Method Article

Fare embriyonik kök hücrelerinde Enhancer RNA Stabilitesinin Optimize Edilebilir Nicel Değerlendirmesi

DOI:

10.3791/69325

⸱

November 21st, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fare embriyonik kök hücrelerinde intergenik ve intragenik güçlendirici RNA'ların kararlılığını ve yarı ömrünü Aktinomisin D tedavisi, RT-qPCR ve doğrusal olmayan regresyon analiziyle nicel olarak ölçer. Konuma özgü normalleştirme stratejileri, eRNA bozunma dinamiklerini bağlama bağlı olarak doğru şekilde modellemek için dahil edilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Güçlendirici RNA'lar (eRNA'lar), transkripsiyonel olarak aktif artırıcı bölgelerden üretilen kodlamayan transkriptlerdir ve gen ifadesinin ana düzenleyicileri olarak giderek daha fazla kabul edilirler. Fonksiyonel önemlerine rağmen, eRNA'nın stabilite ve bozulma dinamikleri, özellikle embriyonik kök hücrelerde (ESC) kötü karakterize edilmiştir; burada transkripsiyon programları oldukça dinamik ve bağlama bağımlıdır. Bu protokol, fare ESC'lerinde intergenik ve intragenik eRNA'ların bozulma kinetiği ve yarı ömrünü değerlendirmek için nicel bir yöntem sunar. Transkripsiyon, Aktinomisin D ile inhibe edilir ve toplam RNA birden fazla belirlenmiş zaman noktasında toplanır. cDNA, hem poliadenillenmiş hem de poliadenillenmemiş transkriptlerin tespitini sağlamak için hem rastgele heksamer hem de oligo(dT) primerler kullanılarak sentezlenir. Intergenik eRNA'lar için normalizasyon ya ev genleri veya 0 dakika içindeki Ct değeri kullanılarak gerçekleştirilir. İç genik eRNA'lar için, örtüşen pre-mRNA'dan kaynaklanan paraziti en aza indirmek için çift normalizasyon yaklaşımı kullanılır. Bozunma eğrileri, bir fazlı üstel çöküş modeli kullanılarak analiz edilir ve bu da yarı ömrünün doğru tahminini sağlar. Protokol, mESC'lerdeki eRNA'ların hızlı bir devre gösterdiğini ve yaklaşık 2-3 dakika yarı ömrüne sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Bu metodoloji, eRNA kararlılığını incelemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir çerçeve sunar; pluripotent kök hücre bağlamlarında güçlendirici aktivite ve RNA dinamikleri hakkında içgörü sunar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Güçlendiriciler, doku ve uyarıcıya özgü gen ifadesini düzenleyen cis-düzenleyici unsurlardır (CRE) ve transkripsiyon faktörleri ile birlikte regülatörler 1,2,3,4,5,6 için bağlanma platformları olarak hizmet vermektedir. Güçlendiriciler, doğrusal genom seviyesinde hedef genlerinden uzak konumlandırılabilse de, kromatin döngü mekanizmaları promotörlere mekânsal yakınlığı sağlar ve transkripsiyonel düzenlemeyi kolaylaştırır. Aktif güçlendiriciler, RNA polimeraz II (Pol II) tarafından çift yönlü olarak transkribe edilir ve genellikle yaklaşık 1,2,7,8,9 ortanca uzunluklara sahip uzun kodlamayan RNA'lar (eRNA) olarak bilinen güçlendirici RNA'lar üretir. eRNA'ların ekspresyonu, yakındaki hedefgenlerin aktivasyonuyla güçlü bir şekilde korelasyonludur 10,11,12 ve fonksiyonel çalışmalar, eRNA'ların azalmasının hedef genlerin transkripsiyonunu azalttığını tutarlı şekilde göstermiştir; bu da eRNA'ların transkripsiyonel yan ürünler yerine fonksiyonel düzenleyici olarak görev yaptığını göstermektedir 13,14,15,16,17. Fonksiyonel önemlerine rağmen, eRNA'ları güvenilir şekilde tespit etmek ve nicelendirmek için deneysel protokoller sınırlı kalır.

