Yöntem makalesi

K562 Hücrelerinin Epigenetik Mühendisliği: dCas9-DNMT3A ve -HDAC1 Füzyon Proteinleri Kullanılarak Stabil Hedefli DNA Metilasyonu için Çift Vektörlü Epizomal Strateji

DOI:

10.3791/69328

⸱

31 Ekim 2025

 ,  ,  , 
1Biology Laboratory, School of Science and Technology, Hellenic Open University, 2Division of Pharmacology and Biosciences, Department of Pharmacy, School of Health Sciences, University of Patras

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, lokusa özgü DNA metilasyonunu hassas ve azaltılmış hedef dışı etkilerle indüklemek için dCas9-DNMT3A ve dCas9-HDAC1 efektörlerini spesifik sgRNA'larla birleştiren, K562 hücrelerinde hedeflenen epigenetik düzenleme için bütünleştirici olmayan, epizomal CRISPR/dCas9 tabanlı bir sistemi tanımlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA metilasyonunun gen transkripsiyonel düzenlemesindeki kesin rolünün araştırılması ve spesifik gen metilasyon modellerini hedef alan tedavilerin geliştirilmesi, gen ekspresyonunu modüle etmek için bölgeye özgü ve uzun vadeli epigenetik modifikasyonları indükleyebilen çok yönlü araçların azlığı nedeniyle önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Çalışma, hem temel epigenetik araştırmalar hem de terapötik uygulamalar için potansiyel olarak yararlı olan, hedeflenen bir gen lokusunda stabil DNA metilasyonunu kolaylaştırmak için yenilikçi bir epizomal tabanlı sistem geliştirmeyi ve doğrulamayı amaçladı. Bunu başarmak için, K562 hücre hattı iki farklı epizomal vektör ile birlikte transfekte edildi. Her iki vektör tipi de, ZBTB7A geninin yukarısında yer alan CpG adası 326 içinde 367 bp'lik metillenmemiş bir bölgeyi hedefleyen kılavuz RNA'ları (gRNA'lar) eksprese etmek üzere tasarlanmıştır. Her vektör, DNA metiltransferaz DNMT3A'nın (dCas-DNMT3A-CD) katalitik alanına veya tam uzunluktaki histon deasetilaz HDAC1'e (dCas-HDAC1) kaynaşmış, devre dışı bırakılmış bir endonükleaz Cas9 (ölü veya dCas9) formunu kodladı. dCas dizisi, proteinin nükleer ithalatını sağlamak için iki Nükleer Lokalizasyon Sinyali (NLS) içeriyordu. Bu ikili sistem ekspresyon kaseti, potansiyel olarak uzun vadeli epigenetik susturmaya elverişli bir kromatin durumunu teşvik ederek sağlam ve dayanıklı epigenetik sonuçlar vaat eder. Kendi kendini kopyalayan epizomal vektörlerin kullanımı yoluyla konakçı epigenomuna bu müdahaleci yaklaşım, çeşitli avantajlar sunar: konakçı genomuna entegrasyon olmadan çoklu hücre bölünmeleri boyunca vektörlerin düşük kopya sayılarında bakımı ve ekspresyonu, dolayısıyla hedef dışı etkileri en aza indirir ve genom bütünlüğünü korur. Hedeflenen ZBTB7A CpG adası 326'da DNA metilasyonunun kesin ve önemli artışını rapor ediyoruz. Bulgular, tasarlanmış epizomal CRISPR/dCas sistemlerinin dayanıklı, bölgeye özgü DNA metilasyonunu ortaya çıkarabildiğini doğrulamaktadır. Bu nedenle, bu sistem, hedeflenen metilasyon değişikliklerinin fonksiyonel etkilerini değerlendirmek için değerli bir araştırma aracı ve gelecekteki epigenetik tedavilerin geliştirilmesi için umut verici bir platformdur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA metilasyonu ve histon modifikasyonlarını içeren epigenetik düzenleme, gen ekspresyonunun, hücre farklılaşmasının ve genom stabilitesinin kontrolünde çok önemli bir rol oynar. Bu mekanizmaların düzensizliği genellikle çeşitli patolojik durumlarda, özellikle kanserde, nörolojik bozukluklarda ve damgalama sendromlarında- bir neden veya sonuç olarak - söz konusudur 1,2,3. Özellikle, epigenom düzenleme Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) teknolojisi kullanılarak spesifik genomik lokuslardaki epigenetik manzaraya hassas bir şekilde müdahale edilerek, altta yatan DNA dizisinideğiştirmeden gen nakavt modellerinde gözlemlenenlerle karşılaştırılabilir gen baskı seviyeleri elde edilebilir 4. Sonuç olarak, hedeflenen epigenetik düzenleme, gen düzenleyici mekanizmaların incelenmesi ve hassas terapötiklerin geliştirilmesi için umut verici bir strateji olarak ortaya çıkmıştır.

DNA metiltransferaz (DNMT) inhibitörleri ve histon deasetilaz (HDAC) inhibitörleri, şu anda klinik kullanım için onaylanmış epigenetik tedavilerdir. Bununla birlikte, bu ajanlar genom boyunca seçici olmayan bir şekilde epigenetik belirteçleri hedef alır, global kromatin durumlarını değiştirir, hastalarda hedef dışı etkilere ve toksisiteye neden olur5. Geleneksel epigenetik değişiklik ajanlarının sınırlamalarını ele almak için, DNA metiltransferazlar (örneğin, DNMT3A), demetilazlar (örneğin, TET1), histon asetiltransferazlar (örneğin, p300) veya deasetilazlar (örneğin, HDAC3) gibi efektör alanlara kaynaşmış katalitik olarak ölü Cas9'a (dCas9) dayalı programlanabilir epigenetik editörler geliştirilmiştir 6,7,8,9 . dCas9-efektör sistemi, hedef dizide çift sarmallı kırılmalar oluşturmadan, tek kılavuzlu RNA (sgRNA) olarak bilinen küçük bir RNA molekülü tarafından yönlendirilen lokusa özgü epigenom modifikasyonuna izin verir. Son çalışmalar, gen ekspresyonunu değiştirmede, kromatin erişilebilirliğini yeniden şekillendirmede ve hatta hücresel fenotipleri yeniden programlamada kullanımlarını göstermiştir 10,11,12.

