Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Organoid Araştırmaları İçin Tek Hücreli Tohumlu İnsan Bağırsağı Organoidleri

742 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69265

⸱

6 Şubat 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Graduate School of Medical Science, Brain Korea 21 Project, Yonsei University College of Medicine, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, NYU Grossman School of Medicine, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Department of Pathobiology, University of Pennsylvania Perelman School of Veterinary Medicine

Bu makalede

Özet

Tek hücre tohumlu hasta kaynaklı bağırsak organoidleri üretmeyi amaçlayan bir protokol sunuyoruz; bu protokol, heterojenliği azaltan ve sonraki analizler ile hassas tıp uygulamaları için tekrarlanabilirliği artıran standart kültürler sağlıyoruz.

Özet

Organoid teknolojisindeki son gelişmeler, orijinal dokularının yapısal, fonksiyonel, genetik ve epigenetik özelliklerini özetleyen hasta kaynaklı bağırsak organoidlerinin (PDIO) oluşturulmasını mümkün kıldı. Ancak, geleneksel geçiş kaynaklı organoidler kaçınılmaz olarak boyut ve sayı açısından heterojen popülasyonlar üretir ve bu da aynı koşullar altında bile tutarsız sonuçlara yol açar. Bunu ele almak için, burada "tek hücreli tohumlu PDIO'lar" olarak adlandırılan standartlaştırılmış bir yaklaşım oluşturuldu. Bu yöntemde, olgun PDIO'lar enzimatik olarak tek hücrelere ayrıldı ve belirli sayıda 96 kuyu tabakasının bireysel kuyularına tohumlantı. Bu kontrollü tohumlama, PDIO'ların boyutunu ve sayısını normalleştirdi. Geçiş kaynaklı organoidlerle karşılaştırıldığında, tek hücreli tohumlu PDIO'lar, organoid sayılarında kuyular arası varyasyonda ve organoid boyutlarında kuyular içi değişkenlikte azalmıştır; bu da üretim verimliliğinin belirlenmesini sağlar ve canlılık testlerinin tekrarlanabilirliğini artırır. Ayrıca, bu platform, transkriptomik analiz ve protein ifade profili dahil olmak üzere aşağı akış analizleriyle uyumludur. Toplu olarak, bu yaklaşım deneysel tutarlılığı artırabilir ve tekrarlanabilir PDIO tabanlı çalışmalar için pratik bir temel sağlayabilir.

Giriş

İnsan bağırsağı, bağırsak mikrobiyotası, bağırsak epitelimi ve bağışıklık sistemi arasındaki ince ayarlanmış etkileşimlerle tanımlanan son derece karmaşık birekosistemdir. Bu bileşenler, sıkı düzenlenmiş sinyal ağı aracılığıyla bağırsak homeostazını korur. Örneğin, on trilyondan fazla mikrobiyal organizmadan oluşan bağırsak mikrobiyotası, bağışıklık sisteminin aktivitesini modüle etmek için bağışıklık hücreleriyle etkileşime girer ve dengeli bir bağırsak ortamınıkorur 2. Bağırsak epitel, bu mikrobiyota-bağışıklık sistemi çapraz konuşmasında çok önemlidir 3,4. Epitel yenilenmesinin temel itici kaynağı olan bağırsak kök hücreleri (ISC), sürekli olarak özelleşir ve sekresi hücre hatları (Paneth hücreleri, kadeh hücreleri, enteroendokrin hücreler ve Tuft hücreleri), absorbif enterositler ve mikrofold hücreler dahil olmak üzere uzmanlaşmış hücretiplerine ayrılır 5,6. Bu hücreler birlikte, konakçını iltihaplı uyarıcılara karşı koruyan hayati bir fiziksel bariyer ve işlevsel arayüz oluşturur.

