Multipleks floresan immünolojik testler, seroloji testleri için bir referans haline geliyor. Ancak bunların uygulamaları, karmaşıklık ve zaman alıcı boncuk-analit birleştirme işlemleri nedeniyle sınırlıdır. Bu rapor, standart yöntemle karşılaştırılabilir ve sonuç alma süresini önemli ölçüde azaltan yarı otomatik, tekrarlanabilir bir multipleks mikroküre boncuk birleştirme protokolü sunar.
Yöntem makalesi
Arbovirüslere Karşı Antikor Yanıtlarının Tespiti için Multipleks Serolojik Test
Bu makalede
Özet
Özet
Eklembacaklı kaynaklı virüsler (arbovirüsler), küresel olarak dağılmış bir grup sivrisinek kaynaklı patojendir. Amerika'da 2016 yılında bu enfeksiyonları kamuoyunun bilincine taşıyan Zika virüsü (ZIKV) salgınından bu yana, arbovirüsler önemli bir halk sağlığı yükü oluşturmaya devam ediyor. Daha önce endemik olmayan bölgelerde ortaya çıkmaları halk sağlığı endişesine neden olmaktadır. Arboviral enfeksiyonların sürveyansı ve kontrolü, 2024 yılında arboviral hastalıklarla mücadele için küresel bir stratejik plan başlatan Dünya Sağlık Örgütü (WHO) için mevcut bir önceliktir. Multipleks® teknolojisi, minimum numune hacmi gerektirirken birden fazla antikorun aynı anda ölçülmesine izin vererek serolojik sürveyans alanında devrim yarattı. Multipleks serolojik testlerin geliştirilmesindeki uzmanlığa dayanarak, arbovirüs antijenlerine karşı antikorların tespiti için boncuk bazlı bir multipleks test geliştirildi. Test, dang humması (DENV), sarı humma (YFV), Zika ve chikungunya (CHIKV) virüsleri dahil olmak üzere yaygın arbovirüslere özgü çok sayıda antijen içerir. Antijenleri mikroküre boncuklarına kovalent olarak bağlamak için yarı otomatik bir yöntem kullanıldı. Bu yeni protokol son derece etkilidir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlarken tek bir deneyde 96'ya kadar antijenin bağlanmasını sağlar. Medyan Floresan Yoğunluğu (MFI) verileri, kullanıcı dostu bir floresan görüntüleme sistemi kullanılarak elde edildi. Endemik ülkelerden alınan insan serum örneklerine uygulandığında, bu testin sero-sürveyans çabaları için güçlü bir araç oluşturacağını tahmin ediyoruz.
Giriş
Arbovirüsler toplu olarak her yıl binlerce ölüme neden olur. Bu virüsler, çoğunlukla sivrisinekler ve keneler olmak üzere enfekte eklembacaklılar yoluyla insanlara bulaşır. Arboviral enfeksiyonların şiddeti çeşitlidir ve asemptomatik enfeksiyondan ölüme yol açabilecek ciddi hastalığa kadar değişir. 2024 yılında Dünya Sağlık Örgütü (WHO), yalnızca dang virüsünün (DENV) dört serotipinin neden olduğu 10.000'den fazla ölüm kaydetti1. Aynı yıl virüs, 50.000'i ağır vaka olmak üzere 14 milyondan fazla kişiye bulaştı1. DENV en belirgin arbovirüs olsa da, grup dünya çapında birden fazla salgından sorumlu olan yaşamı tehdit eden diğer patojenleri içerir. Afrika'daki arboviral enfeksiyonlara ilişkin yakın tarihli bir özet inceleme, DENV, sarı humma virüsü (YFV), chikungunya virüsü (CHIKV), Kırım-Kongo kanamalı ateşi virüsü (CCHFV), Rift Vadisi ateşi virüsü (RVFV), Batı Nil virüsü (WNV) ve Zika virüsü (ZIKV) dahil olmak üzere bu virüslerin 2023'te kıta genelinde en az 29 salgına neden olduğunu ortaya koymuştur2. 2022 yılında DSÖ Afrika Bölge Ofisi tarafından yayınlanan bir rapor, bölge genelinde arbovirüs sürveyansındaki mevcut sınırlamaları vurguladı ve arbovirüs sürveyansı ve kontrolü için acil yöntemler geliştirme ihtiyacını vurguladı3.
Arboviral enfeksiyonların klinik tanısı, endemik bölgelerde bulunan diğer patojenlerde ortak olan ateş, artralji ve genel halsizlik gibi semptomlardaki benzerlikler nedeniyle zordur4. Ek olarak, virüslerin birlikte dolaşımı ve potansiyel olarak birlikte enfeksiyonu nedeniyle, etiyolojik patojenin ayrımı zordur5. Ayırıcı tanı için laboratuvar doğrulaması çok önemlidir. İnsan örneklerinde arborvirüslerin tespiti için çeşitli yöntemler mevcuttur. Moleküler tanı testleri, viral antijen tespiti ve viral izolasyon dahil olmak üzere doğrudan yöntemler patojenin varlığını tespit ederken, serolojik tanı gibi dolaylı yöntemler viral enfeksiyona karşı bağışıklık tepkisini ölçer6.
Arbovirüslere karşı antikor yanıtlarının tespiti için çok sayıda yöntem geliştirilmiştir. Bunlar arasında enzime bağlı immünosorbent testleri (ELISA'lar), kompleman fiksasyonu, hemaglutinasyon inhibisyonu ve mikroküre immünolojik testleri 6,7 bulunur. Bu rapor, arbovirüs antijenlerine karşı antikor yanıtlarının tespiti için multipleks floresan mikroküre tabanlı bir immünolojik test (FMIA) sunmaktadır. Mikroküre bazlı tahliller8, serolojide yaygın olarak kullanılmaktadır ve en önemlisi, minimum numune hacmi ile tek bir reaksiyonda birden fazla analitin saptanması yeteneği olmak üzere çeşitli avantajlar sunar. İlgilenilen rekombinant antijenlerle kaplanmış optik olarak kodlanmış mikroküreler (manyetik polistiren boncuklar), dolaylı bir serolojik immünolojik testte kullanılır. Birleştirilmiş boncuklar daha sonra numunelerle inkübe edilir ve antijene özgü antikorlar, bir Phycoerythrin (PE) florofor raportörüne konjuge edilmiş bir anti-insan IgG ikincil antikoru kullanılarak tespit edilir. MFI olarak bildirilen yayılan floresansın tespiti için çeşitli analizörler mevcuttur.
