Yöntem makalesi

Membran Protein-İnhibitör Bağlanmasını Araştırmak İçin Biyokatman İnterferometrisi: TACAN Mutant ve GsMTx4 Model Sistemi Olarak

223 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69348

⸱

8 Mayıs 2026

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Pharmacology, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 2ARC Centre for Cryo-electron Microscopy of Membrane Proteins, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 3Melbourne Protein Characterization, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne

Bu makalede

Özet

Bu el yazması, deterjanla çözünürülmüş membran proteinleri için membran protein-ligand etkileşimlerini incelemek amacıyla Biyo-Katman İnterinterferometrisi (BLI) deneylerinin optimize edilmesi ve yürütülmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. TMEM120A M207A mutantı ile peptid inhibitörü GsMTx4 arasındaki etkileşimi model olarak kullanarak, bu iş akışı protein hazırlığı, biyosensör yüklemesi ve kinetik veri toplama süreçlerini özetlemektedir.

Özet

Biyo-Katman İnterferometrisi (BLI), biyomoleküler etkileşimlerin gerçek zamanlı, nicel analizini mümkün kılan verimli bir biyofiziksel tekniktir. Çözünür proteinler için yaygın olarak kullanılsa da, hidrofobik ve deterjan bağımlılığı nedeniyle membran proteinlerine uygulanması hâlâ zordur. Bu çalışma, deterjanla çözünürülmüş membran proteini ile peptid inhibitörü arasındaki etkileşimleri karakterize etmek için optimize edilmiş bir BLI protokolü sunmaktadır.

Bir model sistem olarak, gating-modifikatör peptid Grammostola mekanotoksin 4 (GsMTx4), çok fonksiyonlu membran protein mutantı M207A TMEM120A karşı test edilmiştir. FLAG etiketli TMEM120A varyantı, etiket tabanlı ancak floresan ve enzim etiketi olmayan bir düzeni temsil eden anti-FLAG biyosensörlerinde immobilize edildi ve ilişki ve ayrışma oranlarını ölçmek için GsMTx4'ün seri seyreltmelerine maruz bırakıldı.

Protokol, Lauryl Maltoz Neopentil Glikol (LMNG) kullanılarak deterjan optimizasyonunu ve kütle fotometrisi ile diferansiyel tarama florimetrisi (DSF) ile tamamlayıcı karakterizasyonu entegre eder. Bu iş akışı güvenilir kinetik ölçümler sağlar ve orta verimlilikli tarama ile uyumludur. Bu yaklaşım, deterjan stabilitesinin korunduğu diğer membran protein-ligand sistemlerine de uygulanabilir. Genel olarak, çalışma, immobilizasyon verimliliği ve analit teslimatını etkileyen temel parametreleri vurgulamaktadır ve BLI'nin inhibitör profillemede ve membran protein etkileşimlerinin mekanistik çalışmalarında potansiyel faydasını desteklemektedir.

Giriş

Zar proteinleri, sinyal iletimi, iyon ve metabolit taşıması ile membran organizasyonu gibi temel fizyolojik süreçlerde merkezi roller oynar. Hücresel iletişim ve homeostazdaki rolleri nedeniyle, klinik geliştirmedeki ilaç hedeflerinin önemli bir kısmını temsil ederler. Membran protein-ligand etkileşimlerini anlamak, fonksiyonu aydınlatmak ve terapötik tasarımı yönlendirmek için kritiktir. Ancak, bu proteinlerin amfipatik doğası ve lipid ortamlarına bağımlılıkları, arıtma, stabilizasyon ve biyofiziksel karakterizasyon için önemli zorluklar yaratmaktadır.

Yüzey plazmon rezonansı (SPR) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC), membran protein-ligand etkileşimlerinin kinetik ve termodinamiğiniincelemek için yaygın kullanılan tekniklerdir 1,2. Uygun şekilde optimize edildiğinde, her iki yöntem deterjanla çözünürülmüş veya yeniden oluşturulmuş membran proteinleri için bile ayrıntılı nicel bilgiler sağlayabilir. Mikro ölçekli termoforez (MST), özellikle membran proteinleri için, neredeyse doğal koşullarda bağlanma ayakınlıklarını değerlendirmek için başarıyla uygulanmıştır. Buna rağmen, bu yaklaşımlar önemli örnek tüketimi, membran protein stabilitesini korumadaki zorluklar veya belirli deterjan sistemleriyle sınırlı uyumluluk nedeniyle sınırlı olabilir.