Son yıllarda, PDIO'lar çeviri araştırmalarında güçlü bir platform olarakortaya çıkmıştır 7. Bu üç boyutlu (3D) kültürler, hasta dokularından izole edilmiş ve ekstrahücresel matriks (ECM) gibi ekstrahücresel bir matrikste tutulan ISC'lerden oluşturulur ve ISC nişini 8,9'u yeniden düzenleyen tanımlanmış büyüme faktörleriyle birlikte korunur. Özellikle, PDIO'lar donör dokunun genetik ve epigenetik özelliklerini korur, böylece sürekli genişleme ve tekrarlanabilir deneyler yapılmasına olanak tanır. Sato ve ark. ilk kez lösin açısından zengin tekrar içeren G protein-bağlı reseptör 5+ (Lgr5⁺) ISC'lerden PDIO'largeliştirdiklerinden beri, sonraki çalışmalar PDIO'ların oluşumu ve farklılaşması için temel büyüme faktörlerini belirlemiş ve laboratuvarlarda yaygın olarak benimsenen protokollereyol açmıştır 11,12,13 . Ancak, PDIO'ları aday ilaçlarla tedavi etmek için kullanılan deneysel ortamlar çalışmalar arasında oldukça farklılık gösterir ve genellikle yeterincetanımlanmamaktadır 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44, 45,46,47. Ayrıca, PDIO'lar genellikle mekanik bozulma yoluyla geçiş yapar ve organoid boyut, morfoloji ve mekansal düzende heterojenlik oluşur. Bu değişkenlik, ilaç yanıtlılığının ve altta yatan moleküler mekanizmaların doğru değerlendirilmesini karmaşıklaştırır. Bu sınırlamayı gidermek için, son çalışmalar tek hücre askıya veya sıralanmış tekhücrelerden türetilen PDIO'lar geliştirmiştir: 45,48,49,50,51,52,53,54.

Bu makalede, tamamlayıcı ve pratik yöntemlerden biri olarak, "tek hücreli tohumlu PDIO'lar" geleneksel ECM ve ortam kullanılarak tek hücre süspansiyonundan standartlaştırılmış PDIO'lar üretmek için tanıtılmıştır; böylece doğru ve tekrarlanabilir testler yapılabilir. Kısaca, olgun PDIO'lardan izole edilen tek hücreler ECM'ye belirli hücre yoğunluklarında gömüldü ve ortaya çıkan kültürler 2 hafta boyunca izlenirken sayı, boyut ve morfolojisi nicelendirildi. Her ECM kubbesi bilinen bir hücre girişiyle gömülü olduğundan, her kuyu başına organoid sayısı tutarlıdır ve her organoidhattında rejeneratif kapasite için bir okuma olarak üretim verimliliği hesaplanmasına olanak tanır 49,54. Kubbe şeklindeki Matrigel, Wnt3a konsantrasyonunun doğal kararsızlığı ve sınırlıdifüzyon 55 nedeniyle uzamsal gradyantı nedeniyle boyut heterojenliği üretse de, tek hücreli tohumlu PDIO'larda kuyu arası boyut değişkenliği, geçişten türetilen organoidleregöre belirgin şekilde daha düşüktür. 49,54. Ancak bu yaklaşımın pratik sınırlamaları hâlâ vardır. Floresansla aktive hücre sıralaması olmadan, bazı organoidler çiftlerden veya üçllerden üretilebilir ve bu da PDIO'larda içsel biyolojik heterojenliğe yol açar. Ayrıca, her organoid çizgi için en uygun tek hücre sayısı, farklı üretim verimlilikleri nedeniyle ampirik olarak belirlenmelidir. Son olarak, tamamen farklılaşmış tek hücre tohumlu PDIO'lar, nicel ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR), Western blot ve immünohistokimya gibi sonraki analizlere tabi tutuldu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Deney için gereken tüm malzemeler ve reaktifler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması

  1. Organoidlerin kültür plakasını 37 °C inkübatörde 90 dakikadan fazla süre önceden ısıtın.
    NOT: Kültür plakasının önceden ısıtılması, ECM'nin katılaşmasına ve kubbe şeklinin korunmasına yardımcı olur. ECM polimerizasyonu için minimum süre, 90 dakikadır. Plakanın 12 saatten fazla önceden ısıtılması şiddetle tavsiye edilir.
  2. Organoid kültür ortamı olarak %0,5 penisilin-streptomisin (PS) ile takviye edilmiş organoid büyüme ortamı (EXP) kullanın.
  3. Tek hücreli tohumlu PDIO'ların farklılaşması için, büyüme faktörleriyle desteklenen bazal ortamdan oluşan bir farklılaşma ortamı (DIF) kullanın (Tablo 1). Bazal ortam, %0,5 PS, %0,25 gentamisin sülfat ve %1 glutamin takviyesi ile takviye edilmiş gelişmiş DMEM/F12'den oluşur ve aşağıdaki büyüme faktörleri şunlardır: Noggin (100 ng/mL), R-Spondin-1 (1 μg/mL), Wnt3a (100 ng/mL), epidermal büyüme faktörü (EGF; 50 ng/mL), N-asetil-L-sistein (1 mM), [Leu15]-gastrin I insan (10 nM), A 83-01 (500 nM), insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-I; 200 ng/mL), fibroblast büyüme faktörü (FGF; 100 ng/mL) ve B-27 takviyesi (1x) (Tablo 1) gibi özellikler var.
    NOT: PS ve gentamisin biyolojik tehlikelidir ve eldiven ve göz koruma ile ele alınmalıdır.
  4. Hücre geri kazanma çözeltisi (CRS), yıkama tamponunu (DMEM yüksek glikoz ve %1 BSA), 1 mM Y-27632, EXP ve DIF taze hazırlayın ve kullanıma kadar buzda kalın.
    NOT: EXP ve DIF'in en az 20 dakika oda sıcaklığında dengelenmesine izin verin, ardından önceden ısıtılmış kültür plakalarına ekleyin.
  5. ECM'yi buz üzerinde eritin ve her zaman soğuk tutulduğundan emin olun.
    NOT: ECM buzda erimeyi gerektirir ve erken polimerleşmeyi önlemek için her zaman soğuk tutulmalıdır.
  6. Enzimatik dissosiyasyon reaktifini oda sıcaklığında dengeleyin. Reaktifi uygulamadan önce 37 °C su banyosunda önceden ısıtın.
    NOT: Enzimatik dissosiyasyon reaktifi tahriş edici bir kaynaktır ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla ele alınmalıdır.

2. Kriyokonserve PDIO'ların eritilmesi ve geri kazanılması

  1. Sıvı azot tankından organoidleri içeren kriyoviyal tüpü alın. Tüp kapağını hafifçe gevşet ve 37 °C su banyosunda 60-90 saniye eridin.
    NOT: Tüpü erittikten sonra hemen buza aktarın.
  2. Geniş delikli pipet ucunu yıkama tamponu ile önceden ıslatın ve organoidleri kriyovial tüpten 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
  3. Kriyovial'ı 1 mL yıkama tamponu ile durulayın ve kalan içeriği 50 mL tüpe aktarın. Bu durulama adımını iki kez tekrarlayın.
  4. Santrifüj 290 × g'de 4 °C'de 7 dakika sürdür. Tüpün tabanında görünür bir pelet oluşmasını sağlayın.
  5. Üst natantı aspire edin.
  6. ECM'de geniş delikli önceden ıslatılmış pipet ucu ile yeniden süzülür.
  7. ECM'yi önceden ısıtılmış 24 kuyu tabaklı bir plakaya noktalayın ve 37 °C'de 10 dakika kuluçka yapın.
    NOT: Her kuyu başına 30 μL ECM kullanın.
  8. EXP ekleyin ve kuyuları steril 1x fosfatla tamponlanmış tuzlu su (PBS) veya damıtılmış su ile çevreleyin.
    NOT: Her kuyu başına 500 μL EXP kullanın. EXP'de kültür, ilk 3 gün boyunca 10 μM Y-27632 ile takviye edildi, ardından Y-27632 olmadan EXP'ye değiştirildi.