Testin prensibi Angeloni ve ark.8'de detaylandırılmıştır. Kısaca, ilgilenilen antijenler, renk kodlu mikrokürelere kimyasal olarak bağlanır. Bunun için boncuklar başlangıçta boncukların yüzeyindeki karboksil grubunu aktive ederek amin-reaktif bir bileşik oluşturan 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] Karbodiimid (EDC) ve N-hidroksisülfosüksinimid (sülfo-NHS) ile işlenir. Bu ara yarı kararlı bileşik daha sonra ilgilenilen protein ile karıştırılır, bu sayede proteinin amin kısımları boncuklara kovalent olarak bağlanır ve yüzeyde ilgilenilen protein ile kaplanmış stabil mikro boncuklar oluşturulur. Antijene bağlı boncuklar, antikorların spesifik antijenlere bağlanmasına izin veren numunelerle inkübe edilir. Antijene bağlı antikorlar, bir floresan boyaya konjuge edilmiş bir anti-immünoglobulin sekonder antikoru kullanılarak tespit edilir. PE etiketli sekonder antikor kullanıyoruz. MFI'ler bir ışık görüntüleyici kullanılarak ölçülür (cihazın ayrıntıları Malzeme Tablosunda verilmiştir). Cihaz, boncukların iç boyalarını ve boncukların 9 yüzeyinde bir raportör floresansını ayrı ayrı uyaran bir kırmızı LED ve bir yeşil LED olmak üzere iki LED ışığıkullanır. Filtreler daha sonra boncukları renge göre sınıflandırmak ve analitler tarafından yayılan floresansı ölçmek için kullanılır.
Teknolojiyi daha önce SARS-CoV-210 ve aşı ile önlenebilir hastalıklara11 karşı antikor yanıtlarının tespiti için uyguladık ve multipleks tahlillerin seroprevalans ve sürveyans çalışmaları için paha biçilmez bir araç oluşturduğunu gösterdik. Bu projenin amacı, testi Afrika bölgesinden alınan tarama örneklerine uygulamak amacıyla FMIA'nın kullanımını arbovirüslere ait çoklu antijenlere karşı antikor yanıtlarının saptanmasına genişletmektir.
Multipleks teknolojisini kullanan Arbovirüs multipleks deneyleri, yapısal olmayan protein 1 (NS1)12,13 veya zarf alanı III (EDIII)14 gibi farklı antijen hedefleri kullanılarak başka yerlerde tanımlanmıştır. Bölgede birlikte dolaşan patojenleri test etmek için 26 arbovirüs antijeni (NS1, EDIII, viral benzeri parçacıklar (VLP'ler) ve diğer birçok antijen dahil) içeren 50 katlı bir test sunulmaktadır. Test, bu patojenler için bulaşma yoğunluğunun değerlendirilmesine izin verecektir. Testin geliştirilmesi için kullanılan rekombinant antijenlerin bir özeti Tablo 1'de verilmiştir. Bu raporda sunulan protokol, arbovirüslerin tespitini optimize etmeye odaklanan kapsamlı bir yöntem geliştirme çalışmasının tamamlayıcısı olarak geliştirilmiştir.
Normalde, antijenlerin mikroküre boncuklarına bağlanması (veya fiksasyonu) tek tüplerde8 gerçekleştirilir (manuel bağlama). Bu süreç zaman alıcıdır, hantaldır ve tekrarlanabilirlik hatalarına açıktır. Bu makale, antijenlerin boncuklara kimyasal olarak bağlanmasında yer alan ardışık adımları gerçekleştirmek için otomatik bir alet kullanan bir protokolü bildirmektedir. Bu yazıda, yeni protokolün doğrulanması için atılan adımları rapor ediyoruz. Yeni protokolün doğrulanması, manuel yöntemle veya otomatik protokolle hazırlanan antijene bağlı boncuklar kullanılarak 50 katlı bir FMIA ile ölçülen IgG yanıtlarının karşılaştırılmasıyla gerçekleştirildi. Yöntemin daha fazla doğrulanması, Afrika ve Fransız kohortlarından alınan insan serum örneklerinin analiz edilmesiyle gerçekleştirildi.
Otomatik boncuk birleştirme protokolü hızlıdır ve tek bir çalışmada 96 analite kadar eşzamanlı bağlanmaya izin verir. Daha da önemlisi, sonuçlar, partiden partiye azaltılmış varyasyon ile yerleşik manuel protokol kullanılarak elde edilenlerle karşılaştırılabilir.
Protokol
İnsan örneklerinin kullanımı için uygun etik onayı alınmıştır. Örnekler, önceki çalışmalardan anonimleştirilmiş kalıntılardı. "Standart havuz" ORPAL örneklerinin kullanımına ilişkin protokol, Surinam Ulusal Etik Kurulu (CMWO (Commissie voor Mensgebonden Wetenschappelijk Onderzoek), Görüş Numarası VG 25-17) tarafından onaylandı. Madagaskar'dan örneklerin kullanımı, Londra Hijyen & Tropikal Tıp Okulu'nun Etik Komitesi (28541) ve Madagaskar Comité d'Éthique de la Recherche Biomédicale (135MSANP/SG/AMM/CERBM) tarafından PvSTATEM projesinin bir parçası olarak onaylanırken, Senegal örneklerinin kullanımı, Senegal Ulusal Sağlık Araştırmaları Etik Komitesi (CNERS Sénégal) tarafından devam eden Dielmo ve Ndiop projesinin bir parçası olarak onaylandı. Bu numunelerde NTD'lere karşı antikorları ölçmek için onay CNERS Sénégal (N 00000007 MSAS/CNERS/Sec) tarafından verildi. Endemik olmayan Fransız numuneleri, Fransız hastane laboratuvarlarında yapılan rutin tıbbi testlerden elde edildi ve Fransız Veri Koruma Komisyonu'nun (Commission Nationale de l'Informatique et des Libertes) mevcut düzenlemelerine ve yönergelerine uygun olarak işlendi. İnsan serum örnekleri, arbovirüs prevalansının yüksek olduğu bölgelerden ve saf bir Fransız popülasyonundan deneklerden elde edildi. Serum numuneleri, 56 °C'de 30 dakika inkübasyon yoluyla kullanılmadan önce ısıyla inaktive edildi. Numuneler etkisiz hale getirilmemişse, bunları bir güvenlik kabini altında manipüle edin. Rekombinant antijenlerin çoğu, kurum içinde sentezlenen EDIII rekombinant proteinleri dışında ticari olarak elde edildi. Veri toplama için görüntüleme tabanlı bir analizör cihazı9 kullanıldı. Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda verilmiştir.
