Ubiquitinasyon, hücre içi protein fonksiyonlarının kritik bir düzenleyicisidir. Burada, memeli hücrelerinde substrat protein ubiquitinasyon seviyelerini tespit etmek için iki hücre lizisi yöntemini tanımlıyor ve ubiquitinasyon seviyelerini analiz etme etkinliklerini karşılaştırıyoruz. HEK293T hücrede protein aşırı ekspresyonu, geçici transfeksiyonla indüklenmiş ve ubiquitinated proteinler western blot analiziyle tespit edilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
SMAD2/SMURF2 modeli kullanılarak memeli hücre lizatlarında ubiquitinasyon tespiti için karşılaştırmalı stratejiler
Bu makalede
Özet
Özet
Ubiquitinasyon, translasyon sonrası bir modifikasyon olup, hücre içi protein fonksiyonunun kritik bir düzenleyicisidir. Ubiquitinasyon, protein fonksiyonlarını proteazomal bozulmayı teşvik ederek veya ubiquitin zincirine bağlı sinyalleşme yoluyla subhücre lokalizasyonunu değiştirerek modüle eder. Burada, HEK293T hücrelerde SMAD2 ubiquitinasyon seviyelerini tespit etmek için iki hücre lizisi yöntemini tanımlıyor ve protein ubiquitinasyon seviyelerini analiz etme etkinliklerini karşılaştırıyoruz. Hücrelerde protein aşırı ekspresyonu, geçici transfeksiyonla indüklenmiştir. Plazmidler (HA-Ub, FLAG-SMAD2 ve MYC-SMURF2) ve transfeksiyon reaktifleri bazal ortama ayrı ayrı eklenerek karıştırıldı ve karışım hücrelere eklendi. Hasat öncesi, proteazomal bozulmayı engellemek ve ubiquitinated protein birikimini artırmak için MG132 eklenmiştir. İki deneysel yaklaşım arasındaki temel ayrım, hücre lizisi yöntemleridir - buz banyosu yöntemi (4 °C'de uygulanır) ve ısı arıtma yöntemi (95 °C'de kuluçka içerir), bu da protein lizisinin verimliliğini önemli ölçüde etkiler. Hücre lizisi tamamlandıktan sonra, hücre lizat, agaroz boncukları ve FLAG antikoru karıştırıldı ve gece boyunca 4 °C'de kuluçka edildi. Ubiquitinated proteinler daha sonra western blot analiziyle tespit edildi. Ubiquitinated proteinler tespit edilmeden önce, ikincil antikor kuluçkası için hafif zincirli bir antikor kullanılmıştır. Daha sonra ubiquitinasyon bantları tespit edildi. Sonuçlar, hem buz banyosu yönteminin hem de ısı işleme yönteminin ubiquitinasyon seviyelerini tespit etmek için kullanılabileceğini, ısılı işlem yönteminin ise SMAD2'nin ubiquitinasyonunu daha kolay tespit etmeyi kolaylaştırabileceğini göstermektedir. Bu çalışma, memeli hücrelerinde ubiquitinasyon seviyelerini ölçmek için iki hücre lizisi yöntemini tanımlar ve karşılaştırarak, SMURF2/SMAD2 modelini kullanarak araştırmacıların substrat proteinlerinin ubiquitinasyon seviyelerini tespit etmek için daha uygun yöntemler seçmelerine yardımcı olur.