Hızlı ilerlemelere rağmen, dCas9 tabanlı epigenom mühendisliği sistemleri bazı sınırlamalarla karşı karşıya kalmaya devam ediyor. En yaygın zorluk, özellikle dCas9 füzyon araçlarının13,14 güçlü veya uzun süreli ekspresyonu ile epigenetik efektör alanlarının özgül olmamasından kaynaklanan hedef dışı etkilerdir. Ek olarak, dCas9 füzyonlarının büyük boyutu önemli teslimat zorlukları ortaya çıkarmaktadır. Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) dizisinin boyutu yaklaşık 4.2kb'dir 15, bu da Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörlerinin maksimum kapasite boyutuyla karşılaştırılabilir. Lentiviral vektörler, epigenetik efektörlerle kaynaşmış tam uzunluktaki SpCas9'un verilmesini sağlayan nispeten büyük bir kapasiteye (~12-1 kb) sahip olsa da, rastgele genomik entegrasyon olasılığını hala korurlar, eklemeli mutajenez riskini taşırlar ve klinik uygulamalarını sınırlarlar16. Öte yandan, plazmit transfeksiyonu gibi viral olmayan yaklaşımlar, bölünen hücrelerde zayıf tutulmadan muzdariptir. Geçici veya "vur ve kaç" dağıtım yaklaşımları, genomik entegrasyon olasılığını dışlar, ancak kromatin yeniden şekillendiriciler veya işbirlikçi efektörler 17,18,19 ile birleştirilmedikçe, hücre bölünmeleri boyunca metilasyon değişikliklerini sürdürmede genellikle başarısız olur.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, dCas9 ile kaynaşmış epigenetik efektörler sağlamak için bütünleştirici olmayan, kendi kendini kopyalayan bir epizomal vektör sistemi (pEPI-S/MAR) kullandık. Bu vektör, hücrelerin düşük kopya sayılarında (hücre başına ~1-2) bölünmesinde kromozom dışı olarak devam eder ve aşırı ekspresyon20,21 ile ilişkili istenmeyen işlevleri en aza indirmek için sürekli ancak ılımlı ekspresyona izin verir. Epizomun İskele/Matris Bağlanma Bölgesi (S/MAR) elemanı, nükleer matris ile etkileşime girerek, hücre bölünmesi sırasında epizomun hücre çekirdeğinde stabil bakımına katkıda bulunur22,23. Ayrıca pEPI vektör sistemi, viral entegrasyonla ilişkili riskleri ortadan kaldırır ve yapıların paketleme sınırlarını aşmadan teslim edilmesini sağlar.

Son çalışmalar, aktif histon modifikasyonları, özellikle H3K27 asetilasyonu (H3K27ac) ile işaretlenmiş promotör bölgelerinin, genellikle tasarlanmış DNA metilasyonuna dirençli olduğunu göstermiştir. Histon modifikasyonlarının yazıcılarını veya silgilerini kullanarak histon işaretlerini kaldıran veya ekleyen ve aynı anda DNMT3A yoluyla DNA metilasyonunu tanıtan kombinatoryal yaklaşımların, geçici yaklaşımlarda bile gen baskılanmasının stabilitesini ve kalıcılığını arttırdığı gösterilmiştir19,24. Bu içgörülere dayanarak, dCas9-HDAC1 ve dCas9-DNMT3A'nın birlikte verilmesinin ve komşu genetik alanların hedeflenmesinin kromatin yeniden şekillenmesini destekleyeceğini ve hedef düzenleyici elemanlarda daha verimli ve dayanıklı metilasyonu kolaylaştıracağını varsaydık.

Bu çalışmada, K562 hücrelerinde düşük endojen metilasyon ve anormal H3K27ac işaretleri ile karakterize bir bölge olan ZBTB7A'nın CpG adası 326'ya hedefli ve stabil DNA metilasyonu sağlayabilen bir sistem tasarlamayı ve inşa etmeyi amaçladık. Bu çalışmanın amacı, düşük ekspresyonlu, kararlı, bütünleştirici olmayan pEPI sistemini kullanarak ZBTB7A geninin yukarısındaki CpG açısından zengin düzenleyici bölgeyi hedefleyen, sgRNA'larla birlikte farklı epigenetik efektörlerin her birine kaynaşmış dCas9'u kodlayan iki epizomal yapı sunmaktı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, K562 hücrelerinin bu epizomlarla birlikte transfeksiyonu, düzenleme komplekslerinin, HDAC1'in DNMT3A tarafından müteakip DNA metilasyonunu kolaylaştırmak için lokal histon asetilasyonunu ortadan kaldırdığı ve koordineli ve bölgeye özgü epigenetik modifikasyonla sonuçlandığı ilgilenilen CpG adasına ikili olarak alınmasını sağlar.

Burada açıklanan sistem, yapı boyutu, güvenlik endişeleri veya maliyet sınırlamaları nedeniyle viral dağıtımın mümkün olmadığı uygulamalar için uygundur. Farklı sgRNA'ların ve efektör füzyonlarının modüler klonlanmasını destekleyerek onu bir dizi hedef lokusa uyarlanabilir hale getirir. Şu anda, plazmit transfeksiyonunu ve antibiyotik seçimini tolere eden hücre hatlarında in vitro veya klinik öncesi çalışmalar için en uygun olanıdır. Uygulamamızda, K562 hücrelerinde epizomal doğum, lipofektamin bazlı reaktifler kullanılarak sağlandı ve G-418 seçimi altında tutuldu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. sgRNA'ların tasarımı

