleyici dozunun saflığı, çalışma boyunca dozun bozulmadığından emin olmak için izlenmeli olmalıdır.

İzleyici doz konsantrasyonlarının zamanla dozun fraksiyonu üzerindeki etkisi
Farklı doz seviyelerinin uygulanması, alınan dozun zamanla oranının değişmesine yol açar ve bu da analitik platformun [13C10] retinolünü gerekli zaman noktalarında tüm deneklerde tespit etme yeteneğini etkileyebilir. Yetişkinlerde (Şekil 3A) veya çocuklarda (Şekil 3B) yağda 1 mg veya 0,4 mg [13C10] retinil asetat uygulandığında, 1mg uygulandıktan sonra 0,4mg [13C10] retinil asetat ile karşılaştırıldığında daha yüksek doz oranı gösterdi ve uygulanan LC-MS/MS'nin [13C10] tespit etme yeteneğini doğruladı]deneklerde dozdan 28 gün sonra retinol. Bu, farklı zaman noktalarındaki doz fraksiyonuna ilişkin bilgilerin, uygulanan doz seviyesinin uygulanan analitik platformun tespit seviyesinin üzerinde sinyal almak için yeterince yüksek olup olmadığına karar vermek için kritik olduğunu ve bu bilginin ideal olarak temsilli örneklerle yapılan pilot çalışmada elde edilmesi gerektiğini doğrular.

figure-results-1
Şekil 1: Vitamin A iz dozlarının hazırlanması için akış şeması. Stabil izotop doz hazırlamanın temel adımları, gerekli miktarların belirlenmesi, elde edilen iz dozunun konsantrasyonu ve doz saflığının doğrulanması yer alır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Retinil asetatın izomerizasyonunu incelemek için izleyici dozunun HPLC kromatografisi. [13C 10] retinil asetatın (A) sonikasyon ve (B) ısıtılması ile 30 dakika boyunca 50 °C'ye ısıtılması ile her adımdan sonra izotop dozunun HPLC analizi kullanılarak değerlendirildi. Analiz, Liu ve ark.34 yöntemiyle bir HPLC ile diyot dizisi tespiti ile gerçekleştirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: [13C10] retinil asetat alındıktan sonra plazma retinol fraksiyonunun zamanla doz oranının gözlemlenen ortalamaları. (A) 45 Birleşik Krallıkyetişkininden doz fraksiyonu, 16 yaşlarında ve (B) 112 Filipinliçocuk, sırasıyla 1 mg veya 0,4 mg [13C10] retinil asetat dozu verildi. Doz fraksiyonu = {plazma [13C]retinol konsantrasyonu (μmol/L) X tahmini plazma hacmi (L) / [13C]doz (μmol). Veriler geometrik ortalama ± SEM olarak gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Kararlı izotopTedarikçi/Üretici
[D4]-retinil asetatBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge İzotop Laboratuvarı
[D6]-retinil asetatBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge İzotop Laboratuvarı
[D8]-retinil asetatBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge İzotop Laboratuvarı
[13C3]-retinil asetatBuchem BV/ReseaChem GmbH
[13C4]-retinil asetatBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge İzotop Laboratuvarı
[13C8]-retinil asetatBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge İzotop Laboratuvarı
[13C10]-retinil asetatBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge İzotop Laboratuvarı

Tablo 1: Ticari olarak mevcut stabil vitamin A izotop izotopları. Farklı tedarikçilerden 13C ve 2H etiketli retinil asetat izleyicilerinin listesi.