3. PDIO'ların Geçişi

  1. Harcadığı EXP'yi aspire et.
  2. Geniş delikli pipet ucunu yıkama tamponu ile önceden ıslatın, ECM'yi ayırmak için 1 mL hücre ayrıştırma reaktifi ekleyin ve içeriği 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
  3. Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir sallayıcı üzerinde kuluçka yapın.
  4. Santrifüj 300 × g'de 7 dakika boyunca 4 °C'de koyun.
  5. Süpernatantı boşaltın ve 1 mL yıkama tamponu ekleyin. 20 kez askıya alın.
  6. 1 mL yıkama tamponu daha ekleyin, 20 kez tekrar süzültün ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
  7. Santrifüj 300 × g'de 7 dakika boyunca 4 °C'de koyun.
  8. Üst natantı aspire edin.
  9. ECM'de geniş delikli önceden ıslatılmış pipet ucu ile yeniden süzülür.
  10. ECM'yi önceden ısıtılmış 24 kuyu tabaklı bir plakaya noktalayın ve 37 °C'de 10 dakika kuluçka yapın.
    NOT: Her kuyu başına 30 μL ECM kullanın.
  11. EXP ekleyin ve kuyular steril 1x PBS veya damıtılmış su ile çevreleyin.
    NOT: Her kuyu başına 500 μL EXP kullanın. EXP'de kültür, ilk 3 gün boyunca 10 μM Y-27632 ile takviye edildi, ardından Y-27632 olmadan EXP'ye değiştirildi.

4. Tek hücreli tohumlu PDIO kültürü

  1. Harcadığı EXP'yi aspire et.
    NOT: Antibiyotik içeren atıklar (örneğin, PS veya gentamisin içeren harcanmış ortam) bertaraf edilmeden önce otoklavlanmalıdır.
  2. 1 mL steril 1x PBS ile yıkayın.
  3. Geniş delikli pipet ucunu yıkama tamponu ile önceden ıslat, ECM'yi ayırmak için 300 μL CRS ekleyin ve içeriği 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
  4. Santrifüj 300 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca kalın.
  5. Üst malzemeyi aspire edin, 3 mL yıkama tamponu ekleyin ve 20 kez tekrar süzülün.
    NOT: Bu adım organoidleri mekanik olarak bozar.
  6. 300 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın (Şekil 1B).
  7. Süpernatantı aspire edin ve 10 μM Y-27632 içeren önceden ısıtılmış enzimatik ayrışma reaktifi 5 mL ekleyin. 2-3 kez döndürün ve 37 °C su banyosunda 20 dakika kuluçka yapın, tüpü her 5 dakikada bir sallayın.
    NOT: Enkaz agregaları genellikle kuluçkadan sonra 10 dakika içinde ortaya çıkar. Enzimatik dissosiyasyon reaktifinin toplam tedavisini 20 dakikanın altına indirin. 25 dakikayı aşmayın, çünkü aşırı sindirim tek hücrelerin verimini ve yaşamını ciddi şekilde zayıflatıyor.
  8. 10 mL DMEM yüksek glikoz ekleyin.
  9. Santrifüj 300 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca (Şekil 1C).
  10. Üstten üfleyin ve 1 mL yıkama tamponu ekleyin. 20 kez askıya alın.
    NOT: Enzimatik dissosiyasyon reaktifi içeren atıklar ayrı toplanmalı ve kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak en az 30 dakika boyunca %0,5-1 çamaşır suyu ile inaktive edilmelidir.
  11. 40 μm'lik bir hücre süzgecinden yeni bir 50 mL'lik tüpe filtreleyin (Şekil 1D).
    NOT: Bu adım, olgun organoidlerden tek hücreleri izole etmek için kritiktir. Tek hücreleri izole etmek için 40 μm hücre süzgeci kullanılmalıdır.
  12. Hücreleri trypan blue ile say. Hesaplanan hacmi 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
    NOT: Önceden ısıtılmış 96 kuyu plakasında her kuyu başına 3.000-4.000 hücre levha koyun.
  13. Santrifüj 300 × g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca (Şekil 1E).
  14. Üst natatı, pipet kullanarak çıkarın.
  15. Hücreleri ECM'de (100-500 hücre/μL) geniş delikli önceden ıslatılmış pipet ucu kullanarak yeniden askıya alın.
  16. ECM'yi önceden ısıtılmış 96 kuyu tabaklı bir plakaya noktalayın ve 37 °C'de 10 dakika kuluçka yapın.
    NOT: Her kuyu başına 10 μL ECM kullanın.
  17. Kuyular için DIF ekleyin. Kuyular steril 1x PBS veya damıtılmış su ile çevreleyin.
    NOT: Her kuyu başına 150 μL DIF kullanın. DIF'de kültür, 3 gün boyunca 10 μM Y-27632 ile takviye edildi, ardından Y-27632 olmadan DIF'ye değiştirildi. Her 3 günde bir medium değiştirin ve toplamda 10 gün boyunca koruyun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tek hücreli tohumlu PDIO'lar oluşturmak için, NYU Grossman Tıp Fakültesi Kurumsal İnceleme Kurulu (İltihap Bağırsak Hastalığı Hastalarında Mukoza İmmün Profili; S12-01137). Daha sonra, olgun PDIO'lardan izole edilen 6.000 hücrenin ECM'ye ayrılmasıyla tek hücreli tohumlu PDIO'lar üretildi ve ardından DIF'de kültürlendi. Organoidler tek hücrelerden oluştu ve 6. günde tomurcuk benzeri yapılar oluşturmaya başladı (Şekil 2). Bu yaklaşımın avantajını değerlendirme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

PDIO'lar, bireysel hastaların genetik ve epigenetik manzarasını sadakatle koruyarak hassas hastalık modellemesi, ilaç taraması ve rejeneratif tıp için büyük vaat taşır. Ancak, pratik uygulamaları genellikle organoid üretimi ve karakterizasyonunun standartlaştırılmasındaki zorluklar nedeniyle zekâ çekmektedir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, tek hücre süspansiyonu veya tek hücreden türetilen PDIO'ları kullanan bir yaklaşım sonçalışmalarda 45,48,49,50,51,52,5...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Jordan E. Axelrad, BioFire Diagnostics, Genentech, Janssen ve Takeda'dan araştırma hibeleri almıştır; danışmanlık ücretleri, onurlandırma veya danışma kurulu ücretleri AbbVie, Abivax, Adiso, Biomerieux, Bristol-Myers Squibb, Celltrion, Ferring, Fresenius, Janssen, Merck, Pfizer, Sanofi, Takeda ve Vedanta'dan alınmaktadır. K.C., ABD patenti 10,722,600 ve geçici patentler 62/935,035 ile 63/157,225 üzerinde mucittir.

Teşekkürler

Bu çalışma, kısmen Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi tarafından desteklendi (RS-2025-00557588, RS-2024-00411768, RS-2025-18362970 ve RS-2025-02214844, Kyung Ku Jang); Kore Sağlık ve Refah Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Sağlık Sanayi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge Projesi hibesi (RS-2024-00406488, Kyung Ku Jang); Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) DK093668 (Ken Cadwell); K23DK124570 (Jordan E. Axelrad); Crohn & Kolit Vakfı (Jordan E. Axelrad). Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlama kararı veya makalenin hazırlanması gibi konularda hiçbir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
[Leu15]-Gastrin I insanSigma-AldrichG91450-0.1 mg
15 mL konik tüpSPL50015
20X PBS, pH 7.4BiosesangP2007-7.4
50 mL konik tüpSPL50050
A 83-01Tocris2939-10 mg
İleri DMEM/F-12Gibco12634010
Axygen 1000 µ L pipet uçları, geniş çaplı, şeffaf, steril olmayanAxygenT-1005-WB-C
Axygen 200 & micro; L pipet uçları, geniş çaplı, şeffaf, steril olmayanAxygenT-205-WB-C
B-27 takviyesi (50X) serumsuzGibco17504044
Sığır serum albüminiRoche10735078001
Corning 96 delikli şeffaf polistiren mikroplakalarıCorning3599
Korning hücre kurtarma çözümüCorning354253
Corning ECM Matrisi (Corning Matrigel) Corning356231
Costar 24 kuyu şeffaf TC ile işlenmiş çoklu kuyulu plakalarCorning3526
DMEM yüksek glikoz ve stabil glutamin ve sodyum piruvatBiowestL0103-500
GentamicinGibco15750060
Nazik hücre dissosiyasyon reaktifiKök hücre100-0485
İnsan FGF-bazi (FGF-2/bFGF) (154 aa) rekombinant proteinGibco100-18B-100UG
İnsan IGF-I, hayvansız rekombinant proteinGibcoAF-100-11-500UG
İnsan Noggin proteiniAkrobiyosistemH5219-1mg OLMAYAN
İnsan R-Spondin 1 / RSPO1 (21-146) proteiniAkrobiyosistemRS6-H4220-1mg
IntestiCult Organoid Büyüme Ortamı (İnsan)Kök hücre6010
L-glutamin 100XBiowestX0550-100
Fare EGF rekombinant proteiniGibco315-09-100UG
N-asetil-L-sisteinSigma-AldrichA9165-5 g
Penisillin-streptomisin çözeltisi 100XBiowestl0022-100
Rekombinant insan Wnt3a vekilAkrobiyosistemWNE-W5253-50ug
TripLE (enzimatik dissosiyasyon reaktifi) ekspres enzimi (1X), fenol kırmızısı yok  içeriyor;Gibco12604013
Y-27632 dihidroklorürTocris1254-10MG

Kaynaklar

  1. Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).
  2. Zheng, D., Liwinski, T., Elinav, E. Interaction between microbiota and immunity in health and disease. Cell Res. 30 (6), 492-506 (2020).
  3. Liebing, E., Krug, S. M., Neurath, M. F., Siegmund, B., Becker, C. Wall of Resilience: How the Intestinal Epithelium Prevents Inflammatory Onslaught in the Gut. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 19 (2), 101423(2025).
  4. Soderholm, A. T., Pedicord, V. A. Intestinal epithelial cells: at the interface of the microbiota and mucosal immunity. Immunology. 158 (4), 267-280 (2019).
  5. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: Regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  6. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
  7. Lucafò, M., et al. Patient-derived organoids for therapy personalization in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 28 (24), 2636-2653 (2022).
  8. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2, (2022).
  9. Parente, I. A., Chiara, L., Bertoni, S. Exploring the potential of human intestinal organoids: Applications, challenges, and future directions. Life Sci. 352, 122875(2024).
  10. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  11. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  12. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  13. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793.e6 (2018).
  14. An, S., Huh, H., Ko, J. S., Moon, J. S., Cho, K. Y. Establishment and characterization of patient-derived intestinal organoids from pediatric Crohn's disease patients. Pediatr Gastroenterol Hepatol Nutr. 27 (6), 355-363 (2024).
  15. d'Aldebert, E., et al. Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients. Front Cell Dev Biol. 8, 363(2020).
  16. Arnauts, K., et al. Ex vivo mimicking of inflammation in organoids derived from patients with ulcerative colitis. Gastroenterology. 159 (4), 1564-1567 (2020).
  17. Deleu, S., et al. High acetate concentration protects intestinal barrier and exerts anti-inflammatory effects in organoid-derived epithelial monolayer cultures from patients with ulcerative colitis. Int J Mol Sci. 24 (1), (2023).
  18. Dennison, T. W., et al. Patient-derived organoid biobank identifies epigenetic dysregulation of intestinal epithelial MHC-I as a novel mechanism in severe Crohn's Disease. Gut. 73 (9), 1464-1477 (2024).
  19. Ding, W., Marx, O. M., Mankarious, M. M., Koltun, W. A., Yochum, G. S. Disease severity impairs generation of intestinal organoid cultures from inflammatory bowel disease patients. J Surg Res. 293, 187-195 (2024).
  20. Dotti, I., Mayorgas, A., Salas, A. Generation of human colon organoids from healthy and inflammatory bowel disease mucosa. PLoS One. 17 (10), e0276195(2022).
  21. Ferrer-Picón, E., et al. Intestinal inflammation modulates the epithelial response to butyrate in patients with inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 26 (1), 43-55 (2020).
  22. Gopalakrishnan, S., et al. Comprehensive protocols for culturing and molecular biological analysis of IBD patient-derived colon epithelial organoids. Front Immunol. 14, 1097383(2023).
  23. Hammoudi, N., et al. Autologous organoid co-culture model reveals T cell-driven epithelial cell death in Crohn's Disease. Front Immunol. 13, 1008456(2022).
  24. Jurickova, I., et al. Eicosatetraynoic acid and butyrate regulate human intestinal organoid mitochondrial and extracellular matrix pathways implicated in Crohn's disease strictures. Inflamm Bowel Dis. 28 (7), 988-1003 (2022).
  25. Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., van Griensven, M., Giselbrecht, S. A Microwell-based intestinal organoid-macrophage co-culture system to study intestinal inflammation. Int J Mol Sci. 23 (23), (2022).
  26. Karakasheva, T. A., et al. Patient-derived colonoids from disease-spared tissue retain inflammatory bowel disease-specific transcriptomic signatures. Gastro Hep Adv. 2 (6), 830-842 (2023).
  27. Kawamoto, A., et al. Ubiquitin D is upregulated by synergy of notch signalling and TNF-α in the inflamed intestinal epithelia of IBD patients. J Crohns Colitis. 13 (4), 495-509 (2019).
  28. Kelsen, J. R., et al. Colonoids from patients with pediatric inflammatory bowel disease exhibit decreased growth associated with inflammation severity and durable upregulation of antigen presentation genes. Inflamm Bowel Dis. 27 (2), 256-267 (2021).
  29. Lee, C., et al. Intestinal epithelial responses to IL-17 in adult stem cell-derived human intestinal organoids. J Crohns Colitis. 16 (12), 1911-1923 (2022).
  30. Matsuzawa-Ishimoto, Y., et al. An intestinal organoid-based platform that recreates susceptibility to T-cell-mediated tissue injury. Blood. 135 (26), 2388-2401 (2020).
  31. Matsuzawa-Ishimoto, Y., et al. The γδ IEL effector API5 masks genetic susceptibility to Paneth cell death. Nature. 610 (7932), 547-554 (2022).
  32. Murthy, S., et al. Single-cell transcriptomics of rectal organoids from individuals with perianal fistulizing Crohn's disease reveals patient-specific signatures. Sci Rep. 14 (1), 26142(2024).
  33. Nanki, K., et al. Somatic inflammatory gene mutations in human ulcerative colitis epithelium. Nature. 577 (7789), 254-259 (2020).
  34. Niklinska-Schirtz, B. J., et al. Ileal derived organoids from Crohn's disease patients show unique transcriptomic and secretomic signatures. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 1267-1280 (2021).
  35. Nishimura, R., et al. Establishment of a system to evaluate the therapeutic effect and the dynamics of an investigational drug on ulcerative colitis using human colonic organoids. J Gastroenterol. 54 (7), 608-620 (2019).
  36. Rees, W. D., et al. Enteroids derived from inflammatory bowel disease patients display dysregulated endoplasmic reticulum stress pathways, leading to differential inflammatory responses and dendritic cell maturation. J Crohns Colitis. 14 (7), 948-961 (2020).
  37. Sarvestani, S. K., et al. Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity. Nat Commun. 12 (1), 262(2021).
  38. Skovdahl, H. K., et al. Patient derived colonoids as drug testing platforms-critical importance of oxygen concentration. Front Pharmacol. 12, 679741(2021).
  39. Suzuki, K., et al. Single cell analysis of Crohn's disease patient-derived small intestinal organoids reveals disease activity-dependent modification of stem cell properties. J Gastroenterol. 53 (9), 1035-1047 (2018).
  40. Tindle, C., et al. A living organoid biobank of patients with Crohn's disease reveals molecular subtypes for personalized therapeutics. Cell Rep Med. 5 (10), 101748(2024).
  41. Tsuchiya, M., et al. Functional analysis of isoflavones using patient-derived human colonic organoids. Biochem Biophys Res Commun. 542, 40-47 (2021).
  42. Vanhove, W., et al. Biopsy-derived intestinal epithelial cell cultures for pathway-based stratification of patients with inflammatory bowel disease. J Crohns Colitis. 12 (2), 178-187 (2018).