  1. Bir genom tarayıcısı (örneğin, UCSC genom tarayıcısı) kullanarak ilgilenilen genin promotör bölgesi içindeki istenen CpG adasını veya düzenleyici CpG bölgelerini tanımlayın. Burada tasarım, ZBTB7A geninin CpG adası 326'ya (GRCh38) uygulandı.
  2. Çevrimiçi bir CRISPR sgRNA tasarım platformu [örneğin, CHOPCHOP web aracı (sürüm 3)] kullanarak tek kılavuzlu RNA'lar (sgRNA'lar) tasarlayın. sgRNA'ları tasarlarken, yüksek hedef içi aktivite ve minimum hedef dışı etki sağlamak için aşağıdaki önerileri izleyin:
    1. 3' ucundaki (PAM-3') protospacer bitişik motifi olarak 5'-NGG-3' kullanarak endonükleaz olarak SpCas9 proteinini seçin.
    2. sgRNA uzunluğunu 20 bp olarak seçin (PAM dizisinin yanı sıra). Protospacer dizisinde yalnızca üç uyumsuzluk olan hedef dışı eşleşmelere izin verin.
    3. Genin belirli bir bölgesini hedeflemeyi seçerken, 'Promotör' seçeneğini seçin ve sgRNA'ları düzenleyici bölge içinde konumlandırmak için yukarı akış aralığını (örneğin, CpG adası 326 için 1500 bp'den 3000 bp'ye kadar) tanımlayın.
    4. sgRNA aktivitesini değerlendirmek için Doench ve ark.25 tarafından geliştirilenler gibi hedefe yönelik verimlilik puanlarını kullanın.
  3. Deneysel kullanım için sgRNA'ları seçerken aşağıdaki kriterleri göz önünde bulundurun:
    1. Tüm aday sgRNA'ları hedef bölge için verimliliğe göre sıralayın. Tahmin edilen verimliliğin ilk %10-20'sindeki sgRNA'ları seçin. Seçim yaparken, potansiyel hedef dışı bölgelerde uyumsuzluklara (MM0, MM1, MM2, MM3) sahip sgRNA'lardan kaçının.
    2. dCas9-DNMT'leri kullanarak transkripsiyonel baskılama için orijinal olarak metillenmemiş veya zayıf metillenmiş alanları hedefleyen sgRNA'ları seçin. dCas9-HDAC'leri kullanarak transkripsiyonel baskılama için, artan verimlilik için yüksek oranda asetillenmiş bölgeleri hedefleyin. Hedef lokuslardaki K562 hücrelerinde DNA metilasyonunu ve histon asetilasyon işaretlerini doğrulamak için çevrimiçi veritabanlarını (örneğin, ChIP-Atlas) kullanın.
    3. 100-200 bp26'dan büyük hedef bölgeleri kapsamak için birden fazla sgRNA kullanın.
      NOT: Epigenetik modifikasyonlar (metilasyon ve deasetilasyon), sgRNA bağlanma bölgesinin yukarı ve aşağı akış bölgelerini etkiler ve bu etkiler kısa genomik açıklıklarla sınırlı olabilir.
    4. GC içeriği %40 ile %80 arasında olan sgRNA'ları seçin.
      NOT: Daha yüksek GC içeriği RNA stabilitesini ve dCas bağlanmasını iyileştirdiğinden, sgRNA'nın GC içeriği önemlidir.
    5. Dört veya daha fazla timidin (T) uzantısı içeren sgRNA'lardan kaçının ve PAM bölgesinin dört baz yukarısında bulunan adenin veya timin nükleotidlerine sahip sgRNA'ları seçin.
      NOT: Dört veya daha fazla T, transkripsiyonun erken sonlandırılmasına neden olabilir. PAM bölgesinin yukarısında dört baz bulunan A veya T'ye sahip sgRNA'lar, daha güçlü dCas bağlanması sergileyebilir.
    6. İkincil yapı oluşumu riskini en aza indirmek için yüksek kendi kendini tamamlayıcılığa sahip sgRNA'ları kontrol edin ve bunlardan kaçının.
    7. Birkaç sgRNA dizisinin seçimini sonlandırın.
      NOT: CpG adası 326 boyunca uzanan dört sgRNA tasarlanmıştır. CpG adası 326 boyunca sgRNA1-4 hedef dizileri ve hedef konumları Ek Tablo 1'de gösterilmektedir.
  4. Tercih edilen sgRNA dizisini (PAM üçlüsü hariç) ters tamamlayıcısına dönüştürün. İleri dizinin 5' ucuna GATCG ve 3' ucuna G, ters tamamlayıcı dizinin 5' ucuna AAAAC ve 3' ucuna C ekleyin. Ticari bir oligo sağlayıcısından her sgRNA için son iki oligoyu sipariş edin.

2. Klonlama

NOT: Bu bölüm, hem dCas-epigenetik efektör füzyonunu hem de sgRNA ekspresyon kasetlerini taşıyan epizomal vektörler üretmek için plazmit pEPI-1'in uyarlanmasını açıklar. Klonlama iş akışına ve vektör mimarisine kapsamlı bir genel bakış için Şekil 2'ye bakın. Aşağıda açıklanan tüm kısıtlama sindirimi ve ligasyon reaksiyonları, kullanılan her enzim ve reaktif için üreticinin tavsiye ettiği protokollere göre gerçekleştirilmiştir ve reaksiyon spesifikasyonları Ek Tablo 2'de ayrıntılı olarak listelenmiştir.