Parametreler
Örneklem büyüklüğü [n]:100
Kayıp [n] (%):15 (15%)
Pipetleme kayıpları:20%
MW [13C10]retinil asetat:338.5 μg/μmol
MW [13C10]retinol:296.46 μg/μmol
Doz boyutu:Gönüllü başına 0,4 mg RE [13C10] retinil asetat
Hesaplama
Toplam RE miktarı:= mg RE cinsinden doz boyutu x örnek boyutu x kayıp x pipetleme kayıpları
= 0.4 mg RE x 100 x 1.15 x 1.2
= 55.2 mg RE
Gerekli toplam [13C10] retinil asetat miktarı:= mg RE x MW [13C10]retinil asetat / MW [13C10]retinol
= 55,2 mg RE x 338,5 μg/μmol / 296,46 μg/μmol
= 63,0 mg [13C10] retinil asetat
Yağda [13C 10] retinil asetat doz konsantrasyonu:[13C10]retinil asetat [mg/ml] =
(mg RE x MW [13C10]retinil asetat / MW [13C10]retinol) / 0,15 ml
= (0,4 mg RE x 338,5 μg/μmol / 296,46 μg/μmol) / 0,15 ml
= 3,04 mg/ml
Toplam ayçiçeği yağı hacmi:= Toplam [13C10] retinil asetat ağırlığı / yağdaki doz konsantrasyonu
= 63.0 mg / 3.04 mg/ml
= 20.7 ml yağ
Gereken ayçiçeği yağı ağırlığı:= Toplam ayçiçeği yağı hacmi x göreli yoğunluk ayçiçeği yağı
= 20.7 ml x 0.92 g/ml
= 19.0 g ayçiçeği yağı

Tablo 2: Kararlı izotop izleyici doz boyutu hesaplamalarına örnek. İz dozu ve bitkisel yağı miktarlarını belirlemek için parametrelerin belirtilmesi ve hesaplamaları.

Parametreler
[13C10] retinil asetatın heksan içinde molar sönme katsayısı (E%1%1cm):52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm
Sulandırma faktörü:500 (50mL heksanda 100μL yağ hazırlığı)
Ölçülen ortalama soğurma:0.917
MW [13C10]retinol:296.46 μg/μmol
Hesaplama
Heksanda [13C 10] retinil asetat konsantrasyonu (mol/L):Konsantrasyon (mol/L) = Emilim/E 1%1cm x Küvetin uzunluğu (1cm)
= 0.917 / 52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm = 1.739 x 10-5 mol/L
Konsantrasyonun μmol/μl'ye dönüştürülmesi:Konsantrasyon (mol/L) = Konsantrasyon (μmol/μL)
1.739 x 10-5 mol/L, 1.739 x 10-5 μmol/μL'ye eşdeğerdir
Sulandırma için düzeltme:1.739 x 10-5 μmol/μL x 500 = 8.697 x 10-3 μmol/μL yağda
μL başına ağırlık (μg/μL):= [13C10]retinil asetat μmol/μL yağda x MW [13C10]retinol
= 8.697 x 10-3 μmol/μL x 296.45 μg/μmol = 2.58 μg/μL
Doz başına hacim:= Hacm (μL/ 400 μg doz) = 400μg / 2.58 μg/μL = 155 μL

Tablo 3: Kararlı izotop iz doz konsantrasyonunun belirlenmesi. İzleyici doz konsantrasyonlarını ve oral doz için gerekli hacimleri belirlemek için gerekli parametreler ve hesaplamalar.

Tartışma

İnsan çalışmalarında kullanılan kararlı izotop izleyicileri genellikle güvenli kabul edilir ve uygulanankonsantrasyonlarda olumsuz biyolojik veya fizyolojik etki bildirilmemektedir. Ancak, stabil izotop izleyicisinin ağızdan uygulanması gerektiğinden, iz dozunun gıda güvenliği standartlarına uygun olması şarttır. Bu, stabil izotop etiketli vitamin A tedarikçilerinden ve üreticilerinden, sağlanan 7,20,24 izotopları üzerinde gıda güvenliği testleri yapmalarını talep ederek sağlanabilir. Aynı şekilde, izotop hazırlama ve depolamanın yalnızca gıda hazırlama için özel alanlarda yapılması şarttır. Ayrıca, stabil izotopların hazırlanmasında kullanılan tüm ekipmanlar yalnızca izotop hazırlığına ayrılmalı ve gıda hazırlanma alanlarında tutulmalıdır.

