Yöntem makalesi

Kültürlenmiş Hücrelerde İşlevselleştirilmiş Nanokorlar Kullanılarak Endositik Taşımanın Canlı Hücre Görüntülemesi

DOI:

10.3791/69284

⸱

17 Ekim 2025

 ,  ,  , 
1Biozentrum, University of Basel

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinlerin plazma zarından trans-Golgi ağına endositik ve retrograd taşınması, zar homeostazını korumak ve sinyalleşmeyi düzenlemek için gereklidir. Burada, HeLa hücrelerinde türetilmiş anti-GFP nanokorları kullanılarak canlı hücre mikroskobu ile transmembran kargo proteinlerinin endositik taşınmasını görüntülemek ve ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reseptörlerin ve diğer transmembran proteinlerin hücre yüzeyinden endozomlara ve ötesine endositozu homeostaz, fizyoloji ve fonksiyon için kritik öneme sahiptir. Endositik alımı ve retrograd protein kaçakçılığını araştırmak için, sabit ve canlı hücre görüntüleme, elektron mikroskobu ve otoradyografi ile birleştirilmiş jel elektroforezi yoluyla hücre yüzeyinden trans-Golgi ağına (TGN) taşınmayı izlemek için işlevselleştirilmiş nanokorlardan oluşan çok yönlü bir araç seti oluşturduk. Yeşil floresan proteini (GFP) veya mCherry'yi (monomerik, çapraz bağlanmayan, yüksek afiniteli protein bağlayıcıları) hedefleyen türetilmiş nanokorlar geliştirdik ve bunlar, karşılık gelen hücre dışı floresan etiketlerini taşıyan ilgili membran proteinlerini eksprese eden hücre hatlarına eklenebilir. GFP veya mCherry etiketli transmembran raportörlere bağlandıktan sonra, nanokorlar spesifik olarak içselleştirilir ve raportörlerin endojen sıralama yollarına paralel olarak ticareti yapılır. Bu nanokorlar, floresan mikroskobu ve canlı görüntüleme ile retrograd taşımayı izlemek için seçilen floroforlarla, elektron mikroskobu ile ultrastrüktürel lokalizasyonu çözmek için askorbat peroksidaz 2 (APEX2) ve TGN varış kinetiğini nicel olarak değerlendirmek için tirozin sülfatlama motifleri ile işlevselleştirildi. Bu metodolojik çalışmada, işlevselleştirilmiş nanokorların bakteriyel ekspresyonu ve saflaştırılmasının yanı sıra stabil GFP-raportör hücre hatlarının üretilmesi için genel protokolü detaylandırıyoruz. Transferrin reseptörünün (TfR) ve katyona bağımlı mannoz-6-fosfat reseptörünün (CDMPR) endositik alımını analiz etmek için mCherry ile modifiye edilmiş bir anti-GFP nanogövdesi (VHH-mCherry) kullanarak canlı hücre görüntüleme için bu yaklaşımın faydasını örneklendiriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazma zarından çeşitli hücre içi bölmelere reseptörlerin ve diğer transmembran (TM) proteinlerin endositozu, membran homeostazının korunması için önemlidir 1,2. Klatrine bağımlı veya bağımsız endositoz ile içselleştirmeyi takiben, protein kargoları ilk olarak erken endozomları doldurur ve burada ya endo-lizozomal sistem boyunca sıralanırlar, plazma zarına geri dönüştürülürler ya da retrograd olarak trans-Golgi ağına (TGN) gönderilir 3,4,5. Endozomlardan ve/veya hücre yüzeyinden TGN'ye geri dönüşüm, katyona bağımlı ve katyondan bağımsız mannoz-6-fosfat reseptörleri (CDMPR ve CIMPR) gibi bir dizi transmembran kargo reseptörünün fonksiyonel döngüsünün bir parçasıdır ve yeni sentezlenmiş lizozomal hidrolazları TGN'den geç endozomlara ve lizozomlara 6,7,8, Wntless (WLS), Wnt ligandlarını hücre yüzeyine taşır9, TGN 13,14,15,16'dan pankreas yukarı regüle faktörü (PAUF) ve diğer CARTS kargoları dahil olmak üzere çözünür salgı kargo proteinlerine eşlik eden 10,11,12 veya TGN46. Tüm bu kargo reseptörleri, yeni müşteri proteinlerinin toplanması için TGN üzerinden gidip gelirken, demire bağlı transferrini içselleştiren transferrin reseptörü (TfR), Golgi dönüşü 17,18,19,20,21'den hariç tutulur.

Endositik ve retrograd trafiği araştırmak için, daha önce kargo proteinlerini hücre yüzeyinden hücre içi bölmelere etiketlemek ve izlemek için tasarlanmış nanobody tabanlı bir araç seti oluşturmuştuk17. Nanokorlar, devegillerde ve kıkırdaklı balıklarda doğal olarak bulunan homodimerik ağır zincirli antikorlardan (hcAb'ler) türetilen yeni bir protein bağlayıcı sınıfı oluşturur22,23. hcAb'lerin değişken ağır zincir alanını (VHH) temsil ederler ve geleneksel antikorlara (örneğin, IgG'ler) göre çok sayıda avantaj sunarlar: monomeriktirler, küçüktürler (~15 kDa), yüksek oranda çözünürler, disülfid bağları yoktur, bakteriyel olarak eksprese edilebilirler ve yüksek afiniteli bağlanma24 için seçime uygundurlar. Bu nanocisim araç setinin çok yönlülüğünü ve geniş uygulanabilirliğini geliştirmek için, hücre dışı veya lümenal alanlarında GFP etiketleriyle etiketlenmiş proteinleri yüzey etiketlemek ve izlemek için işlevselleştirilmiş anti-GFP nanokorları kullandık. Nanokorların mCherry, askorbat peroksidaz 2 (APEX2) veya tirozin sülfatlama dizileri ile rekombinant konjugasyonu yoluyla, iyi niyetli transmembran kargo proteinlerinin retrograd ticareti, sabit ve canlı hücre floresan mikroskobu, elektron mikroskobu veya otoradyografi kullanılarak biyokimyasal tahliller ile analiz edilebilir. Tirosilprotein sülfotransferazlar TPST1 ve TPST2 tarafından katalize edilen tirozin sülfatlamanın, trans-Golgi/TGN ile sınırlı bir translasyon sonrası modifikasyon olduğu göz önüne alındığında, bu strateji, hücre yüzeyindenGolgi bölmesine 25,26,27 taşıma dinamiklerinin ve kinetiğinin doğrudan değerlendirilmesini sağlar. Daha yakın zamanlarda, bu işlevselleştirilmiş protein bağlayıcı repertuarını, türetilmiş anti-mCherry nanokorlarını içerecek şekilde genişlettik. Bu reaktiflerin, MPR'lerin, özellikle CDMPR 17,28'in makineye bağlı taşıma yollarının biyokimyasal analizler yoluyla TGN'ye diseksiyonunda etkili olduğu kanıtlanmıştır.

Önceki çalışma esas olarak otoradyografi19 ile TGN gelişini biyokimyasal olarak değerlendirmek için tirozin sülfatlama dizileri ile modifiye edilmiş nanokorların uygulanmasına odaklanırken, bu yöntem makalesi, endositik kaçakçılığın canlı hücre görüntülemesi için floresan etiketli, işlevselleştirilmiş nanokorların (VHH-mCherry) ve raportör hücre hatlarının üretimini açıklamaktadır. Ek bir Golgi'de yerleşik floresan raportör proteini ile kombinasyon halinde, bu protokol, seçilen kargo proteinlerinin endozomdan TGN'ye taşınmasının canlı hücre görüntülemesini nicel olarak analiz etmek için sağlam bir iş akışı olarak hizmet edecek şekilde daha da uyarlanabilir.

Bu protokolü uygulamadan önce araştırmacılar, hedef proteinin, tipik olarak standart moleküler klonlama yaklaşımları tarafından oluşturulan GFP etiketli bir füzyon yapısı olarak ifade edildiğinden emin olmalıdır. İşlevselleştirilmiş nanokorlar, yüzey etiketleme deneyleri için yeterli verimlerde bakterilerde kolayca üretilebilir, düşük nanomolar aralıktaki çalışma konsantrasyonları çoğu canlı hücre görüntüleme testi için uygundur. Kullanıcılar ayrıca, taşıma kinetiğinin kargo proteinleri arasında değişebileceğini ve endositik veya endozomdan TGN'ye kaçakçılığın en iyi şekilde görselleştirilmesi için etiketleme süresinin veya görüntüleme sıklığının ayarlanmasını gerektirebileceğini de göz önünde bulundurmalıdır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. VHH-mCherry ile bakteriyel dönüşüm

NOT: Bu protokol, daha önce tarif edildiği gibi işlevselleştirilmiş anti-GFP nanokorlarının ekspresyonu, saflaştırılması ve analizi için optimize edilmiştir17. Aşağıdaki adımlar VHH-mCherry için uyarlanmıştır ve önceki metodolojik rapor19 ile tutarlıdır.