Giriş
Ubiquitinasyon, vazgeçilmez bir translasyon sonrası modifikasyon olup, hücre içi protein fonksiyonlarının kritik birdüzenleyicisidir 1. Eukaryotlardaki proteinlerin %80'inden fazlasının bozulmasını sağlayan ubiquitin-proteasom sistemi (UPS), ubiquitin (Ub), E1 aktive edici enzimler, E2 konjuge enzimleri, E3 ligazlar, deubiquitylasyon enzimleri (DUB'lar) ve 26Sproteasome 2'den oluşur. Bu sistem, protein dönüşümünü yüksek özgüllükle düzenler; böylece hücre döngüsüilerlemesi 3, sinyal iletimi 4,5 ve stresyanıtları 6,7 gibi temel hücresel süreçleri kontrol eder. Ubiquitinasyon çok aşamalı bir enzimatik süreçtir. E1, ATP'yi hidrolize ederek Ub'un C-terminalini adenilize eder ve böylece bir Ub-AMP ara maddesi oluşturur. Daha sonra, aktive edilen Ub, E1'den bir E2 konjuge edici enzimin aktif sistein bölgesine aktarılır ve böylece bir tioester bağı oluşur. Son olarak, bir E3 ligaz hem E2-Ub kompleksini hem de hedef proteini ayarlayarak Ub'un E2'den substrat8 üzerindeki lizin kalıntısına transferini katalize eder.
Ubiquitin, yedi lizin rekıntısında (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48, Lys63) veya Met1(M1)4 üzerinden çeşitli poliubiquitin zincirleri oluşturabilir. Her bağlantı türü farklı biyolojik sonuçlar belirler: K48 bağlantılı zincirler öncelikle proteinleri proteazomal bozulmaiçin hedef alır 9, K63 bağlantılı zincirler sinyal ve DNA onarımınıdüzenler 10,11 ve M1 bağlantılı zincirler doğuştan gelen bağışıklık yanıtları içinkritiktir 12. Ubiquitinasyon ve deubiquitinasyon, protein bozunmasından sinyal iletimine kadar çeşitli hücresel olayları yöneten kritik translasyonel modifikasyon süreçleridir. Örneğin, kolorektal kanserde, MDM2 aracılı p53 ubiquitinasyonunun anormal aktivasyonu p53'ün aşırı bozulmasına yol açar; bu da hücre döngüsünün durması ve apoptozunu indükleme yeteneğini zayıflatarak tümör ilerlemesini ve kemodirençoluşturur 13,14. Hepatik iskemi-reperfüzyon hasarında, OTUD1, K48 bağlantılı poliubiquitinasyonunu çıkararak NRF2'yi stabilize eder ve böylece hücre içi oksidatif stresseviyelerini 15,16 iyileştirir. Bortezomib, karfilzomib ve ixazomib gibi çeşitli proteozom inhibitörleri, multipl miyelom gibi hastalıklar için klinikuygulamaya kademeli olarak girmiştir 17,18,19.
Şu anda, ubiquitinated proteinleri tespit etmek için western blotting, radyoaktivite tabanlı testler ve floresantestleri 20 dahil olmak üzere birçok yöntem bulunmaktadır. Ancak bilimsel araştırmalarda, western blot, nispeten hızlı ve basit protokolü nedeniyle protein ubiquitinasyonunun tespiti için tercih edilen yöntem olmaya devam etmektedir. Ubiquitinated proteinlerin geleneksel tespit yöntemleri, ko-immünopresipitasyon (co-IP) teknolojisine benzer: hücre pelletlerini düşük sıcaklıkta inkübe etmek ve lizlemek için lizis tamponu kullanırlar, ardından substratproteinlerinin ubiquitinasyonunu tespit etmek için antikorlar kullanırlar 21,22. Ancak, bu deneysel protokol genellikle çok sayıda hücre gerektirir. Ayrıca, düşük sıcaklıkta nispeten hafif liz yöntemi protein etkileşimlerini tamamen bozamadığından, tespit edilen ubiquitinasyonda yanlış pozitif çıkma olasılığını artırır. Isıtma ve SDS kullanımı, protein yapısını önemli ölçüde bozabilir, böylece protein-protein etkileşimlerinden kaynaklanan yanlış pozitif sonuçları etkili bir şekildeazaltabilir. Benzer şekilde, hücreler ısıtma ve SDS tedavisi sırasında yeterli lizize uğrar, daha fazla protein salgılanır ve buna bağlı olarak deney için gereken hücre miktarı azalır. Özetle, hem buz banyosu yöntemi hem de ısı işleme yöntemi, hücreleri lüzüyor ve substrat proteinlerinin ubiquitinasyon seviyelerini antikor kuluçka yoluyla tespit ediyor. Ancak ısıtma yöntemi, hücre lizisinin artmasına ve daha güçlü protein denatürasyonuna yol açar.