  1. eGFP (geliştirilmiş yeşil floresan proteini) kodlama dizisini çevreleyen AgeI ve BspEI kullanarak pEPI-1 plazmitini sindirin. Kısıtlama sindirimini takiben, DNA polimeraz I'in Klenow fragmanını kullanarak ortaya çıkan çıkıntıları köreltin. eGFP ile silinmiş vektörü oluşturmak için T4 DNA ligaz kullanarak künt uçlu plazmit omurgasını bağlayın.
    NOT: Genel vektör boyutunu azaltmak için eGFP geninin silinmesi gerçekleştirilir. Daha büyük bir vektör boyutu, aşağı akış klonlama ve transfeksiyon adımlarını sınırlayabilir.
  2. DNMT3A geninin katalitik alanı (CD) ve HDAC1 geninin tam uzunluğu için kodlama dizilerini elde edin. Her kodlama dizisinin 3' (aşağı akış) ucuna bir durdurma kodonu ekleyin. Dizileri çevreleyen BglII (5') ve AseI (3') kısıtlama bölgelerini ekleyin.
  3. eGFP ile silinmiş pEPI-1 vektörünü BglII ve AseI ile sindirin. Ayrı olarak, hazırlanan DNMT3A(CD) ve HDAC1 kodlama dizilerini aynı enzimlerle sindirin. İki bağımsız ligasyon reaksiyonu gerçekleştirin:
    1. pEPI-1-DNMT3A yapısını oluşturmak için DNMT3A(CD) fragmanını sindirilmiş vektöre bağlayın.
    2. pEPI-1-HDAC1 yapısını oluşturmak için HDAC1 fragmanını sindirilmiş vektöre bağlayın.
      NOT: BglII ve AseI siteleri, optimal ekspresyon için ekleri pCMV promotörünün aşağı akışına ve S/MAR elemanının yukarı akışına yerleştirir.
  4. Kimyasal olarak yetkin Escherichia coli'yi (örneğin, NEB 5-alfa Yetkin E. coli, Yüksek Verimlilik) her vektörden ayrı ayrı ligasyon ürünleriyle dönüştürün. Dönüştürülmüş hücreleri kanamisin (50 μg/mL) içeren LB agar üzerine yerleştirin ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Pozitif kolonileri seçin ve hızlı kaynayan miniprep yöntemini27,28 kullanarak plazmit DNA'yı izole edin.
  5. Katalitik olarak ölü SpCas9'u (dCas9) kodlayan diziyi elde edin. Aşağıdaki öğeleri belirtilen sırayla tanıtın:
    1. 5' sonunda: AscI kısıtlama bölgesi, Kozak konsensüs dizisi ve başlangıç kodonu (ATG).
    2. 3' sonunda: NLS, isteğe bağlı olarak bir HA etiketi, ardından bir BamHI kısıtlama sitesi.
  6. Hem pEPI-1-DNMT3A hem de pEPI-1-HDAC1 vektörlerini AscI ve BamHI ile sindirin. Aynı parçalamayı dCas9 ekinde de gerçekleştirin. dCas9 parçasını ilgili her vektöre bağlayın.
    NOT: AscI/BamHI siteleri, dCas9'un DNMT3A veya HDAC1'in yukarısına, pCMV promotörünün doğrudan aşağı akışına yerleştirilmesini sağlar. Doğru okuma çerçevesini korumak için dCas9 ile epigenetik efektör arasında kısa bir bağlayıcı veya birkaç nükleotid bulunduğundan emin olun.
  7. Nihai ligasyon ürünlerini, plazmit ekspresyonunun sıkı kontrolü ile yüksek verimli yetkin E. coli suşlarına dönüştürün (örneğin, NEB 5-alfa F'Iq Yetkin E. coli, Yüksek Verimlilik). Kanamisin plakalarındaki transformantları seçin. Hızlı kaynayan miniprep yöntemini kullanarak pozitif klonlardan yüksek kaliteli plazmit DNA hazırlayın.
  8. Tüm bileşenlerin doğru montajını onaylamak için nano gözenek dizilimi kullanarak son plazmit yapılarını (pEPI-1-dCas9-DNMT3A ve pEPI-1-dCas9-HDAC1) sıralayın, çevrimiçi bir çeviri aracı (örneğin, Expasy çeviri aracı 3.0) kullanarak okuma çerçevesini doğrulayın ve çevrimiçi bir hizalama aracı (örneğin, BLAST hizalama aracı) kullanarak potansiyel mutasyonları veya rekombinasyon olaylarını kontrol edin.
    NOT: Büyük vektörler rekombinasyona daha yatkındır ve mutasyonlar biriktirebilir. Bu nedenle, kapsamlı dizi doğrulaması önemlidir.
  9. T4 polinükleotid kinaz kullanarak hem ileri hem de geri sgRNA oligonükleotitlerinin 5' hidroksil gruplarını fosforile edin. İkincil yapıları denatüre etmek için karışımı birkaç dakika 90 °C'ye ısıtarak iki tamamlayıcı ipliği hibridize edin, ardından çift sarmallı DNA'ya tam tavlama için gece boyunca oda sıcaklığına kademeli olarak soğumaya bırakın.
  10. Seçilen pGuide sgRNA ekspresyon vektörünü BamHI ve Esp3I ile sindirin. Tavlanmış çift sarmallı sgRNA fragmanını, T4 DNA ligaz kullanarak doğrusallaştırılmış vektöre bağlayın.
  11. Spesifik PCR primerlerini kullanarak (Ek Tablo 3), (1) U6 promotörü, (2) Klonlanmış sgRNA dizisi ve (3) sgRNA iskelesini içeren tam gRNA ekspresyon kasetini çoğaltın. Aşağı akış klonlamaya uygun temiz, künt uçlu PCR ürünleri sağlamak için 3' çıkıntı (yani bir düzeltme polimerazı) oluşturmayan yüksek kaliteli bir DNA polimeraz kullanın.
  12. Bölüm 1'de tasarlanan her bir gRNA için 2.9-2.11 adımlarını tekrarlayın. Hedef özgüllüğünü korumak için her gRNA kasetinin ayrı ayrı hazırlandığından ve amplifiye edildiğinden emin olun.
  13. pEPI-1-dCas9-DNMT3A ve pEPI-1-dCas9-HDAC1 vektörlerini SacII ile sindirin. DNA polimeraz I'in Klenow fragmanını kullanarak yapışkan uçları köreltin. Önceden amplifiye edilmiş U6 promotör-sgRNA-iskele kasetlerini T4 ligaz kullanarak bu vektörlere klonlayın.
    NOT: Deneysel aşamada birkaç gRNA-epigenetik efektör kombinasyonu (örneğin, sgRNA1-dCas9-DNMT3A, sgRNA2-dCas9-HDAC1, vb.) oluşturulmuştur. Ancak, sonraki bölümlerde sunulan deneyler için yalnızca seçilen iki kombinasyon ileriye taşındı.
  14. Nihai ligasyon ürünlerini, plazmit ekspresyonunun sıkı kontrolü ile yüksek verimli yetkin E. coli suşlarına dönüştürün. Kanamisin plakalarındaki transformantları seçin. Hızlı kaynayan miniprep yöntemini kullanarak pozitif klonlardan yüksek kaliteli plazmit DNA hazırlayın.
  15. Nanopor dizilimi kullanarak son plazmit yapılarını sıralayın, okuma çerçevesini doğrulayın ve potansiyel mutasyonları veya rekombinasyon olaylarını kontrol edin.