  1. Protein ekspresyonu için uygun kemokompetan bakterileri (örneğin, Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) hücreleri) buz üzerine yerleştirerek çözün.
    NOT: Standart laboratuvar protokollerini izleyerek kemokompetan bakteri hücrelerini hazırlayın. Bunun için NEB'den ticari olarak temin edilebilen BL21 (DE3) hücreleri kullanılabilir.
  2. İşlevselleştirilmiş VHH-mCherry yapısını kodlayan 50 ng plazmit ekleyin (Addgene #109421). Bakteri ekspresyonu sırasında nanogövde raportörünün bölgeye özgü verimli biyotinilasyonunu sağlamak için, bakteriyel biyotin ligaz BirA'yı (Addgene #109424) kodlayan bir plazmitin üç kat fazlalığı (150 ng) ile birlikte dönüşüm. Hücreleri ve plazmit DNA'yı karıştırmak için tüpü 4x-5x hafifçe kaydırın.
    NOT: Biyotin alıcı peptid (BAP) tarafından biyotinilasyon gerekli değilse, BirA kodlayan plazmit ile birlikte transformasyon gerekli değildir.
  3. Karışımı buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Bu adım sırasında ajitasyondan kaçının.
  4. Bakteri hücrelerini 42 °C'de tam olarak 20 saniye boyunca bir su banyosuna veya bir ısıtma bloğuna yerleştirerek ısı şoku uygulayın.
  5. 1 mL oda sıcaklığında (RT) Luria suyu (LB) ortamı ekleyin ve antibiyotik direnç genlerinin fenotipik ekspresyonuna izin vermek için dönüştürülmüş bakterileri bir termoshaker'da (250-500 rpm) 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    NOT: 1 L LB ortamı hazırlamak için 5 g maya özütü, 10 g tripton, 10 g NaCl ekleyin ve hacmi su ile tamamlayın ve otoklavlayarak sterilize edin.
  6. Bakterileri 1 dakika boyunca 11.000 x g'da santrifüjleme ile pelet edin ve peleti 100 μL taze LB ortamında yeniden süspanse edin. Pipetleyerek iyice karıştırın.
  7. Asılı bakterileri, uygun antibiyotikleri içeren önceden ısıtılmış LB plakalarına yerleştirin (örneğin, 50 μg/mL kanamisin ile; BirA ile birlikte dönüştürülürse, ayrıca 50 μg/mL karbenisilin içerir, bkz. adım 1.2).
  8. Antibiyotik takviyeli LB plakalarını 37 °C'de 13-15 saat baş aşağı inkübe edin.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Yetiştirilmiş kolonilere sahip plakalar 4 °C'de saklanabilir ve kurumayı önlemek için geçirgen film ile kapatılabilir.

2. Bakteriyel sıvı kültürü ve VHH-mCherry ekspresyonunun indüksiyonu

  1. Transformasyon plakasından tek bir bakteri kolonisi seçin ve onu antibiyotiklerle desteklenmiş 20 mL LB ortamı içeren bir Erlenmeyer şişesine aşılayın. Kültürü çalkalayan bir inkübatörde 37 ° C'de 13-15 saat inkübe edin (ayrıca seçim antibiyotikleri ile ilgili adım 1.7'ye bakın).
  2. Ertesi gün, gece boyunca 20 mL bakteri kültürünü, karşılık gelen seçim antibiyotikleri ile 1 L LB ortamı içeren taze bir şişeye seyreltin.
  3. Kültür, 600 nm'de (OD600) 0.6-0.7'lik bir optik yoğunluğa ulaşana kadar 37 °C'de inkübe etmeye devam edin.
    NOT: Protein ekspresyonunun indüklenmesinden önce kültürün RT'ye veya 16 ° C'ye soğumasını bekleyin.
  4. İndükleyicinin 1 mM'lik nihai konsantrasyonunu (1:1000 seyreltme) elde etmek için 1 mL 1 M izopropil-β-D-tiogalaktopiranosid (IPTG) ekleyerek VHH-mCherry (ve birlikte eksprese edilirse BirA) ekspresyonunu indükleyin. BirA ekspresyon plazmidi ile birlikte transformasyon gerçekleştirildiyse, kültürü ayrıca 10 mL 20 mM D-biyotin stok çözeltisi ile destekleyin ve büyüme ortamında 200 μM D-biyotin nihai konsantrasyonu elde edin. Bu, VHH-mCherry yapısında bulunan biyotin alıcı (BAP) epitopunun in vivo biyotinilasyonunu kolaylaştırır.
    NOT: D-biotin stoğunu ddH2O içinde hazırlayın ve kademeli olarak 500 mM NaH2PO4 ilavesiyle çözündürün .
  5. Optimal protein katlanmasını ve verimini teşvik etmek için IPTG ile indüklenen 1 L kültürü 16 ° C'de 13-15 saat inkübe edin.
    NOT: Diğer floresan etiketlerle yeni tasarlanmış nanogövde yapıları için ekspresyon koşulları, araştırmacı tarafından ampirik optimizasyon gerektirebilir.
  6. Kültürü 1 L'lik bir santrifüj şişesine aktarın ve 45 dakika boyunca 4 ° C'de 5.000 x g'da santrifüjleme ile hücreleri hasat edin. Süpernatanı uygun sıvı biyoatığa atın ve saflaştırma adımlarına devam edin.
    NOT: Protokol bu noktada bakteri peletini -80 °C'de saklayarak duraklatılabilir. VHH-mCherry peleti tipik olarak pembe görünür ve floresan füzyon proteininin uygun şekilde katlandığını gösterir.

3. VHH-mCherry'nin IMAC bazlı saflaştırılması

  1. Gerekirse, donmuş bakteri peletini buz üzerinde çözdürün (ayrıca bkz. adım 2.6).
  2. Bakteri hücresi peletine 30 mL buz gibi bağlayıcı tampon (1x PBS'de 20 mM imidazol) ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice yeniden süspanse edin. Süspansiyonu etiketli 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  3. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri 200 μg / mL lizozim, 20 μg / mL DNase I, 1 mM MgCl2 ve 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ile destekleyin. Karışımı RT'de 10 dakika, ardından uçtan uca döndürücüde 4 °C'de 1 saat inkübe edin.
    NOT: PMSF zehirlidir. Stok çözeltilerini eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması takarak kimyasal çeker ocakta hazırlayın ve kullanın; PMSF içeren atıkları halojenli organik atık kaplarına atın. Deneyler için 0,1 M'lik bir stok çözeltisi kullanıldı ve daha da seyreltildi.
  4. Doğrudan süspansiyona yerleştirilen bir uç sonikatör kullanarak bakteri hücrelerini mekanik olarak bozun. Belirtilen sonikatör ayarlarıyla her darbe arasında 1 dakikalık bir soğutma aralığına izin vererek sabit üç adet 1 dakikalık sonikasyon darbesi uygulayın (Prob ucu boyutu: 6 mm, katı uç; Genlik @; Görev döngüsü (darbe modu): 1 sn AÇIK/1 sn KAPALI)
  5. Bakteriyel hücre kalıntılarını ve bozulmamış bakterileri peletlemek için lizatı 4 °C'de 45 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleme ile berraklaştırın.
    NOT: Lizat bir santrifüj şişesine aktarılabilir veya tezgah üstü santrifüjleme için 5 mL'lik tüplere aktarılabilir.
  6. Elde edilen süpernatanı dikkatlice yeni bir 50 mL tüpe aktarın ve peleti uygun biyoatığa atın.
  7. Hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisine (IMAC) hazırlanırken temizlenmiş lizatı buz üzerinde tutun. Histidin etiketli nanokorların izolasyonu için, yerçekimi akışı işlemi için optimize edilmiş önceden paketlenmiş, tek kullanımlık His-tag saflaştırma kolonlarını kullanın.
  8. Ni-NTA (nikel-nitrilotriasetik asit) kolonlarını metal bir stand veya uygun bir kolon tutucu üzerine sabitleyin.
    1. Depolama tamponunu kolonlardan boşaltın ve 10 mL bağlama tamponu (1x PBS'de 20 mM imidazol) ile dengeleyin.
    2. Tamponun yerçekimi ile geçmesine izin verin; akışı biyolojik atık olarak atın.
  9. Temizlenmiş bakteri lizatını (~ 30 mL) yavaş yavaş kolona uygulayın. Yerçekimi ile akmasına izin verin ve akışı atın.
  10. Kolonu iki ardışık 10 mL hacim bağlama tamponu (1x PBS'de 20 mM imidazol) ile yıkayın.
  11. Bağlı nanokorları 2 mL elüsyon tamponu (1x PBS'de 500 mM imidazol) ile 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ayrıştırın.
  12. Bir arabellek değişimi gerçekleştirin.
    1. 50 mL'lik bir tüp adaptörüne yerleştirilmiş bir tuzdan arındırma kolonunu, 5 mL 1x PBS ile 5x durulayarak dengeleyin.
    2. Tamponun paketlenmiş reçineye tamamen girmesine izin verin; akışı atın. Son PBS yıkamasından sonra, kolonu 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin.
    3. Akışı atın. Adaptörlü sütunu yeni bir 50 mL tüpe yerleştirin. PBS ile dengelenmiş tuzdan arındırma kolonuna 2 mL ayrıştırılmış işlevselleştirilmiş nanocisim (adım 3.11'den itibaren) yükleyin ve 2 dakika boyunca 1.000 x g'da döndürün ve elüatı toplayın.
      NOT: Diyaliz alternatif olarak tampon değişimi için kullanılabilir.
  13. Saflaştırılmış VHH-mCherry proteininin konsantrasyonunu, üreticinin protokollerine göre bir bisinkoninik asit (BCA) veya Bradford testi kullanarak ölçün.
    NOT: Canlı hücre görüntüleme uygulamalarında verimli nanocisim alımı için, 5-10 mg / mL'lik bir nihai stok konsantrasyonu önerilir.