TGF-β, çeşitli hastalıkların patofizyolojik süreçlerinde çift roloynar 26,27. SMAD2, TGF-β'nin kritik bir aşağı akış transkripsiyon faktörüdür. SMAD2'nin SMURF2 aracılı ubiquitinasyonu, proteazomal bozulmayı hedefleyerek TGF-β sinyal yoğunluğu28'i ince ayarlar. Bu çalışma, memeli hücrelerinde ubiquitinasyon seviyelerini ölçmek için SMURF2/SMAD2 modelini kullanarak iki hücre lizis yöntemini tanımlar ve karşılaştırır. Burada, HEK293T hücrelerde protein aşırı ekspresyonu, HA-Ub, FLAG-SMAD2 ve MYC-SMURF2 plazmidleriyle geçici transfeksiyonla indüklenmiştir. Hücreler sırasıyla buz banyosu yöntemi ve ısı işleme yöntemiyle lizleştirildi. Ubiquitinated proteinler Western blot analiziyle tespit edildi. Hem buz banyosu yönteminin hem de ısı arıtma yönteminin ubiquitinasyon seviyelerini tespit etmek için kullanılabileceğini ve ısılı işlem yönteminin SMAD2'nin ubiquitinasyonunu daha kolay tespit etmeyi kolaylaştırabileceğini bulduk. Bu protokol, ubiquitinated proteinleri tespit etmek için yeni bir alternatif sunar. Ayrıca, ubiquitinasyonla güçlü şekilde ilişkilendirilen belirli substrat proteinleri için ısı işlem yöntemi daha iyi protein lizis verimliliği sağlar ve böylece ubiquitinasyonun daha kolay tespit edilmesini sağlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Lizin tamponu ve reaktiflerinin hazırlanması
NOT: Tüm tamponları belirtilen konsantrasyonlarda hazırlayın. Konsantrasyon farksızlıklarını önlemek için üreticinin reaktif tozları talimatlarını takip edin.
- 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0) ve %1 Triton X-100 içeren liz tamponu hazırlanır. Gerekirse NaCl konsantrasyonunu 50-150 mM arasında ayarlayın. Tüm tamponları çift damıtılmış H₂O ile hazırlayın.
- Çalışan çözeltiyi %1 proteaz inhibitörü kokteyli ile takviye ederek (EDTA olmadan) hazırlayın. İyice karıştırın ve kullanana kadar buzda tutun.
- 10 ml PBS'de 1g SDS tozu çözerek %10 SDS hazırlayın. Tamamen çözünene kadar karıştırın. Oda sıcaklığında sakla.
- 250 mM Tris-HCl (pH 6.8), %10 SDS, %50 gliserol, %0.5 bromofenol mavisi ve %5 β-merkaptoetanol içeren 5× protein yükleme tamponu hazırlayın. Bileşenleri çift damıtılmış H2O içinde çöz. Kullanmadan önce iyice karıştırın.
NOT: SDS ve β-merkaptoetanol bir duman davlumanında uygun koruyucu ekipman takarak kullanın. Kontamine malzemeleri kurumsal kimyasal atık yönergelerine göre bertaraf etmelidir.
2. Hücrelerin hazırlanması
- Yüksek glikozlu DMEM'de HEK293T hücreleri %10 FBS ve %1 penisillin-streptomisin takviyesinde tutun. Steril koşullarda %5 CO₂ ile 37 °C'de kuluçka yapın. Geçiş hücreleri yaklaşık %90 birleşimde.