3. Hücre kültürü ve transfeksiyon

  1. K562 hücrelerini T-75 kültür şişelerinde 37 °C'de,% 5CO2 ve nem koşulları altında tutun. %10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 1× Penisilin/Streptomisin solüsyonu (Pen/Strep) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) kullanın.
  2. Transfeksiyon için plazmitleri hazırlayın:
    1. Transfeksiyon başına 8 μg toplam plazmit DNA'sı, dolayısıyla iki plazmitin birlikte transfeksiyonu için her plazmitten 4 μg kullanın. 260 nm'de absorbans kullanarak DNA'yı ölçün ve ardından gerekli miktarı 90 μL ultra saf su ile seyreltin.
    2. Seyreltilmiş DNA'ya 10 μL 3 M Sodyum Asetat çözeltisi ve 2.5 hacim% 100 etanol ekleyin.
    3. İyice karıştırın ve DNA'yı çökeltmek için gece boyunca -20 °C'de inkübe edin.
      NOT: İki plazmidi farklı gRNA-epigenetik efektör kombinasyonları (örneğin, gRNA1-dCas9-DNMT3A ve gRNA2-dCas9-HDAC1) ile birlikte transfekte ederken, aşağı akış prosedürlerinin kullanımını basitleştirmek için her iki plazmidin de aynı çökeltme tüpünde birleştirilmesi önerilir.
    4. Ertesi gün, DNA çökeltme tüplerini 4 °C'de 15 dakika boyunca 11.000 × g'da santrifüjleyin.
      NOT: Sonraki tüm adımları steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin, çünkü bu aşama aynı zamanda canlı hücrelerin işlenmesini de içerecektir.
    5. Süpernatanı dikkatlice atın. Peleti yıkamak için 500 μL %70 etanol ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 11.000 × g'da santrifüjleyin.
    6. Etanol süpernatanını tamamen çıkarın. Görünür etanol kalmayana kadar peletin havayla kurumasını bekleyin.
    7. Kurutulmuş DNA peletini 50 μL DMEM içinde iyice yeniden süspanse edin. Plazmid-DMEM çözeltisini kullanana kadar 4 °C'de tutun.
    8. Transfeksiyondan önce DNA saflaştırmasının ve bütünlüğünün başarısını doğrulamak için hazırlanan epizomal DNA'nın 400 ng'sini (yaklaşık 2.5 μL yeniden süspanse edilmiş çözelti) %1'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın.
  3. Hücreleri hazırlayın:
    1. Transfeksiyon verimliliğini sağlamak için kültürler %50-60 birleşmeye ulaştığında K562 hücrelerini bir T-75 şişesinden hasat edin.
    2. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. 2 × 105 hücre içeren bir hacmi, FBS veya antibiyotik içermeyen 900 μL DMEM içeren 35 mm'lik bir kültür kabına aktarın.
      NOT: Transfeksiyon prosedüründeki tüm adımlar için serumsuz DMEM kullanın. Tam orta kültür koşullarına ancak transfeksiyon inkübasyon süresi tamamlandıktan sonra devam edin.
    3. Hücreleri transfeksiyona hazır tutmak için kabı inkübatöre (37 °C,% 5 CO2) yerleştirin.
  4. Plazmit iletimi için Lipofectamine bazlı bir transfeksiyon kiti kullanın. Kullanılan özel kit için üreticinin talimatlarını izleyin ve gerekirse ses seviyelerini ayarlayın.
    1. Hazırlanan plazmit-DMEM çözeltisine 3 μL P3000 Reaktifi (transfeksiyon kitinde verilir) ekleyin. Yavaşça karıştırın ve plazmit-P3000 reaktif karışımını oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    2. Toplam 100 μL reaksiyon hacmine ulaşmak için yeterli DMEM ile birlikte 5 μL Lipofectamine 3000 Reaktifi (transfeksiyon kitinde verilir) ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
    3. Tam 100 μL transfeksiyon karışımını hücre içeren 35 mm'lik kaba ekleyin. Karışımı dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın, ardından kabı inkübatöre geri koyun.
  5. Transfeksiyondan 24 saat sonra, transfekte edilmiş hücrelerin proliferasyonunu başlatmak için her 35 mm'lik kaba 3 mL tam ortam (%10 FBS ve 1× Pen/Streprep ile desteklenmiş DMEM) ekleyin. Transfeksiyondan 72 saat sonra, 1 mg/mL'lik nihai konsantrasyona G-418 antibiyotiği ekleyerek seçim prosedürüne başlayın.
  6. Seçim yeterince oluşturulduktan ve toplam hücre sayısı 1 × 106'yı aştıktan sonra, floresanla aktive olan hücre sıralamasını (FACS) kullanarak tek klonları izole etmeye devam edin (Şekil 3A):
    1. Hücreleri 25 °C'de 6 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleme ile hasat edin. 1× steril fosfat tamponlu salin (PBS, pH ~7.4) ile bir kez yıkayın ve aynı koşullar altında tekrar santrifüjleyin.
    2. Hücre peletini 1× PBS'de yeniden süspanse edin ve bir hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin. Süspansiyonu 1 × 106 hücre/mL'ye seyrelterek tam bir yeniden süspansiyon sağlayın.
    3. Toplama cihazı olarak 96 oyuklu doku kültürü ile işlenmiş bir plaka kullanarak FCS'yi tek hücre moduna kadar kısaltın (damlacık başına 1 hücre sağlar). Kullanılan cihaza bağlı olarak gerekirse yazılım ayarlarını yapın (Şekil 3B).
    4. Birincil popülasyonu beklenen boyuta (FSC) ve ayrıntı düzeyine (SSC) göre geçitleyin. Kalıntıları (düşük FSC/SSC) ve yüksek oranda tanecikli veya ölü malzemeyi (yüksek SSC) hariç tutun. Singlet'ları geçmek için FSC-A ile FSC-H veya SSC-A ile SSC-H nokta grafiklerini kullanın.
    5. 96 oyuklu plakayı, kuyucuk başına 1 mg / mL G-418 içeren 100 μL tam ortamla önceden doldurun. Ayırmadan önce plakayı inkübatörde ısıtın.
    6. Sıralama doğruluğunu artırmak için sıralama hızını saniyede 300 olayın altında tutarak sıralamayı tek hücre modunda gerçekleştirin.
    7. Ayırmadan sonra, kuyucuk başına bir hücreyi doğrulamak için kuyucukları mikroskop altında inceleyin. Plakayı %5CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
  7. Tek hücreli klonların 96 oyuklu plakada ayrı ayrı genişlemesine izin verin. Klonal büyüme sağlandıktan sonra, seçimi sürdürmek için G-418 konsantrasyonunu 400 μg/mL'ye düşürün.
  8. İyi büyüyen klonları sırayla 12 oyuklu plakalara, ardından T-25'e ve son olarak T-75 şişelerine, her klon ~1 × 106 hücreye ulaşana kadar aktarın.
  9. Düzenli aralıklarla çift hücreli peletleri toplayın. Genomik DNA ekstraksiyonu için bir peleti -20 °C'de saklayın. Ek olarak, RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezi için -20 °C'de 500 μL Trizol Reaktifi içinde homojenize edilmiş bir peleti saklayın.
    DİKKAT: Trizol Reaktifi, toksisitesi ve aşındırıcı yapısı nedeniyle kişisel koruyucu ekipman giyilirken kimyasal çeker ocakta dikkatli kullanılmalı ve kontamine malzemeler tehlikeli atık bertarafı için etiketlenmelidir.
  10. Geleneksel fenol-kloroform ekstraksiyonu ve ardından etanol çökeltme kullanarak seçilen klonlardan genomik DNA'yı çıkarın.
    DİKKAT: Fenol:kloroform toksik ve aşındırıcıdır ve kişisel koruyucu ekipman giyilirken kimyasal çeker ocakta kullanılmalıdır. Fenol ve kloroform içeren atıkları tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edin.
  11. DNA'nın nükleaz içermeyen su veya TE tamponu içinde tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olun. Sonraki uygulamalara geçmeden önce bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ve saflığını ölçün.
    NOT: Bu DNA, epigenetik düzenleme verimliliğini değerlendirmek için PCR ve Pyrosequencing gibi aşağı akış deneylerinde kullanılacaktır.
  12. Trizol Reaktifi kullanarak hücre peletlerinden toplam RNA'yı ekstrakte edin, ardından izopropanol çökeltme29. RNaz içermeyen reaktifler ve tek kullanımlık malzemeler sağlayarak ve prosedür sırasında numuneleri 4 °C'de tutarak RNA numunelerini dikkatli bir şekilde kullanın.
    NOT: Toplam RNA, bir ters transkripsiyon kiti kullanılarak cDNA sentezi için kullanılacaktır.