4. VHH-mCherry ekspresyonunun ve saflığının doğrulanması (Coomassie boyama)

  1. Yerleşik laboratuvar protokollerine göre 'luk bir sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel (SDS-PAGE) hazırlayın.
    NOT: Alternatif olarak, kolaylık ve tekrarlanabilirlik için Bio-Rad'ın ticari olarak temin edilebilen prekast gradyan jelleri kullanılabilir.
  2. 20 μg saflaştırılmış VHH-mCherry'yi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde ayırın ve numune tamponunda 95 °C'de 5 dakika kaynatılarak denatüre edin.
  3. Denatüre nanogövde örneğini SDS-poliakrilamid jel üzerine yükleyin ve izleme boyası (örneğin, bromofenol mavisi) çözücü jelin dibine ulaşana kadar standart PAGE prosedürlerini izleyerek elektroforez gerçekleştirin.
  4. Coomassie boyama ve jelin lekelenmesi ile devam edin.
    1. Jeli kasetten dikkatlice çıkarın ve hafifçe çalkalanan bir platformda RT'de 20-30 dakika boyunca Coomassie boyama solüsyonuna ( asetik asit içinde 10 g/L Coomassie Brilliant Blue stoğunun %5'i ve ddH2O içinde E metanol) daldırın. Jelin boyama solüsyonuna tamamen batırıldığından emin olun.
    2. Jeli bir leke giderme çözeltisi (ddH2O içinde% 7.5 asetik asit ve% 15 metanol) kullanarak lekeleyin ve RT'de her biri 1 saatlik 2-3 ardışık yıkama gerçekleştirin. Optimum arka plan azaltma için jeli taze leke giderme solüsyonunda 13-15 saat bekletin.
      NOT: Fazla boya, leke çıkarma işlemi sırasında jelin etrafına ev tipi kağıt havlular yerleştirilerek etkili bir şekilde emilebilir. Boyama/leke giderme solüsyonları yanıcı metanol ve tahriş edici asetik asit içerir. Çeker ocakta kullanın, eldiven ve gözlük takın ve kullanılmış solüsyonları belirlenmiş yanıcı-sıvı atık kaplarında toplayın.
  5. Bir jel dokümantasyon sistemi veya tercih ettiğiniz kamerayı kullanarak jeli görselleştirin.
    NOT: Nanocisim ekspresyonunun ek olarak doğrulanması için, epitopa özgü antikorlar kullanılarak immünoblotlama yapılabilir (ayrıca bakınız Şekil 1C).

5. Retroviral transdüksiyon kullanılarak GFP etiketli raportör HeLa hücre hatlarının oluşturulması

NOT: Çeşitli GFP muhabiri HeLa α Kyoto hücre dizileri (burada basitçe HeLa veya HeLa α olarak adlandırılır) daha önce17 oluşturulmuştur. Canlı hücre görüntüleme testini göstermek amacıyla, temsili kargo proteinleri olarak GFP etiketli CDMPR veya TfR kullanılır. Tip I topolojiye sahip TM proteinleri, aşırı N-terminalinde GFP etiketliyken, tip II topolojiye sahip TM proteinleri, C-terminal GFP füzyonu gerektirir.

  1. EGFP-CDMPR (Addgene #182642) veya TfR-EGFP (#243763) kodlayan genler, daha önce standart kısıtlama enzimi klonlama teknikleri17 kullanılarak retroviral vektör pQCXIP'ye alt klonlanmıştır. Kemokompetan E. coli'ye dönüşümün ardından, midi hazırlık kitleri (örneğin, Macherey-Nagel'den) kullanarak yüksek saflıkta plazmit DNA hazırlayın.
    NOT: Kemokompetan bakteri hücreleri standart laboratuvar protokollerine göre hazırlanmalıdır. NEB'den NEB 5-alfa Yetkin E. coli , klonlama ve plazmit saflaştırması için kullanılabilir.
  2. Kararlı GFP raportör HeLa hücre dizileri oluşturmak için, retroviral partiküller, paketleme hücre hattı Phoenix ampho'nun transfeksiyonu ile üretilir. Tüm hücre kültürü çalışmaları BSL2 laminer akış koşulları altında gerçekleştirilir.
    1. Transfeksiyondan bir gün önce, ertesi gün `-80 birleşme elde etmek için 2.0-3.0 x 106 Phoenix amfo hücresini 10 mL ortamda 10 cm'lik bir kaba tohumlayın. Phoenix amfo, fetal sığır serumu (FBS), 100 ünite/mL penisilin/streptomisin ve 1 mM sodyum piruvat ile DMEM yüksek glikozlu GlutaMAX-I içinde tutulur.
    2. Transfeksiyon gününde, besiyerini 10 mL taze tam besiyeri ile değiştirin.
    3. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 1 mL serum ve takviye içermeyen DMEM yüksek glikozlu GlutaMAX-I'i 10 μg pQCXIP-EGFP-CDMPR veya pQCXIP-TfR-EGFP ve 30 μL FuGENE HD transfeksiyon reaktifi ile birleştirin. Pipetleyerek iyice karıştırın.
    4. DNA-reaktif komplekslerinin oluşumuna izin vermek için karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
    5. Tüm transfeksiyon karışımını Phoenix amfo kültürüne damla damla ekleyin. Kompleksleri eşit olarak dağıtmak için plakayı hafifçe döndürün.
    6. Transfekte edilmiş Phoenix amfo hücrelerini 37 °C'de 13-15 saat boyunca %5CO2 ile inkübe edin.
      NOT: Retro-X Q vektör sistemi ile uyumlu olmaları koşuluyla alternatif paketleme hücre hatları kullanılabilir.
  3. Ertesi gün, transfeksiyon ortamını atın ve viral üretimi arttırmak için 7 mL taze tam ortam ile değiştirin.
  4. Transfeksiyondan 48 saat sonra ve isteğe bağlı olarak 72 saat sonra, bir pipet yardımı kullanarak viral partiküller içeren kültür süpernatanını (~ 7 mL) toplayın. Bir floresan mikroskobu veya görüntüleme sistemi (örneğin, Bio-Rad ZOE) kullanarak transfekte edilmiş Phoenix ampho hücrelerinde GFP ekspresyonunu izleyin.
    NOT: Yine, retroviral manipülasyonlar BSL-2 muhafazası gerektirir. Tüm çalışmaları sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin, eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması giyin ve atıkları otoklav yoluyla bertaraf etmeden önce yüzeyleri %1 hekzakuent ve ardından p etanol ile dekontamine edin.
  5. Toplanan viral süpernatanı 0.45 μm boyutunda bir filtreden süzün. Filtrelenmiş süpernatan hemen kullanılabilir (bkz. adım 5.7) veya kısa süreli kullanım için 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -80 °C'de saklanabilir. Viral titrelerin dondurulduktan sonra azalabileceğini unutmayın.
  6. Stabil GFP raportör HeLa hücreleri oluşturmak için, filtrelenmiş viral süpernatantı kullanarak retroviral transdüksiyona devam edin. Tüm prosedürler BSL2 koşulları altında gerçekleştirilmelidir.
    1. Transdüksiyondan bir gün önce, ertesi gün `-80 birleşmeye ulaşmak için 10 mL ortam içeren 10 cm'lik bir kaba yaklaşık 2.0-3.0 x 106 HeLa α hücresi ekin. Kültür HeLa α hücreleri, FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ile desteklenmiş DMEM yüksek glikozlu GlutaMAX-I içinde kültürlenir.
    2. Enfeksiyon etkinliğini artırmak için filtrelenmiş viral süpernatanı 15 μg/mL polibren (heksadimetrin bromür) ile karıştırın.
      NOT: Polibren tahriş edicidir - stok hazırlama sırasında eldiven ve göz koruması ile tutun, aerosol oluşumunu önleyin ve Polibren içeren solüsyonları tehlikeli kimyasal atık olarak atın.
    3. Ertesi gün, standart büyüme ortamını Polybren içeren seyreltilmemiş viral süpernatant ile değiştirin ve kabın tüm yüzeyinin kaplandığından emin olun.
    4. HeLa α hücrelerini transdüksiyon altında 37 °C'de 13-15 saat boyunca %5CO2 ile inkübe edin.
      NOT: Viral titreyi belirlemek için HeLa α hücreleri üzerinde seri seyreltme ve enfeksiyon testleri yapılabilir. Retrovirüsler yalnızca bölünen hücreleri enfekte ettiğinden, bu durumda titre isteğe bağlıdır.
  7. Transdüksiyondan sonraki gün, viral ortamı BSL2 atığına atın ve 10 mL taze tam HeLa α ortamı ile değiştirin. %5 CO2 ile 37 °C'de 13-15 saat inkübe edin.
  8. Ertesi gün, besiyerini 1.5 μg/mL puromisin içeren tam besiyeri ile değiştirerek seçimi başlatın.
  9. Seçim baskısını 2-3 hafta boyunca sürdürün, gerektiğinde hücreleri geçirin. Genetiği değiştirilmiş hücreleri bir BSL1 ortamına aktarmadan önce, replikasyon yetkin viral partiküller içermediklerinden emin olun.
  10. Homojen bir popülasyon elde etmek için, klonlama halkaları veya silindirleri kullanarak klonal izolasyon veya floresanla aktive olan hücre sınıflandırması (FACS) kullanın. FACS, floresan yoğunluğuna dayalı tek tip GFP ekspresyonu ile bir popülasyonu zenginleştirmek için FACSAria III veya Fusion (BD Biosciences) kullanılarak transdüksiyona tabi tutulan HeLa α hücreleri üzerinde gerçekleştirilebilir.
    NOT: HeLa α hücrelerinde GFP raportörünün ekspresyonu, sabit hücreli floresan mikroskobu veya anti-GFP antikorları ile immünoblotlama ile daha da doğrulanabilir (ayrıca bakınız Şekil 2C).