Kök hücrelerde, güçlendirici aktivite pluripotensinin korunmasında ve gelişimsel geçişlerin ilerlemesinde kritik roloynar 18,19. Güçlendiriciler, intergenik bölgelerde (intergenik veya ekstragenik güçlendiriciler) bulunabilir veya gen gövdelerine intragenik güçlendiricilerolarak gömülü olabilirler 8. Intergenik güçlendiriciler çeşitli hücre tiplerinde kapsamlı şekilde incelenmiş olsa da, intragenik güçlendiriciler, konak gen pre-mRNA'larıyla transkripsiyonel örtüşme ve transkripsiyonel uzamaya bağlı histon modifikasyonlarının varlığı gibi teknik zorluklar nedeniyle nispeten az araştırılmıştır. Buna rağmen, son çalışmalar, hem intergenik hem de intragenik güçlendiricilerin, ESC'lerde pluripotensi22,23 ve erken farklılaşma24'te rol alan gen düzenleyici ağlara katkıda bulunduğunu göstermiştir. Özellikle, tüm annotasyonlu güçlendiricilerin neredeyse yarısı intragenik20,25 olup, aktiviteleri gelişim evrelerine göre değişir; sıklıkla farklılaşmış dokularda artar; 8,26,27,28. Ancak, ESC'lerde intragenik güçlendiricilerin yaygınlığı ve fonksiyonel rolleri hâlâ tam olarak anlaşılmamaktadır. Özellikle, intergenik eRNA'lar genler arasında transkribe edilirken, intragenik eRNA'lar gen gövdeleri içinde transkribe edilir ve pre-mRNA transkriptleriyle örtüşebilir. Bu pozisyonsal fark, intergenik ve intragenik eRNA'ların yorumlanıp nicelendirilmesinde farklı analitik yaklaşımlar gerektirir.

mRNA'ların aksine, eRNA'lar genellikle 3′ poli(A) kuyruğuna sahip değildir; bu da düşük stabiliteye ve hızlı bozulmayayol açar 1,2,7,8,9. Bu içsel istikrarsızlık, özellikle zaman süreli deneylerde eRNA ifadesinin analizini zorlaştırır. Nöronlarda, eRNA'ların yarı ömrü 7,5 dakika17 kadar kısa olduğu bildirilmiştir. Ancak, bu kararsızlığın farklı hücre tiplerinde, özellikle ESC'lerde tutarlı olup olmadığı belirsizdir; çünkü hem güçlendirici aktivite hem de eRNA transkripsiyonu hücre tipine özgü 7,17,29,30 olarak değişir. ESC'ler, plüdürpotensiyi korumak veya farklılaşmayı başlatmak için dinamik gen düzenleyici programlara dayanır; bu da onları eRNA dönüşümünü incelemek için benzersiz bir sistemyapar 31,32. ESC'lerdeki hızlı transkripsiyonel değişimler göz önüne alındığında, eRNA bozulmasını bu bağlamda anlamak, güçlendirici aktivitenin zamansal olarak nasıl düzenlendiğiniortaya koyabilir. Ayrıca, intergenik ve intragenik eRNA'lar arasındaki farklar, örneğin konak gen transkriptleriyle örtüşme, farklı analitik yaklaşımlar gerektirir20. Bu soruların önemine rağmen, ESC'lerde eRNA yarı ömrünü ölçmek veya farklı eRNA türlerinin bozunma dinamiklerini karşılaştırmak için çok az standart yöntem mevcuttur.

Bu çalışma, mESC'lerde intergenik ve intragenik güçlendiricilerden transkribe edilen eRNA'ların stabilitesi ve yarı ömrünü değerlendirmek için nicel bir protokol sunmaktadır. Transkripsiyonel inhibisyon, belirli zaman aralıklarında aktinomisin D (ActD) kullanılarak sağlanır, ardından gerçek zamanlı nicel PCR (RT-qPCR) ve doğrusal olmayan regresyon analizi ile eRNA çürümesinin nicelendirilmesi sağlanır. Intergenik ve intragenik güçlendiriciler arasındaki konumsal farklılıkları gidermek için yöntem, eRNA bozulma dinamiklerinin sistematik ve doğru karşılaştırılmasını mümkün kılan farklı normalizasyon stratejileri içerir. Bu yapılandırılmış analitik çerçeve, pluripotent kök hücrelerde eRNA dönüşümü hakkında değerli bilgiler sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmadaki tüm deneyler fare embriyonik kök hücreleri (mESC; E14Tg2A) ve bu hattlar doğrudan laboratuvarımızda üretilmemiş, ancak ATCC (CRL-1821) tarafından ticari olarak temin edilebilen yerleşik bir hücre hattından elde edilmiştir. Bu nedenle, bu makalede açıklanan çalışmalar Chungnam Ulusal Üniversitesi'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) incelemesini gerektirmemektedir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. mESC'lerin hücre kültürü