1. Eşleşme için optimal antijen konsantrasyonlarını belirleyin
NOT: Fotoağartmayı önlemek için, işlem boyunca mikroküre boncuklarının ışığa maruz kalmasını en aza indirin. Toplu birleştirmeden önce, manuel bir birleştirme protokolü kullanarak her antijen için birleştirme konsantrasyonlarını optimize edin. Protokol Angeloni ve ark.'dan8 uyarlanmıştır. Tamponlar ve çözeltiler Ek Tablo 1'de detaylandırılmıştır.
- Birleştirme için kullanılacak boncuk bölgelerini seçin. 20 saniye boyunca iyice girdap yapın. Tüpü en az 60 saniye boyunca sonikleştirin.
- 200 μL (2,5 M boncuk) boncuk 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Boncukları 200 μL 100 mM Monobazik sodyum fosfat/0.125x Triton ile yıkayın.
- Tüpü 60 saniye boyunca manyetik bir tüp ayırıcıya yerleştirin. Boncuklara dokunmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın.
- Monobazik sodyum fosfat tamponu ekleyin. Manyetik rafta 60 saniye bekletin. Süpernatanı çıkarın.
- Boncukları 80 μL 100 mM monobazik sodyum fosfat, 0.125x Triton, 10 μL sülfo-NHS ve 10 μL EDC içeren bir tamponla etkinleştirin.
- Tüplere monobazik sodyum fosfat -sülfo-NHS -EDC ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika bir rulo üzerinde inkübe edin.
- Boncukları 250 μL PBS (1x) ve 0.125x Triton'da yıkayın. Yıkamayı üç kez tekrarlayın.
- Antijenleri bağlayın.
- Toplam 1 mL, 1x PBS ve 0.125x Triton hacminde antijenlerin farklı konsantrasyonlarını (seri seyreltmeler) hazırlayın. En az iki antijen konsantrasyonunu test edin.
- Aktive edilmiş boncuklara antijen solüsyonları ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 °C'de bir silindir üzerinde inkübe edin.
- Birleştirilmiş boncukları 500 μL PBS-TBN ve 0.125x Triton'da yıkayın. Yıkamayı üç kez tekrarlayın.
- Birleştirilmiş boncukları 1 mL PBS-TBN ve 0.125x Triton'da yeniden süspanse edin.
NOT: Birleştirilmiş boncukları kullanmadan önce en az 24 saat 4 °C'de saklayın. Birleştirilmiş boncuklar, 24 saat sonra yapılan teste kıyasla, birleştirmeden hemen sonra test edildiğinde MFI'lerde değişkenlik gösterdi. - Sonraki büyük ölçekli birleştirmede kullanmak için en uygun konsantrasyonu seçin. Standart bir havuzda immünolojik test için farklı birleştirilmiş boncuklar kullanın. Doğrusal bir standart eğrinin elde edildiği en düşük konsantrasyonu seçin.
NOT: Standart bir havuza antikor yanıtının doğrusallığının bir örneği, sonuçlar bölümünde, Şekil 1'de verilmiştir.
2. Büyük ölçekli otomatik boncuk bağlantısı
- Pro Manyetik COOH boncuklarını hazırlayın.
- Gerekli boncukları hesaplayın: 500 boncuk/numune kullanıldığında 5000 numune için 2,5 milyon boncuk yeterlidir.
- Daha önce açıklandığı gibi bağlantı için kullanmak üzere boncuk bölgelerini hazırlayın.
- İstenilen hacimdeki boncukları tahsis edilen kuyucuklara aktarın. 2,5 milyon boncuk için 200 μL boncuk (standart Luminex konsantrasyonu 1,25e7 boncuk/mL'dir) kullanıldı.
- Antijenleri hazırlayın. Bu, doğru miktarda antijen sağlamak için kritik bir adımdır.
- Optimizasyonu takiben gerekli antijen miktarlarını hesaplayın. Her antijen için kullanılan konsantrasyonlar Tablo 1'de detaylandırılmıştır.
- 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, yeterli miktarda ilgilenilen antijeni 1x PBS /0.125x Triton ile toplam 1 mL'ye kadar iyice karıştırın.
- Reaktiflerle plakalar hazırlayın. 96 derinliğinde kuyucuk plakalarını aşağıdaki gibi hazırlayın. Hacimler kuyu başınadır ve 2,5 milyon boncuk bağlantısı için hesaplanmıştır.
- Plaka 1 (Uç Tarakları): Uç taraklarını yükleyin.
- Plaka 2 (Boncuklar): İlgilenilen boncuk bölgelerinden 8 μL 0.125x Triton ve 200 μL ekleyin.
- Plaka 3 (Yıkama1): 200 μL 100 mM Monobazik sodyum fosfat / 0.125x Triton ekleyin.
- Plaka 4 (Aktivasyon): 80 μL 100 mM Monobazik sodyum fosfat / 0.125x Triton + 10 μL sülfo-NHS + 10 μL EDC ekleyin.
- Plaka 5 (Yıkama2): 250 μL 1x PBS /0.125x Triton ekleyin.
- Plaka 6 (Bağlantı): 1 mL antijen solüsyonunu tahsis edilen kuyuya aktarın.
- Plaka 7 (Yıkama3): 500 μL PBS-TBN/0.125x Triton ekleyin.
- Plaka 8 (Son plaka, birleştirilmiş boncuklar içerir): 1 mL PBS-TBN + 0.125x Triton ekleyin.
- Otomatik işlemcide bağlantı döngüsü çalıştırmasını ayarlayın.
- Makineyi açmak ve protokolü ayarlamak için üreticinin talimatlarını izleyin. Gerekli yazılım PC15'e indirilebilir. Çalıştırmaya özgü parametreler Ek Tablo 2'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
- Plakaları makinede ayrılan yuvaya yükleyin. Protokolü seçin. Döngüyü başlatın. Programın tamamlanması için tahmini süre 2:50 saattir.