Retinil asetat etiketli izotoplar daha önce etanol kullanılarak çözülmüş, ardından azot gazı altında kurutulmuş ve bitkiselyağda çözünmüştür. Burada, izotop etiketli izleyicinin sonikasyon ve ısı kombinasyonuyla bitkisel yağa çözünmesine olanak tanıyan bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, gıda hazırlık alanında daha kolay olsa da, izleyiciyi bitkisel yağda çözecek ısı uygulanırken dikkatli olunmalıdır. All-trans-retinol, ısı işlem sırasında 13-cis-retinol olarak izomerize edilir ve bu retinol daha yükseksıcaklıklarda hızlanır 37. Retinolün izomerizasyonu, ışığamaruz kalarak da artar. Ayrıca, retinolün stabilitesi, bitkisel yağ 32,38'in lipid oksidasyon özelliğinden etkilenir. Bitkisel yağdaki α tokoferol içeriği A vitaminitutma 32 üzerinde olumlu etkisi olduğu ve ayçiçek yağı α-tokoferol33 oranının en yüksek içeriklerinden birine sahip olduğundan, iz dozlarını hazırlamak için ayçiçeği yağı kullanmayı tercih ettik. İzleyicinin çözünmesi için 50°C'ye kadar ısı uygulanması kararı, kozmetik ürünlerde retinol kristallerini önemli kayıp olmadan çözmek için ısı uygulamasınadayanıyordu39. Tarif edilen protokol altında retinil asetatın anlamlı bir bozunması gözlemlememiş olsak da, ısı tedavisinden hemen sonra tracer dozunun cis izomerizasyonunu kontrol etmek hayati öneme sahiptir (Şekil 2). Ayrıca, uygulanan iz doz konsantrasyonunun doğrulanması için çalışma boyunca izleyici dozunun stabilitesinin izlenmesini öneriyoruz.

İzleyici, gerekli dozu vermek için kullanılan teslimat sisteminin hacimsel sınırları içinde bir konsantrasyonda hazırlanmalıdır. RID, stabil izotop etiketli izleyicilerin doğru teslimatına dayandığından, doz uygulaması için pozitif yer değiştirmeli pipet kullanılması önerilir. Geçmişte 1 mL'ye kadar doz boyutları yetişkinlereuygulanmış olsa da, 100 - 250 μL arasında hacimler uygulamak daha kolaydır, çünkü bu hacimlerin bebekler ve çocuklar tarafından iyi tolere edildiğigösterilmiştir 1. Alternatif olarak, dozlar kapsülform 17 halinde de uygulanabilir, ancak yağ sızıntısını önlemek ve çalışma popülasyonu içinde kabul edilebilirliği sağlamak için özel olarak tasarlanmış kapsüllerin seçilmesi şarttır. Son olarak, uygulanan doz seviyeleri, hedef popülasyonunyaş grubuna (29), uygulamalı analitik platformun düşükseviye 3'ü tespit etme yeteneğine ve hedef popülasyonun toplam vücut depolarına bağlıdır; daha yüksek toplam vücut depolarında daha düşük plazma oranıile 1.

Yukarıdaki örnekte belirtildiği gibi, [13C10] retinil asetat, ayçiçeği yağında 2,58 μg/μL konsantrasyonda, 155 μL ayçiçeği yağında 0,4 mg RE izleyici dozu sağlar ve bu doz 250 μL pozitif yer değiştirmeli pipet kullanılarak doğru şekilde verilebilir. Teslimat sisteminin hacimsel sınırları içinde konsantrasyonlar elde etmek için, izleyiciyi çözünürmek için seçilen bitkisel yağın, stabil izotop izleyicisini içeren şişeye analitik bir tartı (0,1 g doğruluk) doğru şekilde tartılması kritik öneme sahiptir. Örneğin, toplamda 63 mg [13C10] retinil asetat 3,04 mg/mL konsantrasyonda ayçiçek yağında hazırlanacaksa ve ayçiçeği yağının özgül ağırlığı 25 ◦C'de 0,92 g/mL ise, izleyici içeren şişeye 19,0 g (20,7 mL x 0,92 g/mL) yağ tartılmalıdır. Stabil izotop izleyicisinin nihai konsantrasyonu spektrofotometre ölçümüyle doğrulanacak olsa da, izotop izleyicisi ve uygulanan yağın doğru tartışı, elde edilen konsantrasyonların her doz için seçilen teslimat hacmine yakın olmasını garanti eder.