- Tohum hücreleri, 6 kuyruklu plakalarda 5 × 10⁵ hücre başına yerleştirilin. İki kuyiden hücreleri toplayarak bir örnek üretin.
- Transfeksiyon karışımlarını toplam kültür hacminin %10'unu temsil edecek şekilde hazırlayın ve deneysel model olarak SMAD2 ubiquitinasyonunu kullanın. 100 μL serumsuz DMEM'de 1 μg HA-Ub plazmid, 1 μg FLAG-SMAD2 plazmid ve 0,5 μg boş vektör veya MYC-SMURF2 plazmid birleştirin. Ayrı bir tüpte, 100 μL serumsuz DMEM içinde 3,75 μL transfeksiyon reaktifini seyreltirin. Reaktif karışımı plazmid çözeltisine damla olarak ekleyin, oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın ve hücrelere eşit şekilde dağıtın.
- 6-8 saat sonra transfeksiyon ortamını her kuyu başına 2 mL taze tam DMEM ile değiştirin. 48 saat boyunca hücreleri kuluçka altına alın.
- Hücreleri hasat öncesi 12 saat boyunca 5 μM MG132 ile tedavi edin.
NOT: MG132'yi eldiven takarak bir biyogüvenlik dolabında kullanın. Kontamine malzemeleri kurumsal güvenlik prosedürlerine uygun olarak bertaraf et.
3. Hücre toplama
- Hücreleri %90-100 birleşimde (~3 × 10⁶ hücre) hasat edin. Orta ortamda aspirasyon yapın ve her birini 1 mL önceden soğutulan PBS ile iyice yıkayın. PBS'i tamamen kaldırın.
- Her kuyuya 1 mL PBS ekleyin ve hücreleri nazikçe yeniden süskü altına alın. Süspansiyonu 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve buzun üzerine koyun.
- Santrifüj 380 × g'de 4 °C'de 5 dakika sürdüm. Üst yüzeyi çıkarın ve peleti koruyun.
4. Agaroz boncuk hazırlama
- Her örnek için 50 μL Protein A/G agaroz boncuklarını yeni bir tüpe aktarın. Boncukları 1 mL liz tamponu ile 3 kez yıkayın. Yıkamalar arasında 100 × g sıcaklıkta 4 °C'de 1 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Pelleti rahatsız etmeden kalıntı tamponu çıkarın. 100 μL çalışan çözelti ve 5 μL anti-FLAG antikor ekleyin. 4 °C'de hafif bir dönüşle 6 saat kuluçka yapın.
5. Hücre lizisi
- Buz banyosu yöntemi
- Pellete 500 μL önceden soğutulan çalışma çözeltisi ekleyin. 30 dakika buzda kuluçka yapın.
- 2 W frekansta 4 saniye açık/4 saniye kapalı döngüler kullanarak beş tekrar sonikasyon yapın. Sonikasyon sırasında örnekleri buz üzerinde tutun. Örnekleri kuluçkanın geri kalanında buza geri gönderin.
NOT: Zayıf protein etkileşimleri için NaCl konsantrasyonunu 50-75 mMM'e indirin ve sonikasyon çıkarın.
- Isı işlem yöntemi
- Pellete 45 μL çalışma çözeltisi ekleyin. Sürekli karıştırırken %10 SDS 5 μL ekleyin.
- Kısa bir girdap 95 °C'de ısıtılır, süspansiyon şeffaf ve tamamen sıvılaştırılana kadar. Düzensiz denatürasyonu sağlamak için aralıklı olarak ters çevirin.
- 450 μL çalışan çözelti ekleyin. 2 W gücünde, 4 saniye açık/4 saniye kapalı döngüler kullanarak beş tekrar boyunca sonikasyon yapın ve örnekleri buz üzerinde tutun.