- Döngünün sonu
- Makineyi kapatmak için üreticinin talimatlarını izleyin. Plakaları talimatlara göre boşaltın. Plaka 8'in boncukları (kahverengi topak) içerdiğini görsel olarak kontrol edin. Ek olarak, araçlardan bir çalıştırma raporu dışa aktarılır.
- Birleştirilmiş boncukları plaka 8'den depolama için ayrı 1,5 mL'lik tüplere aktarın. Birleştirilmiş boncukları kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
- Boncukları sayın.
NOT: Bir hücre sayacı kullanıldı. Bir hemasitometre kullanarak manuel sayım için Luminex yemek kitabı kılavuzunabakın 8.- Boncukları iyice vorteksleyin. 10 μL'yi bir hücre sayma odasına aktarın. mL başına boncuk sayısını okumak için üreticinin talimatlarını izleyin.
- Görüntüyü hücre sayacında görselleştirerek toplamayı kontrol edin. Kümelenmemiş boncukların temsili bir görüntüsü için Ek Şekil 1'e bakın.
- Agregalar varsa, en az 5 dakika boyunca iyice girdap yapın ve sonikasyon yapın. Sayımı tekrarla
NOT: Boncuk sayımından sonra, antikor yanıtının doğrusallığını değerlendirmek için standart bir havuz üzerinde birleştirilmiş boncukların immünolojik testi yapılarak eşleşme etkinliği değerlendirildi.
Tablo 1: 50-plex'e dahil edilen antijenlerin paneli. Test, arboviral enfeksiyonların ve birlikte dolaşan patojenlerin tespiti için çoklu antijenler içerir. 1.25 milyon boncuğun bağlanması için kullanılan antijen miktarları verilmiştir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
3. Multipleks immünolojik test
NOT: MFI ölçümü protokolünün ayrıntılı adımları ilgili kılavuzdaverilmiştir 9. Boncukların ışığa maruz kalmasını ve ışıkla ağartma riskini en aza indirmek için, boncuklar buzdolabından çıkarılmadan önce tüm solüsyonlar ve numuneler hazırlanır.
- Plaka düzenini ayarlayın. 96 oyuklu plakalar kullanıldı ve standart bir havuzun seri seyreltmelerinin yanı sıra ilk sırada bir boşluk (yalnızca tampon) içeriyordu.
- Numuneleri ve standardı ayrı bir bağlayıcı olmayan plakada PBT tamponunda seyreltin. Numuneler için 1:200 seyreltme (1:400 nihai konsantrasyon) kullanıldı. Standart eğri için, standart serum havuzunun 1:50 oranında seyreltilmesi (1:100'lük bir nihai konsantrasyonla sonuçlanır) ve on adet 2 kat seri seyreltme kullanıldı.
- Toplam 50 μL/kuyu hacminde kullanılacak birleştirilmiş boncukların miktarını belirleyin. Kuyu başına her boncuktan 500 boncuk kullanıldı ve PBT tamponu ile hacme ayarlandı.
- Birleştirilmiş boncukları 30 saniye boyunca iyice vorteksleyin. En az 60 saniye boyunca sonikasyon yapın.
- Her analit için eşit boncuk sağlamak amacıyla multipleks ön karışımına eklenecek her bir birleştirilmiş boncuğun hacmini hesaplayın. Boncuk hacimleri şu şekilde hesaplandı: Kuyu başına boncuk hacmi = kuyu başına boncuk sayısı/boncuk sayısı.
NOT: Ön karışım için gerekli olan boncukların ve tampon hacimlerinin hesaplanması için bir örnek Ek Tablo 3'te gösterilmektedir. - Yeterli boncuk antijen hacimlerini bir santrifüj tüpüne aktarın.
- PBT ile ses seviyesini ayarlayın.
- Ön karışımı iyice karıştırın.
- Ön karışımın 50 μL'sini görüntüleme mikroplakasına (örn. ps, f-alt plakalar) dağıtın.
- Seyreltilmiş numunelerden 50 μL'yi boncuklara ekleyin.
- Bir tabak çalkalayıcıda oda sıcaklığında, 700 rpm'de 30 dakika karıştırın.
- Plakaları aşağıdaki gibi üç kez yıkayın (manuel yıkama).
- Plakayı oda sıcaklığında 60 saniye boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Plakayı rafta sıkıca tutun ve süpernatanı atın.
- 100 μL PBT tamponu ekleyin. Manyetik rafta 60 saniye bekletin. Yıkamaları tekrarlayın
NOT: Alternatif olarak, bir plaka rondelası16 kullanılabilir. Yıkayıcı şu şekilde ayarlandı: 1 döngü ıslatma, ardından 3 döngü (aspirasyon, dağıtım ve ıslatma) ve son döngü aspirasyonu.
- Süpernatanı atın ve 50 μL seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin.
- İkincil antikorun stok çözeltisini hazırlamak için tedarikçinin talimatlarını izleyin. 1/120 oranında sekonder antikor seyreltme solüsyonu kullanıldı. İkincil antikor hacimleri şu şekilde hesaplandı: sekonder antikor hacmi = toplam hacim/seyreltme faktörü.
- İkincil antikoru yeterli miktarda PBT tamponu ile karıştırın. İyice karıştırın. Yıkanan boncuklara 50 μL seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin.
- Bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında, 700 rpm'de 15 dakika inkübe edin.
- Daha önce açıklandığı gibi üç yıkama gerçekleştirin.
- Boncukları 150 μL PBT tamponunda yeniden süspanse edin.
- Bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında, 700 rpm'de 5 dakika inkübe edin. Aletleri kurmak için üreticinin talimatlarını izleyin9.
NOT: Görüntüleyici cihazıyla birlikte verilen xPONENT yazılımı17 kullanılmıştır. Floresan okuması için ayarlar şu şekilde ayarlandı: toplama hacmi, minimum 50 boncuk ölçüsüyle, XY ısıtıcısı olmadan ve analiz tipi yok olarak 50 μL'ye ayarlandı.
4. Veri analizi
- Doğrulamayı çalıştır
- Minimum boncuk sayısına ulaşılıp ulaşılmadığını kontrol edin. İstatistiksel olarak geçerli bir MFI8 elde etmek için kuyu başına en az 35 boncuk önerilir.