4. Klonlarda her iki epizomun varlığını doğrulamak için PCR

  1. Hücreleri iyice yeniden süspanse ettikten sonra her kültür klonundan yaklaşık 5 × 105 hücre toplayın. 25 °C'de 3 dakika boyunca 7.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatan ortamı atın.
  2. Hücreyi 1× PBS'de yeniden süspanse ederek yıkayın. Aynı koşullar altında tekrar santrifüjleyin.
  3. Pelet seviyesinin hemen üzerinde küçük bir hacim bırakarak süpernatanı atın. PCR için şablon olarak 1 μL hücre süspansiyonu kullanın.
  4. Alternatif olarak, transfekte edilmiş klonlardan ekstrakte edilen 200 ng saflaştırılmış genomik DNA kullanın.
    NOT: Yıkanmış hücrelerden doğrudan PCR, hızlı bir tarama yöntemi sağlar ancak değişken sonuçlar verebilir. Daha yüksek özgüllük ve duyarlılık için şablon olarak saflaştırılmış genomik DNA kullanın.
  5. PCR ana karışımını Tablo 1'e göre hazırlayın.
  6. dCas9 dizisini hedefleyen ortak bir ileri primer ve her epigenetik efektör vektöre özgü ayrı ters primerler ile iki set primer kullanın (Ek Tablo 3).
  7. Tablo 2'de sunulan bisiklet koşullarını takip edin.
  8. PCR ürünlerini agaroz jel üzerinde çalıştırın veya ürün boyutlarını doğrulamak için kılcal elektroforez ile analiz edin: DNMT3A içeren vektör için 230 bp ve HDAC1 içeren vektör için 205 bp (Şekil 3C). Beklenen bant boyutlarını doğrulamak ve PCR verimliliğini doğrulamak için pozitif bir kontrol (her iki plazmitin 10-20 ng konsantrasyonda karışımı) ekleyin. Şablon kontrolü yok (NTC) ekleyin.
ReaktifNihai konsantrasyon/miktar
10× Tampon1×
İleri astar1 μΜ
Ters primerler0,5 μM
DNA200 ng
Polimeraz1.25 U
dNTP'lerHer biri 200 μM
Su, nükleaz içermez50 μL'ye kadar

Tablo 1: Epizom doğrulaması için PCR reaksiyon karışımı.

AdımSıcaklık, °CSaatDöngü sayısı
İlk denatürasyon953 dakika1
Denatürasyon9530 sn.30
Tavlama5830 sn.
Uzantı721 dakika
Son Uzatma725 dk1

Tablo 2: Epizom doğrulaması için PCR döngü koşulları.

5. Hedeflenen pirosekanslama analizi

  1. Transfekte klonlardan ekstrakte edilen gDNA'yı (1.5 μg), üreticinin talimatlarına göre bir bisülfit dönüştürme kiti ile işleyin.
  2. Yapılar tarafından hedeflenen düzenleyici bölge içindeki CpG sitelerini çevreleyen tasarım primerleri. Özel bir bisülfit astar tasarım aracı kullanın. Şu tasarım yönergelerini izleyin:
    1. CpG adasını veya CpG sitesi düzenleme bölgesini bisülfit dönüştürülmüş sürüme dönüştürün.
    2. Bisülfitle dönüştürülmüş DNA'nın PCR amplifikasyonu için bir ileri ve geri primer tasarlayın. Streptavidin kaplı boncuklar üzerinde immobilizasyon için bir astar üzerine (genellikle tersi) bir biyotin etiketi ekleyin.
    3. İlgilenilen ilk CpG'nin yukarısında, PCR ürününün içinde bir dizileme primeri (18-25 bp) tasarlayın. Hedef bölge olarak, potansiyel lokal epigenetik modifikasyonları değerlendirmek için sgRNA bağlanma bölgesinin yukarı veya aşağı akışında 100 bp'lik bir pencere seçin.
    4. Tarafsız amplifikasyon sağlamak için primer dizileri içindeki CpG bölgelerinden kaçının.
    5. Assay Design yazılım puanı %75'in üzerinde olan ve yazılım analizinin herhangi bir sorun veya endişe tespit etmediğini gösteren 'yüksek' (mavi) kalite derecesine sahip bir primer çifti seçin.
      NOT: CpG adası 326'yı hedeflemek üzere tasarlanmış primer dizileri için Ek Tablo 3'e bakın. Primerler, sgRNA1 ve sgRNA2 bağlanma bölgelerini çevreleyen bölgelere bağlanacak ve hedeflenen lokusları çevreleyen CpG bölgelerinin dizilenmesine izin verecek şekilde tasarlanmıştır.
  3. Bisülfit şablonları için optimize edilmiş, yüksek kaliteli bir sıcak başlangıçlı DNA polimeraz kullanarak bir PCR reaksiyonu kurun.
  4. Pyrosequencing prosedürü:
    1. Biyotinlenmiş PCR ürünlerini streptavidin kaplı sefaroz boncuklara bağlayın ve bir pirosekanslama iş istasyonu kullanarak tek sarmallı DNA'yı izole edin.
    2. Dizileme primerini tavlama tamponundaki tek sarmallı DNA'ya ekleyin. Karışımı 2 dakika boyunca 80 derecede ısıtın, ardından yavaş yavaş oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
    3. Pyrosequencing cihazını ve primer tasarımı sırasında tanımlanan dağıtım sırasını kullanarak sıralama reaksiyonlarını gerçekleştirin.
  5. Veri analizi:
    1. Her CpG bölgesindeki metilasyon yüzdesini ölçmek için özel pirosekanslama yazılımı kullanın.
    2. Transfekte edilmiş ve transfekte edilmemiş klonlar arasındaki metilasyon seviyelerini karşılaştırın. Düzenleme verimliliğini değerlendirin (Şekil 3D). Tedavi edilmemiş kontroller ile her bir CpG bölgesindeki her bir transfekte edilmiş klon arasındaki metilasyon seviyelerini karşılaştırmak için iki kuyruklu eşleştirilmemiş bir t-testi yapmayı düşünün.