  1. 6 delikli hücre kültür plakalarını %0,1 jelatin (her kuyu başına 2 mL) ile önceden kaplamak. Plakaları 37 °C'de 10 dakika kuluçka edin.
  2. Jelatini aspire edin ve her birini 1 mL PBS ile bir kez iyice yıka. Plakaları en az 15 dakika boyunca UV ışınıyla sterilize edin.
  3. Tohum mESC'ler tam 2 mL hücre kültürü ortamı kullanılarak jelatin kaplı plakalara uygulanır (Tablo 1).
    NOT: LIF'i, deney için gereken toplam ortam hacmine göre hemen kullanılmadan hemen önce gerekli konsantrasyonda kültür ortamına taze ekleyin.
BileşenSon KonsantrasyonKullanılan hacim
Glasgow'un Minimum Gerekli Ortamı (GMEM)-500 mL
KnockOut™ Serum Değişimi (KOSR)10%50 mL
Penisillin-streptomisin0.50%2.5 mL
Fetal sığır serumu (FBS)1%5 mL
Sodyum piruvat0,1 mM / 1 %5 mL
MEM Temel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi (MnEA)0,1 mM/ 1 %5 mL
2-merkaptoetanol0.1 mM910 uL
Lösemi inhibitör faktörü (LIF)1000 U/mL-

Tablo 1: mESC kültür ortamının bileşimi. MESC kültür ortamının hazırlanmasında kullanılan bileşenler ve nihai konsantrasyonları. Tipik hacimler, toplam ortamın 500 mL başına listelenmiştir.

  1. Hücreleri %5CO2 içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde standart kültür koşulları altında 37 °C'de tutun (Şekil 1A).

figure-protocol-1
Şekil 1: eRNA stabilite analizi için deneysel tasarım. (A) Transkripsiyonel tutuklama deneyinin şeması. Hücreler, %0,1 jelatin kaplı 6 delikli plakalar üzerine kaplama yapıldı ve hasat sonrası belirtilen zaman noktalarında (0 dakika, 5 dakika, 10 dakika, 15 dakika, 20 dakika ve 30 dakika) actD (nihai konsantrasyon: 5 μg/mL) ile muamele edildi. (B) RT-qPCR test düzeni. Toplam RNA, rastgele heksamer veya oligo(dT) primerleri kullanılarak tersine transkribe edildi. Her zaman noktasından cDNA örnekleri, belirtilen hedefler için RT-qPCR kullanılarak analiz edildi: Tbp_mRNA, intergenik eRNA ve intragenik eRNA. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Aktinomisin D (ActD) tedavisi

  1. ActD'yi DMSO'da çözerek 1 mg/mL33 konsantrasyonda stok çözeltisi hazırlayın.
    NOT: Burada kısa süreli transkripsiyonel inhibisyon için Aktinomisin D kullanılsa da, gelecekteki çalışmalarda transkripsiyon başlatmayı engellemek için triptolid gibi alternatif inhibitörler de kullanılabilir. Hem Aktinomisin D hem de DMSO ışığa duyarlı olduğundan, orijinal çözeltiyi kehribar mikrotüplerde hazırlayın, ışıktan koruyun ve kullanılana kadar -20 °C sıcaklıkta saklayın.
  2. Hücre tohumlanmasından iki gün sonra (veya hasat gününde), actD stok çözeltisini kültür ortamına 5 μg/mL33 nihai konsantrasyonla ekin. İşlemden sonra 0 dakika, 5 dakika, 10 dakika, 15 dakika, 20 ve 30 dakika içinde örnekler alın (Şekil 1A).
    NOT: Çoğu eRNA 0-30 dakika aralığında hızlı bozunma gösterirken, bazı eRNA'lar daha uzun yarı ömür gösterebilir. Hedef lokunun özelliklerine bağlı olarak, uzun zaman noktalarında (örneğin 1 saat, 3 saat veya 6 saat) ek örnekler daha doğru şekilde aktarılabilir ve böylece bozulma kinetikleri daha doğru yakalanabilir. Bu çalışmada, Aktinomisin D kısa süreli (≤30 dakika) transkripsiyonel blokada 5 μg/mL konsantrasyonda kullanıldı; ancak daha uzun kuluçkalarda (>1 saat) hücresel stres yanıtlarını en aza indirmek için konsantrasyonun 1-2 μg/mL'ye düşürülmesi önerilir. DMSO'nun kendisi transkripsiyonel aktiviteyi etkileyebildiği için, sadece DMSO'ya yönelik bir kontrol de dahil edilmelidir.