- Boş ve negatif kontrol örneği MFI değerlerinin minimum düzeyde olduğunu kontrol edin.
- Standart bir eğri çizerek standartlar için MFI değerlerini kontrol edin. Bunlar boş ve/veya negatif kontrol örneğinden daha yüksektir.
- Örnek veri analizi
- Verileri CSV dosyaları olarak dışa aktarın ve R yazılımını kullanarak harici olarak analiz edin.
Sonuçlar
Protokolün doğrulanması için izlenen süreci göstermek için, üç arbovirüs ailesini temsil eden üç antijen seçtik: Flavivirüsler (DENV1 NS1 proteini), Alfavirüsler (CHIKV VLP proteini) ve Bunyavirüsler (RVFV NP). Antijenler, önceden maruz kalmış bir popülasyon (ORPAL), Fransız (maruz kalmamış) popülasyon serumları ve Afrika'dan (Senegal ve Madagaskar) iki kohorttan oluşan standart bir havuz üzerinde test edildi.
Antikor yanıtının seyreltme doğrusallığı
Boncuk birleştirme için kullanılacak antijenlerin konsantrasyonu, ORPAL havuzunun seri dilüsyonları kullanılarak belirlendi. Optimal konsantrasyon, doğrusal bir standart eğrinin elde edildiği en düşük konsantrasyon olarak seçildi (veriler gösterilmemiştir). Şekil 1 , her bir antijen için optimal konsantrasyonda seçilen arbovirüs antijenlerinin doğrusallığını göstermektedir. Bağlantının kalite kontrolü için, her bir birleştirilmiş boncuk partisi, önceden seçilmiş konsantrasyon kullanılarak ORPAL standart havuzunda seyreltme doğrusallığı açısından test edildi.
Standart manuel bağlantı testiyle karşılaştırılabilirlik
Yeni otomatik protokol kullanılarak elde edilen verilerin köklü manuel bağlantıyla karşılaştırılabilirliğini değerlendirmek için, manuel ve otomatik bağlantıyla elde edilen sonuçlardan oluşturulan standart eğrileri karşılaştırdık. Şekil 2 , her iki tahlil için paralel doğrusallığı göstermektedir. MFI değerleri antijene göre değişir.
Boncuk birleştirme partisi varyasyonu
Aynı birleştirme partisinden testlerin tekrarlanabilirliği değerlendirildiğinden, birleştirme partisi varyasyonu, Levey-Jennings çizelgesi18 kullanılarak değerlendirildi. Temsili antijenler ve kontrol BSA'ya bağlı boncuklar kullanıldı ve ORPAL standart havuzunda test edildi. Şekil 3 , her antijen için farklı günlerde test edilen 19 farklı plakadan MFI'leri göstermektedir. Ortaya çıkan MFI'ler, üç antijen ve kontrol için ortalama ± 3 SD aralığındadır.
Çoğullamanın MFI üzerindeki etkisi
Testin performansını daha fazla değerlendirmek için, birkaç antijenin çoğullanmasının ölçülen antikor yanıtını etkileyip etkilemediğini test ettik. Yanıt, ORPAL standart havuzu kullanılarak tek bir antijenle (veya tek pleks boncukla) karşılaştırıldı. Şekil 4 , MFI'ler tek antijenler üzerinde veya 50 antijen içeren bir ön karışımdan ölçüldüğünde elde edilen sonuçlar arasında güçlü bir korelasyon (R = 0.99, p < 2.2e-16) göstermektedir.
Afrika popülasyonlarında insan serum örneklerinden alınan antikor yanıtları
Testin çeşitli kohortlardan alınan örneklere uygulanabilirliğini değerlendirmek için, arbovirüslere maruz kalma olasılığı yüksek olan Afrika popülasyonlarından alınan insan serum örneklerindeki antikor tepkilerini, muhtemelen bu virüslere daha az maruz kalan bir Fransız kohortundakilerle karşılaştırdık. Toplamda Madagaskar için 1.596, Senegal için 1.428 ve Fransız kohortundan 84 numune test edildi. Şekil 5 , farklı kohortlar için yoğunluk grafiklerini sunmaktadır. Senegal kohortu için, CHIKV VLP'ye verilen yanıtlar için net bir iki modlu veri dağılımı gözlenmiştir, bu da popülasyonda CHIKV'ye iki farklı yanıt olduğunu düşündürmektedir. Senegal kohortunda DENV1 NS1 ve RVFV NP için de ince bir bimodal kuyruk gözlenirken, Fransız ve Madagaskar kohortları arasında hiçbir fark yoktur.