6. dCas ekspresyonunun analizi için cDNA sentezi ve dijital PCR

  1. 12 μL RNaz içermeyen su içinde transfekte edilmiş klonlardan ekstrakte edilen toplam RNA'yı (reaksiyon başına 1.100 ng) hazırlayın. Numuneleri buz üzerinde tutun.
  2. Genomik DNA eliminasyon karışımını buz üzerinde birleştirin: 2 μL gDNA silme tamponunu, 1.100 ng toplam RNA içeren RNA örneğini ve RNaz içermeyen suyu 14 μL'lik bir nihai hacme kadar karıştırın. 42 °C'de 2 dakika inkübe edin, ardından buz üzerine koyun.
  3. Ters transkripsiyon ana karışımını buz üzerinde hazırlayın: 4 μL RT Tamponunu 1 μL RT primeri ile karıştırın ve 1 μL ters transkriptaz ekleyin.
  4. 14 μL genomik DNA eliminasyon karışımını 6 μL ters transkripsiyon ana karışımı ile toplam 20 μL reaksiyon hacmine birleştirin. Yavaşça karıştırın ve 42 °C'de 15 dakika inkübe edin. Ters transkriptazı 95 °C'de 3 dakika ısıtarak inaktive edin.
    NOT: cDNA'yı daha fazla kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
  5. Tüm numunelerden cDNA'yı nükleaz içermeyen suyla 1:1 oranında seyreltin. dCas'a özgü primerlere sahip bir dijital PCR sistemi kullanarak, aşağı akış dijital PCR analizi için seyreltilmiş cDNA'yı kullanın (Ek Tablo 3):
    1. 4× Ana karışımı ve Reaksiyon karışımını Tablo 3'e göre hazırlayın. Karışıma seyreltilmiş cDNA ekleyin ve iyice karışmasını sağlamak için hafifçe pipetleyin.
      NOT: Tüm klonlar için reaksiyonları en azından kopyalar halinde ayarlayın. Negatif bir kontrol (işlenmemiş K562 hücrelerinden alınan cDNA) ve bir NTC ekleyin.
    2. PCR plakasının her bir oyuğuna 9 μL Reaksiyon karışımı yükleyin. Tablo 4'te sunulan döngü koşullarını kullanarak PCR sistemini kurun.
    3. Algılama için FAM boya kanalını seçin ve çalıştırmayı başlatın.
    4. Tamamlandıktan sonra örnekleri alın ve verileri analiz edin.
      NOT: Dijital PCR, sonuçları μL reaksiyon başına kopya olarak bildirir.
    5. Reaksiyon başına toplam kopya elde etmek için rapor edilen değeri (kopya/μL) reaksiyon hacmiyle (10 μL) çarpın. Ng cDNA başına kopyalar elde etmek için bu değeri reaksiyondaki cDNA miktarına bölün (ng RNA girişine eşdeğer).
      NOT: Kesin protokol izlenirse, her numune 20 μL RT reaksiyonunda (55 ng / μL) 1.100 ng RNA ile başlar. 1:1 seyreltmeden sonra çalışma konsantrasyonu 27,5 ng/μL'dir ve her PCR reaksiyonuna 1 μL eklendiğinden bu, reaksiyon başına 27,5 ng cDNA'ya (RNA eşdeğeri) karşılık gelir.
Ana karışım (4×)
ReaktifNihai konsantrasyon/miktar
25× SYBR Yeşil boya2×
5× Dijital PCR karışımı4×
Su, nükleaz içermez100 μL'ye kadar
Reaksiyon karışımı
ReaktifNihai konsantrasyon/miktar
4× Ana karışım1×
İleri astar1 μΜ
Ters astar1 μΜ
cDNA (seyreltilmiş)1 μL
Su, nükleaz içermez10 μL'ye kadar

Tablo 3: 4× dCas ekspresyonunun dijital PCR analizi için ana karışım ve reaksiyon karışımı.

AdımSıcaklık, °CSaatDöngü sayısı
İlk denatürasyon9610 dakika1
Denatürasyon965 sn.40
Tavlama/Uzatma6015 sn.

Tablo 4: Dijital PCR için döngü koşulları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hedeflenen epigenetik düzenleme araçlarımızın ZBTB7A CpG adası 326'da bölgeye özgü DNA metilasyon değişikliklerini indükleyip indükleyemeyeceğini araştırmak için, önce CpG adası 326 içindeki hedef bölgelerle tasarlanmış çeşitli sgRNA'larla birlikte DNMT3A(CD) veya HDAC1'e kaynaşmış dCas9'u kodlayan epizomal vektörler ürettik. Başlangıçta sgRNA ve efektör modüllerin eşzamanlı verilmesinin tekrarlanabilir epigenetik modifikasyonlara yol açıp açmayacağını değerlendirmek için K562 h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokoldeki en kritik adımlardan biri, oldukça spesifik sgRNA'ların tasarımıdır. Hedef dışı etkiler, genellikle dCas9 bağlanma sadakatsizliğinden ve efektör alanların spesifik olmayan aktivitesinden kaynaklanabilen CRISPR tabanlı epigenetik düzenleme sistemlerinin bilinen bir sınırlamasıdır. Bunu en aza indirmek için, sgRNA'lar, yüksek hedef içi aktivite ve minimum hedef dışı bağlanma30 için optimize eden biyoinformatik araçlar kullanılarak tasarlanmalıdır. Ta...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden finansal veya finansal olmayan çıkarlar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Irene Dereki ve Vasiliki Chondrou, Yunanistan Açık Üniversitesi Araştırma Fonları Özel Hesabı'ndan (ELKE) üç yıllık bir burs (Hibe No. 80706) ile desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Absolute Q DNA Dijital PCR Master Mix (5x)Uygulamalı BiyosistemlerA52490
AgeI-HF NEBR3552
AscINEBR0558
AseINEBR0526
BamHI-HFNEBR3136
BD FACS Melody Cell SorterBD
BglllNEBR0144
BspEINEBR0540
Deoksinükleotid (dNTP) Çözelti Karışımı (her biri 10 mM)NEBN0447
DMEM Yüksek Glikoz, stabil Glutamin ve Sodyum Piruvat ortamı ileBiowestL0103
DNA Polimeraz I, Büyük (Klenow) ParçaNEBM0210
DNMT3A (CD), HDAC1 dizileriIDT
DreamTaq DNA Polimeraz Termo BilimselEP0712
EpiTectQiagen59104Bisülfit dönüşüm kiti 
Epitect Bisülfit KitiQiagen59104
Esp3INEBR0734
Fetal Sığır SerumuGibcoA5256701
Geneticin seçici antibiyotik (G418 sülfat)Gibco11811031
Lipofektamin 3000 transfeksiyon kitiInvitrogenL3000015
NEB®   5-alfa Yetkin E. coli  (Yüksek Verimlilik)NEBC2987I
NEB®   5-alfa F'Iq  Yetkin E. coli  (Yüksek Verimlilik)NEBC2992H
Nukleospin Dokusu Macherey-Nagel740952.50
PBS, 10x çözelti pH 7.4LonzaBE17-517Q
Penisillin-Streptomisin çözeltisi 100xBiowestL0022
pGuide vektörüOriGene TeknolojileriGE100042
Fenol:Kloroform:İzoamil Alkol 25:24:1 10 mM Tris ile doymuş, pH 8.0, 1 mM EDTASigma-AldrichP2069
Primerler, sgRNA'lar Eurofins
PyroMark Assay Tasarımı QiagenSürüm 2.0Bisülfit primer tasarım aracı 
PyroMark Gold Q24 ReaktifleriQiagen970802
PyroMark PCR kiti Qiagen978703
PyroMark Q24 MDxQiagenPyrosequencing çalışma istasyonu 
PyroMark Q24 Yazılım Qiagenv2.0.8Pyrosequencing yazılımı 
S5® Yüksek Isabetli DNA PolimerazNEBM0491
QuantiTect Reverse Transkripsiyon KitiQiagen205311
QuantStudio Absolute Q MAP16 Plaka KitiUygulamalı BiyosistemlerA52865Dijital PCR sistemi 
SYBR Green I Nukleik Asit Jel Boyama, DMSO'da 10.000x konsantreInvitrogenS7563
T4 DNA LigazıNEBM0202
T4 Polinükleotid KinazNEBM0201
TRIzol ReaktifiInvitrogen15596026