6. Canlı hücre görüntüleme için kültürlenmiş hücreler tarafından VHH-mCherry alımı

NOT: Tüm hücre kültürü prosedürleri, canlı hücre mikroskobundan önce laminer bir akış başlığı içinde steril koşullar altında gerçekleştirilir.

  1. 6.1 Steril laminer akış altında, GFP etiketli CDMPR veya TfR raportör yapılarını stabil bir şekilde eksprese eden yaklaşık 50.000 ila 110.000 HeLa hücresini, μ lamlı 4 oyuklu ibiTreat odası slaytının her bir oyuğuna tohumlayın. FBS, 100 U/mL penisilin/streptomisin, 2 mM l-glutamin ve 1.5 μg/mL puromisin ile desteklenmiş, antibiyotik (DMEM yüksek glikoz, fenol kırmızısız) içeren 700 μL tam kültür ortamı kullanın.
  2. Uygun yapışma ve proliferasyona izin vermek için hücreleri 37 ° C'de 13-15 saat boyunca% 5CO2


    6. figure-protocol-1

      figure-protocol-2

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli hücre içi bölmelere retrograd protein kaçakçılığını araştırmak için, yakın zamanda hücre yüzeyinden rekombinant füzyon proteinlerini etiketlemek ve izlemek için anti-GFP nanocisim tabanlı bir araç oluşturduk17. Burada, bu tür türetilmiş nanokorların bakteri üretimini tanımlıyoruz ve canlı hücre görüntüleme ile endositik alımın izlenmesindeki faydalarını gösteriyoruz. Golgi'de yerleşik bir floresan raportör ile birlikte bu protokol, seçilen kargo proteinlerinin trans-Golgi ağına (TGN) geriye dönük taşınmasını gerçek zamanlı olarak nicel olarak incelemek için sağlam bir platform sunar.

Standart moleküler klonlama tekniklerini17 kullanarak ortak bir modüler mimariyi paylaşan farklı işlevselleştirilmiş anti-GFP nanokorlarından oluşan bir koleksiyon oluşturduk. Mevcut çalışma, floresan varyantı VHH-mCherry'ye odaklansa da, bu araç setinin çok yönlülüğünü göstermek ve gelecekteki uygulamalar için potansiyellerini vurgulamak için ek türetilmiş nanokorlar da dahil ediyoruz. En temel yapımız olan VHH-std (standart için std), VHH alanı, antikor bazlı tespit için T7 ve HA epitopları, saflaştırma için bir C-terminal hekzahistidin (His6) etiketi ve enzimatik biyotinilasyon ve yüksek afiniteli streptavidin bazlı aşağı çekme deneylerini mümkün kılmak için bir biyotin alıcı peptit (BAP) dizisi içerir (Şekil 1A). Bu çekirdek tasarımdan, biyokimyasal analiz, sabit ve canlı hücre görüntüleme ve elektron mikroskobu yoluyla endositik ve retrograd kaçakçılığın incelenmesini kolaylaştırmak için çeşitli nanogövde türevleri geliştirildi.

Endositik taşımanın canlı hücre görüntülemesi için, GFP'ninkinden farklı uyarma ve emisyon spektrumlarına sahip bir florofor içeren bir floresan anti-GFP nanogövdesi tasarladık, böylece floresan mikroskobu sırasında optimum spektral ayrımı sağladık. IPTG ile indüklenen E. coli'deki üstün katlanma özelliklerine ve iyi karakterize edilmiş fotofiziksel özelliklerine dayanarak, tercih edilen floresan etiketi olarak mCherry'yi seçtik. Monomerik kırmızı floresan proteini (mRFP) gibi diğer kırmızıya kaymış floroforlar da prensipte uygun alternatifler olabilir, ancak mCherry bu sistemde özellikle sağlam ve etkili olduğunu kanıtladı.

VHH-mCherry dışındaki diğer işlevselleştirilmiş nanocisimlerin potansiyeli nedir? Plazma zarından trans-Golgi ağına (TGN) protein kaçakçılığını araştırmak için, yalnızca TGN ve trans-Golgi sarnıçlarında bulunan TPST'lerin bölmeye özgü lokalizasyonundan yararlandık. Bu amaçla, VHH-std'yi sıçan prokolesistokinin29'dan türetilen bir tandem tirozin sülfatlama motifi (2xTS) ile modifiye ettik, böylece bu bölmelere gelen kargonun biyokimyasal olarak okunmasını sağladık. VHH-std'nin mCherry'ye füzyonu, sabit veya canlı hücre görüntüleme ile retrograd taşımanın doğrudan görselleştirilmesine izin verirken, APEX230 gibi peroksidazlarla işlevselleştirme, elektron mikroskobu, hedeflenen sitokimyasal ablasyon veya yakınlığa dayalı biyotinilasyon deneyleri ile ultrastrüktürel lokalizasyona izin verir. Ayrıca, bir tütün aşındırma virüsü (TEV) proteaz bölünme bölgesinin nanogövde iskelesine dahil edilmesi, içselleştirilmiş ve yüzeye bağlı nanokorlar arasında ayrım yapmak için biyokimyasal bir araç sağlar (Şekil 1A). Daha önce nanogövdeye bağlı EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP17'nin geri dönüşüm kinetiğini izlemek için VHH-tev yapısını kullanmıştık. Hücre yüzeyinde nanocisim etiketli reseptörlerin yeniden ortaya çıkması, hücre dışı olarak rekombinant TEV proteaz uygulanarak kolayca tespit edilebilir, bu da nanocismin C-terminal epitop kasetinin spesifik bir kaybına neden olur. Benzer şekilde, burada sunulan mCherry ile işlevselleştirilmiş nanogövde VHH-mCherry'ye bir TEV bölünme bölgesinin dahil edilmesi, canlı hücre görüntüleme ile EGFP raportör geri dönüşümünün dinamik olarak değerlendirilmesine izin verir. Ek floroforlar, enzimatik etiketler veya translasyon sonrası modifikasyon için dizi motifleri gibi alternatif protein alanlarıyla işlevselleştirme, istenen eklerin SpeI ve EcoRI kısıtlama bölgeleri tarafından VHH-std omurgasına alt klonlanmasıyla kolayca gerçekleştirilebilir. Orijinal çalışmada17 kullanılan tüm işlevselleştirilmiş anti-GFP nanogövde yapıları, halka açık dağıtım için Addgene ile biriktirilmiştir.