Şekil 1: ORPAL standart havuzunda test edilen antikor yanıtının doğrusallığı. Seçilen arbovirüs antijenleri örnek olarak gösterilmiştir. Medyan floresan yoğunlukları (MFI) y ekseninde (log ölçeği) ve standart havuzun seri seyreltilmesi x ekseninde gösterilir. Paneldeki tüm antijenler, numuneler üzerinde toplu testten önce standart havuzda önceden test edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Birleştirme yöntemleriyle antikor yanıtının paralel doğrusallığı. ORPAL standart havuzunun (x ekseni) seri seyreltmeleri üzerinde test edilen temsili antijenlerin (faset) MFI (y ekseni) günlüğü. Renkler farklı bağlantı yöntemlerini temsil eder: otomasyon (kırmızı, yeşil, mavi) ve manuel (mor). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Plakadan plakaya varyasyon. BSA bağlı boncuk (kontrol), DENV1 NS1, CHIKV VLP ve RVFV için Levey_Jennings grafikleri, 1:400 konsantrasyonda ORPAL standart havuzu için gösterilmiştir. Sonuçlar, farklı günlerde çalıştırılan 19 plakayı temsil ediyor. MFI'ler y ekseninde sunulur, test sayısı x eksenindedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Antikor yanıtının mono ve multipleks teste korelasyonu. Standart havuz, 1:400'lük bir nihai konsantrasyonda seyreltildi ve tek antijen kaplı boncuklara paralel olarak 50-pleks antijenleri içeren bir ön karışım üzerinde test edildi. Analiz için Pearson korelasyonu kullanıldı. Örnek olarak üç temsili antijen gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Testin endemik ve endemik olmayan numune kohortuna uygulanması. Test, Madagaskar (yeşil), Senegal (mavi) ve Fransa'dan (kırmızı) alınan numuneler üzerinde test edildi. Numuneler 1:400'lük bir nihai konsantrasyonda seyreltildi. X ekseni, aynı konsantrasyonda (1:400) numune MFI'nin standart havuz MFI'sine oranı olarak hesaplanan normalleştirilmiş MFI'leri (nMFI) temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Boncuk toplamanın örnek temsili görüntüsü. Panel (A) agrega edilmemiş boncukları gösterir ve panel (B) boncuk agregalarını gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Tamponlar tablosu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 2: KingFisher Apex boncuk birleştirme protokolü ayarları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 3: Ön karışım için boncuk hacimlerinin hesaplanmasına örnek. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
FMIA'nın kullanımı serolojik testlerin manzarasını değiştirmiştir. Tahlillerin gücü, tek bir reaksiyonda birden fazla antijene karşı antikor tepkilerini değerlendirme, sonuçlara ulaşma süresini kısaltma ve test maliyetini düşürme yeteneğinde yatmaktadır. Bu özellikle serolojik sürveyansta önemlidir. Bununla birlikte, FMIA testlerinin rutin kullanımı, reaksiyon başına tek antijenlerin işlenmesini gerektiren, emek yoğun, zaman alıcı manuel boncuk birleştirme adımı tarafından engellenmektedir. Bu rapor, antijenlerin boncuklara kimyasal olarak bağlanması için otomatik bir yöntem sunar. Otomasyon, tek bir çalışmada 96'ya kadar antijenin aynı anda bağlanmasına izin vererek, yüksek verimli antijen eşleşmesi için gereken süreyi önemli ölçüde azaltır.
Şekil 1 , antijenlerin boncuklara başarıyla bağlandığını göstermektedir. Sonuçlar ayrıca yeni otomatik protokol ile köklü manuel protokol arasında güçlü bir paralellik olduğunu göstermektedir (Şekil 2), bu da değerlendirilen antijenlere IgG yanıtlarının saptanmasında daha düşük doğruluk olmadığını göstermektedir. Plakadan plakaya (Şekil 3) ve boncuk birleştirme partisi varyasyonunun (Şekil 2) sonuçları, birleştirme için otomatik yöntem kullanıldığında verilerin karşılaştırılabilirliğini gösterir. Multipleks ve singleplex MFI'ler arasındaki yüksek korelasyon (Şekil 4), çok sayıda antijenin çoğullanmasının, bu tahlilde kullanılan bireysel antijen setine antikor yanıtını etkilemediğini göstermektedir.
Testin doğrulanması için hem endemik hem de endemik olmayan kohortlardan alınan numuneler test edildi (Şekil 5). Arbovirüslerin seroprevalans çalışmaları Afrika'da hala az olsa da, mevcut veriler 19,20,21,22, tek tek ülkeler arasında ve içinde değişken IgG seroprevalansları ile nüanslı bir tablo önermektedir. Özellikle, mevcut veriler Senegal'de üç virüsün (chikungunya, dang humması ve Rift Vadisi) Madagaskar'a kıyasla daha yüksek prevalansına işaret ediyor, örneğin19. Bu prevalanslar, diğer kohortlarla karşılaştırıldığında Senegal'deki farklı antijenlere açık ve belirgin bir yanıt gösteren bu rapordaki gözlemle tutarlıdır. Bu, testin nispeten yüksek seroprevalans bağlamında antikor profillerini ayırt etme yeteneğini destekler. Madagaskar kohortu için gözlemlenen veriler, numune toplama bölgesi22'de virüslerin bildirilen düşük prevalansı ile açıklanabilirken, verilerin endemik olmayan kohortla karşılaştırılabilirliği kısmen Fransız kohortunun küçük örneklem büyüklüğü ile açıklanabilir. Ek olarak, bölgeler arasında bildirilen değişkenlik, veri kümelerinde gözlemlenen farklılıkları açıklayabilir. IgG seroprevalansını değerlendirmek için kapsamlı bir çalışma gereklidir; bununla birlikte, bu raporda sunulan veriler, geliştirilen tahlilin, değerlendirilen arbovirüs antijenlerine verilen IgG yanıtlarını saptamak için spesifik olduğunu, endemik bölgelerden verileri ve aynı popülasyon içindeki incelikli, farklı yanıtları ayırt ettiğini göstermektedir.
Temel teknik zorluklar arasında çok küçük miktarlarda kullanılmalarına rağmen homojen antijen çözeltilerinin elde edilmesi, ön karışımda boncuk bölgelerinin eşmolar temsilinin sağlanması ve boncuk agregasyonunun en aza indirilmesi yer alıyordu. 96 oyuklu plakada homojen bir çözelti elde etmenin zorluğunun üstesinden gelmek için, tüm antijenik çözeltilerin plakaya dağıtılmadan önce 1.5 mL'lik bir tüpte iyice önceden karıştırıldığı bir adım uygulandı. Ek olarak, ön karışıma eşit sayıda boncuk bölgesinin eklenmesini sağlamak için birleştirilmiş boncukları saymak ve hacimleri ayarlamak için bir adım eklendi. Boncuk karıştırmayı kolaylaştırmak ve ön karışımda agregasyonu en aza indirmek için bir sonikasyon adımı da dahil edildi.