NOT: Nihai SDS konsantrasyonu %<0,1% kalın. Görünür pelletin kayboluşunu ve uniform çözelti berraklığını doğrulayarak tam lizisi doğrulayın.
6. İmmünopresipitasyon ve ubiquitinasyon tespiti
- Santrifüj, 4 °C'de 15 dakika boyunca 13.680 × g'de lizatlanır. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.
- 60 μL lizat ayırın ve 15 μL 5× yükleme tamponu ekleyin. 95 °C'de 15 dakika ısıtın ve giriş olarak etiketleyin.
- Kalan lizata 100 μL antikor bağlı boncuk ekleyin (son hacim 540 μL). 4 °C'de 8-12 saat boyunca dönerek kuluçka yapın.
- Santrifüj boncuklarını 100 × g'de 4 °C'de 1 dakika boyunca kullanın ve üst yüzeyi atın. Boncukları 3 kez liz tamponu ile yıkayın. 75 μL 1× SDS yükleme tamponu ekleyin ve proteinleri elütasyon etmek için 95 °C'de 15 dakika ısıtın. IP olarak etiketleyin.
- Standart bir JoVE protokolüne göre western blot'la ubiquitinated proteinleri tespit edin.
NOT: Detaylı transfer ve tespit prosedürleri için western blotprotokolü 29'a bakınız. Moleküler ağırlık işaretleyicileriyle tam boy kesmemiş lekeler Ek Dosya 1'de sunulmaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
TGF-β sinyal yolunda "moleküler haberci" olan SMAD2, TGF-β reseptörleri tarafından fosforile edildikten sonra SMAD3 ve SMAD4 ile bir kompleks oluşturur, çekirdeğe taşınır ve aşağı akış hedefgenlerin transkripsiyonunu başlatır 30. Bu nedenle, hücre dışı sinyalleri hücre içi gen ifadesine bağlayan kilit bir moleküldür. Bozulması, hedef proteinin poliubiquitinasyonunu katalize eden ve böylece proteazomal bozunmaya yönelik E3 ubiquitin ligaz olan SMURF2 tarafından ara...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışma, E3 ligazla aracılı substrat ubiquitinasyonunu tespit etmek için özel olarak optimize edilmiş iki ayrıntılı protein lizisi protokolünü sunar ve karşılaştırır. Tespit edilebilirliği sağlamak için, hücrelerde plazmid bazlı aşırı ekspresyonu (örneğin, SMAD2, SMURF2 veya Ub etiketli) kullandık; bu da belirli ubiquitinasyon sinyallerini görselleştirmek için yeterli protein seviyeleri sağladı ve bu çalışmada E3 ligaz-substrat etkileşimlerinin doğrulanması için kritik öneme sahip. Hü...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Bu araştırma çalışması, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı, Nos. 82370647 (W.H.), Nos. 82170642 (J-X.) tarafından desteklendi. Z), No. 81801923 (X-F. Z), No. 81670575 (J-X. Z), Nos. 81570570 (W.H.) ve Nos. 81070355 (J-X. Z) ve Huazhong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi HUST Akademik Sınır Gençlik Takımı programı (2018 QYTD02). Hubei'nin Açık Vakfı Rejeneratif Tıp ve Çok Disiplinli Translasyonel Araştırma Laboratuvarı (2022zsyx003). Çin'in Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2024YFA1107601).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL mikrotüp | Servicebio | EP-150-M | |
| 100 mm TC ile işlenmiş kültürlü tabak | Servicebio | CCD-100 | |
| 6-kuyuklu disk | Servicebio | CCP-6H | |
| Anti-FLAG antikorları | Proteintech | 20543-1-AP | IP için 1:200 kullanılan seyreltme 1:10000 için WB için 1:10000 |