Yukarıda açıklanan protokol kullanılarak, burada gösterilen tüm nanogövde varyantları yüksek verim ve saflığa kadar saflaştırıldı (Şekil 1B). Sadece mCherry füzyonu, saflaştırmayı takiben protein alanlarının küçük proteolitik kırpılmasını sergiledi (Şekil 1B, şerit 5). Gözlenen iki bozunma ürünü, görünen moleküler ağırlıklarından anlaşıldığı ve epitopa özgü immünoblot tespiti ile doğrulandığı gibi, büyük olasılıkla bireysel VHH ve mCherry alanlarına karşılık gelir (Şekil 1C). Birlikte eksprese edilen BirA'nın yokluğunda, VHH-mCherry tipik olarak preparat başına yaklaşık 20 mg'lık verimlerde geri kazanıldı. Deneyimlerimize dayanarak, BirA'nın birlikte ekspresyonu, nanogövde verimini kabaca 1/3 ila 1 /2 oranında sürekli olarak azaltır. Biyotinilasyon oldukça tamamlandı çünkü BSA ile 1:1 karışımdan elde edilen nanokorlar streptavidin-agaroz tarafından tamamen geri kazanıldı (Şekil 1D).

Bu nanocisim araç setinin endositik taşımayı incelemek için uygunluğunu değerlendirmek için, farklı hücre içi kaçakçılık yollarına sahip EGFP etiketli yüzey reseptör proteinlerini eksprese eden stabil HeLa hücre hatları ürettik. Bunlar arasında plazma zarı ile erken (ayırma ve geri dönüşüm) endozomlar arasında geçiş yapan TfR; Erken endozomlar tarafından plazma zarı ile TGN arasında trafik yapan TGN46; ve TGN, plazma zarı ve hem erken hem de geç endozomlar arasında mekik dokuyan her iki MPR17. EGFP, her bir reseptörün hücre dışı alanına - spesifik olarak, sinyal peptidi ile CDMPR, CIMPR ve TGN46 için reseptör dizisi arasına yerleştirildi - ve TfR'nin C-terminaline kaynaştırıldı. Bu tasarım, doğal sitoplazmik alanları koruyarak, bilinen tüm sıralama sinyallerinin bozulmadan kalmasını ve EGFP etiketinin hücre dışı anti-GFP nanokorları tarafından bağlanma için erişilebilir olmasını sağladı (Şekil 1E). Hücre dışı alanı alışılmadık derecede büyük olan CIMPR için, bu tür bir kesmenin normal kaçakçılık davranışını koruduğunu gösteren önceki çalışmalarla tutarlı olarak kısaltılmış bir versiyon kullanıldı31,32.

Stabil hücre hatları, retroviral transdüksiyon ile oluşturuldu, ardından orta ve karşılaştırılabilir ekspresyon seviyelerine sahip homojen hücre popülasyonlarını izole etmek için floresanla aktive olan hücre sınıflandırması (FACS) yapıldı. Dikkat çekici bir şekilde, EGFP-CDMPR, heterojen glikosilasyonun göstergesi olan endojen muadili33'e benzer şekilde, immünoblotlarda tutarlı bir şekilde çift bant olarak göründü. EGFP füzyon proteinlerinin, endojen proteinlerin kararlı durum lokalizasyonunu ve ekspresyon modellerini özetleyip özetlemediğini değerlendirmek için, stabil olarak eksprese eden hücreler, ebeveyn HeLa hücreleri ile birlikte kültürlendi ve konfokal floresan mikroskobu ile analiz edildi (Şekil 2B). EGFP sinyali, karşılık gelen endojen proteinlerin dağılımını aslına uygun olarak yansıttı. Beklendiği gibi, CDMPR, CIMPR ve EGFP etiketli versiyonları, periferik endozomlarda ek etiketleme ile ağırlıklı olarak perinükleer bölgeye lokalize oldu - TGN ve geç endozomal bölmeleri yansıttı. Hem endojen hem de EGFP etiketli TGN46, neredeyse yalnızca perinükleer TGN'de bulunurken, TfR ve TfR-EGFP, belirgin periferik sıralama ve perinükleer geri dönüşüm endozomları ile karakteristik erken endozom dağılımını sergiledi. Kullanılan antikorlar hem endojen hem de EGFP etiketli formları (CIMPR hariç) tespit etse de, füzyon proteinlerini eksprese eden hücrelerde genel boyama yoğunluğu belirgin bir şekilde artmadı, bu da EGFP yapılarının önemli ölçüde aşırı eksprese edilmediğini düşündürdü. EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP ile doğrudan karşılaştırma için EGFP-TGN46 ve EGFP-CIMPR'yi Şekil 2B'ye dahil ettik. Hücre fiksasyonu ve floresan mikroskobu görüntüleme için kullanılan protokoller önceki çalışmalardaözetlenmiştir 17,19.

VHH-mCherry kullanılarak, EGFP etiketli raportör proteinlerin endositik taşınması, canlı hücre görüntüleme ile izlenebilir. Bunun için örnek olarak EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP eksprese eden hücreleri kullandık. Hücreler, ortama VHH-mCherry eklenmesi üzerine ters çevrilmiş geniş alanlı bir floresan mikroskop ile zaman içinde görüntülendi (Video 1 ve Video 2). Çeşitli zaman noktalarındaki durağan görüntüler Şekil 3'te gösterilmektedir. Alım, mCherry kanalındaki sinyal ölçülerek, otofloresan arka planı çıkarılarak ve etiketli bölmelerin hareketinden veya odak düzlemindeki potansiyel küçük kaymalardan kaynaklanan dalgalanmaları ortadan kaldırmak için EGFP sinyaline normalleştirilerek ölçüldü. VHH-mCherry'nin 25 nM'deki ortamdaki floresansı ihmal edilebilir düzeydeydi ve ölçümlere müdahale etmedi. Raportörlerin hücre yüzeyinden hücre içi bölmelerine, kararlı durum dağılımına taşınmasının analizi, önceki yayın17'nin Şekil 2'sinde gösterilen biyokimyasal deneylerle aynı kinetik sonuçları verdi, EGFP-CDMPR için ~9 dakika ve TfR-EGFP için ~4 dakika alım yarı ömürleri ve ~43 dakika ve ~20 dakika sonra doygunluk, sırasıyla. Bu değerler, immünoblotlama deneyleri17 kullanılarak biyokimyasal alım deneylerinden elde edilen değerlerle karşılaştırılabilirdi. Prensip olarak, MPR'lerin en yüksek konsantrasyonunun perinükleer bölgesi gibi ilgilenilen hücre altı bölgelere retrograd taşınmanın kinetiği de analiz edilebilir. Bununla birlikte, perinükleer bölge sadece Golgi/TGN içermez, aynı zamanda geç endozomlar ve geri dönüşüm endozomları açısından da zengindir. Perinükleer bölgeye nanobody alımının kinetiği, tanımlanmış bir organele retrograd taşınmayı analiz etmek için yeterince spesifik değildir. Plazma membranından TGN'ye taşınmasını daha güvenilir bir şekilde değerlendirmek için, başka bir floresan protein, TGN'de yerleşik bir transmembran proteini, florofor özelliklerinin spektral örtüşmesi olmayacak şekilde GFP raportör proteini ile birlikte stabil bir şekilde birlikte eksprese edilmelidir. Bu ekstra işaretleyicinin kullanılması, daha önce belgelendiği gibi, TPST'lerin aracılık ettiği tirozin sülfatlaşmasına benzer şekilde, raportör tarafından ithal edilen VHH-mCherry'nin saptanmasına izin verir19.