3. RNA çıkarımı ve cDNA sentezi

  1. Hücre kültür ortamını emiş yoluyla çıkarın ve her kuyuya 1 mL TRIzol reaktifi ekleyin. Plakaları oda sıcaklığında (RT)34,35 10 dakika boyunca bir shaker üzerinde kuluçka edin, ardından lizat yeni bir 1,5 mL tüpe aktarılır.
    NOT: TRIzol tedavisinden sonra, örnekler RNA çıkarımından önce bir haftaya kadar -80 °C sıcaklıkta saklanabilir. TRIzol reaktifi, yüksek toksik ve aşındırıcı olan fenol ve guanidinyum izotiosiyanat içerdiği için, onu büyük dikkatle kullanın. Tüm TRIzol atıkları, uygun şekilde bertaraf edilebilmesi için belirlenmiş organik çözücü atık konteynerinde toplanmalıdır.
  2. Her numuneye 500 μL kloroform ekleyin. Tüpleri sertçe sallayın ve RT'de 3 dakika kuluçka yapın.
  3. Örnekleri 13.500 × g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjlendirin.
  4. Sulu fazı, eşit hacimde izopropanol içeren yeni bir 1.5mL tüpe dikkatlice aktarın. RNA çökelmesini artırmak için karışımı RT seviyesinde 10 dakika kuluçka altına alın.
    NOT: Ara fazla kontaminasyondan kaçınmak için dikkatlice sadece şeffaf üst sulu faza aktarın. RNA verimini artırmak için, izopropanol eklendikten sonra örnekleri -20 °C'de 1 saat ile gece boyunca (O/N) inkübe edin. Düşük girdili örnekler için, izopropanol eklemeden hemen önce glikojen (son 10-20 μg/mL) veya GlycoBlue ekleyin; böylece RNA pellet görünürlüğünü ve geri kazanım verimliliğini artırabilirsiniz. İzopropanol son derece yanıcı olup insan sağlığı için potansiyel olarak zararlıdır; Buhar soluma veya cilt veya gözlerle temas etmek tahriş, baş ağrısı, baş dönmesi veya merkezi sinir sistemi depresyonuna neden olabilir. Dikkatli davranın ve kalan tüm çözeltileri onaylı organik çözücü atık konteynerinde doğru bertaraf etmek için toplayın.
  5. Numuneleri tekrar 13.500 × g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjle edin ve üst yüzeyi atınız.
  6. Ortaya çıkan RNA pelletini 1 mL %75 etanol ile yıkayın. Santrifüj 6.800 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca koyun.
    NOT: Etanol eklendikten sonra tüpü nazikçe ters çevirerek pelleti kaldırın.
  7. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve pelleti 42 °C'de 10 dakika boyunca hava kurutmayın. Kurutulmuş peleti RNase içermeyen suda tekrar askıya alın ve 55 °C'de 10 dakika kuluçka yapın.
    NOT: RNA saflığı yüksek olduğunda, beyaz pelet hava kurutma sürecinde saydam hale gelebilir. Peleti 10 dakikadan fazla fazla kurutmaktan kaçının, çünkü aşırı kurutma yeniden süspansiyon verimliliğini azaltabilir.
  8. NanoDrop spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonu ve saflığını ölçin.
  9. Üreticinin talimatlarına uygun olarak M-MLV cDNA Sentez Kiti kullanılarak μg RNA'dan cDNA sentezlenin (Tablo 2).
BileşenKullanılan hacim 
10X M-MLV RT tamponu2 uL
dNTP2 uL
Astar (Random / Olido dT)1uL
M-MLV RT1uL
Rnase inhibitörü0.5 uL
RNA örneği2ug (RNA örnek konsantrasyonuna göre ayarlanan hacm)
DWHacim, RNA numune konsantrasyonuna göre ayarlanır (nihai hacmi oluşturmak için)
Toplam Hacim20 uL

Tablo 2: cDNA sentez reaksiyonunun (M-MLV ters transkriptaz) bileşimi. M-MLV cDNA Sentez Kiti kullanılarak toplam RNA'nın 2 μg tersini transkripsiyonu için kullanılan ayrıntılı hacimler ve reaktifler. RNA örneğinin hacmi konsantrasyonuna göre ayarlandı ve nükleazsız DW eklenerek nihai reaksiyon hacmi 20 μL'ye ulaştı.

  1. cDNA reaksiyonunu 37 °C'de 2 saat kuluçka edin, ardından enzimi 85 °C'de 5 dakika ısıyla inaktive edin.
    NOT: Sentezlenen cDNA'yı -20 °C'de sakla. Tipik cDNA konsantrasyonu yaklaşık 100 ng/μL'dir. İntrajenik eRNA'ları tespit etmek için, aynı RNA örneğinden hem rastgele heksamer primerleri hem de oligo(dT) primerleri kullanılarak cDNA sentezlenin.

4. Gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR)

  1. 15 ng cDNA, 5 μL Power SYBR Green PCR master karışımı, her primerden 5 pmol ve damıtılmış su (DW) içeren 10 μL reaksiyon karışımı hazırlayın.
    NOT: eRNA lokusları genellikle tekrarlayan dizileri içerir veya bitişik olur, bu da dikkatli primer tasarımı gerektirir. Aday bölgeleri kısıtlamak için tekrar maskeli diziler kullanın ve BLAST ile genom genelinde primer-çift özelliğini doğrulayın. Mümkünse, spesifik olmayanamplifikasyonu (36) dışlamak için yakın kontrol bölgelerini dahil edin.
  2. Gerçek zamanlı PCR sistemi kullanılarak aşağıdaki termal döngü koşullarıyla amplifikasyon yapılacaktır: 50 °C'de 2 dakika ve 95 °C'de 10 dakika ilk aktivasyon ve denatürasyon adımı, ardından 15 saniye boyunca 95 °C'de 40 döngü denaturasyon ve 60 °C'de 1dakika 34 dakika tavlama, uzatma ve floresans ölçümü. 37 (Tablo 3).
SafhaAdımSıcaklık (°C)SaatDevir
Sahneyi TutTers transkripsiyon502 dakika1
İlk denatürasyon9510 dakika1
PCR AşamasıDenatürasyon9515 s40
Tavlama/Uzatma601 dakika40
Erime eğrisi EvresiDenatürasyon9515 s1
Tavlama601 dakika1
Dissosiyasyon (erime eğrisi)9515 s1

Tablo 3: RT-qPCR için termal döngü koşulları. Ters transkripsiyon, 40 döngülü qPCR (10 μL reaksiyon) ve standart erime eğrisi analizi için özet sıcaklık, zaman ve döngü koşulları.

  1. İntragenik eRNA nicelendirmesi için, hem Tbp (veya diğer temizlik/kontrol geni) hem de intragenik güçlendirici bölgeyi oligo(dT) primerleriyle sentezlenen cDNA kullanarak analiz edin. Intergenik eRNA'lar için, yalnızca rastgele heksamer primerleriyle sentezlenmiş cDNA kullanın (Tablo 4 ve Şekil 1B).
    NOT: Her örneği teknik kopyalar halinde (iki kuyu) çalıştırın, veri analizi sırasında ortalamaya izin verilsin.
Gen adıAstar probuSıralama (5'-3')Amplikon boyutları 
TbpİletmekTGACTCCTGGAATTCCCATC122 bp
TersTTGCTGCTGCTGTCTTTGTT
Nsun2_mRNAİletmekGGATGAAGCAGTGATCGCAG93 bp
TersATCCACTTCAGTCCTGGCAA
Pou5f1_mRNAİletmekTCCCTACAGCAGATCACTCAC80 bp
TersCGCCGGTTACAGAACCATAC
Sox2_mRNAİletmekACAGATGCAACCGATGCACC105 bp
TersTGGAGTTGTACTGCAGGGCG
Nsun2_eRNAİletmekCCTGAGAGGTTTTGCTTTGT110 bp
TersAGGTTAACACATCAGCCCCA
Pou5f1_eRNAİletmekCACTTCTCTGGGTCTCTGG107 bp
TersCCAGGACAACAGCCATTG
Sox2_eRNAİletmekAGTCAGCTACATGGGCAGAG119 bp
TersCCCCTCTTCTCACCGTACAG
Nsun2_negative kontrolüİletmekCCCCGTGTTTAAGAGGAATGA88 bp
TersACTGAGAACAACCCACTAGCA

Tablo 4: RT-qPCR analizi için primer dizileri. RT-qPCR deneylerinde her hedef genin spesifik amplifikasyonu için ileri ve geri primer dizileri. Bu primerler, mRNA ve eRNA ifadesinin doğru nicelenmesini sağlamak için optimize edilmiştir.