Şişe açıldıktan sonra 2 hafta içinde şişedeki tüm dozların kullanılmasını sağlamak için yağ hazırlıklarını beklenen günlük gereksinime göre aliquot yapmak tavsiye edilir. Yağ hazırlıklarını kullanım sırasında sahadaki buz paketlerinde tutmak ve dozlama tamamlandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede tekrar dondurmak en iyisidir. Yağ hazırlıkları tekrar eden dondurma ve erime döngülerinden etkilenmese de, kullanılmadığında ışıktan korunmaları ve dondurulmaları gerekir.

Özetle, bu protokol RID yöntemi için iz dozlarının hassas hazırlanmasını ve kalite kontrolünü detaylandırarak doğru dozlama, stabilite ve güvenliği sağlar. Yöntem, izleyici gereksinimlerini hesaplar, bitkisel yağda çözünürlüğü optimize eder ve spektrofotometri ile HPLC kullanarak saflık ve konsantrasyonu doğrular. Titiz işleme ve depolama rehberleri, doğru izotop tabanlı değerlendirmeler için güvenilir iz parça bütünlüğü garanti eder.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışmaya destek Bill & Melinda Gates Vakfı (Proje Numarası: OPP1115464) ve Viyana'daki Uluslararası Atom Enerjisi Ajansı (IAEA) (Proje Numarası E4.30.30) tarafından sağlandı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dozların alikotasyonu için 2ml kehribar cam şişelerFisher11573690Çalışmanın örneklem büyüklüğüne ve günlük dozlanan gönüllü sayısına bağlı olarak, daha büyük, örneğin 4ml amber şişeylerin kullanılması daha verimli olabilir
100ml hacimsel şişelerFisher11323644Pyrex Borosilicate Cam Sınıf A Sertifikalı Hacimsel Şişe
50ml hacimsel şişelerFisher11313644Pyrex Borosilicate Cam Sınıf A Sertifikalı Hacimsel Şişe
Analitik tartı terzileri Fisher13592970
Kapiler pistonlar (pipet uçları) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
2x91 CP1000ST kahiller pistonlarGilsonF148180
6x96 CP250ST kapillyar pistonlarGilsonF148714
Karton kriyoboxStarlabA9623-8181
Hellma cuvette UV kuvarsSLSCEL1600
HPLC sertifikalı HPLC için heksan %95 n-heksanFisherH/0406/17
2ml kehribar cam şişeler için kapaklarFisher11573542
Microman E M1000E Pipet (pozitif deplasman)GilsonFD10006
Microman E M100E Pipet (pozitif deplasman)GilsonFD10004
Microman E M250E Pipet (pozitif deplasman)GilsonFD10005
MikroskopNikonEclipse E400
Mikroskop cam slaytları Sigma41122601
Sonikasyon su banyosuVWRUSC100T
SpektrofotometreThermo Fisher ScientificA51119600C
Kararlı izotop etiketli retinil asetat izleyicisiBuchem BVYokRID yöntemi için çeşitli kararlı izotoplar kullanılabilir. Ticari olarak mevcut olan farklı izotopların listesi Tablo 1. 'de verilmiştir;
Karıştırılmamış su banyosuSLSSLS1176
Bitkisel yağıHerhangi bir marketteYokİzotop dozlarının hazırlanması için yeterli raf ömrüne sahip taze bitkisel yağ kullanmak önemlidir.
Volac fişsiz cam pastör pipeti 150mmSLSPIP4150

