Yöntem makalesi

Arabidopsis'te tek hücreli analizler için dokuya özgü yüksek kaliteli protoplast izolasyonu

DOI:

10.3791/69330

⸱

6 Şubat 2026

 ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Arabidopsis thaliana'nın kök, yaprak, gövde ve çiçek dokuları için geliştirilmiş bir protoplast izolasyon protokolünü sunmaktadır. Hücresel hasarı ve kalıntıyı en aza indirmek için optimize edilmiş enzim sindirimi ve arındırma adımlarını kullanır; böylece verimi artırır ve tek hücreli RNA dizileme gibi tek hücreli yöntemler için yüksek kaliteli protoplastlar elde eder.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücreli RNA dizileme (scRNAseq), bitki biyolojisinde hücre tipine özgü gen ifadesi, gelişimsel dinamikler ve çevresel faktörlere dokuya özgü yanıtlar hakkında yüksek çözünürlüklü bilgi elde etmek için temel bir araç haline gelmiştir. scRNAseq'in bitkilere uygulanmasında önemli teknik zorluklardan biri, bitki dokularının heterojenliğini temsil eden hücre duvarları olmayan, canlı tek hücrelerin verimli ve tekrarlanabilir izolasyonudur. Protoplast izolasyonu, hücre duvarını enzimatik olarak çıkararak tek, canlı bitki hücreleri elde eden bu amaçla yaygın olarak kullanılan bir yaklaşımdır. Ancak, başarılı protoplast izolasyonu, hücre yaşamlılığını korumak ve hücre tipine özgü transkriptom profillerini korumak için dikkatli optimizasyon gerektirir. Burada, yer üstü (yapraklar, saplar, çiçekler) ve kök dokuları dahil olmak üzere birden fazla Arabidopsis thaliana dokusundan yüksek kaliteli protoplastların izole edilmesi için sağlam ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, doku tiplerinin benzersiz fizyolojik özelliklerini dikkate alır, enzimatik sindirim koşullarını ve arındırma adımlarını optimize ederek yüksek verim ve çeşitli hücre tiplerinin geniş temsilini sağlar. Ortaya çıkan protoplastlar, scRNAseq, akış sitometrisi (FACS) ve geçici gen ifade analizi gibi uygulamalar için uygundur. Bu yöntem, birden fazla doku tipinden tek hücreli süspansiyonların üretilmesine olanak tanır. Sunulan yöntem, hücresel heterojenliğin araştırılmasını destekler ve bitki araştırmalarında tek hücreli yaklaşımların güvenilirliğini artırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücreli RNA dizileme (scRNAseq), bitki biyolojisinde gen ifadesinin eşi benzeri görülmemiş bir çözünürlükte analiz edilmesini mümkün kılarak devrim niteliğinde değiştirmiştir. scRNAseq, hücre tipine özgüçözünürlük 1,2,3'te hücresel heterojenlik, gelişimsel yörüngeler ve çevresel uyaranlara yanıtlar hakkında transkriptom bilgisi sağlar.

Hayvan sistemlerinden farklı olarak, katı bitki hücre duvarı ve bitki dokularının yapısal karmaşıklığı, transkriptomik analiz için tek hücrelerin verimli izolasyonuna önemli engeller oluşturur. Mevcut yöntemler arasında, protoplastlar üretmek için hücre duvarının enzimatik olarak çıkarılması, yaygın olarak kullanılan bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır ve bu yöntem 60 yıldan fazla bir süre önce geliştirilmiştir (4,5,6). Yaygın kullanımına rağmen, protoplast izolasyonu teknik olarak zorlayıcı bir prosedür olmaya devam ediyor ve hücre verimini, canlılığı ve stabil bir transkriptomu dengelemek için dokuya özgü optimizasyon gerektiriyor. Tek çekirdekli RNA dizileme (snRNA-seq) gibi alternatif yöntemler, çekirdek7'yi izole ederek hücre duvarı sindirimi ihtiyacını ortadan kaldırır. Ancak bu, sitoplazmada bulunan olgun transkriptler hakkında bilgi kaybı pahasına gelir. Mekanik ve lazer destekli mikrodiseksiyon gibi diğer fiziksel ayrıştırma yöntemleri enzimatik hücre duvarı sindirimini önler, ancak çapraz kontaminasyona karşı genellikle hassastır ve hücre yaşamalılığını azaltabilir ve sınırlı veriverimliliğine yol açabilir 8,9,10.

Son yıllarda, özellikle Arabidopsis için, birçok bitki hücresi atlası geliştirilmiştir; bu atlaslar çeşitli dokuların transkriptomik manzaralarınadair önemli bilgiler sağlar 2,11,12,13,14,15,16,17,18 . Ancak bu atlaslar esas olarak genç veya fide evresindeki bitkilere dayanır ve ağırlıklı olarak kök veya yaprak dokularına odaklanır. Bu çalışmalarda kullanılan protokoller, olgun yapraklar, çiçekler ve saplar gibi eski Arabidopsis dokuları için optimizasyon süreçleri gerektirir. Ayrıca, scRNAseq veya Floresans-Aktiflenmiş Hücre Sıralaması (FACS) gibi hücre tipine özgü dizileme çalışmaları RNA dizileme ile birleştirilene kadar, protoplast izolasyonunun neden olduğu transkriptom değişiklikleri tam olarak hesabakatılmamıştı 19.

Burada sunulan yöntem, önceki çalışmalara dayanarak birkaç kritik iyileştirme getirir: hem kök hem de yer üstü dokular (yapraklar, saplar, çiçekler) için tampon konsantrasyonlarını optimize ederek bitki dokularındaki fizyolojik ve anatomik değişkenliği hesaba katır ve hücresel hasarı en aza indirmek ve protoplastların saflığını artırmak için nazik arıtma adımları içerir. Çekirdek tabanlı yaklaşımlara kıyasla, bu yöntem tüm hücre transkriptomunu koruma potansiyeline sahiptir ve sitosolde bulunan olgun mRNA moleküllerinin daha yüksek çözünürlüklü bilgisini sağlar. Önemli olarak, bu prosedür dokular arasında yüksek protoplast canlılığı, heterojenliği ve tekrarlanabilir konsantrasyonlar sağlar; çiçeklerde yaklaşık 9,8 ×10 3 hücre/mg'den yapraklarda 2,2 ×10 2 hücre/mg arasında değişir.

Sunulan yöntemin genel amacı, Arabidopsis thaliana'nın birden fazla dokusu için uyarlanmış, bitkisel tek hücreli çalışmalar için çeşitli hücre tiplerini kapsayan yüksek kaliteli girdi ihtiyacını ele alan sağlam ve tekrarlanabilir bir protoplast izolasyon protokolü sunmaktır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma için kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Tampon hazırlığı

  1. Tablo 1'e göre ilgili protoplast izolasyontamponu 17,18'i 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde hazırlayın; Kök dokusu için kök protoplast izolasyon tamponu veya yer üstü dokular için çiçek/sap/yaprak protoplast izolasyon tamponu kullanılır.
    NOT: Beş hasat edilen Arabidopsis thaliana çiçekli bitkisi için (kapalı çiçek tomurcukları olan 11-12. aşama) için yaklaşık protoplast izolasyon tamponu miktarı: Kök (~ 375 mg): 7 mL, Yaprak (~930 mg): 5 mL, Sap (~215 mg): 3 mL, Çiçek (~10 mg): 2 mL.
  2. Kök/yaprak protoplast izolasyon tamponu kullanmadan önce %2 (v/v) Selülaz RS ve %1 (v/v boyunca) Macerozyme R10 taze ekleyin. Protoplast izolasyon tamponunu rotatora koyarak toz tamamen çözünene kadar iyice karıştırın (yaklaşık 10 dakika boyunca 25 °C). Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının ve tamponun içinde toz kümeleri kalmadığından emin olun.

2. Doku sindirimi

  1. Kullanmadan önce ilgili protoplast izolasyon tamponunu 0.2 μm filtreyle filtreleyin. Yapraklar ve kökler için standart boyutlu bir Petri kabı (100 mm x 15 mm), çiçekler gibi küçük dokular için ise küçük boyutlu bir Petri kabı (30 mm x 15 mm) kullanın. Dokuları aktarmadan önce petri kabına birkaç damla protoplast izolasyon tamponu ekleyin.
  2. İlgili dokuyu petri kabına aktarın ve jilet bıçağıyla dikey darbelerle mümkün olduğunca ince ve hızlı şekilde küçük parçalara doğrayın (Şekil 1A).
    NOT: Her örnek için çapraz kontaminasyonu önlemek için her zaman farklı bıçaklar ve cımbızlar kullanın. Jilet bıçağını tutarken koruyucu eldiven takın.
  3. Kalan protoplast izolasyon tamponunu ilgili Petri kabına ekleyerek doğranmış dokuyu batırın ve 25 °C'de 1 saat kuluçka yapın. Yer üstü dokuları tezgahta tutun (sallanmadan) ve kök dokularını yörünge sallayıcı platformuna (60 rpm) aktarın.

3. Filtrasyon

  1. İnkubasyon sonrası kök örneği:
    1. Bir Pasteur pipeti kullanılarak, protoplastları petri kabından önceden soğutmuş açık 50 mL santrifüj tüpünün üzerine yerleştirilen 40 μm Hücre Süzgeci'ne aktarın.
    2. Kalan protoplastları toplamak için, aynı Petri kabına tutuklanan protoplastları toplamak için aynı hacimdeki W5 çözeltisi (2 mM MES pH 5.7, 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl) aynı Petri kabına eklenin. W5 çözeltisinde yeniden süzülen protoplastları, önceden soğutulmuş açık 50 mL santrifüj tüpünün üzerine yerleştirilen aynı 40 μm hücre süzgecisine aktarın.
    3. Yeni 40 μm hücre süzgecinden yeni bir ön soğutmalı 50 mL santrifüj tüpüne ikinci kez geçirin. Bundan sonra örnekleri buz üzerinde tutun ve protoplastları tutarken çok nazik olun.
  2. İnkubasyon sonrası yer üstü örnekler:
    1. Bir Pasteur pipeti kullanılarak, protoplastları Petri kabından önceden soğutmuş açık 50 mL santrifüj tüpünün üzerine yerleştirilen 70 μm Hücre Süzgeci'ne aktarın.
    2. Kalan protoplastları toplamak için, aynı Petri kabına aynı hacimde W5 çözeltisi (2 mM MES pH 5.7, 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl) eklenerek petri kabının tabanına yapışan protoplastları toplayın. W5 çözeltisinde yeniden süzülen protoplastları, önceden soğutturulmuş açık 50 mL santrifüj tüpünün üzerine yerleştirilen aynı 70 μm hücre süzgecine aktarın. Bundan sonra örnekleri buz üzerinde tutun ve protoplastlara karşı çok nazik olun.

4. Yıkama ve Ficoll arındırması

  1. Santrifüjü 4 °C'ye kadar önceden soğutup protoplastları 5 dakika boyunca 500 × g ağırlığında toplayın (pellet) ve santrifüjün fren ayarını sıfırlayın.
  2. Santrifüjleme sonrası kök örneği:
    1. Protoplast peletini rahatsız etmeden süpernatantı at.
    2. Protoplastları önceden soğutulmuş (4 °C) 600-700 μL kök yeniden süspansiyon tamponu (eşit kısım kök protoplast izolasyon tamponu (enzimsiz) ve W5 çözeltisi) ile Pasteur pipeti veya 1 mL Gilson pipeti ile kesilmiş uçlu bir kesim yöntemiyle çok nazikçe askıya alın.
    3. Süspansiyonu 1.5 mL önceden soğutmalı (4 °C) tüplere aktarın.
  3. Santrifüjleme sonrası yer üstü örnekler:
    1. Süpernatantı pelleti rahatsız etmeden at.
    2. Pelleti, önceden soğutulmuş (4 °C) 600-700 μL çiçek/sap/yaprak yeniden süspansiyon tamponu (eşit parçalar çiçek/sap/yaprak protoplast izolasyon tamponu (enzimsiz) ve W5 çözeltisi) ile Pasteur pipeti veya 1 mL Gilson pipeti ile kesilen uçlu şekilde çok nazikçe askıya alın.
    3. Süspansiyonu 1.5 mL önceden soğutmalı (4 °C) tüplere aktarın.
    4. 1.5 mL bir tüpte 300 μL %13,3 (w/v) Ficoll PM 400 çözeltisi hazırlayın. Karıştırın ve buz üzerinde tutun.
    5. Yeniden askılanmış protoplast örneğini (600-700 μL) hazırlanmış Ficoll çözeltisi üzerine yavaşça ekleyin, Ficoll tabakasına dokunmadan veya karıştırmadan.
    6. Santrifüj 4 °C'de 5 dakika boyunca 700 × g'de sıfır kırma ayarıyla santrifüj yapın.
    7. Orta katmanda (arayüzde) bulunan protoplastları üst faza (birinci katman) ile birlikte toplayın (Şekil 1B). Ficoll ve ayrılmış enkazı içeren alt üçte katmanı toplamamaya dikkat edin. Daha fazla kullanıma kadar 4 °C'de sakla.

5. Sayma ve kalite kontrolü

  1. Protoplast çözeltisinden 10 μL kullanarak Neubauer hemositometre ile izole protoplast sayısını sayabilirsiniz.
    İÇERİ SEÇMELI: Protoplastların uygulanabilirliğini değerlendirmek için %1 (v/v) Evans Blue boyası eklenebilir (Şekil 1C).
  2. Protoplast çözeltisini, ilgili dokunun önceden soğuttulan (4 °C) yeniden süspansiyon tamponu (kök için adım 4.2.2 ve yer üstü dokular için adım 4.3.2'de açıklanmıştır) kullanarak protoplast çözeltisini, gerekli protoplast/mL konsantrasyonuna seyreltin.
  3. Amaçlanan deneye mümkün olduğunca hızlı devam edin; örneğin, tek hücreli RNA dizilemesi ve/veya FACS15,19.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yerüstü ve kök dokuları için uygulanan protoplast izolasyon protokolleri, hücre duvarının verimli sindirimini ve tüm Arabidopsis thaliana dokularından sağlam tek hücrelerin serbest bırakılmasını başarıyla mümkün kılar. Çiçekler, saplar, yapraklar ve kökler dahil olmak üzere test edilen doku tiplerinde, enzimatik sindirim süreci, sindirilmeyen hücre grubunun çok az olduğu iyi ayrılmış protoplastlar üretmiştir (Şekil 2A-D). Evans Blue boya testleri, küresel morfolojiye sahip ve düzgün plazma zarı sınırları gösteren protoplastların canlı hücreler olduğunu doğruladı (Şekil 1C). Her doku tipi için küresel protoplastlar sayıldı. Çiçeklerde ortalama 97.875 ± 7.531 (9.788 hücre/mg, n = 3), saplar 119.025 ± 22.508 (550 hücre/mg, n = 4), yapraklar 210.483 ± 15.572 (225 hücre/mg, n = 3) ve kökler 225.363 ± 52.561 (599 hücre/mg, n = 4) içerir.

Protoplast süspansiyonları, her elde edilen dokunun heterojen hücresel bileşimini yansıtan geniş bir hücre boyutları dağılımını ve yeşil veya soluk plastidlerin varlığını göstermiştir (Şekil 3A-D). Bunu doğrulamak için, transgenik eşlik hücresine özgü YFP raporlayıcı hattıyla protoplast izolasyonu yapıldı ve süspansiyon, eşlik hücreleri temsil eden YFP sinyali olan canlı küçük protoplastlar içeriyordu (Şekil 3E). Bu, kullanılan protoplast izolasyon protokolünün, sert hücre duvarlarına sahip zor izole edilen damar hücreleri için uygun olduğunu vurgular.

Sunulan optimize edilmiş yöntemle, yetişkin bitkilerin çeşitli dokularından minimum miktarda kalıntı ile çok sayıda canlı protoplast izole edilebilir. Yer üstü örneklerin arıtmasını iyileştirmek için, sindirilen örneklerden salınan organelleri ve diğer hücre kalıntılarını çıkarırken transkriptom kalitesini koruyan bir Ficoll yastık temizleme adımı ekledik (Şekil 4).

Protoplastlardan oluşturulan scRNAseq cDNA kütüphanelerinde, ACTIN2 gibi yüksek ekspresyonlu ev temizleme transkriptleri ve kambiyal ve meristematik hücrelere özgü bir belirteç olan homeodomain transkripsiyon faktörü KNAT1 gibi nadir/düşük ekspreslenen transkriptler ile birlikte SUC2 ve PARCL1 komut hücre belirteçleri spesifik cDNA PCRtestleri 15 ile tespit edildi (Şekil 5). Bu, elde edilen protoplast popülasyonunun geniş bir hücre tipi temsili ve heterojenliğini göstermektedir; bu yöntem ile üretilen scRNAseq verilerinin analiziyledaha da doğrulanmıştır 15.

figure-results-1
Şekil 1: Protoplast izolasyon adımlarının iş akışı. Altı ana adım gösterilmiştir: (1) tampon hazırlama, (2) doku sindirimi, (3) filtrasyon, (4) yıkama ve Ficoll arıtma, (5) sayma ve kalite kontrolü ve (6) sonraki deneylere devam etmek. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Protoplast hazırlık adımlarının görüntüleri. (A) Yaprak örneğinin doğrama aşamasının temsil resmi (Adım 2.1). Üst görsel, toplanan dokuyu standart boyutlu bir Petri kabında birkaç damla tampon ve doğrama için bir jilet ile gösteriyor. Aşağıdaki soldaki görsel, jilet bıçağıyla birkaç dikey darbeden sonra dokuyu temsil ediyor (bkz. ok). Aşağıdaki fotoğraf, sağda, doğranmış örneği temsil ediyor ve bir sonraki adım için hazır. (B) 1.5 mL bir tüpte santrifüjasyon sonrası Ficoll yastığının görüntüsü (Adım 4.3.7). Beyaz ok, protoplastları içeren orta katmanı gösterir. (C) Evans Blue boyasında kuluçka hale getirilen yaprak protoplastlarının temsil mikroskop görüntüsü. Ölçek çubuğu: 250 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Üretilen protoplastların mikroskop görüntüleri. Her doku tipinden protoplast görüntüleri gösterilir. (a) çiçek, (b) sap, (c) yaprak, (d) kök. Ölçek çubuğu: 250 μm. (E) Eşlik eden hücreye özgü YFP haber hattının konfokal mikroskop görüntüleri. İlk görüntü (solda), YFP eşlik hücre raporlayıcısının yaprak damarındaki ifadesini (yeşil renk) temsil eder. İkinci görüntü (sağda), YFP raporlayıcısını (yeşil sinyal) ifade eden hücrelerden alınan protoplastları temsil ediyor. Mor/mavi renk kloroplast oto-floresansını temsil eder. Ölçek çubuğu 10 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: (A) ve sonra (B) Ficoll yastığı temizlenmesinden önce yaprak protoplastlarının mikroskop görüntüleri. Ölçek çubukları: 250 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: scRNAseq kütüphanelerinin kalite kontrol PCR'leri. Kök ve yer üstü doku tek hücreli RNA kütüphanelerinin kalite kontrol PCR'larının temsil jel görüntüleri. SUC2, PARCL, KNAT1, ACT2 genleri (sırasıyla A'dan D'ye) ve her doku için sırasıyla çiçek, sap, yaprak, soldan sağa doğru genler. cDNA (+) pozitif kontrol olarak, su ise negatif kontrol olarak kullanılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Kök Protoplasting BufferÇiçek/Sap/Yaprak Protoplasting Tamponu
600 mM Mannitol400 mM Mannitol
2 mM MgCl2-
%0,1 BSA%0,1 BSA
2 mM CaCl210 mM CaCl2
2 mM MES pH 5.720 mM MES pH 5.7
10 mM Kl20 mM Kl
Gerekirse 1M Tris Baz ile pH 5.5'e ayarlayınGerekirse 1M Tris Baz ile pH 5.5'e ayarlayın

Tablo 1: Protoplast izolasyon tampon bileşimleri. Kök ve yer üstü (çiçek, sap, yaprak) dokular için protoplast izolasyon tampon tarifleri sunulmaktadır.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli Arabidopsis dokularından protoplastların izole edilmesi için optimize edilmiş bu protokol, sitoplazma ve çekirdeklerde bulunan tüm transkriptomu analiz eden scRNAseq uygulamaları için uyarlanmıştır. Tamponların dokuya özgü optimizasyonu ve sindirim ile arındırma için ek adımlar, farklı dokular arasında sağlam ve tekrarlanabilir verimler sağladı. Özellikle, çiçek protoplastları ortalama olarak bir örnek başına ~98.000 hücre (mg başına ~9.788 hücre), kök protoplastlar ~119.000 hücre (~mg/550 hücre), yaprak protoplastları ~210.500 hücre (~225 hücre/mg) ve kök protoplastları ~225.000 hücre (~599 hücre/mg) olup, bu dokuların yapısal ve fizyolojik çeşitliliğini yansıtmaktadır.

Bu protokolteki önemli bir iyileştirme, daha yaygın kullanılan sukroz bazlı gradyanlar/minderler yerine Ficoll tabanlı bir yastığın saflaştırma için kullanılmasıydı. Hücreler tarafından emilen vetranskriptom 13,20,21 üzerinde büyük etkisi olan sukrozun aksine, Ficoll osmotik olarak inert ve zar geçirimsizdir, böylece izolasyon sırasında RNA bütünlüğünü korur 22. Bu adım, ayrıca kloroplastlar gibi serbest organellerin askıdaki kırık hücreler ve hücre kalıntılarından oluşmasını da azalttı. Bu tür döküntülerin varlığı, mikrofluidik cihazların kanallarını tıkayarak damla oluşumunu engelleyebilir veya oluşan damlalarda birden fazla hücrenin bulunmasına neden olabilir ve bu da ortam RNA kontaminasyonuna katkıda bulunur. Tüm bu faktörler, scRNA-seq verilerinin analizinde yanlış sonuçlara veya önyargılara yol açabilir.

Protoplast izolasyonunun bitkihücrelerinin transkriptomunu değiştirebileceği gösterilmiştir 2,15,16,19. Bu protokolde bu artefaktı en aza indirmek için temel stratejilerden biri, enzimatik sindirimden sonra protoplastları buz üzerinde 4 °C'de tutmaktır; bu da metabolik ve transkripsiyon aktivitesini yavaşlatır ve böylece protoplast izolasyonuyla ilişkili transkripsiyonel değişiklikleri azaltır. Ayrıca, doku hasat süresinin tekrarlar arasında tutarlı tutulması ve çalışma hedefiyle uyumlu olması çok önemlidir; çünkü zamanlamadaki farklılıklar hem protoplast kaynaklı genleri hem de scRNA-seq veri setlerinde tespit edilen sirkadiyen düzenli transkriptlerietkilediği gösterilmiştir 15.

Bu yöntemde, minimal kalıntıyla tek hücre üretmenin yanı sıra, dokuların heterojenliğinin potansiyel olarak tüm hücre tiplerini temsil etmesi için korunması çok önemli bir diğer noktadır. Protoplast süspansiyonlarındaki çeşitlilik, elde edilen popülasyon içinde farklı boyutlar ve hücre tipine özgü raporlayıcı hatlarından sinyallerin varlığı dahil olmak üzere farklı protoplast morfolojilerinin tespit edilmesiyle doğrulandı (Şekil 2). Ayrıca, protoplast popülasyonu PCR kullanılarak scRNA-seq cDNA kütüphanelerinde nadir ve hücre tipine özgü ve ev işlerinin transkriptleri tespit edilerek değerlendirildi (Şekil 4). Bunlar arasında sürgünün apikal meristemindeki nadir işaretleyici genler ve yoldaşhücrelerin 15 belirteçleri yer alıyordu. Bu transkriptlerin başarılı şekilde yakalanması sunulan yöntemin yüksek bütünlükle çeşitli hücre tiplerinin izolasyonuna olanak sağladığını ve bitkilerde tek hücreli araştırmaların ilerlemesi için değerli bir araç olduğunu doğrulamaktadır. scRNAseq'in yanı sıra, bu yöntem akış sitometrisi, geçici gen ifade analizi ve bitki yenilenmesi testleri için de kullanılabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını belirtti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı kapsamında (Grant Agreement No. 810131) Avrupa Araştırma Konseyi'nden (ERC) fon alan bir projenin parçasıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cellulaz RS Duchefa BiochemieC8003
Santrifüj 5810R modeliEppendorf5810000010
Ficoll PM 400 Sigma-Aldrich26873-85-8
Macerozyme R10Duchefa BiochemieM8002
Mikrosantrifüj 5417R modeliEppendorfÜretimi sona erdirildi
Puradisc 30 Steril Şırınga Filtresi, 0.2 & mikro; mCytiva104622000.2 µ olarak adlandırılır; Protokolde m filtresi
Steril Hücre Süzcü 40 & mikro; m Naylon Ağ Fisherbrand22363547
Steril Hücre Süzcü 70 & mikro; m Naylon Ağ Fisherbrand22363548

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  2. Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Dev Cell. 48 (6), 840-852.e5 (2019).
  3. Tenorio Berrío, R., et al. Dual and spatially resolved drought responses in the Arabidopsis leaf mesophyll revealed by single-cell transcriptomics. New Phytol. 246 (3), 840-858 (2025).
  4. Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
  5. Zhai, Z., Jung, H., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J Vis Exp. (30), e1149(2009).
  6. Adedeji, O. S., Naing, A. H., Kim, C. K. Protoplast isolation and shoot regeneration from protoplast-derived calli of Chrysanthemum cv. White ND. Plant Cell Tissue Organ Cult. 141 (3), 571-581 (2020).
  7. Wang, K., et al. An optimized FACS-free single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) method for plant science research. Plant Sci. 326, 111535(2023).
  8. Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
  9. Brandt, S., Walz, C., Schad, M., Pavlovic, N., Kehr, J. A simple, chisel-assisted mechanical microdissection system for harvesting homogenous plant tissue suitable for the analysis of nucleic acids and proteins. Plant Mol Biol Report. 21 (4), 417-427 (2003).
  10. Berkowitz, O., et al. RNA-seq analysis of laser microdissected Arabidopsis thaliana leaf epidermis, mesophyll and vasculature defines tissue-specific transcriptional responses to multiple stress treatments. Plant J. 107 (3), 938-955 (2021).
  11. Jean-Baptiste, K., et al. Dynamics of gene expression in single root cells of Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 31 (5), 993-1011 (2019).
  12. Ryu, K. H., Huang, L., Kang, H. M., Schiefelbein, J. Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells. Plant Physiol. 179 (4), 1444-1456 (2019).
  13. Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Rep. 27 (7), 2241-2247.e4 (2019).
  14. Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), eaay4970(2020).
  15. Apelt, F., et al. Shoot and root single-cell sequencing reveals tissue- and daytime-specific transcriptome profiles. Plant Physiol. kiab537. , (2021).
  16. Kim, J. -Y., et al. Distinct identities of leaf phloem cells revealed by single-cell transcriptomics. Plant Cell. 33 (3), 511-530 (2021).
  17. Zhang, T. -Q., Chen, Y., Wang, J. -W. A single-cell analysis of the Arabidopsis vegetative shoot apex. Developmental Cell. 56 (7), 1056-1074.e8 (2021).
  18. Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Dev Cell. 57 (4), 543-560.e9 (2022).
  19. Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
  20. Aghdasi, M., Smeekens, S., Schluepman, H. Microarray analysis of gene expression patterns in Arabidopsis seedlings under trehalose, sucrose and sorbitol treatment. Int J Plant Prod. 2 (4), 309-320 (2008).
  21. Nakayama, Y., Kusano, M., Kobayashi, M., Manabe, R., Watanabe, M. Catabolic reprogramming of Brassica rapa leaf mesophyll protoplasts during the isolation procedure. Plant Growth Regul. 99 (2), 337-357 (2023).
  22. Grgac, R., Rozsypal, J., Des Marteaux, L., Štětina, T., Koštál, V. Stabilization of insect cell membranes and soluble enzymes by accumulated cryoprotectants during freezing stress. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (41), e2211744119(2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Single Cell AnalysisArabidopsis ThalianaSingle Cell RNAseqTissue Specific IsolationEnzymatic DigestionCell ViabilityFlow CytometryGene Expression AnalysisPlant Cell Suspension

İlgili makaleler