figure-results-1
Şekil 1: EGFP etiketli hücre yüzeyi proteinlerini izlemek için türetilmiş nanokorların tasarımı ve üretimi. (A) Türetilmiş nanokorlara şematik genel bakış. Standart nanocisim yapısı, saflaştırma için bir GFP'ye özgü VHH alanı, T7 ve HA epitop etiketleri, bir biyotin alıcı peptid (BAP) ve bir C-terminal hekzahistidin (His6) etiketi içerir. Ek nanogövde varyantları, tandem tirozin sülfatlama bölgeleri (2xTS), tasarlanmış peroksidaz APEX2 veya floresan protein mCherry ile modifikasyonları içerir. Ölçek çubuğu amino asit (aa) uzunluğunu gösterir. (B) Bakteriyel olarak eksprese edilen ve afiniteyle saflaştırılmış nanokorlar (20-50 μg), gradyan SDS-PAGE ile analiz edildi ve Coomassie boyama ile görselleştirildi. Moleküler ağırlık standartları (kDa cinsinden) solda belirtilmiştir. Minör proteolitik kırpma sadece VHH-mCherry için gözlendi ve muhtemelen VHH ve mCherry alanları arasında meydana geldi. (C) T7, HA veya His 6 epitopuna karşı yönlendirilen antikorlar kullanılarak veya biyotinilasyon değerlendirmesi için streptavidin-HRP (SA-HRP) ile tespit edilen nanovücut preparatlarının (10 ng) immünoblot analizi. (D) Nanobody biyotinilasyonunun kapsamı, nanokorların BSA ile 1:1 oranında inkübe edilmesi, ardından streptavidin-agarozun aşağı çekilmesi, peletlenmesi ve boncukların yıkanması ile değerlendirildi. Süpernatantın (S) ve boncuk bağlı materyalin (B) eşit hacimleri daha sonra SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile analiz edildi. Boncuk bağlı fraksiyonda nanogövdenin kantitatif geri kazanımı, tam biyotinilasyonu gösterir. Bağlı fraksiyonda hem VHH hem de mCherry fragmanlarının varlığı, muhtemelen SDS-PAGE analizi için numune hazırlama sırasında meydana gelen kısmi bozulmayı düşündürür. 2. ve 3. şeritler arasındaki beyaz çizgi, ilgisiz iki şeridin silindiğini gösterir. Bu rakam17'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Floresan etiketli EGFP etiketli kargo reseptörlerinin ekspresyonu ve hücre içi lokalizasyonu. (A) EGFP füzyon yapılarının şematik gösterimi. Salgı transmembran proteinlerinden türetilen diziler, N-terminal sinyal peptitleri ve dahili transmembran alanları sarı renkle vurgulanarak siyah renkle gösterilmiştir. EGFP kısmı yeşil renkle gösterilmiştir. CDMPR, TfR ve TGN46 için tam uzunlukta yapılar oluşturulurken, normal kaçakçılık davranışını korumak için CIMPR için iyi karakterize edilmiş kesilmiş bir varyant kullanıldı. Ölçek çubuğu amino asit (aa) uzunluğunu gösterir. EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP daha önce tanımlanmıştır17. (B) Hücre altı lokalizasyonunu değerlendirmek için, EGFP füzyon proteinlerini stabil bir şekilde eksprese eden HeLa hücreleri, ebeveyn HeLa hücreleri ile birlikte kültürlendi ve floresan mikroskobu ile analiz edildi. Ölçek çubuğu 10 μm'yi temsil eder. (C) EGFP etiketli raportör proteinleri stabil bir şekilde eksprese eden HeLa hücreleri parçalandı ve protein ekstraktları SDS-PAGE'ye tabi tutuldu, ardından GFP ve aktine karşı antikorlar kullanılarak immünoblotlama yapıldı. Moleküler ağırlık belirteçleri (kDa cinsinden) sağda belirtilmiştir. Bu rakam17'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP'nin aracılık ettiği nanovücut endositik alım kinetiğinin canlı hücre görüntülemesi. 37 °C'de fenol kırmızısı içermeyen tam ortamda (A) EGFP-CDMPR veya (B) TfR-EGFP'yi stabil bir şekilde eksprese eden HeLa hücrelerine 25 nM VHH-mCherry eklenmesinin ardından canlı hücre görüntüleme yapıldı. Hücreler, 36 s aralıklarla yarı otomatik geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak GFP ve mCherry kanallarında görüntülendi. Temsili birleştirilmiş durağan görüntüler, aşağıdaki ayrı kanallarda perinükleer bölgenin büyütülmüş görüntüleri (büyütme: 2,2x) eşliğinde gösterilmektedir. (Ölçek çubukları, 10 μm.) Ayrıca bkz. Video 1 ve Video 2. (C) EGFP-CDMPR ve (D) TfR-EGFP'de nanocisim alım kinetiğinin kantitatif analizi, her biri yaklaşık 40 ayrı hücreyi yakalayan üç bağımsız deneyden elde edilen veriler kullanılarak gerçekleştirildi. Organel hareketini ve odak düzlemi değişkenliğini hesaba katmak için, mCherry floresan yoğunluğu GFP sinyaline normalleştirildi (norm) ve üç deneyden tüm hücrelerde ortalama ± SD olarak çizildi. Ortalama maksimum alım sinyali 1'e normalleştirildi. Her hücre için alım kinetiği, birinci dereceden bir kinetik model kullanılarak ayrı ayrı yerleştirildi. Çizilen çizgiler, karşılık gelen hız sabitlerinin ortalamasından türetilen ortalama eğrileri temsil eder. Bu rakam17'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: EGFP-CDMPR tarafından mCherry-nanocor alımının canlı hücre görüntülemesi. EGFP-CDMPR'yi stabil bir şekilde eksprese eden HeLa hücreleri, 25 nM VHH-mCherry içeren tam ortamda 37 °C'de inkübe edildi ve hem EGFP hem de mCherry floresan kanallarında 36 s aralıklarla görüntülendi. Film, 3 dakika/sn'lik gerçek zamanlı sıkıştırmaya karşılık gelen 5 kare/sn'lik bir oynatma hızında işlendi. Bu film17'den değiştirildi. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 2: TfR-EGFP tarafından mCherry-nanocor alımının canlı hücre görüntülemesi. TfR-EGFP'yi stabil bir şekilde eksprese eden HeLa hücreleri, 25 nM VHH-mCherry ile desteklenmiş tam ortamda 37 °C'de inkübe edildi ve 36 s aralıklarla EGFP ve mCherry floresansı için görüntülendi. Film, 3 dakika/sn'lik hızlandırılmış çekim hızını temsil eden 5 kare/sn'de işlendi. Bu film17'den değiştirildi. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanokorlar, geleneksel antikorlara göre çok sayıda avantaj sunan, hızla ortaya çıkan bir protein bağlama iskelesi sınıfını temsil eder: küçük, oldukça kararlı, monomerik, çapraz bağlanmaz, disülfid bağları yoktur ve yüksek afiniteli bağlanma24 için seçilebilirler. Önceki çalışmamızda, yüzeye maruz kalan proteinleri etiketlemek ve hücre içi trafiğini çeşitli bölmelere izlemek için bakteri ekspresyonu ile üretilen işlevselleştirilmiş nanokorlar geliştirdik ve uyguladık, özellikle trans-Golgi ağına (TGN)17 retrograd taşımaya odaklandık. Çok yönlülüğü sağlamak için bir anti-GFP nanogövdesi kullandık ve hücre dışı GFP, YFP veya mCerulean ile etiketlenmiş füzyon proteinlerinin hedeflenmesini sağladık - yaygın olarak bulunan ve genellikle zaten karakterize edilmiş floresan etiketler. Anti-GFP nanogövdesinin mCherry, APEX2 veya tirozin sülfatlama motifleri ile işlevselleştirilmesi, sabit ve canlı hücre görüntüleme ile kargo alımını görselleştirmemize, retrograd taşıma bölmelerini ultrayapısal düzeyde lokalize etmemize, hedeflenen bölme ablasyonu gerçekleştirmemize ve taşıma kinetiğini nicel olarak değerlendirmemize olanak sağladı. Bu yaklaşımın bir sınırlaması, işlevselleştirilmiş anti-GFP nanokorlarının etkili bir şekilde kullanılabilmesi için hedef hücre hatlarının genetik modifikasyonunun - ya stabil aşırı ekspresyon ya da endojen etiketleme yoluyla - ön koşuludur. Bununla birlikte, bu strateji, hayvan bağışıklaması veya ribozom veya faj görüntüleme teknolojileri34 kullanılarak sentetik VHH kitaplıklarından in vitro seçim yoluyla üretilen etiketlenmemiş, endojen hedef proteinlere karşı yönlendirilen nanokorların büyüyen repertuarına kolayca uyarlanabilir. Ek olarak, mCherry, V5 veya ALFA gibi yaygın olarak kullanılan epitop etiketlerini hedefleyen nanokorlar son yıllarda geliştirilmiştir 35,36,37. Özellikle, yakın zamanda, hızlı fonksiyonel inaktivasyon28 yoluyla GGA2'den yoksun HeLa hücrelerinde CDMPR'nin retrograd kaçakçılığını araştırmak için sülfatlama yetkin bir anti-mCherry nanoconu kullandık. Küçük epitop etiketleri, kritik yapısal alanlara müdahale etme olasılıkları daha düşük olduğundan, hedef proteinin doğal yapısını ve işlevini koruma avantajını sunar. Bu kompakt epitopları (örneğin, ALFA, V5) tanıyan nanokorlar, endositik ve retrograd kaçakçılık mekanizmalarının incelenmesindeki faydasını genişletmek için fonksiyonel nanogövde araç setine sorunsuz bir şekilde entegre edilebilir.