Kaynaklar

  1. Ford, J. L., et al. Use of Model-Based Compartmental Analysis and a Super-Child Design to Study Whole-Body Retinol Kinetics and Vitamin A Total Body Stores in Children from 3 Lower-Income Countries. J Nutr. 150 (2), 411-418 (2020).
  2. Haskell, M. J., Jamil, K. M., Peerson, J. M., Wahed, M. A., Brown, K. H. The paired deuterated retinol dilution technique can be used to estimate the daily vitamin A intake required to maintain a targeted whole body vitamin A pool size in men. J Nutr. 141 (3), 428-432 (2011).
  3. Lietz, G., et al. Current Capabilities and Limitations of Stable Isotope Techniques and Applied Mathematical Equations in Determining Whole-Body Vitamin A Status. Food Nutr Bull. 37, S87-S103 (2016).
  4. Pinkaew, S., et al. Triple-Fortified Rice Containing Vitamin A Reduced Marginal Vitamin A Deficiency and Increased Vitamin A Liver Stores in School-Aged Thai Children. J Nutr. 144 (4), 519-524 (2014).
  5. VMNIS: Serum retinol concentrations for determining the prevalence of vitamin A deficiency in populations. , World Health Organisation. https://www.who.int/publications/i/item/WHO-NMH-NHD-MNM-11.3 (2011).
  6. Engle-Stone, R., et al. Plasma retinol-binding protein predicts plasma retinol concentration in both infected and uninfected Cameroonian women and children. J Nutr. 141 (12), 2233-2241 (2011).
  7. Engle-Stone, R., et al. Filipino Children with High Usual Vitamin A Intakes and Exposure to Multiple Sources of Vitamin A Have Elevated Total Body Stores of Vitamin A But Do Not Show Clear Evidence of Vitamin A Toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  8. Larson, L. M., et al. Approaches to Assess Vitamin A Status in Settings of Inflammation: Biomarkers Reflecting Inflammation and Nutritional Determinants of Anemia (BRINDA) Project. Nutrients. 10 (8), (2018).
  9. Sheftel, J., Tanumihardjo, S. A. Systematic Review and Meta-Analysis of the Relative Dose-Response Tests to Assess Vitamin A Status. Adv Nutr. 12 (3), 904-941 (2021).
  10. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of Nutrition for Development (BOND)-Vitamin A Review. J Nutr. 146 (9), 1816-1848 (2016).
  11. Furr, H. C., et al. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  12. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).
  13. Green, M. H., Ford, J. L., Green, J. B. Development of a Compartmental Model to Investigate the Influence of Inflammation on Predictions of Vitamin A Total Body Stores by Retinol Isotope Dilution in Theoretical Humans. J Nutr. 151 (3), 731-741 (2021).
  14. Suri, D. J., et al. Association between Biomarkers of Inflammation and Total Liver Vitamin A Reserves Estimated by (13)C-Retinol Isotope Dilution among Preschool Children in 5 African Countries. J Nutr. 153 (13), 622-635 (2023).
  15. Furr, H. C., et al. Stable isotope dilution techniques for assessing vitamin A status and bioefficacy of provitamin A carotenoids in humans. Public Health Nutr. 8 (6), 596-607 (2005).
  16. Green, M. H., et al. A Retinol Isotope Dilution Equation Predicts Both Group and Individual Total Body Vitamin A Stores in Adults Based on Data from an Early Postdosing Blood Sample. J Nutr. 146 (10), 2137-2142 (2016).
  17. Green, M. H., et al. Use of Population-Based Compartmental Modeling and Retinol Isotope Dilution to Study Vitamin A Kinetics and Total Body Stores among Ghanaian Women of Reproductive Age. Curr Dev Nutr. 8 (11), 104484(2024).
  18. Haskell, M. J., et al. Population-based plasma kinetics of an oral dose of [2H4]retinyl acetate among preschool-aged, Peruvian children. Am J Clin Nutr. 77 (3), 681-686 (2003).
  19. Lopez-Teros, V., et al. Use of a "Super-child'' Approach to Assess the Vitamin A Equivalence of Moringa oleifera Leaves, Develop a Compartmental Model for Vitamin A Kinetics, and Estimate Vitamin A Total Body Stores in Young Mexican Children. J Nutr. 147 (12), 2356-2363 (2017).