Bu sınırlı çalışmada, tüm numuneler boncuk bağlanmasından sonraki bir ay içinde test edildiğinden, birleştirilmiş boncukların stabilitesi ve bunların test performansı üzerindeki etkisi değerlendirilmemiştir. Bu değerlendirme, bu raporun kapsamı dışındadır ve gelecekteki çalışmalarda değerlendirilecektir. Bu sınırlamalara rağmen, bu rapor, arbovirüsler de dahil olmak üzere çeşitli patojenlere karşı antikor tepkilerini tespit etmek için hızlı ve güvenilir bir yöntem sunmaktadır. Arboviral enfeksiyonların serolojik sürveyansı, hastalıkların kontrol altına alınması için çok önemlidir ve bu virüslere karşı antikor tepkilerini saptamak için tekrarlanabilir, hızlı bir yöntemin mevcudiyeti, bulaşmadaki heterojenlikleri değerlendirmeye ve bu enfeksiyonların yükünü hafifletmeye yönelik müdahaleleri hedeflemeye yönelik küresel çabalarda önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Ek olarak, bu raporun odak noktası arbovirüsler olmasına rağmen, bu protokol geniş bir antijen yelpazesine geniş ölçüde uygulanabilir ve bu alanda önemli bir ilerlemeyi temsil eder.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar, çalışma alanlarının her birinde çalışma katılımcılarına ve toplum sağlığı çalışanlarına içtenlikle teşekkür eder. Ayrıca tüm laboratuvar ve saha personeline numune toplama, veri toplama ve laboratuvar analizleri konusundaki özverili çabalarından dolayı minnetle teşekkür ederiz. Bu çalışma, Wellcome Trust'tan [228185/Z/23/Z] Afrika genelinde arbovirüslerin bulaşma yoğunluğunun yeniden yapılandırılması ve değişen iklime müdahalelerin etkisi (xSTAR) hibesi ile desteklenmiştir. Açık erişim amacıyla, yazarlar bu gönderimden kaynaklanan herhangi bir Yazar Tarafından Kabul Edilen Makale sürümüne CC BY kamu telif hakkı lisansı uygulamışlardır. Ayrıca örnekleri kullanma izni için aşağıdakilere teşekkür ederiz: Rob Van Der Pluijm (Bulaşıcı Hastalıklar Epidemiyoloji ve Analitik, Institut Pasteur, Paris) ve Maylis Douine ve Alice Sanna (Centre d'Investigation Clinique Antilles-Guyane, Centre Hospitalier de Cayenne, Cayenne).
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Mikrosantrifüj tüpleri | - | Genel laboratuvar işlemleri | |
| 1000 mL filtre üniteleri 0.2 um | Termo Balıkçı Bilimsel | 567-0020 | |
| 25 mL rezervuarlar | Termobilimsel | 95128095 | |
| 50 mLFalcon tüpleri | - | Genel laboratuvar işlemleri | |
| 96 derin kuyulu plaka - KingFisher DW | Termobilimsel | 10373480 | |
| Otomatik plaka yıkayıcı (isteğe bağlı) | TECAN | HydroFlex Plus mikroplaka çamaşır makinesi | |
| B pertussis FHA | Native antijen | BP-FHA-50 | |
| Denge | - | Genel laboratuvar ekipmanları | |
| Tezgah Santrifüjü | - | Genel laboratuvar ekipmanları | |
| BioPlex Pro Manyetik COOH Boncukları | Luminex | MC10xxx (x=boncuk bölgesi) | |
| Sığır Serum Albümini, BSA | Sigma | A7906 | |
| Branson Ultrasonics Bransonic Ultrasonik Temizleyici Model B200 | Fisher bilimsel | 15-337-22 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| CCHF GP | Doğal antijen | REC31639-100 | |
| Hücre sayacı/Hemasitometre | Biorad/Merck | TC20 /Z359629 | |
| CHIKV E2 | Doğal antijen | REC31617-100 | |
| CHIKV VLP | Doğal antijen | CHIKV-VLP-100 | |
| Şeffaf Düz Tabanlı Immuno Steril Olmayan 96 Kuyu Plakaları | Termobilimsel | 3455 | |
| cmv-parçacıkları | Doğal antijen | CMV-HP-100 | |
| Sayma slaytları, hücre sayacı için çift odalı | Biorad | L003662 A | |
| CP23 | Doğal antijen | Üretim Prot | |
| CT694 | Doğal antijen | Üretim Prot | |
| CtxB | |||
| DENV1 EDIII + SNAP | Kendi içi yapım | - | |
| DENV1 NS1 | Doğal antijen | DENV1-NS1-100 | |
| DENV1 VLP | Doğal antijen | DENVX4-VLP-100 | |
| DENV2 EDIII + SNAP | Kendi içi yapım | - | |
| DENV2 NS1 | Doğal antijen | DENV2-NS1-100 | |
| DENV2 VLP | Doğal antijen | DENVX4-VLP-100 | |
| DENV3 EDIII + SNAP | Kendi içi yapım | - | |
| DENV3 NS1 | Doğal antijen | DENV3-NS1-100 | |
| DENV3 VLP | Doğal antijen | DENVX4-VLP-100 | |
| DENV4 EDIII + SNAP | Kendi içi yapım | - | |
| DENV4 NS1 | Doğal antijen | DENV4-NS1-100 | |
| DENV4 VLP | Doğal antijen | DENVX4-VLP-100 | |
| difteri toksikoloji | Native antijen | DIP-TNL-100 | |
| EBV-GP125 | Doğal antijen | REC31601-100 | |
| EDC | Sigma | 03449 | |
| Etanol %100 | - | Genel laboratuvar | |
| Film alüminyum sızdırmazlığı steril değildir | - | Genel | |
| Floresans Görüntüleme Cihazı - MAGPIX Sistemi | Luminex | MAGPIX-XPON4.1-CEIVD | |
| Plakalar için elde taşınan mıknatıs - Manyetik 96 kuyu ayırıcı | Luminex | CN-0269-01 | |
| hev-ORF2 | Native antijen | REC31653-100 | |
| Inaba OSP | Boston_MGH | - | |
| Kingfisher DeepWell 96-kuyu uç tarak | Termobilimsel | 17170069 | |
| Leishmania K28 | Clinisciences | MBS3040095 | |
| Luminex MAGPIX Kalibrasyon Kiti | Luminex | MPX-CAL-K25 | |
| Luminex MAGPIX Doğrulama Kiti | Luminex | MPX-PVER-K25 | |
| Manyetik boru ayırıcısı | Invitrogen | DynaMag | |
| MAGPIX Drive Fluid Plus | Luminex | 40-50030 | |
| Kızamık NP | Doğal antijen | REC31796 | |
| Mikroplaka çalkalayıcı | Randox | ||
| MIKROPLAKA, 96 KUYUSU, PS, F-BOTTOM (BACA KUYUSU) | Greiner-Bio bir | 655096 | |
| MiliQ H20 | - | Genel laboratuvar | |
| Çok kanallı pipetler 10, 300 | SARTORIUS | ||
| NIE | Doğal antijen | Üretim Prot | |
| Ogawa OSP | Boston_MGH | - | |
| ONNV E2 | Clinisciences | IT-022-006EP | |
| Partikül işlemci aleti | Termobilimsel | Termo Bilimsel KingFisher Flex | |