  43. Xu, P., et al. Interleukin-28A induces epithelial barrier dysfunction in CD patient-derived intestinal organoids. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 320 (5), G689-G699 (2021).
  44. Ko, C. Y., et al. Alleviative Effect of alpha-lipoic acid on cognitive impairment in high-fat diet and streptozotocin-induced type 2 diabetic rats. Front Aging Neurosci. 13, 774477(2021).
  45. Jang, K. K., et al. Tofacitinib uptake by patient-derived intestinal organoids predicts individual clinical responsiveness. Gastroenterology. 167 (7), 1453-1456.e5 (2024).
  46. Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids. Int J Mol Sci. 22 (11), (2021).
  47. Laudadio, I., et al. Characterization of patient-derived intestinal organoids for modelling fibrosis in Inflammatory Bowel Disease. Inflamm Res. 73 (8), 1359-1370 (2024).
  48. Marinucci, M., et al. Standardizing patient-derived organoid generation workflow to avoid microbial contamination from colorectal cancer tissues. Front Oncol. 11, 781833(2021).
  49. Lin, X., et al. IL-17RA-signaling in Lgr5(+) intestinal stem cells induces expression of transcription factor ATOH1 to promote secretory cell lineage commitment. Immunity. 55 (2), 237-253.e8 (2022).
  50. Miller, D. S., Talbot, C. A., Simpson, W., Korey, A. A comparison of naproxen sodium, acetaminophen and placebo in the treatment of muscle contraction headache. Headache. 27 (7), 392-396 (1987).
  51. Yang, L., et al. A tunable human intestinal organoid system achieves controlled balance between self-renewal and differentiation. Nat Commun. 16 (1), 315(2025).
  52. Abdulla, N., Aronson, R., Plessis, T. D., Bebington, B., Kaur, M. Protocol for the establishment and characterization of South African patient-derived intestinal organoids. STAR Protoc. 6 (3), 103970(2025).
  53. Kang, S., Lee, M. R., Choi, W., Kong, S. Y., Kim, Y. H. Protocol for generation and utilization of patient-derived organoids from multimodal specimen. STAR Protoc. 6 (3), 104039(2025).
  54. Zhou, C., et al. Epigenetic reprogramming alters intestinal stem cell fate in pouchitis. bioRxiv. , (2025).
  55. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372(2020).
  56. Jang, K. K., et al. Variable susceptibility of intestinal organoid-derived monolayers to SARS-CoV-2 infection. PLoS Biol. 20 (3), e3001592(2022).
  57. He, G. W., et al. Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of paneth cell formation. Cell Stem Cell. 29 (9), 1333-1345.e6 (2022).
  58. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  59. Sockell, A., et al. A microwell platform for high-throughput longitudinal phenotyping and selective retrieval of organoids. Cell Syst. 14 (9), 764-776.e6 (2023).
  60. Saito, T., Amako, J., Watanabe, T., Shiraki, N., Kume, S. Human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids for pharmacokinetic studies. Eur J Cell Biol. 104 (2), 151489(2025).
  61. Velasco, V., Shariati, S. A., Esfandyarpour, R. Microtechnology-based methods for organoid models. Microsyst Nanoeng. 6, 76(2020).
  62. Kakni, P., et al. Intestinal organoid culture in polymer film-based microwell arrays. Adv Biosyst. 4 (10), e2000126(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tek H cre EkimiHasta Kaynakl OrganoidlerOrganoid De i kenli iOrganoid Tekrarlanabilirli iOrganoid Canl l k AnaliziOrganoid retim Verimlili iTranskriptomik AnalizProtein Ekspresyon Profillemesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.