  20. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of beta-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  21. Ribaya-Mercado, J. D., et al. Quantitative assessment of total body stores of vitamin A in adults with the use of a 3-d deuterated-retinol-dilution procedure. Am J Clin Nutr. 77 (3), 694-699 (2003).
  22. Tang, G. W., Qin, J., Hao, L. Y., Yin, S. A., Russell, R. M. Use of a short-term isotope-dilution method for determining the vitamin A status of children. Am J Clin Nutr. 76 (2), 413-418 (2002).
  23. Oxley, A., et al. Determination of Vitamin A Total Body Stores in Children from Dried Serum Spots: Application in a Low- and Middle-Income Country Community Setting. J Nutr. 151 (5), 1341-1346 (2021).
  24. Oxley, A., Lietz, G. Use of stable isotopes to study bioconversion and bioefficacy of provitamin A carotenoids. Methods Enzymol. 670, 399-422 (2022).
  25. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  26. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. Deuterium enrichment of retinol in humans determined by gas chromatography electron capture negative chemical ionization mass spectrometry. J Nutr Biochem. 9 (7), 408-414 (1998).
  27. Wang, J., et al. Vitamin A equivalence of spirulina beta-carotene in Chinese adults as assessed by using a stable-isotope reference method. Am J Clin Nutr. 87 (6), 1730-1737 (2008).
  28. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  29. Green, M. H., Lopez-Teros, V., Green, J. B. Does the Amount of Stable Isotope Dose Influence Retinol Kinetic Responses and Predictions of Vitamin A Total Body Stores by the Retinol Isotope Dilution Method in Theoretical Children and Adults. J Nutr. 152 (1), 86-93 (2022).
  30. Ribaya-Mercado, J. D., et al. Bioconversion of plant carotenoids to vitamin A in Filipino school-age children varies inversely with vitamin A status. Faseb J. 14 (4), A486-A486 (2000).
  31. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).
  32. Hemery, Y. M., et al. Influence of light exposure and oxidative status on the stability of vitamins A and D3 during the storage of fortified soybean oil. Food Chem. 184, 90-98 (2015).
  33. Shahidi, F., de Camargo, A. C. Tocopherols and Tocotrienols in Common and Emerging Dietary Sources: Occurrence, Applications, and Health Benefits. Int J Mol Sci. 17 (10), (2016).
  34. Liu, Z., Lee, H. J., Garofalo, F., Jenkins, D. J. A., El-Sohemy, A. Simultaneous Measurement of Three Tocopherols, All-trans-retinol, and Eight Carotenoids in Human Plasma by Isocratic Liquid Chromatography. J Chromatograph Sci. 49 (3), 221-227 (2011).
  35. Davies, P. S. W. Stable isotopes: their use and safety in human nutrition studies. Eur J Clin Nutr. 74 (3), 362-365 (2020).
  36. Haskell, M. J., Ribaya-Mercado, J. D. Handbook on Vitamin A Tracer Dilution Methods to Assess Status and Evaluate Intervention Programs. , Harvest Plus Technical Monographs. (2005).
  37. Han, S. H., et al. Quantitative characterization of degradation behaviors of antioxidants stabilized in lipid particles. Talanta. 71 (5), 2129-2133 (2007).
  38. Park, H., Mun, S., Kim, Y. R. UV and storage stability of retinol contained in oil-in-water nanoemulsions. Food Chem. 272, 404-410 (2019).
  39. Retinol 50C, 15D and 10S. , BASF. https://www.skinident.world/fileadmin/img/spanish-pictures/pdf/BASF_Vitamin_A.pdf (2005).
  40. Green, M. H., et al. Plasma Retinol Kinetics and beta-Carotene Bioefficacy Are Quantified by Model-Based Compartmental Analysis in Healthy Young Adults with Low Vitamin A Stores. J Nutr. 146 (10), 2129-2136 (2016).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kararl zotop zleyicisizotopik Zenginle tirmezleyici Haz rlamaSpektrofotometrik Do rulamaD teryum EtiketlemesiKarbon 13 EtiketlemesiBitkisel Ya da z nd rme
Retinol İzotop Sulandırma Tekniği ile İnsan Bireylere Uygulanacak Vitamin A İzleyici Dozlarının Formülasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.