Bu çalışmada, canlı hücre görüntüleme deneylerinde VHH-mCherry'nin uygulanmasını gösteriyoruz. EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP'yi raportör proteinler olarak kullanarak, reseptöre özgü endositik alımı ve bunların kararlı durum dağılımına doğru ilerlemesini görselleştirebildik. Bu muhabirlerin plazma zarından ilgili hücre içi bölmelerine kaçakçılığının kantitatif analizi, önceki bir çalışmanın17 Şekil 2'sinde sunulan biyokimyasal tahliller yoluyla elde edilenlerle tutarlı kinetik ortaya çıkardı. Görünen yarı ömrün EGFP-CDMPR (~9 dakika) için TfR-EGFP'den (~4 dakika) önemli ölçüde daha uzun olduğunu ve sinyallerin sırasıyla yaklaşık 43 dakika ve 20 dakika sonra doygun hale geldiğini bulduk. Bu nicel bulgular, MPR ve TfR kaçakçılık dinamikleri 38,39,40 hakkında daha önce yayınlanmış verilerle uyumludur. Özellikle, VHH-mCherry yapısı, çok sayıda Addgene dağıtım talebinin kanıtladığı gibi, araştırma topluluğundan büyük ilgi görmüştür ve halihazırda birkaç bağımsız çalışmada başarıyla uygulanmıştır 28,41,42,43,44.

Mikroskop konfigürasyonuna veya deneysel gereksinimlere bağlı olarak, mCherry etiketli anti-GFP nanokorları her zaman optimal olmayabilir. Bu gibi durumlarda, alternatif floroforlar veya floresan protein varyantları, GFP raportör hücre hatları ile kombinasyon halinde kullanıldığında daha uygun spektral özellikler sağlayabilir. Bunu ele almak için, mTagBFP2, mNeptune2.5, mCardinal2, TagRFP657 ve iRFP670 (243764-68) dahil olmak üzere çok çeşitli floresan proteinleri içeren işlevselleştirilmiş nanokorlardan oluşan bir kitaplık oluşturduk. Bu ek nanogövde yapıları Addgene aracılığıyla kullanıma sunulacaktır. Spektral olarak farklı floroforların kullanılması, uyarma ve emisyon sinyallerinin net bir şekilde ayrılmasını sağlar, böylece minimum spektral örtüşme ile üç adede kadar floresan kanalının optimum canlı, gerçek zamanlı görüntülenmesini kolaylaştırır.

Kararlı duruma endositik alımın izlenmesi basit görünse de, proteinlerin TGN'ye retrograd taşınmasını izlemek daha büyük bir deneysel zorluk sunar. VHH-mCherry ve GFP etiketli bir raportör proteine ek olarak, görselleştirme ve miktar tayini için ek bir floresan veya boya konjugatedilebilir TGN'de yerleşik işaretleyici gereklidir. Bununla birlikte, bazı Golgi'de yerleşik proteinler, hücre yüzeyinde kısmi sızıntı sergiler ve bu, taşıma makinesi bileşenlerinin deneysel manipülasyonu ile ortaya çıkanlar gibi hücre içi kaçakçılık yollarının bozulmaları ile daha da kötüleşebilir. Örneğin TGN46, belirli salgı kargolarının TGN'den hücreye yüzey taşınmasına aracılık eden bir kargo reseptörü olarak işlevsel rolüne rağmen, yaygın olarak Golgi'de yerleşik bir belirteç olarak kullanılır16,45. Benzer şekilde, β-1,4-galaktosiltransferaz gibi glikosiltransferazlar da plazma zarında41 tespit edilmiştir. Bu proteinler yüzeye çıkabilse de, baskın kararlı durum lokalizasyonları TGN içinde kalır. Bu tür belirteçlerin spektral olarak farklı bir floresan proteini veya boya uyumlu bir etiketle (örneğin, SNAP, Halo, vb.) etiketlenmesi ve bunların GFP etiketli bir transmembran raportör ile stabil bir şekilde birlikte ifade edilmesi, TGN varışının kantitatif canlı hücre görüntülemesini sağlayacaktır. Bu, Golgi'de yerleşik füzyon proteinine karşılık gelen floresan kanalı içinde mCherry sinyalinin birikmesine dayalı niceleme ile yukarıda açıklanan iş akışına benzer şekilde ölçülebilir. Sabit veya canlı hücrelerde retrograd kaçakçılığı araştırmak için mevcut stratejiler genellikle IgG antikorları (örneğin, CD8) 46,47 ile kombinasyon halinde kimerik reseptör yapılarına dayanır. Bununla birlikte, yüzey etiketleme sırasında geleneksel IgG'lerin iki değerlikliliğinden kaynaklanan doğal çapraz bağlanma riski, etiketli proteinin hücre içi kaderini önemli ölçüde değiştirebilir ve onu sıklıkla endositoz48,49'dan sonra lizozomal bozunmaya yönlendirebilir. Buna karşılık, nanokorlar, tek değerlikli yapıları ve 1:1 bağlayıcı stokiyometrileri nedeniyle çapraz bağlanmayı indüklemez, böylece hedef proteinin fizyolojik kaçakçılık yollarını korur. Bu, nanocisim tabanlı yaklaşımları, yapay yönlendirme artefaktları eklemeden otantik retrograd taşıma dinamiklerini incelemek için özellikle değerli kılmaktadır.

Canlı hücre görüntüleme için bu protokolün optimum performansı, nano gövde konsantrasyonunun dikkatli bir şekilde titretilmesini gerektirir, çünkü aşırı miktarlar ortamdaki bağlanmamış nanogövdeden yüksek arka plan floresansına yol açar. Ayrıca, doğru kantitatif karşılaştırmayı sağlamak için titrasyon sırasında GFP raportör hücre hatlarının ekspresyon seviyelerindeki farklılıklar hesaba katılmalıdır. Nanocisim üretimi için, E. coli'de düşük sıcaklıkta indüksiyon, mCherry alanının uygun şekilde katlanmasını teşvik etmek için kritik öneme sahiptir. Daha yüksek indüksiyon sıcaklıkları tipik olarak proteinin yanlış katlanmasına veya bozulmasına neden olur ve bu nedenle önerilmez.

Bu protokolün başarısı kritik olarak üç temel hususa bağlıdır: birincisi, tutarlı etiketleme ve minimum arka plan sağlamak için fonksiyonel nanogövde yapılarının yüksek verimli ifadesi ve saflığı; ikincisi, fizyolojik kaçakçılık yollarını özetlemek için hücre yüzeyi lokalizasyonu ile GFP etiketli raportör proteinleri stabil bir şekilde eksprese eden iyi karakterize edilmiş hücre hatlarının kullanılması; ve üçüncüsü, kargo taşımacılığı dinamiklerinin doğru niceliksel ve niteliksel analizini sağlamak için görüntüleme parametreleri ve spektral ayırma dahil olmak üzere floresan mikroskobu kurulumunun optimum kullanımı ve konfigürasyonu.