5. eRNA kararlılık verileri Analizi 22

  1. Tüm verileri ΔCt yöntemiyle analiz edin ve göreceli eRNA seviyelerini Tbp'ye normalize edin_mRNA (Ek Dosya 1 ve Şekil 2A).
    NOT: İki teknik kopya arasındaki Ct değer farkı 0.5'i aşıyorsa, veri daha fazla analizden hariç tutulun. Kontrol geninin Ct değerini (örneğin, Tbp_mRNA) hedef genin değerinden çıkararak ΔCt yöntemiyle göreli gen ifade seviyelerini hesaplayın (ΔCt = Control_Ct - Target_Ct). Göreceli ifade daha sonra 2^-ΔCt (Ek Dosya 2B) olarak hesaplanabilir.
  2. İntrajenik eRNA niceliklendirmesi için, rastgele heksamerlerle sentezlenen cDNA'dan alınan değerleri oligo(dT) primerleriyle sentezlenen cDNA'dan alınan değerlere bölünerek ifade değerlerini normalize edin.
    NOT: Tüm qPCR reaksiyonlarını üç bağımsız biyolojik replikat (n = 3) kullanarak gerçekleştirin.
  3. Her zaman noktasının ifade seviyesini (ΔCt yöntemiyle eldeedilen) 0 dakika değerine normalleştirin ve bozulma eğrisini çizin.
    NOT: Bu protokol kısa süreli Aktinomisin D tedavisi kullansa da, transkripsiyon inhibitörlerine (örneğin ActD) uzun süre maruz kalmak da ev genlerini azaltabilir. Daha yüksek hassasiyetli nicel ölçüm için, hücre lizisi aşamasında RNA çıkarma verimliliği, ters transkripsiyon verimliliği ve pipetleme doğruluğundaki değişiklikleri düzeltmek ve böylece örnekler arasında daha tutarlı normalleşme sağlanması amacıyla hücre lizisi aşamasında dışsal bir spike-in RNA (örneğin, ERCC) eklenmesiniöneriyoruz 38,39.
  4. Normalize eRNA seviyelerini zaman içinde çizin ve bunları GraphPad Prism'de doğrusal olmayan bir regresyon modeli (tek fazlı üstel bozulma) kullanarak uyarlayın (Ek Dosya 3).
  5. Bireysel biyolojik çoğaltıcılardan eRNA yarı ömrünü tahmin edin.
    1. GraphPad Prizma'yı açın ve Create > XY'yi seçin (Seçenekler: X = Sayılar; Y = Her nokta için tek bir Y değerini girin ve çizin).
    2. Zaman noktalarını (0, 5, 10, 15, 20 ve 30 dakika) X ekseni değerleri olarak girin.
    3. Örnek isimlerini Y ekseninde (Grup) listeleyin ve her zaman noktası için karşılık gelen tek veri değerini girin.
    4. Analiz > regresyon ve eğriler > doğrusal olmayan regresyon (eğri uyumu) seçin.
    5. Üstel sekmesinde Tek fazlı bozum modelini seçin.
    6. Tablodan Sonuçlara Tablo sayfasında, Excel veya benzeri yazılımlarla her örnek için yarı ömür değerlerinin ortalama ve standart sapmasını hesaplayın. Ortaya çıkan değerleri çizin.
  6. Uyum bozma eğrileri %95 güven aralıklarıyla
    1. GraphPad Prizma'yı açın ve Create > XY'yi seçin (Seçenekler: X = Sayılar; Y = yan yana alt sütunlarda 3 replikasyon değeri girin).
    2. Zaman noktalarını (0, 5, 10, 15, 20 ve 30 dakika) X ekseni değerleri olarak girin.
    3. Örnek isimlerini Y ekseninde (Grup) listeleyin ve her eRNA örneği için üç çoğaltılan değeri ilgili veri sayfasına girin.
    4. Analiz > regresyon ve eğriler > doğrusal olmayan regresyon (eğri uyumu) seçin.
    5. Üstel sekmesinden, analiz için Tek fazlı bozunma modelini seçin.
    6. Tablodan Sonuç'a sayfasında, üçlü örneklerin analizinden elde edilen %95 güven aralığı (CI) değerlerini çıkarabilirsiniz.