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Firdaus, Z., Li, X. Epigenetic explorations of neurological disorders, the identification methods, and therapeutic avenues. Int J Mol Sci. 25 (21), 11658(2024).
  2. Yu, X., et al. Cancer epigenetics: from laboratory studies and clinical trials to precision medicine. Cell Death Discov. 10 (1), 1-12 (2024).
  3. Wang, S. E., Jiang, Y. -H. Novel epigenetic molecular therapies for imprinting disorders. Mol Psychiatry. 28 (8), 3182-3193 (2023).
  4. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  5. Ptak, C., Petronis, A. Epigenetics and complex disease: from etiology to new therapeutics. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 48 (1), 257-276 (2008).
  6. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Res. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  7. Sapozhnikov, D. M., Szyf, M. Unraveling the functional role of DNA demethylation at specific promoters by targeted steric blockage of DNA methyltransferase with CRISPR/dCas9. Nat Commun. 12 (1), 5711(2021).
  8. Kwon, D. Y., Zhao, Y. -T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nat Commun. 8 (1), 15315(2017).
  9. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5615-5628 (2016).
  10. Giehrl-Schwab, J., et al. Parkinson's disease motor symptoms rescue by CRISPRa-reprogramming astrocytes into GABAergic neurons. EMBO Mol Med. 14 (5), e14797(2022).
  11. Moreno, A. M., et al. In situ gene therapy via AAV-CRISPR-Cas9-mediated targeted gene regulation. Mol Ther. 28 (8), 1931(2020).
  12. Sokka, J., et al. CRISPR activation enables high-fidelity reprogramming into human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 17 (2), 413-426 (2022).
  13. Galonska, C., et al. Genome-wide tracking of dCas9-methyltransferase footprints. Nat Commun. 9 (1), 1-9 (2018).
  14. Lin, L., et al. Genome-wide determination of on-target and off-target characteristics for RNA-guided DNA methylation by dCas9 methyltransferases. GigaScience. 7 (3), 1-19 (2018).
  15. Kennedy, M. E., Cullen, R. B. Bacterial CRISPR/Cas DNA endonucleases: a revolutionary technology that could dramatically impact viral research and treatment. Virology. 479 - 480, 213-220 (2015).
  16. Rothe, M., Modlich, U., Schambach, A. Biosafety challenges for use of lentiviral vectors in gene therapy. Curr Gene Ther. 13 (6), 453-468 (2013).
  17. Cappelluti, M. A., et al. Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing. Nature. 627 (8003), 416-423 (2024).
  18. Hanzawa, N., et al. Targeted DNA demethylation of the Fgf21 promoter by CRISPR/dCas9-mediated epigenome editing. Sci Rep. 10 (1), 1-14 (2020).
  19. O'Geen, H., Tomkova, M., Combs, J. A., Tilley, E. K., Segal, D. J. Determinants of heritable gene silencing for KRAB-dCas9 + DNMT3 and Ezh2-dCas9 + DNMT3 hit-and-run epigenome editing. Nucleic Acids Res. 50 (6), 3239-3253 (2022).
  20. Sgourou, A., Routledge, S., Spathas, D., Athanassiadou, A., Antoniou, M. N. Physiological levels of HBB transgene expression from S/MAR element-based replicating episomal vectors. J Biotechnol. 143 (2), 85-94 (2009).
  21. Lazaris, V. M., et al. Non-viral episomal vector mediates efficient gene transfer of the β-globin gene into K562 and human haematopoietic progenitor cells. Genes. 14 (9), 1774(2023).
  22. Mulia, G. E., Picanço-Castro, V., Stavrou, E. F., Athanassiadou, A., Figueiredo, M. L. Advances in the development and the applications of nonviral, episomal vectors for gene therapy. Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1076-1095 (2021).
  23. Piechaczek, C., Fetzer, C., Baiker, A., Bode, J., Lipps, H. J. A vector based on the SV40 origin of replication and chromosomal S/MARs replicates episomally in CHO cells. Nucleic Acids Res. 27 (2), 426-428 (1999).
  24. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503-2519.e17 (2021).
  25. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  26. Brezgin, S., Kostyusheva, A., Kostyushev, D., Chulanov, V. Dead Cas systems: types, principles, and applications. Int J Mol Sci. 20 (23), 6041(2019).
  27. Holmes, D. S., Quigley, M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. Anal Biochem. 114 (1), 193-197 (1981).
  28. Harwood, A. J. The rapid boiling method for small-scale preparation of plasmid DNA. Methods Mol Biol. 58, 265-367 (1996).
  29. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), (2010).
  30. Labuhn, M., et al. Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications. Nucleic Acids Res. 46 (3), 1375-1385 (2018).
  31. Hofacker, D., et al. Engineering of effector domains for targeted DNA methylation with reduced off-target effects. Int J Mol Sci. 21 (2), 502(2020).
  32. Yang, Q., et al. EpiCas-DL: predicting sgRNA activity for CRISPR-mediated epigenome editing by deep learning. Comput Struct Biotechnol J. 21, 202-211 (2023).
  33. Mu, W., et al. Machine learning methods for predicting guide RNA effects in CRISPR epigenome editing experiments. bioRxiv. , (2024).
  34. Batra, S. S., et al. Predicting the effect of CRISPR-Cas9-based epigenome editing. bioRxiv. , (2025).
  35. Stavrou, E. F., et al. Episomal vectors based on S/MAR and the β-globin replicator, encoding a synthetic transcriptional activator, mediate efficient γ-globin activation in haematopoietic cells. Sci Rep. 9 (1), 19765(2019).
  36. Stavrou, E. F., et al. The β-globin replicator greatly enhances the potential of S/MAR based episomal vectors for gene transfer into human haematopoietic progenitor cells. Sci Rep. 7 (1), 40673(2017).
  37. Hagedorn, C., Antoniou, M. N., Lipps, H. J. Genomic cis-acting sequences improve expression and establishment of a nonviral vector. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (8), e118(2013).
  38. Stehle, I. M., Rupprecht, S., Cremer, T., Jackson, D. A., Lipps, H. J. Establishment and mitotic stability of an extra-chromosomal mammalian replicon. BMC Cell Biol. 8, 33(2007).
  39. Lufino, M. M. P., Manservigi, R., Wade-Martins, R. An S/MAR-based infectious episomal genomic DNA expression vector provides long-term regulated functional complementation of LDLR deficiency. Nucleic Acids Res. 35 (15), e98(2007).
  40. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  41. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).
  42. Ewaisha, R., Anderson, K. S. Immunogenicity of CRISPR therapeutics-critical considerations for clinical translation. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1138596(2023).
  43. Raghavan, R., et al. Rational engineering of minimally immunogenic nucleases for gene therapy. Nat Commun. 16 (1), 105(2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

dCas9 HDAC1Episomal Vekt rlerHedefli MetilasyonCRISPR Epigeneti iAk SitometrisiGen D zenlemesi

İlgili makaleler