| Anti-GAPDH antikorları | Proteintech | MA5-15738 | kullanılan seyreltme 1:10000 |
| Anti-HA antikorları | Proteintech | 51064-2-AP | kullanılan seyreltme 1:10000 |
| Anti-IgG antikorları | CST | #3900 | IP için 1:200 suyulma kullanıldı |
| Anti-MYC antikorları | Proteintech | 60003-2-Ig | kullanılan seyreltme 1:10000 |
| Anti-SMAD2 antikorları | CST | #5339 | Seyreltme IP için 1:200 kullanıldı, WB için 1:2000 |
| Bromofenol mavisi | Servicebio | GC307006-5g | |
| EDTA (pH=8.0) | Servicebio | G1207-1L | |
| FBS | ABW | ||
| Gliserol | Sinopharm | 10010618 | |
| Isıtma/Soğutma Kuru Banyo | Guocheng | ||
| HEK293T hücreleri | ATCC | CRL-3216 | |
| Yüksek glukozlu DMEM | Servicebio | G4515-500ML | |
| HRP ile bağlanmış keçi anti-fare IgG Hafif Zinciri | Abklonal | AS062 | kullanılan seyreltme 1:5000 |
| HRP ile bağlanmış Fare anti-Tavşan IgG Hafif Zinciri | Abklonal | AS061 | kullanılan seyreltme 1:10000 |
| Lipo8000 | Beyotime | C0533 | |
| MG132 | Aladdin | M421264 | |
| Mikrosantrifüj | Labgic | CF1524R | |
| NaCl tozu | Servicebio | GC102004 | |
| PBS | Servicebio | G4202-500ML | |
| pCMV-FLAG-SMAD2 | Memeli ifadesi için | ||
| pCMV-HA-Ub | Memeli ifadesi için | ||
| pCMV-MYC | Memeli ifadesi için | ||
| pCMV-MYC-SMURF2 | Memeli ifadesi için | ||
| Penisillin-streptomisin | Servicebio | G4003-100ML | |
| EDTA olmadan proteaz inhibitörü kokteyli | TargetMol | C0001 | |
| Protein A/G agaroz boncukları | Beyotime | P2017 | |
| PVDF membranı | Vayzme | E801 | |
| SDS tozu | Solarbio | S8010-500g | |
| SDS-PAGE sistemi | Aervicebio | BVE4-BVT4 | |
| Sonics | Uibra hücresi | ||
| Tris-HCl tozu | Biotopped | HST-0372 | |
| Triton X-100 | Servicebio | GC204003-100ml | |
| Tripsin | Servicebio | G4021-100ML | |
| Vortex mikser | Vayzme tarafından nazikçe bağışlanmıştır | ||
| β-merkaptoetanol | Aladdin | M301573 |
Kaynaklar
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nat Med. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Han, D., Wang, L., Jiang, S., Yang, Q. The ubiquitin-proteasome system in breast cancer. Trends Mol Med. 29 (8), 599-621 (2023).
- Fulcher, L. J., Batley, C., Sobajima, T., Barr, F. A. Time as a danger signal promoting G1 arrest after mitosis. Trends Cell Biol. 36 (2), 142-153 (2025).
- Gao, L., et al. The mechanism of linear ubiquitination in regulating cell death and correlative diseases. Cell Death Dis. 14 (10), 659(2023).
- Serratore, V., Lucibello, M., Malanga, D., Viglietto, G., De Marco, C. Akt and DUBs: A bidirectional relationship. Cell Mol Biol Lett. 30 (1), 77(2025).
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends Biochem Sci. 42 (11), 873-886 (2017).
- Liu, J. Z., et al. BDH2 triggers ROS-induced cell death and autophagy by promoting NRF2 ubiquitination in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 123(2020).
- Cappadocia, L., Lima, C. D. Ubiquitin-like protein conjugation: Structures, chemistry, and mechanism. Chem Rev. 118 (3), 889-918 (2018).
- Li, J., et al. ATRA upregulates OTUD6B to recruit CD8+ T cells to suppress colorectal liver metastasis by stabilizing DDX5/STAT3/CXCL11 axis. Cell Death Dis. 16 (1), 521(2025).
- Niu, K., et al. USP33 deubiquitinates PRKN/Parkin and antagonizes its role in mitophagy. Autophagy. 16 (4), 724-734 (2020).
- Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. J Cell Mol Med. 22 (10), 4558-4567 (2018).
- Guo, Y., Zhao, Y., Cong, Y. S. Met1-linked ubiquitination in cell signaling regulation. Biophys Rep. 10 (4), 230-240 (2024).
- Di, Y., et al. The c-Myc-WDR43 signalling axis promotes chemoresistance and tumour growth in colorectal cancer by inhibiting p53 activity. Drug Resist Updat. 66, 100909(2023).
- Liebl, M. C., Hofmann, T. G. The role of p53 signaling in colorectal cancer. Cancers (Basel). 13 (9), 2125(2021).
- Oikawa, D., et al. OTUD1 deubiquitinase regulates NF-κB- and KEAP1-mediated inflammatory responses and reactive oxygen species-associated cell death pathways. Cell Death Dis. 13 (8), 694(2022).
- Zhang, Q., et al. The deubiquitinase OTUD1 stabilizes NRF2 to alleviate hepatic ischemia/reperfusion injury. Redox Biol. 75, 103287(2024).
- Moreau, P., et al. Oral ixazomib, lenalidomide, and dexamethasone for multiple myeloma. N Engl J Med. 374 (17), 1621-1634 (2016).
- Stewart, A. K., et al. Carfilzomib, lenalidomide, and dexamethasone for relapsed multiple myeloma. N Engl J Med. 372 (2), 142-152 (2015).
- Zhu, Y., et al. Targeting gut microbial nitrogen recycling and cellular uptake of ammonium to improve bortezomib resistance in multiple myeloma. Cell Metab. 36 (1), 159-175.e8 (2024).
- De Silva, A. R. I., Page, R. C. Ubiquitination detection techniques. Exp Biol Med (Maywood). 248 (15), 1333-1346 (2023).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of protein ubiquitination. J Vis Exp. (30), e1293(2009).
- Worboys, J. D., Palazón-Riquelme, P., López-Castejón, G. Method to measure ubiquitination of NLRs. Methods Mol Biol. 2696, 105-114 (2023).
- DeCaprio, J., Kohl, T. O. Denaturing lysis of cells for immunoprecipitation. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 098616(2020).
- Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for western blotting applications to physiological research. Scand J Med Sci Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and troubleshooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Crane, J. L., Cao, X. Bone marrow mesenchymal stem cells and TGF-β signaling in bone remodeling. J Clin Invest. 124 (2), 466-472 (2014).
- Gough, N. R., Xiang, X., Mishra, L. TGF-β signaling in liver, pancreas, and gastrointestinal diseases and cancer. Gastroenterology. 161 (2), 434-452.e15 (2021).
- Tzavlaki, K., Moustakas, A. TGF-β signaling. Biomolecules. 10 (3), 487(2020).
- The western blot. J vis exp. , e5065(2025).
- Wu, M., Chen, G., Li, Y. P. TGF-β and BMP signaling in osteoblast, skeletal development, and bone formation, homeostasis and disease. Bone Res. 4, 16009(2016).
- Jeon, S., et al. The miR-15b-SMURF2-HSP27 axis promotes pulmonary fibrosis. J Biomed Sci. 30 (1), 2(2023).
- Zhang, W., et al. SMURF2 predisposes cancer cell toward ferroptosis in GPX4-independent manners by promoting GSTP1 degradation. Mol Cell. 83 (23), 4352-4369.e8 (2023).
- Pi, Y., et al. Loss of SMURF2 expression enhances RACK1 stability and promotes ovarian cancer progression. Cell Death Differ. 30 (11), 2382-2392 (2023).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