      NOT: Aşağıdaki bozulma denklemini kullanın: Y = (Y0 - Plateau) • e-kt + Plateau, burada Y, t zamanındaki göreli eRNA seviyesi, Y0 başlangıç eRNA seviyesi ve k bozulma sabitidir. eRNA eğrisi uyumu sırasında Plateau'yu sıfıra sabitlemeyin, çünkü önceki çalışmalar eRNA'nın zamanla tamamen bozulmayıp kalabileceğinigöstermektedir 17,40. Ancak, mRNA bozunmasını analiz ederken, önceki mRNAprotokolleri 41,42'yi takip ederek platoyu sıfıra sabitleyin. GraphPad Prism'in eRNA yarı ömrünü (t₁/₂) otomatik olarak şu formülle hesaplamasına izin verin: t1/2 = In(2)/ k. Zamanı dakika ile girin; Ortaya çıkan yarı ömür değerlerini en az cinsinden raporlayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkripsiyonel duruklama sonrası RNA stabilitesini değerlendirmek için mESC'ler actD ile tedavi edildi ve toplam RNA belirlenmiş zaman noktalarında (0 dakika, 5 dakika, 10 dakika, 15 dakika, 20 dakika ve 30 dakika) toplandı. cDNA sentezinden sonra, RT-qPCR Nsun2 ve Sox2'nin intragenik eRNA'sını, Pou5f1'in intergenik eRNA'sını ve ilgili mRNA'larını niceliklendirmek için gerçekleştirildi. Bu veriler, zamana bağlı bozulma eğriler...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, mESC'lerde eRNA kararlılığını ölçmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktadır. Hücre kültürü, aktinomisin D tedavisi, RNA çıkarımı ve RT-qPCR niceliklendirme gibi kritik deneysel adımlar, kullanıcıları iş akışı boyunca yönlendirmek için şekillerde ve ek dosyalarda açıkça gösterilmiştir. Ayrıca, doğru yarı ömür tahminini desteklemek için doğrusal olmayan regresyon modellemesi ve güven aralıklarının yorumlanması gibi ayrıntılı analitik prosedürler Ek Do...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, açıklamak için herhangi bir çıkar çatışması belirtmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Chungnam Ulusal Üniversitesi araştırma fonu tarafından desteklendi [2024-0991-01 (S.-K.K.)]; Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı'nın (NRF) Temel Bilim Araştırma Programı [RS-2023-00209842 (S.-K.K.)] ve Biyo-Tıbbi Teknoloji Geliştirme Programı [RS-2025-02305916 (S.-K.K.)].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-merkaptoetanolGibco21985023
Aktinomisin DSigma-AldrichA9415
kloroformDaejung kimyasalları2548-4105
DMSOGenDEPOTD2680
Fetal sığır serumu (FBS)Sigma-AldrichF0392
JelatinSigma-AldrichG1890-100G
Glasgow' Minimum Temel Ortam (GMEM)Gibco11710035
GraphPad Prism (sürüm 9)GraphPad Yazılımı
izopropanolDaejung kimyasalları5035-4105
KnockOut Serum Değişimi (KOSR)Gibco, 10828028
Lösemi inhibitör faktörü (LIF)MerckESG1106
MEM Temel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi (MnEA)WelgeneLS005
M-MLV cDNA Sentez Kiti EnzimomiklerEZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus KLAB01-QI685-M-16-C
Penisillin-streptomisinWelgeneLS202-02
Power SYBR-Green PCR master mix Uygulamalı Biyosistemler4368708
QuanStudio1 Gerçek Zamanlı PCR sistemi Uygulamalı BiyosistemlerA40425
Sodyum piruvatWelgeneLS013
TRIzol Invitrogen15596018