| PBS 10x PH~7.0 | EUROMEDEX | ET330 | |
| PE-konjuge edilmiş anti-insan IgG Fc ikincil antikor | Jackson Immuno araştırmaları | 709-116-098 | |
| PfAMA1 | Kendi içi yapım | - | |
| PfMSP1 | Doğal antijen | REC32013-100 | |
| pgp3 | Doğal antijen | Üretim Prot | |
| Pipet uçları (tedarikçi) 10 & mikro; L, 200 & mikro; L, 1000 & micro; L | - | Genel laboratuvar işlemleri | |
| Pm MSP1 | Clinisciences | CUST-PRT-31102024-1B | |
| Po MSP1 | Clinisciences | CUST-PRT-31102024-1A | |
| PvMSP1 | Doğal antijen | REC31724-100 | |
| R software R4.4.1 | - | - | |
| RVFV NP | Doğal antijen | REC31640-100 | |
| Tek kanallı pipetler 10p, 20p, 200p, 1000p | Eppendorf | ||
| SNAP | Kendi içi yapım | - | |
| S-NHS | Sigma | 56485 | |
| Sodyum azid | Sigma | S2002 | |
| Sodyum hipoklorit çözeltisi (çamaşır serişdesi) | - | Genel ev çamaşır suyu | |
| Tetanos Toksini | Doğal antijen | REC31801-100 | |
| Thermo Scientific BindIx Yazılımı sürüm 1.1 | ThermoFisher Scientific | - | |
| TRITON | Termo Bilimsel | A16046 | |
| Tüp silindiri | IKA | Roller 6D -100219627 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| USUV EDIII + SNAP | Kendi içi yapım | - | |
| USUV NS1 | Doğal antijen | USUV-NS1-100 | |
| Vortex | - | Genel laboratuvar ekipmanları | |
| VSP3 | Doğal antijen | Üretim Prot | |
| VSP5 | Doğal antijen | Üretim Prot | |
| WNV EDIII + SNAP | Kendi içi yapım | - | |
| WNV NS1 | Doğal antijen | WNV-NS1-100 | |
| xPONENT yazılımı | Luminex | 89-30000-00-759 Rev A 19 Mayıs | |
| YFV EDIII + SNAP | Kendi içi yapım | - | |
| YFV NS1 | Doğal antijen | YFV-NS1-100 | |
| ZIKV EDIII + SNAP | Kendi içi yapım | - | |
| ZIKV NS1 | Doğal antijen | ZIKV-NS1-100 | |
| ZIKV VLP | Doğal antijen | ZIKV-VLP-100 |
Kaynaklar
- Global dengue surveillance. , World Health Organization. https://worldhealthorg.shinyapps.io/dengue_global (2025).
- Bangoura, S. T., et al. Arbovirus epidemics as global health imperative, Africa, 2023. Emerg Infect Dis. 31 (2), e240754(2024).
- World Health Organization. Surveillance and control of arboviral diseases in the WHO African Region: assessment of country capacities. , WHO. (2022).
- Starolis, M. W., Perez, O., Powell, E. A. Clinical features and laboratory diagnosis of emerging arthropod-transmitted viruses. J Clin Virol. 132, 104651(2020).
- Alves, R. P. D. S., Amorim, J. H. Editorial: Arboviruses: Co-circulation, co-transmission, and co-infection. Front Microbiol. 14, 1321166(2023).
- Pan American Health Organization. Recommendations for laboratory detection and diagnosis of arbovirus infections in the region of the Americas. , PAHO. (2023).
- Fischer, C., et al. Challenges towards serologic diagnostics of emerging arboviruses. Clin Microbiol Infect. 27 (9), 1221-1229 (2021).
- Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. xMAP cookbook: A collection of methods and protocols for developing multiplex assays with xMAP technology. Luminex. , https://info.diasorin.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook (2025).
- Luminex MAGPIX user manual. , Luminex Corporation. (2023).
- Rosado, J., et al. Multiplex assays for the identification of serological signatures of SARS-CoV-2 infection: An antibody-based diagnostic and machine learning study. Lancet Microbe. 2 (2), e60-e69 (2021).
- Bloch, E., et al. Investigation of the sero-epidemiology of vaccine preventable diseases and common viral infections in French populations using a multiplex serological assay. medRXiv. , (2024).
- Venkateswaran, N., Sarwar, J., Nelson, W., Venkateswaran, K. Determination of IgG antibody profile to arboviruses using a multiplex serology panel. , (2024).
- Lawford, H. L. S., et al. Integrated serological surveillance for neglected tropical diseases, vaccine-preventable diseases, and arboviruses in Samoa, 2018. Sci Rep. 15 (1), 12667(2025).
- Bailly, S., et al. Spatial distribution and burden of emerging arboviruses in French Guiana. Viruses. 13 (7), 1299(2021).
- KingFisher Apex purification system: User guide. , Thermo Fisher Scientific Inc. https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0018970_kingfisher_apex_UG.pdf (2025).
- Instructions for use for HydroFlex Plus. , Tecan. (2025).
- XPONENT 4.3 installation instructions. , Luminex Corporation. https://us.diasorin.com/sites/default/files/products-documentation-tool/89-30000-00-759.pdf (2025).
- Van Den Hoogen, L. L., et al. Quality control of multiplex antibody detection in samples from large-scale surveys: the example of malaria in Haiti. Sci Rep. 10 (1), 1135(2020).
- Bangoura, S. T., et al. Seroprevalence of seven arboviruses of public health importance in sub-Saharan Africa: a systematic review and meta-analysis. BMJ Glob Health. 9 (10), e016589(2024).
- Awuah, A. A., et al. Seroprevalence of dengue in the Democratic Republic of Congo, Ghana and Senegal: results of the SERODEN study. Int J Infect Dis. 152, 107428(2025).
- Mhamadi, M., et al. Human and livestock surveillance revealed the circulation of Rift Valley Fever virus in Agnam, Northern Senegal, 2021. Trop Med Infect Dis. 8 (2), 87(2023).
- Broban, A., et al. Seroprevalence of IgG antibodies directed against dengue, chikungunya and West Nile viruses and associated risk factors in Madagascar, 2011 to 2013. Viruses. 15 (8), 1707(2023).
Yeniden basım ve izinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste