Method Article

Elektroakupunktur sırasında Somatosensory Korteks Nöronlarının Uzaylı-Zamansal Dinamiklerinin İki Foton In Vivo Görüntüleme Kullanılarak Görselleştirilmesi

DOI:

10.3791/69340

⸱

January 16th, 2026

 ,  ,  , 
1Traditional Chinese Medicine, School of Medicine, Acupuncture Research Institute, Jianghan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Thy1-GCaMP6f transgenik farelerde kraniyal pencereleri, standartlaştırılmış elektroakupunktur ve iki foton görüntülemeyi entegre ederek uyarım sırasında milisaniye ölçeğinde kortikal topluluk dinamiklerini görselleştirir ve katman spesifik plastisiteyi ortaya çıkarır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, EA (elektroakupunktur) uyarısı sırasında kortikal devreler dinamiklerini araştırmak için kapsamlı bir deneysel çerçeve oluşturur. Metodoloji, üç temel bileşeni entegre eder: Thy1-GCaMP6f transgenik farelerde kronik kraniyal pencere implantasyonu, ST36 akupunktur noktasında 2/100 Hz bifazik darbelerle standartlaştırılmış EA uyarısı ve yüksek çözünürlüklü iki fotonlu kalsiyum görüntüleme. Bu entegre yaklaşım, birincil somatosensory (S1) korteksteki sinir topluluğu aktivitesinin milisaniye zamansal hassasiyetle gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlar ve nöromodülasyona yönelik ağ düzeyindeki yanıtların daha önce erişilemeyen detaylarını yakalar. Bu teknik, tabakaya özgü aktivasyon desenlerini ve boylamasına plastisitete değişikliklerini başarıyla ortaya koyarak EA'nın etkilerinin altında yatan kortikal mekanizmalar hakkında kritik bilgiler sağlamaktadır. Geleneksel fMRI ve elektrofizyolojik tekniklerde bulunan temel uzaylı-zamansal sınırlamaları aşarak, bu yüksek çözünürlüklü platform, dinamik sinir devrelerini haritalamak için eşi benzeri görülmemiş analitik yetenekler sunar. Protokolün sağlam tasarımı ve tekrarlanabilir sonuçları, hedefli nöromodülasyon tedavilerini optimize etmek ve çevresel uyarıma yanıt olarak devre düzeyinde plastikliği anlamamızı ilerletmek için özellikle değerli kılmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroakupunktur, iğnelerle belirli akupunktur noktalarına uygulanan kontrollü elektrik akımlarını içeren geleneksel akupunkturun modern bir uyarlaması olup, ağrı işleme, motor kontrol ve otonom fonksiyonlarda yer alan sinir devrelerini modüle etmesiyle tanınır. Etkilerinin, periferik duyusal sinir aktivasyonları (öncelikle Aδ ve C lifleri) tarafından başlatılan karmaşık sinyal zincirlerini içerdiğine inanılır; bu süreçte nörotransmitter salınımı (örneğin, opioidler, serotonin, GABA) ve ardından omurga, beyin sapı ve kortikal 1,2 seviyelerinde modülasyon gerçekleşir. İlgili ana yapılar arasında somatosensorik korteksler yer alır. Dokunsal ve nosiseptif bilgileri işleyen S1 korteksinde, EA muhtemelen hem yerel inhibitör-uyarıcı dengeleri hem de uzun menzilli bağlantıyıetkiler 3,4. Ancak, EA uyarısı sırasında ve hemen sonrasında farklı nöronal popülasyonlar (örneğin, piramidal nöronlar, internöronlar) ve S1 içindeki katmanlar arasındaki aktivasyon/inhibisyonun kesin zamansal dizisi daha önce bahsedilen metodolojik kısıtlamalar nedeniyle büyük ölçüde haritalanmamıştır 5,6. Bu gerçek zamanlı dinamikleri anlamak, EA parametrelerini optimize etmek ve terapötik sonuçları tahmin etmek için çok önemlidir.

EA'nın (elektroakupunktur) kortikal devreler üzerindeki nöro-modülatör etkilerini araştırmak için yapılan geleneksel yöntemler, örneğin davranışsal çalışmalar ve ölüm sonrası analizler, değerli bilgiler sunar ancak gerçek zamanlı sinirsel aktiviteyi yüksek uzaylı-zamansalçözünürlük 7,8 ile yakalayamıyor. Bu sınırlamaları aşmak için, in vivo iki fotonlu kalsiyum görüntüleme güçlü bir alternatif olarak ortaya çıkar ve uyarım sırasında sinir topluluğu dinamiklerinin doğrudangörselleştirilmesini sağlar 8,9. Bu teknik, kronik uzunlamasına çalışmalar için eşsiz avantajlar sağlar ve araştırmacıların uyanık ve davranan hayvanlarda kortikal katmanlar üzerindeki hızlı ve dağınık aktiviteyi hücresel çözünürlükle gözlemlemesine olanak tanır. Yüksek zamansal çözünürlük ancak sınırlı mekansal kapsama sunan akut elektrofizyolojinin aksine, iki foton görüntüleme, belirli bir görüş alanı içinde yüzlerce ila binlerce nöronunun aynı anda büyük ölçekliizlenmesini kolaylaştırır 9,10. Ayrıca, tüm beyin kapsamında üstün olan ancak daha yavaş zaman ölçeklerinde çalışan ve hücresel özelliğe sahip olmayan fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (fMRI) ile karşılaştırıldığında, iki fotonlu kalsiyum görüntüleme, sinaptik ve devre düzeyindeki süreçlerle ilgili bir zaman diliminde belirli nöronal popülasyonlardan aktiviteyi ince taneli olarak tespit eder11,12. Bu nedenle, iki foton görüntüleme, çevresel EA uyarılarının özellikle birincil somatosensorik korteks (S1) gibi bölgelerde mekansal ve hassas kortikal aktivasyon desenlerine nasıl çevrildiğine dair kritik bir boşluğu kapatmak için benzersiz bir konuma sahiptir. Somatosensorik işlemin (akupunktur sinyalleri dahil) birincil merkezi olarak ve EA'nın etkinliğini güçlü şekilde modüle ettiği göz önüne alındığında, S1 elektroakupunktur tarafından indüklenen kortikal devre dinamiklerini incelemek için stratejik bir kapı oluşturur.

İki fotonlu lazer tarama mikroskopisi (2PLSM) ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler), örneğin GCaMP6, sinirbilim için devrim niteliğinde bir araçtır. Hücresel ve subhücresel özgüllük13 ile in vivo sinirsel aktivitenin kronik, yüksek çözünürlüklü görüntülemesini sağlar. GECI'ler, hücre içi kalsiyum geçicilikleriyle orantılı olarak floreslenir ve nöronal ateşleme için güvenilir bir vekilgörevi görür 14. Önemli olarak, 2PLSM'nin yakın kızılötesi uyarılma ışığı kullanımı, geleneksel mikroskopiye kıyasla yüzlerce mikron derinlik penetrasyonu sağlar ve yüzeysel ve daha derin kortikal katmanlarda (örneğin, L2/3, L4, L5) aktivitenin görselleştirilmesini sağlar. Doğal optik kesitlemesi, odak dışı floresansı ve fotohasarı en aza indirerek, haftalar veya aylar boyunca 15,16,17 boyunca uzunlamasına çalışmalar için ideal hale getirir. Bu teknoloji, EA araştırmalarında devrim niteliğinde bir ilerlemeyi temsil ediyor; anlayışımızı kökten dönüştürme potansiyeline sahip; uyarım sırasında belirli bir kortikal hacimde yüzlerce ila binlerce bireysel nöronun milisaniye ölçeği dinamiklerini aynı anda takip etme potansiyeli sunuyor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneylerde 8-12 haftalık transgenik Thy1-GCaMP6ffare 18 kullanıldı. Tüm deneysel prosedürler ve hayvan bakım protokolleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Rehberi'ne uygun olarak yürütüldü ve Huazhong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC; Protokol Onay Numarası: 3603). Kullanılan hayvan sayısını ve acılarını en aza indirmek için her türlü çaba gösterildi. Deneysel kurulumun bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Kronik kranial pencere implantasyonu

  1. Anestezi indüksiyonu ve stereotaksik stabilizasyon
    1. Anestezi başlatın; 8-12 haftalık Thy1-GCaMP6f faresini, %4-5 isofluran (vol/vol) ile sağlanan ve %100 tıbbi derecede oksijenle 1 L/dakika akış hızında bir indüksiyon odasına yerleştirin.
    2. Düzeltme refleksi kaybedildiğinde (genellikle 2-3 dakika içinde), hayvanı dijital stereotaksik çerçeveye entegre edilmiş termostat kontrollü bir ısıtma pedine (37 °C'de tutulur) aktarın.
    3. Fareyi cerrahi bakım için %1,5-2,0 isofluran sağlayan burun koni ile sabitleyin. Korneanın kurumasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem (örneğin, Puralube Vet Merhemi) uygulayın.
    4. Travmatik olmayan kulak çubuklarını dış işitme gövdesine dikkatlice yerleştirin; aşırı basınç olmadan simetrik pozisyon sağlanır ve bu doku hasarına veya timpanik zar yırtılmasına yol açabilir19.
    5. Burun kelepçesiyle çene damağını sabitleyin, böylece hava yolu tıkanıklığını önleyin.
    6. Derin anestezi, pedal yoksunluk refleksinin olmaması ile sert parmak sıkıştırması ve stabil, yavaş solunum hızı (80-120 nefes/d) olarak doğrulan. Rektal prob ile çekirdek vücut sıcaklığını sürekli izleyin ve ısıtıcı pedi buna göre ayarlayın.
    7. Deri altı (s.c.) önemez analjezi (örneğin, Karprofen, 5 mg/kg) ve sıvı desteği (steril salin, 0,5-1 ml s.c.) uygulanır. Kurulum boyunca stabil fizyolojik parametreleri (SpO₂ >% 95, solunum düzenli) doğrulayın.
  2. Kafatasının cerrahi açıdan maruz kalması
    1. Sırt derisini elektrikli makas makinesiyle titizlikle tıraş edin, ardından tam tüy alma için kimyasal bir depilyatör krem uygulayın. Steril salinle iyice durulayın.
    2. Ardışık antisepsis yapın: Açıkta kalan cildi üç kez ovalayın; povidon-iyot (%10) ve %70 izopropil alkol sürüntleri arasında dönüşümlü olarak silin, sonunda klorheksidin glukonat (%2) çözeltisi ile bitirin.
    3. Steril mikro-disseksiya makası ve ince forseps (Dumont #5) kullanarak, deri ve alttaki bağ dokusundan ~2 mm arkadan başlayıp interparietal-oksipital birleşime kadar uzanan orta hat sagittal kesi (~15-20 mm uzunluğunda) yapılabilir.
    4. Kesi kenarlarında kapiller kanamayı kontrol etmek için mikro-hemostatik forseps veya bipolar koteri (düşük ayar) kullanın. Deri kapaklarını yan tarafa doğru nazikçe geri çekin, çevredeki örtüye sabitlenmiş 5-0 ipek dikişler kullanın.
    5. Tüm dorsal kalvaryumu, frontal, parietal ve interparietal kemikleri açığa çıkarın. Mikro-küret (#00) kullanarak, kemik yüzeyine yapışan lifli damar zarı olan periostumu yüksek büyütme (cerrahi mikroskop) altında titizlikle kazıyın.
    6. Kafatasını oymamak veya dikişlere zarar vermemek için nazik, teğane darbeler uygulayın (bregma, lambda, sagital, koronal). Hassas kraniotomi ve ardından yapışkan bağlanma için gerekli olan pürüzsüz, avasküler kemik yüzeyi elde edin.
    7. Kemik tozunu gidermek ve doku nemlendirmesini korumak için tarlayı steril, sıcak (37 °C) %0,9 salinle sık sık sulayin.
  3. S1 arka ayv bölgesinin stereotaksik hedeflenmesi
    1. Yüksek hassasiyetli stereotaksik manipülatör kolu kullanarak, ince cerrahi işaretleyici kalemin veya mikro-matkap ucunun ucunu anatomik referans noktası bregma'nın (koronal ve sagital dikişlerin kesişimi) doğrudan üzerine yerleştirin. Koordinatları mikroskop görselleştirmesi altında onaylayın (10x).
    2. Manipülatörü, işaretleyiciyi tam olarak anteroposterior (AP) -1,5 mm (bregmaya posterior) ve orta hatta (sagital dikiş) göre +2,0 mm (sağ yarımküre) hareket ettirecek şekilde ayarlayın.
      NOT: Bu konum, birincil somatosensorik korteks (S1) arka uzuv temsil alanına (S1HL) karşılık gelir.
    3. Bu koordinatta açık parietal kemik yüzeyine hafifçe küçük bir nişangah (<0,5 mm) kazıyarak kemiği delmeden görünürlüğü sağlayın.
    4. İşaretlenen alanda büyük yüzey damarlarının olmadığını doğrulamak; önemli damarlar varsa, ML koordinatlarını minimuma (±0,1-0,2 mm) ayarlayarak bunları önlemek için, dural damarlar sızılırsa bolca kanamaya neden olabilir ve optik berraklığı engelleyebilir.
    5. Son ayarlanmış koordinatları belgeleyin.
  4. Kesin kraniotomi uygulaması
    1. Steril, tek kullanımlık 3 mm çapında biyopsi punch'ını tam olarak işaretlenmiş S1HL koordinatının üzerine merkezleyin. Yumruyu hafifçe döndürerek dış kortikal kemik tabakasını çevrenin etrafında tamamen çizerek sert ve sabit aşağı basınç uygulayın. Punch'u kaldır.
    2. Yüksek hızlı mikro-cerrahi matkap (örneğin, 0,5-0,8 mm karbür buru ile) stereotaksik kola sabit %0,9 tuzlu sulama (soğutma ve kalıntı temizleme) ile kemiği dikkatlice inceltmek için oluşturulmuş daire içinde inceltilmiştir.
    3. Hafif, teğnet bir frezeleme hareketiyle kısa sürelerle delme yapın, periferiden merkeze doğru sistematik ilerleyin. Büyütme altında kemik saydamlığını yakından izleyin.
    4. Alttaki dura mater'de hafif bir "kızarma" görünümü gözlemlenir gözlemlemez sondajı durdurun; bu da kemik kalınlığının minimuma (<50 μm) olduğunu gösterir. Kalan ince kemik parçalarını dikkatlice kaldırıp soymak için ince mikro forsepslere (Dumont #5/45) ve mikromakasla geçin, merkezden radyal olarak dışa doğru hareket edin.
    5. Dura mater'i sağlam tutun - yırtık veya ciddi kanama olmadan saydam ve parlak görünmesini sağlayın. Küçük dural kanamayı hemen kontrol edin; %0,9 salin veya trombinle ıslatılmış steril sıkıştırılmış köpük pledget ile nazik bir baskı uygulayın.
    6. Maruz kalan durayı, tüm kemik kalıntılarını temizlemek için sıcak, steril yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) veya %0,9 tuzlu suyla bolca sulayın. Kurumayıönleyin 17,20.
  5. Kronik kraniyal pencere implantasyonu ve baş-bar fiksasyonu
    1. Steril 3 mm çapında, #1 kalınlığında (yaklaşık 150 μm) dairesel cam kapak hazırlayın. Optik netlik ve daha düşük yapışma için iç yüzeyini ince bir silikon elastomer tabakası ile kaplayabilirsiniz.
    2. Coverslip'i ince forseps kullanarak kraniotominin üzerine tam olarak yerleştirin. Üretici talimatlarına göre hızlı kürlenebilen, hafif kürlenmiş bir diş çimento (örneğin, Metabond veya Charisma) hazırlayın.
    3. Hızlı bir şekilde (<90 saniye çalışma süresi), örtü damlasının çevresine ince bir çimento damlası uygulayın, doğrudan kuru, temiz kafatası yüzeyine uygulan. Çimento kaplama kenarını tamamen kapattığından emin olun ancak dura üzerine alt kısmını emmediğinden emin olun.
    4. Hemen bir diş kürleme ışığı (mavi ışık, 450 nm) ile çimentoyu 20-30 saniye boyunca her çeyrek başına 20-30 saniye boyunca kürleyin. Mühür, daha yavaş kürlenebilen, 5 mL, kendi kendine kürlenen akrilik diş çimentosu (örneğin, Jet Repair Acrylic veya Paladur) ile güçlendirin; böylece kraniotomi kenarının ötesine çevre kafatasına kadar uzanan sağlam, düşük profilli (<2 mm yükseklikte) bir çimento kapağı oluşturulur.
    5. Çimento kapağının ilk kürlenme aşamasında hafif, özel yapımı paslanmaz çelik veya titanyum başlık çubuğu (örneğin, 15-20 mm uzunluğunda, merkezi açıklıkta) gömülün.
    6. Baş çubuğunun, sagittal dikişe paralel konumlandırıldığından ve pencerenin ortasında konumlandırıldığından emin olun; böylece mikroskop altında gelecekte baş desteği için optik erişimi engellemeden sert ve dengeli sabitleme noktaları sağlanır.
    7. Çimento tamamen sertleşince (≥15 dakika). Tam hemostazı ve pencere netliğinidoğrulayın 21.
  6. Ameliyat sonrası iyileşme ve izleme
    1. Çimento ile kürlendikten sonra, fareyi kulak çubuklarından ve burun kelepçesinden dikkatlice çıkarın. İzofluranı bırakın ve spontan solunum tamamen yeniden başlayana kadar %100 oksijen verin.
    2. Analjezi için ameliyattan hemen sonra buprenorfin HCl (0,05-0,1 mg/kg s.c.) uygulanır. Hayvanı, temiz kağıt yatak örtüleriyle kaplanmış önceden ısıtılmış (30-32 °C), oksijenli bir iyileşme odasına transfer edin.
    3. Sternal yatma ve tam yürüyüş sağlanana kadar (genellikle 30-60 dakika) sürekli olarak takip edin. Ameliyattan 24 saat sonra ikinci bir karprofen dozu (5 mg/kg s.c.) verin. Gerekirse hidrasyon desteği için ısıtılmış laktasyonlu Ringer's solüsyesi (1 mL s.c.) sağlayın.
    4. Fare, kafes arkadaşlarının baş implantına zarar vermesini önlemek için yuva malzemesiyle zenginleştirilmiş standart bir kafeste tek başına yerleştirin. Çevresel koşulları (22-24 °C, %40-60 nem, 12:12 saat ışık/karanlık döngü) koruyun, yiyecek ve hidrojele imkansız erişim sağlanın.
    5. Ameliyattan sonraki 7 gün boyunca fareyi ağrı/sıkıntı belirtileri (kambur duruş, piloereksiyon, azalmış aktivite, kilo kaybı >15%), enfeksiyon (irinli akıntı, şişlik, kızarıklık), nörolojik defzukluk veya baş çubuğu gevşemesi için günde en az iki kez izleyin.
    6. Akut cerrahi iltihabın çözülmesi, normal davranış ve glimfatik klirensin geri kazanılması ve başlangıç kortikal aktivitesinin stabilizasyonu için herhangi bir deneysel prosedüre (görüntüleme veya EA) başlamadan önce minimum ≥7 günlük iyileşme süresi tanın. Hayvanı günlük tartarak iyileşmeyi takipedin 22.

2. Elektroakupunktur uyarısı

  1. ST36 akupunktur noktasının hassas anatomik lokalizasyonu
    1. Fare arka uzuvındaki yerleşik anatomik işaretlere dayanarak ST36 ("Zusanli") akupunktur noktasını hedefleyin. İğne yerleştirilmeden önce, patellar bağın yerleştiği diz ekleminin hemen distalinde bulunan belirgin kemik çıkıntısı olan tibial tüberoziteyi belirlemek için proksimal ön tibia'yı palpasyon yapın.
    2. İnce kaliperler veya steril bir işaretleyici kullanarak, tibial tüberozitinin merkezine göre 2 mm lateral (fibulaya doğru) ve 2 mm kaudal (posterior) ölçün. Bu konum, tibialis ön kas karınına karşılık gelir; derin peroneal sinir dalına yüzeysel ve ön tibial arterin bifurkasyonuna proksimaldir.
    3. Gerekirse bölgede büyük yüzeysel kan damarlarının olmadığını transilluminasyon ile doğrulayın.
      NOT: Doğruluk kritik öneme sahiptir, çünkü hafif sapmalar (>0,5 mm) S1'de uyarılan sinir yapılarını ve ardından gelen kortikal yanıtları önemli ölçüde değiştirebilir. Gösteri noktası tanımlama, operatörler arası değişkenliği en aza indirmek için eğitimli personel tarafından tutarlı şekildeyapılmalıdır 23,24.
      NOT: İğne stabilitesini sağlamak için yöntemler şunlardır: (i) İğne yerleştirildikten ve fiksasyonundan sonra, farenin alışması ve başlangıçtaki mücadeleyi azaltması için bir adaptasyon dönemi verilir. (ii) Elektroakupunktur uyarıcısı tarafından üretilen titreşim frekansı (örneğin, 2 Hz) doğası gereği düşük genliktedir. Ayrıca, kullanılan ince iğneler (örneğin, Φ0,16 mm) bu minimal titreşime etkili şekilde karşı koyacak kadar sertliğe sahiptir. (iii) Deney boyunca operatör iğne ucu pozisyonunu sürekli izler. Hayvan hareketlerinden kaynaklanan önemli bir yer değiştirme gözlemlenirse deneme verileri hariç tutulacaktır.
  2. Steril iğne yerleştirme tekniği
    1. Cilt dezenfeksiyonundan sonra (%70 etanol ve klorheksidin peelingi), steril, tek kullanımlık paslanmaz çelik akupunktur iğnesini (nominal çap: 0,18 mm, 36 gauge eşdeğer; uzunluk: 13 mm) ST36 koordinatında deriye dik olarak yerleştirin.
    2. İğneyi deri, deri altı doku boyunca ve alttaki tibialis ön kasına doğru ilerletmek için doku travmasını en aza indirmek için pürüzsüz bir döner hareketle ilerletin.
      NOT: Hedef yerleştirme derinliği cilt yüzeyinden 3 mm yüksekliktedir. Bu derinlik, tip II/III kas afferentlerinin (Aδ lifleri) ve potansiyel olarak somatik küçük çaplı liflerin alttaki tibia veya derin nörovasküler demetlerle temas riskini almadan optimal şekilde bağlanmasını sağlar.
    3. İğne merkezini, sonraki elektrik uyarısı ve olası ince uzuv hareketleri sırasında yerinden çıkmayı önlemek için küçük steril bir yapışkan ped veya özel klips ile sıkıca sabitleyin.
    4. Yerleştirme sırasında hafif ve geçici lokal kas fasikülasyonu gözlemleyerek stabil iğne yerleşimini doğrulayın - doğru kas içi pozisyonun fizyolojik göstergesi.
    5. Enfeksiyonu önlemek için özellikle kronik uyarılma paradigmalarında23.
  3. Elektroakupunktur uyarısı parametreleştirmesi ve teslimatı
    1. Yerleştirilen iğnenin yalıtılmış kolunu programlanabilir elektroakupunktur stimulyatörünün (örneğin, HANS Acupoint Sinir Stimlatörü, model LH202) anod (+) çıkış kanalına bağlayın.
    2. Genellikle iletken jelle kaplanmış küçük paslanmaz çelik plaka veya klipsli elektrot, ipsilateral arka patiye (örneğin, topuk yakınındaki plantar yüzey) referans katot (-) elektrodu yerleştirin.
    3. Her iki noktada da güvenli temas ve düşük empedans (<5 kΩ) sağlanır. Uyarıcıyı elektrot polarizasyonunu ve doku hasarını en aza indirmek için iki fazlı kare dalga darbeleri (dengeli pozitif/negatif fazla) verecek şekilde programlayın.
    4. Uyarım paradigmasını yoğun dağılımlı moda ayarlayın: 3 saniye boyunca 2 Hz (düşük frekans) patlamalar, ardından 3 saniye boyunca 100 Hz (yüksek frekans) patlamalar.
      NOT: Bu birleşik frekans deseninin (genellikle 2/100 Hz olarak gösterilen) deneysel olarak MSS'de endogen opioid (örneğin, β-endorfin, enkefalin) ve monoamin (örneğin, serotonin, norepinefrin) salınımını tek frekanslara göre daha etkili artırdığı ampirik olarak gösterilmiştir.
    5. Mevcut yoğunluğu 0.1 mA'dan başlayıp hafif ritmik bir pati seğirmesi (parmak veya ayak bileğinin bükülmesi) görsel olarak gözlemlenene kadar ayarlayın - genellikle hafif anestezi altında yetişkin farelerde 1.0 mA arasında ulaşılır. Bu seğirme eşiği, motor efferentlerin ve ilişkili büyük çaplı afferentlerin (Aβ liflerinin) yeterli şekilde toplandığını gösterir; fizyolojik aktivasyonu ancak sıkıntı veya şiddetli mücadeleye yol açmadan doğrular. Bu kalibre edilmiş yoğunluğu 20 dakikalık uyarımseansı boyunca 25,26 boyunca koruyun.
  4. Kritik prosedürel kontroller ve fizyolojik izleme
    1. Uyarılma artefaktı azaltımı
      1. EA kablolarını görüntüleme ekipmanından/baş sahnesinden fiziksel olarak ayırın.
      2. Sağlam topraklama uygulayın: Uyarıcının topraklama terminalini özel topraklama ile mikroskop çerçevesi ile hayvan ısıtma pedinin ortak bir topraklama noktasını paylaştığından ve emin olun.
      3. Varsa, mikroskobun boşlama sinyaliyle zamansal olarak uyarılma darbelerini senkronize edin veya kalsiyum izlerinden kalan elektrik artefaktlarını çıkarmak için post-hoc sinyal işleme kullanın.
    2. Fizyolojik stabilite
      1. 20 dakikalık EAA seansı boyunca çekirdek vücut sıcaklığını (geri besleme kontrollü ısıtma pediyle 37,0 ± 0,5 °C arasında tutulur), solunum hızını (80-120 nefes/dakika) ve SpO₂'yi (%>95%) sürekli izleyin.
      2. Kombine görüntüleme/uyarım sırasında hareketsizlik için hafif izofluran anestezisini (%1,0-1,5) sürdürmek. Sürekli olarak tetiklenen pati seğirmesini gözlemleyin; azalırsa veya durursa, iğne teması ve empedansı kontrol edin ve yoğunluğu hafifçe ayarlayın (≤0.1 mA artışlar) böylece tutarlı, hafif motor aktivasyonu sürdürülür.
      3. Eğer sıkıntı belirtileri (örneğin, takipinne, şiddetli mücadele) ortaya çıkarsa uyarıyı hemen bırakın.
    3. Tekrarlanabilirlik
      1. Tüm hayvanlar ve seanslar için aynı iğne tipi, yerleştirme derinliği, uyarıcı modeli ve kalibrasyon yöntemi (paw twitch eşiği) kullanın. Her denek için kullanılan son uyarım yoğunluğunu belgeleyin.
      2. Uyarı sonrası en az 5 dakikalık iyileşme süresi tanıyarak anestezi sonlandırmak veya ek işlemler yapmak üzere 27,28.

3. EA sırasında iki fotonlu görüntüleme

  1. Hayvan hazırlığı, baş sabitleme ve fizyolojik bakım
    1. Ameliyat sonrası ≥7 günlük iyileşmenin ardından, Thy1-GCaMP6f faresini, motorlu XY aşamasına monte edilmiş özel tasarım, titreşim sönümlü fiksasyon cihazı içinde implante edilmiş baş-bar ile kafa sabitlesin.
    2. Hayvanı, düşük sürtünmeli, hava ile yağlanan silindirik koşu bandına rahatça yerleştirin; böylece arka uzuvların sınırsız hareket etmesine izin verebilirsiniz. %0,5-0,8 isofluran içeren %100 O₂ içeren burun koni ile hafif cerrahi anestezi uygulanmasını sürdürün. Bu azalmış izofluran seviyesi, sinirsel aktivitenin bastırılmasını en aza indirirken yüksek çözünürlüklü görüntüleme için yeterli hareketsizlik sağlar.
    3. Çekirdek vücut sıcaklığını (geri besleme kontrollü ısıtma yastığı ile 37,0 ± 0,2 °C arasında tutulur), solunum hızını (100-140 nefes/dakika) ve çevresel oksijen doygunluğunu (SpO₂ > %95) sürekli olarak takip edin ve kaydedin.
    4. Uzun süreli görüntüleme sırasında korneanın kurumasını önlemek için oftalmik jel uygulayın. ST36'da EA iğne yerleştirme için S1HL kranial penceresine giden arka uzuvun ipsilateral kısmının erişilebilir olduğundan emin olun.
    5. Başlık fiksasyonundan sonra fizyolojik stabilizasyon için 15-20 dakika bekleyin ve görüntüleme29 başlatın.
  2. Katman II/III görüntüleme için optik hedefleme ve optimizasyon
    1. Yüksek kaliteli nöron sinyalleri almak için odak düzlemini kesin olarak belirleyin. Bu doğrulama prosedürünü takip edin.
      1. Lazer gücünü düşük seviyeye indirin (genellikle görüntüleme gücünün %10-20'si, örneğin 5-10 mW) böylece uçak konumlandırma sırasında gereksiz foto ağartma ve foto hasarını önleyin.
      2. İki fotonlu mikroskobunun Z ekseni sürücüsünü kullanarak, nesneyi mikron adımlarla yavaşça hareket ettirin. Kranial pencere yüzeyinden başlayın ve beyin dokusuna daha derinlemesine ilerleyin.
      3. Canlı önizleme modunda, 3.2.1.4 ve 3.2.1.5 adımlarında açıklandığı gibi bu görsel göstergeler kullanılarak odak düzlemini belirleyin.
      4. Bir nöronal soma tabakasında doğru odak düzlemi için: Görüntünün açık, parlak, noktalı yapılar (nöron somataları) yuvarlak veya oval göründüğünü ve iyi arka plan kontrastı olduğunu doğrulayın. Hücre sınırlarının keskin olduğundan ve belirgin bir "tuz ve karabiber" görünümü sergilediğinden emin olun.
      5. Yanlış odak düzlemi için: Eğer görüntü bulanık veya homojen görünüyorsa, iyi tanımlanmış noktalı yapılar olmadan, odak noktasının somata olmayan bir bölgede olduğunu fark edin. Büyük, koyu, yapısız damar gölgeleri görünürse, bunu kan damarı tabakası olarak tanımlayın.
    2. Uygun floresans başlangıç çizgisinin doğrulanması
      1. Herhangi bir deneysel uyarıcı uygulamadan önce sağlıklı ve stabil bir floresans başlangıç çizgisini doğrulayın; böylece sonraki kalsiyum sinyallerinin (ΔF/F) geçerli yorumlanmasını sağlayın. 3.2.2.2-3.2.2.4 adımlarını gerçekleştirin.
      2. Lazer gücünü resmi görüntüleme seviyesine (örneğin, 30-50 mW) ayarlayın.
      3. Hızlı, düşük çözünürlüklü önizleme modunda birkaç saniyeliğine görüntü alın.
      4. Gerçek zamanlı olarak gösterilen ortalama floresans yoğunluğunu gözlemleyin (veya görüntü parlaklığını doğrudan izleyin). Sinyalin sabit kaldığını ve hızlı foto ağartma belirtisi göstermediğini deneysel veri toplamaya geçmeden önce doğrulayın.
    3. Görüntü alanını kafatası penceresi içinde merkezleyin.
      1. Daldırma bağlantısı için objektif ile kapak arasına ultrasonik jel veya damıtılmış su uygulayın. Kızılötesi Dodt gradyan kontrastı veya epifloresan aydınlatması kullanılarak, yüzey damarlarını tespit edin ve görüş alanını (FOV) hizaladıktan sonra büyük yüzey damarlarını (>20 μm çapında) önleyin.
      2. Ayarlanabilir femtosaniye darbeli Ti:Sapphire lazeri kullanarak iki foton uyarılma moduna geçin. Uyarılma dalga boyunu 920 nm olarak ayarlayın - GCaMP6f (zirve ~920 nm) için optimal olan, yeşil otofloresans ve fotohasarı kısa dalga boylarına kıyasla en aza indirirken.
      3. Lazer gücünü kademeli olarak artırın (genellikle örnekte ölçülürken 20-50 mW) şeffaf dura üzerinden kortikal yüzeye (pia mater) odaklanın. ObjektİFin Z-konumunu piezoelektrik nano-odak cihazı ile ayarlayarak pial yüzeyinin 200 ± 10 μm derinliğine ulaşın; bu derinlik, kortikal Katman II/III'e karşılık gelir.
      4. Karakteristik nöronal yoğunluk ve morfoloji ile derinliği doğrulamak: Görünür apikal dendritlere sahip küçük-orta piramidal nöron somatalarından oluşan yoğun bir popülasyon (10-15 μm çap).
      5. Lazer gücü ve fotoçarpan tüp (PMT) kazanç ayarlarını optimize ederek doygunluk olmadan (piksel yoğunluğu dedektör maksimumunun %50-70) ve minimum arka plan30,31 olmadan güçlü temel GCaMP6f floresansı (F0) elde edin.
        NOT: Görüntüleme sırasında, 920 nm uyarılma ışığının ortalama gücü hedefte tam olarak 30-50 mW olarak korundu. Bu güç seviyesi, aynı cerrahi işlemlere tabi tutulan hayvan dokusu üzerinde pilot deneylerle doğrulandı; böylece 25 dakikaya kadar tarama süreleri için etkili sinyal alımı sağlandı ve fotohasar ile floresans fotobeyazlamasını en aza indirdi.
  3. Yüksek hızlı kalsiyum görüntüleme alma protokolü
    1. Rezonans tarayıcıyı yüksek hızlı kare alımı için yapılandırın:
      Çerçeve boyutu: 512 × 512 piksel (tipik FOV: ~450 × 450 μm, piksel boyutu ~0.88 μm)
      Kare hızı: Çift yönlü tarama ile (~14 kHz hat hızı) elde edilen saniyede 7 kare (fps). Bu hız, GCaMP6f bozunma kinetiklerini (τ~500 ms) yeterince örneklerken, sinyal-gürültü oranını (SNR) dengeler ve foto ağartmayı en aza indirir.
      Piksel bakışı süresi: ~0.8 μs (7 Hz'de SNR için optimize edilmiştir).
    2. Satın alma yazılımı (örneğin, ScanImage, Prairie View) kullanarak sürekli zaman geçişi başlatın. EA uyarılmasından önce 5 dakikalık bir başlangıç dönemi kaydederek uyarı öncesi sinirsel aktivite dinamiklerini (F₀) belirleyin.
    3. Tam olarak t = 5 dakika olduğunda, görüntüleme kesintisiz devam ederken ST36'da EA uyarısına başlayın. 20 dakikalık EA uyarı dönemi boyunca sürekli veri edinin. Toplam tarama süresi = 25 dakika (1500 s, ~10.500 kare).
    4. Verileri çoklu TIFF yığını veya EA tetikleme darbeleriyle TTL giriş kanalı aracılığıyla senkronize edilmiş gömülü zaman damgaları ile özel ikili format olarak kaydedin.
    5. Lazer güç kararlılığını ve odak kaymasını (<2 μm) gerçek zamanlı olarak izleyin; Yalnızca önemli bir kayma gerçekleştiğinde (örneğin, >5 μm) kısa bir süre yeniden odaklanmak için duraklayın ve zamannoktası 32,33 not edilir.
  4. Titiz hareket düzeltmesi ve mekansal kayıt
    1. Alım sonrası, ham görüntüleme yığını MATLAB'da NoRMCorre (Kesin Olmayan Hareket Düzeltme) kullanılarak işlenip, kalıntı mikrohareketlerden (örneğin, nefes alma, nabız) mekânsal artefaktları ortadan kaldırın.
    2. İlk olarak, yığını örtüşen uzaysal yamalara ayırın (örneğin, 64 × 64 piksel, %50 örtüşme). Her yama için, temel dönemden yüksek SNR çerçevelerini ortalamasıyla bir referans şablonu hesaplayın.
    3. Fourier tabanlı çapraz korelasyon kullanılarak, şablona göre her kare için X-Y translasyon kaymalarını hesaplayın. Bu kaymaları alt piksel interpolasyonu yoluyla uygulayın.
    4. Sonra, katı olmayan deformasyonları ele alın: parça parça afin dönüşümler (transleksiyon + kesme) kullanarak yamalar içindeki yerel bozulmaları modelleyin. Kayıt doğruluğunu artırmak için şablonu yinelemeli olarak güncelleyin. Ana parametreler:
      max_shift: 20 piksel (çeviri için sınır)
      max_dev: 3 piksel (maksimum sert olmayan sapma)
      bin_width: 50 kare (şablon güncellemeleri için zamansal bineleme)
    5. Düzeltme etkinliğini, kare-kare korelasyon grafikini inceleyerek görselleştirin (düzeltme sonrası yaklaşık 1.0 civarında stabil olmalıdır) ve ortalama görüntü projeksiyon farkı haritası oluşturarak (düzeltme öncesi ve sonrası). Hareket düzeltmeli yığını sonraki analiz için saklayın. Bu adım, özellikle EA kaynaklı ince uzuv hareketleri sırasında kalsiyum geçişlerinin piksel bazında doğru analizi için kritiktir.

4. Uzaylı-zamansal dinamik analizi

Hareket düzeltmeli görüntüleme yığını, Python'daki Suite2p boru hattı (v0.12.3) kullanılarak otomatik nöronal segmentasyon ve sinyal çıkarımından geçer. Ana işleme aşamaları şunlardır:

  1. Mekânsal ayak izi tanımlaması
    1. Yığını mekânsal bileşenlere ayırmak için kısıtlı negatif olmayan matris çarpanlaştırması (CNMF) uygulanır.
    2. İlgi alanlarını (ROI'ları) korelasyona dayalı bir yaklaşımla başlatın: 0.7 > ve yerel SNR > 4'e sahip pikselleri aday ROI'lara birleştirin. Somatik yatırım getirisini dendritler/aksonlardan boyut (8-15 μm çap) ve dairesellik (kompaktlık eşiği >0.6) açısından ayırt edin.
  2. Nöropil kontaminasyon düzeltmesi
    1. Her yatırım getirisi için konsantrik bir nöropil halka tanımlanabilir (iç yarıçap: 1,5× ROI yarıçapı, dış yarıçap: 2,5× ROI yarıçapı).
    2. Nöropil katsayısı (r_neuropil) en küçük kare regresyonuyla hesaplanın:
      F_corrected(t) = F_raw(t) - 0.7 × F_neuropil(t)
      (Thy1-GCaMP6f fareleri için ampirik olarak doğrulanmış katsayı).
  3. Sinyal dekonvolüsyonu
    1. AR(2) gürültü modeliyle OASIS (l₁-düzenlenmiş dekonvolüsyon) kullanarak ΔF/F izlerinden spike olasılığı S(t) 'yi tahmin etmek için spiking aktivitesi çıkarım:
      ΔF/F(t) = k ⋅ S(t) + b + ε
      burada 'k' kalsiyumun geçici çekirdeği, ε ise Gauss gürültüsüdür.
  4. Kalite kontrolü
    1. SNR <3, mekânsal örtüşme >%30 veya nöropil korelasyonu >0.3 olan ROI'ları hariç tutun. Görsel doğrulama Suite2p GUI34 üzerinden gerçekleştirilir.
      Özel işlemler ve arayüz öğeleri Ek Dosya 1'de sağlanmıştır. Yukarıda oluşturulan hareket düzeltmeli TIFF dosyası doğrudan Suite2p boru hattına besleniyordu. Suite2p'nin entegre ortamı kendi katı hareket düzeltmesini içerse de, bu gereksiz iç adım daha hassas bir sert olmayan düzeltme uygulandığı için devre dışı bırakıldı. Otomatik olarak çıkarılan nöronal ROI'lar Ek Dosya 2'de bulunabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S1 korteksinin yapısal karakterizasyonu ve başlangıç sinirsel aktivitesi
Görüntüleme deneylerimiz için yüksek isabetli yapısal ve fonksiyonel bir temel oluşturmakla başladık. Doku morfoloji analizi, uygulanmamış (Şekil 2A) ve örtü kaydırmalı (Şekil 2B) kranial pencere preparatları arasında belirgin yapısal farklılıklar ortaya koymuştur. Coverslip uygulaması küçük sıkıştırma artefaktları (ok uçları,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroakupunkturun (EA) kortikal etkilerini gerçek zamanlı gözlemlerdeki kritik boşluğu kapatmak için, optik erişim için kronik kraniyal pencere implantasyonu, standart EA uyarısı ve birincil somatosensory (S1) kortekse yönelik uzunlamasına iki fotonlu kalsiyum görüntülemeyi birleştiren kapsamlı entegre bir protokol sunuyoruz.

Bu entegre protokol, EA'nın kortikal etkilerini incelemek için geleneksel yöntemlere göre birkaç belirgin avantaj sunar. Birincisi, EA...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (No. 82405550) alınan bir hibe ile desteklendi. Zhang laboratuvarı üyelerine faydalı tartışmalar için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
KarprofenMCEYokAnaljezi için 5 mg/kg
Dijital stereotaksik çerçeveRWDKopf Model 1900
Elektroakupunktur uyarıcısıHANS LH202 (2/100 Hz bifazik darbeler)YokHANS LH202 (2/100 Hz bifazik darbeler)
İzofluranRWDR510-22-10Tıbbi derecede, %100 oksijen taşıyıcı
Mikro-matkap sistemiRWD0,5 mm karbid burr, tuzlu soğutma
Povidon-iyotMCEHY-B2234%10 çözüm
ScanImageScanImagehttps://scanimage.org/
Steril salinBeyuntianST341-500ml%0,9 NaCl
Cerrahi mikroskopZeisshttps://www.zeiss.com/meditec/en/products/surgical-microscopes.html10-40 dakika; büyütme
Thy1-GCaMP6f transgenik farelerCygen55239788-12 haftalık, erkek/kadın
İki foton mikroskopuNikon A1MPNikon A1MPTi:Safir lazer (920 nm uyarılma)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, X., et al. A central and peripheral dual neuromodulation strategy in pain management of zoster-associated pain. Sci Rep. 14 (1), 24672(2024).
  2. Xia, R., et al. Autonomic nervous system in bone remodeling: From mechanisms to novel therapies in orthopedic diseases. Orthop Surg. 17 (6), 1561-1576 (2025).
  3. Arvanitidis, M., Falla, D., Sanderson, A., Martinez-Valdes, E. Does pain influence force steadiness? A protocol for a systematic review. BMJ Open. 11 (1), e042525(2021).
  4. Urits, I., et al. An evidence-based review of galcanezumab for the treatment of migraine. Neurol Ther. 9 (2), 403-417 (2020).
  5. Barbeau, E. J., Chauvel, P., Moulin, C. J., Regis, J., Liegeois-Chauvel, C. Hippocampus duality: Memory and novelty detection are subserved by distinct mechanisms. Hippocampus. 27 (4), 405-416 (2017).
  6. Dannenberg, H., Young, K., Hasselmo, M. Modulation of hippocampal circuits by muscarinic and nicotinic receptors. Front Neural Circuits. 11 (7), 102(2017).
  7. Shang, Q., et al. Erp evidence for consumer evaluation of copycat brands. PLoS One. 13 (2), e0191475(2018).
  8. Shariff, S., et al. Advances in understanding the pathogenesis of epilepsy: Unraveling the molecular mechanisms: A cross-sectional study. Health Sci Rep. 7 (2), e1896(2024).
  9. Wahl, A. S. State-of-the-art techniques to causally link neural plasticity to functional recovery in experimental stroke research. Neural Plast. 2018 (1), 3846593(2018).
  10. Zheng, X. S., Yang, Q., Vazquez, A. L., Tracy Cui, X. Imaging the efficiency of poly(3,4-ethylenedioxythiophene) doped with acid-functionalized carbon nanotube and iridium oxide electrode coatings for microstimulation. Adv Nanobiomed Res. 1 (7), 2000092(2021).
  11. De Pasquale, F., et al. A cortical core for dynamic integration of functional networks in the resting human brain. Neuron. 74 (4), 753-764 (2012).
  12. Stamatakis, A. M., et al. Miniature microscopes for manipulating and recording in vivo brain activity. Microscopy (Oxf). 70 (5), 399-414 (2021).
  13. Gu, Z., Jamison, K., Sabuncu, M. R., Kuceyeski, A. Human brain responses are modulated when exposed to optimized natural images or synthetically generated images. Commun Biol. 6 (1), 1076(2023).
  14. Li, J., et al. Pedot:Pss-based bioelectronics for brain monitoring and modulation. Microsyst Nanoeng. 11 (1), 87(2025).
  15. Lee, C. R., Najafizadeh, L., Margolis, D. J. Investigating learning-related neural circuitry with chronic in vivo optical imaging. Brain Struct Funct. 225 (2), 467-480 (2020).
  16. Kirwan, P., et al. Development and function of human cerebral cortex neural networks from pluripotent stem cells in vitro. Development. 142 (18), 3178-3187 (2015).
  17. Gomez, J., Neco, P., Difranco, M., Vergara, J. L. Calcium release domains in mammalian skeletal muscle studied with two-photon imaging and spot detection techniques. J Gen Physiol. 127 (6), 623-637 (2006).
  18. Sylte, O. C., Muysers, H., Chen, H. L., Bartos, M., Sauer, J. F. Neuronal tuning to threat exposure remains stable in the mouse prefrontal cortex over multiple days. PLoS Biol. 22 (1), e3002475(2024).
  19. Imori, T., Matsuda, H., Tohjo, M., Kamata, Y. An experimental production of suppurative otitis media in dog, and a trial to evaluate the therapeutic effect of cefmetazole on this otitis media. Jpn J Antibiot. 35 (9), 2277-2287 (1982).
  20. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  21. Bray, M. A., et al. Cell painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nat Protoc. 11 (9), 1757-1774 (2016).
  22. Jirkof, P., et al. Assessment of postsurgical distress and pain in laboratory mice by nest complexity scoring. Lab Anim. 47 (3), 153-161 (2013).
  23. Fang, K., Cheng, W., Yu, B. Effects of electroacupuncture at varied frequencies on analgesia and mechanisms in sciatic nerve cuffing-induced neuropathic pain mice. J Mol Neurosci. 74 (4), 98(2024).
  24. Hsiao, I. H., Liao, H. Y., Lin, Y. W. Optogenetic modulation of electroacupuncture analgesia in a mouse inflammatory pain model. Sci Rep. 12 (1), 9067(2022).
  25. Han, J. S. Acupuncture: Neuropeptide release produced by electrical stimulation of different frequencies. Trends Neurosci. 26 (1), 17-22 (2003).
  26. Zeng, L. T., et al. Study on optimization of image processing parameters of pneumoconiosis by DR. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 41 (12), 897-900 (2023).
  27. Costa, F. F., et al. Identification of microRNAs as potential prognostic markers in ependymoma. PLoS One. 6 (10), e25114(2011).
  28. Gazerani, P., Aloisi, A. M., Ueda, H. Editorial: Differences in pain biology, perception, and coping strategies: Towards sex and gender specific treatments. Front Neurosci. 15, 697285(2021).
  29. Masamoto, K., Kanno, I. Anesthesia and the quantitative evaluation of neurovascular coupling. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1233-1247 (2012).
  30. Korsunsky, I., et al. sensitive and accurate integration of single-cell data with Harmony. Nat Methods. 16 (12), 1289-1296 (2019).
  31. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  32. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  33. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: Flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2 (1), 13(2003).
  34. Friedrich, J., et al. Multi-scale approaches for high-speed imaging and analysis of large neural populations. PLoS Comput Biol. 13 (8), e1005685(2017).
  35. Tidball, P., et al. Differential ability of the dorsal and ventral rat hippocampus to exhibit group I metabotropic glutamate receptor-dependent synaptic and intrinsic plasticity. Brain Neurosci Adv. 1 (1), 2398212816689792(2017).
  36. Yang, W., Yuste, R. Holographic imaging and photostimulation of neural activity. Curr Opin Neurobiol. 50 (1), 211-221 (2018).
  37. Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nat Commun. 8 (1), 2153(2017).
  38. Pfeffer, C. K., Xue, M., He, M., Huang, Z. J., Scanziani, M. Inhibition of inhibition in visual cortex: The logic of connections between molecularly distinct interneurons. Nat Neurosci. 16 (8), 1068-1075 (2013).
  39. Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, e28728(2018).
  40. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  41. Godenschweger, F., et al. Motion correction in MRI of the brain. Phys Med Biol. 61 (5), R32-R56 (2016).
  42. Hattori, R., Danskin, B., Babic, Z., Mlynaryk, N., Komiyama, T. Area-specificity and plasticity of history-dependent value coding during learning. Cell. 177 (7), 1858-1872.e15 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Somatosensory CortexTwo Photon ImagingElectroacupuncture StimulationNeural Circuit DynamicsCalcium ImagingCranial Window ImplantationThy1 GCaMP6f MiceSpatiotemporal DynamicsCortical PlasticityNeuromodulation

Related Articles