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  2. Gorbovytska, V., et al. Enhancer RNAs stimulate Pol II pause release by harnessing multivalent interactions to NELF. Nat Commun. 13 (1), 2429(2022).
  3. Joo, J. -Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. -K. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers. Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).
  4. Levine, M. Transcriptional enhancers in animal development anfd evolution. Curr Biol. 20 (17), R754-R763 (2010).
  5. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  6. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).
  7. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biol. 8 (5), e1000384(2010).
  8. Kim, T. -K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  9. Songyue, G., et al. The roles of enhancer, especially super-enhancer-driven genes in tumor metabolism and immunity. Int J Biol Macromol. 308 (1), 142414(2025).
  10. Kim, S. H., et al. Epigenetic regulation of IFITM1 expression in lipopolysaccharide-stimulated human mesenchymal stromal cells. Stem Cell Res Ther. 11, 1-12 (2020).
  11. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: Recent insights and future perspectives. Nat Rev Genet. 17 (4), 207-223 (2016).
  12. Sartorelli, V., Lauberth, S. M. Enhancer RNAs are an important regulatory layer of the epigenome. Nat Struct Mol Biol. 27 (6), 521-528 (2020).
  13. Lam, M. T., et al. Rev-Erbs repress macrophage gene expression by inhibiting enhancer-directed transcription. Nature. 498 (7455), 511-515 (2013).
  14. Li, W., et al. Functional roles of enhancer RNAs for oestrogen-dependent transcriptional activation. Nature. 498 (7455), 516-520 (2013).
  15. Melo, C. A., et al. eRNAs are required for p53-dependent enhancer activity and gene transcription. Mol Cell. 49 (3), 524-535 (2013).
  16. Mousavi, K., et al. eRNAs promote transcription by establishing chromatin accessibility at defined genomic loci. Mol Cell. 51 (5), 606-617 (2013).
  17. Schaukowitch, K., et al. Enhancer RNA facilitates NELF release from immediate early genes. Mol Cell. 56 (1), 29-42 (2014).
  18. Göttgens, B., et al. Establishing the transcriptional programme for blood: The SCL stem cell enhancer is regulated by a multiprotein complex containing Ets and GATA factors. The EMBO J. 21 (12), 3039-3050 (2002).
  19. Wang, H. F., et al. Defining essential enhancers for pluripotent stem cells using a features-oriented CRISPR-Cas9 screen. Cell Rep. 33 (4), 108309(2020).
  20. Cinghu, S., et al. Intragenic enhancers attenuate host gene expression. Mol Cell. 68 (1), 104-117.e106 (2017).
  21. Hobson, D. J., Wei, W., Steinmetz, L. M., Svejstrup, J. Q. RNA polymerase II collision interrupts convergent transcription. Mol Cell. 48 (3), 365-374 (2012).
  22. Moon, J., et al. Embryonic stem cell-specific intragenic enhancer RNA essential for NSUN2-mediated stem cell fate regulation. Int J Biol Macromol. 319, 145470(2025).
  23. Tata, P. R., Tata, N. R., Kühl, M., Sirbu, I. O. Identification of a novel epigenetic regulatory region within the pluripotency associated microRNA cluster, EEmiRC. Nucleic Acids Res. 39 (9), 3574-3581 (2011).
  24. Sohni, A., et al. Dynamic switching of active promoter and enhancer domains regulates Tet1 and Tet2 expression during cell state transitions between pluripotency and differentiation. Mol Cell Biol. 35 (6), 1026-1042 (2015).
  25. Borsari, B., et al. Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions. Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).
  26. Bressin, A., et al. High-sensitive nascent transcript sequencing reveals BRD4-specific control of widespread enhancer and target gene transcription. Nat Commun. 14 (1), 4971(2023).
  27. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).
  28. Pérez-Molina, R., et al. An intronic Alu element attenuates the transcription of a long non-coding RNA in human cell lines. Front Genet. 11, 928(2020).
  29. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  30. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  31. Atlasi, Y., Stunnenberg, H. G. The interplay of epigenetic marks during stem cell differentiation and development. Nat Rev Genet. 18 (11), 643-658 (2017).
  32. Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144 (6), 940-954 (2011).
  33. Ratnadiwakara, M., Änkö, M. -L. mRNA stability assay using transcription inhibition by actinomycin D in mouse pluripotent stem cells. Bio Protoc. 8 (21), e3072-e3072 (2018).
  34. Kim, S. -K., et al. Functional coordination of BET family proteins underlies altered transcription associated with memory impairment in fragile X syndrome. Sci Adv. 7 (21), eabf7346(2021).
  35. Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis. J Vis Exp. (30), e1470(2009).
  36. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134(2012).
  37. Kim, S. -K., et al. SET7/9 methylation of the pluripotency factor LIN28A is a nucleolar localization mechanism that blocks let-7 biogenesis in human ESCs. Cell Stem Cell. 15 (6), 735-749 (2014).
  38. Lugowski, A., Nicholson, B., Rissland, O. S. DRUID: A pipeline for transcriptome-wide measurements of mRNA stability. RNA. 24 (5), 623-632 (2018).
  39. Lugowski, A., Nicholson, B., Rissland, O. S. Determining mRNA half-lives on a transcriptome-wide scale. Methods. 137, 90-98 (2018).
  40. Tsai, P. F., et al. A muscle-specific enhancer rna mediates cohesin recruitment and regulates transcription in trans. Mol Cell. 71 (1), 129-141.e128 (2018).
  41. Woolley, C. R., et al. Full-length mRNA sequencing resolves novel variation in 5' UTR length for genes expressed during human CD4 T-cell activation. Immunogenetics. 77 (1), 14(2025).
  42. Zhang, H., et al. Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity. Nature. 621 (7978), 396-403 (2023).
  43. Kim, T. -K., Shiekhattar, R. Architectural and functional commonalities between enhancers and promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enhancer RNAsRNA StabilityMouse Embryonic Stem CellseRNA DecayActinomycin DRT qPCRIntergenic Enhancer RNAIntragenic Enhancer RNARNA Half LifeTranscriptional Arrest

Related Articles