Burada sunulan, mCherry etiketli anti-GFP nanokorlarının kullanımına odaklanan yöntem ve protokol, kültürlenmiş memeli hücrelerinde hücre yüzeyinden endositik bölmelere kadar kargo proteinlerinin hem nicel hem de nitel olarak izlenmesini sağlar. Floresan etiketli bir Golgi yerleşik belirteci ile birlikte eksprese edildiğinde, bu yaklaşım ayrıca retrograd taşıma yollarının analizine izin verir. Bu nedenle, bu araç, spesifik ligandların veya uyumlu monomerik bağlayıcı reaktiflerin bulunmaması nedeniyle daha önce etiketleme için erişilemeyen hücre yüzeyi transmembran proteinlerinin ve reseptörlerinin hücre içi trafiğini izlemek için güçlü bir strateji sağlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Basel Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Prof. em'e teşekkür ederiz. Rakamların oluşturulması ve düzenlenmesi için Dr. Martin Spiess, destek için Biozentrum'un Görüntüleme Çekirdek Tesisi (IMCF) ve yeniden basım izni için PNAS.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-GFP antikorları Sigma-Aldrich118144600001Ürün Sigma-Aldrich tarafından dağıtılmakta, ancak Roche tarafından üretilmektedir
100 mm hücre kültürü çanaklarıTPPTPP93100
Anti-aktin antikorEMD Millipore MAB1501
Anti-HA antikorlaboratuvardan12CA5 hibritomasından yapılmıştır
Anti-His6 antikoruBethyl Laboratories A190-114A
Anti-T7 antikor Bethyl Laboratories A190-117A
BL21(DE3) Competent E. coliNEBC2527H
Kalsiyum klorür dihidratMerck Millipore102382steril suda çözünmüş, stok 1 M
Karbenisisilin disodyum tuzuApplichemA1491steril suda çözünürse, stok 100 mg/mL
Coomassie-R (Parlak Mavi)Sigma-AldrichB-0149
D-biotinSigma-AldrichB4501steril 500 mM NaH2PO4 veya DMSO'da çözünmüştür
Tek kullanımlık PD10 tuz arıtma kolonlarıGE HealthcareGE17-0851-01
DMEM GlutaMAX-IThermo Fisher Scientific61965026
DMEM, yüksek glikoz, glutamin yok, fenol kırmızı yokThermo Fisher Scientific31053028
DNase IApplichemA3778steril suda çözünmüş
Dulbecco' s fosfat tamponlu tuzlu (DPBS) Ca2+/Mg2+Sigma-AldrichD8537
Fetal sığır serumu (FBS)Thermo Fisher ScientificA5256701
Filtropur S, PES, Porengrö ß e: 0.45 ve mikro; mSarstedt83.1826
FuGENE HD transfeksiyon reaktifiPromega E2311
Cam kapak kaymaları (No. 1.5H)VWR631-0153
Keçi anti-fare HRPSigma-AldrichA-0168
Keçi anti-tavşan HRPSigma-AldrichA-0545
Tampon kitiCytvia11003400
GraviTrap köşe yazılarıCytvia11003399
ibidi µ-Slide 4 iyi, ibiTreat80426-IBIibidi
İzopropil-β-D-tiogalaktopyranosid (IPTG)ApplichemA1008steril suda çözünmüş, stok 1 M
Kanamisin sülfatApplichemA1493steril suda çözünürse, stok 100 mg/mL
L-glutaminApplichemA3704
Lyozyme Sigma-Aldrich18037059001Ürün Sigma-Aldrich tarafından dağıtılmakta, ancak Roche tarafından üretilmektedir
Magnezyum klorür heksahidratMerck Millipore105833steril suda çözünmüş, stok 1 M
Mini-Protean TGX jelleri, %4-20, 15-wellBio-Rad4561096
Değiştirilmiş HeLa Kyotolaboratuvardan
NEB5-alpha Competent E. coliNEBC2987U
NucleoBond Xtra Midi Plus, 10 hazırlıkMacherey-Nagel 740412.1
Penisilin/StreptomisinBioconcept 4-01F00-H
Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)ApplichemA0999.0025%40 DMSO, %60 izopropanolde çözünmüş, stok 500 mM içinde
Phoenix amfo hücre hattıNolan laboratuvarı
Polibren (heksadimetrin bromid)Sigma-AldrichH9268
PuromysinInvivogenANT-PR-1
Sodyum klorür Merck Millipore106404steril suda çözünmüş, stok 5 M
Sodyum piruvat Thermo Fisher Scientific11360039
Trans-Blot Turbo Pack, miniBio-Rad1704158
TriptonApplichemA1553
Maya ekstraktı ApplichemA1552

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Boucrot, E., et al. Endophilin marks and controls a clathrin-independent endocytic pathway. Nature. 517 (7535), 460-465 (2015).
  4. Renard, H. F., et al. Endophilin-A2 functions in membrane scission in clathrin-independent endocytosis. Nature. 517 (7535), 493-496 (2015).
  5. Rioux, D. J., Prosser, D. C. A CIE change in our understanding of endocytic mechanisms. Front Cell Dev Biol. 11, 1334798(2023).
  6. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. J Cell Biol. 106 (3), 617-628 (1988).
  7. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (3), 202-212 (2003).
  8. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  9. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Dev Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  10. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nat Cell Biol. 13 (8), 914-923 (2011).
  11. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nat Cell Biol. 10 (2), 178-185 (2008).
  12. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nat Commun. 9 (1), 3737(2018).
  13. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochim Biophys Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  14. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  15. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. J Cell Biol. 125 (2), 253-268 (1994).
  16. Lujan, P., et al. Sorting of secretory proteins at the trans-Golgi network by human TGN46. Elife. 12, 91708(2024).
  17. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  18. Buser, D. P., Spang, A. Protein sorting from endosomes to the TGN. Front Cell Dev Biol. 11, 1140605(2023).
  19. Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J Vis Exp. (144), e59111(2019).
  20. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. J Cell Biol. 100 (3), 826-834 (1985).
  21. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  22. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  23. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  24. Schnider, S. T., Vigano, M. A., Affolter, M., Aguilar, G. Functionalized Protein Binders in Developmental Biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 40 (1), 119-142 (2024).
  25. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annu Rev Physiol. 50, 363-376 (1988).
  26. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  27. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotech. 25 (5), 299-317 (2009).
  28. Buser, D. P., Bader, G., Spiess, M. Retrograde transport of CDMPR depends on several machineries as analyzed by sulfatable nanobodies. Life Sci Allianc. 5 (7), 202101269(2022).
  29. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. J Biol Chem. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  30. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Meth. 12 (1), 51-54 (2015).
  31. Waguri, S., et al. Visualization of TGN to endosome trafficking through fluorescently labeled MPR and AP-1 in living cells. Mol Biol Cell. 14 (1), 142-155 (2003).
  32. Anitei, M., et al. A high-throughput siRNA screen identifies genes that regulate mannose 6-phosphate receptor trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5079-5092 (2014).
  33. Hoflack, B., Kornfeld, S. Purification and characterization of a cation-dependent mannose 6-phosphate receptor from murine P388D1 macrophages and bovine liver. J Biol Chem. 260 (22), 12008-12014 (1985).
  34. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nat Meth. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  35. Götzke, H., et al. The ALFA-tag is a highly versatile tool for nanobody-based bioscience applications. Nat Commun. 10 (1), 4403(2019).
  36. Zeghal, M., et al. Development of a V5-tag-directed nanobody and its implementation as an intracellular biosensor of GPCR signaling. J Biol Chem. 299 (9), 105107(2023).
  37. Katoh, Y., et al. Overall Architecture of the Intraflagellar Transport (IFT)-B Complex Containing Cluap1/IFT38 as an Essential Component of the IFT-B Peripheral Subcomplex. J Biol Chem. 291 (21), 10962-10975 (2016).
  38. Hirschmann, D. T., Kasper, C. A., Spiess, M. Quantitative analysis of transferrin cycling by automated fluorescence microscopy. Methods Mol Biol. 1270, 365-378 (2015).
  39. Ciechanover, A., Schwartz, A. L., Dautry-Varsat, A., Lodish, H. F. Kinetics of internalization and recycling of transferrin and the transferrin receptor in a human hepatoma cell line. Effect of lysosomotropic agents. J Biol Chem. 258 (16), 9681-9689 (1983).
  40. Hirst, J., Futter, C. E., Hopkins, C. R. The kinetics of mannose 6-phosphate receptor trafficking in the endocytic pathway in HEp-2 cells: the receptor enters and rapidly leaves multivesicular endosomes without accumulating in a prelysosomal compartment. Mol Biol Cell. 9 (4), 809-816 (1998).
  41. Sun, X., Mahajan, D., Chen, B., Song, Z., Lu, L. A quantitative study of the Golgi retention of glycosyltransferases. J Cell Sci. 134 (20), 258564(2021).
  42. Pereira, C., et al. The exocyst complex is an essential component of the mammalian constitutive secretory pathway. J Cell Biol. 222 (5), 202205137(2023).
  43. Podinovskaia, M., Prescianotto-Baschong, C., Buser, D. P., Spang, A. A novel live-cell imaging assay reveals regulation of endosome maturation. Elife. 10, 70982(2021).
  44. Reck, J., Beuret, N., Demirci, E., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. Small disulfide loops in peptide hormones mediate self-aggregation and secretory granule sorting. Life Sci Alliance. 5 (5), 202101279(2022).
  45. Wakana, Y., et al. A new class of carriers that transport selective cargo from the trans Golgi network to the cell surface. EMBO J. 31 (20), 3976-3990 (2012).
  46. Rawat, S., Sharma, M. CD8alpha-CI-M6PR Particle Motility Assay to Study the Retrograde Motion of CI-M6PR Receptors in Cultured Living Cells. Bio Protoc. 14 (9), e4979(2024).
  47. Breusegem, S. Y., Seaman, M. N. Image-based and biochemical assays to investigate endosomal protein sorting. Methods Enzymol. 534, 155-178 (2014).
  48. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  49. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Rep. 21 (11), 3256-3270 (2017).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Retrograd Ta maFloresan MikroskobuTransmembran ProteinlerNanobody Safla t rmaEGFP EtiketlemeZaman Atlamal G r nt lemeTransferrin Resept r

İlgili makaleler