Biyo-Katman İnterfiometrisi (BLI), deterjan veya amfipol çözünürülmüş membran proteinleri dahil olmak üzere biyomoleküler etkileşimlerin nicel ölçümünü sağlayan gerçek zamanlı optik bir tekniktir. Daha önce bahsedilen biyofiziksel tekniklerin yanı sıra, BLI, bağlanma kinetiklerinin doğrudan ölçülmesini sağlayan verimli bir platform sunar; bu da ilişki (kaçık), dissosiyasyon (kkapalı) ve denge dissosiyasyon sabitleri (K D) dahil, daha düşük örnek konsantrasyonları ve deterjan veya nanodisk çözünürlenmiş membran proteinlerine doğrudan uyum sağlar. Ayrıca, tüm biyofiziksel teknolojiler gibi, BLI'nin de kendi sınırlamaları olduğu ve bu sınırlamalar Tartışma bölümünde belirtilecektir.

BLI, biyosensör ucundan yansıyan beyaz ışığın girişim desenindeki kaymaları tespit eder; optik kalınlıktaki değişiklikler biyomoleküler bağlanma olaylarına karşılık gelir. Bu kaymalar (Δλ, nm cinsinden) sensorgramlar olarak kaydedilir ve sensör yüzeyindeki kütleyle orantılıdır. BLI, protein-protein ve protein-ligand etkileşimlerine (peptidler ve küçük moleküller dahil) yaygın şekilde uygulanmıştır ve nanomolar ile mikromolar4 arasındaki affinite aralıkları için uygundur. Esnekliği, düşük örnek tüketimi ve nispeten basit kurulumu, deterjanla çözünürülmüş membran proteinlerini incelemek için potansiyel olarak avantajlıbir araç olarak öne çıkar 5,6,7.

Bu çalışma, TMEM120A M207A (bir membran proteini) ile bir peptid inhibitörü olan Grammostola mekanotoksin 4 (GsMTx4) arasındaki etkileşimi karakterize etmek için bir BLI protokolü sunmaktadır. TMEM120A, mekanik ağrı tespitinde görev alan mekanik duyarlı bir iyonkanalı olarak önerilmiştir 8; ancak iyon kanalı aktivitesi tartışmalı olmaya devam etmektedir. Birçok çalışma, HEK293 veya CHOhücreleri 1,9,10,11 gibi heterolog sistemlerde TMEM120A ifade edildiğinde mekanik duyarlı akımların olmadığını bildirmiştir. Bugüne kadar, kapalı halde TMEM120A yapısını dört üzerinde kriyo-EM çalışması çözmüş ve açık konformasyongözlemlenmemiştir 1,9,10,11.

Moleküler dinamik simülasyonları ve elektrofizyolojik analizler, metionine 207 (M207) (M207)'nin vahşi tip insan TMEM120A iyon iletim yolu11 içinde bir kapı bariyeri olarak görev yapabileceğini göstermektedir. Bu kalıntının alanine (M207A) mutasyonunun, muhtemelen heliks paketini değiştirerek ve Phe223 gibi hidrofobik yan zincirleri yerinden değiştirerek iyon geçirgenliğini artırdığı gösterilmiştir. Sonuç olarak, M207A mutantı GsMTx4 ile bağlanma çalışmaları için seçildi.

GsMTx4, örümcek zehrinden türetilen ve mekanosensitif katyon kanallarını inhibe eden bir gating-modifikatör peptiddir. 32 amino asit dizisinden oluşur ve moleküler ağırlığı 4 ila 5 kDa'dır; Piezo ve TRP kanalları da dahil, öncelikle12,13 gözeneklerini doğrudan kapatmak yerine lipid çift tabakasıyla etkileşime girerek gerçekleşir. Önceki çalışmalar, GsMTx4'ün yapay çift katmanlı sistemlerde TMEM120A aktivitesiniazalttığını göstermiştir 8. BLI testlerinde, TMEM120A M207A mutantı anti-FLAG biyosensörlerinde immobilize edilmiş ve artan GsMTx4 konsantrasyonlarına maruz kalmış, böylece ilişki (kaçık) ve dissosiyasyon (kkapalı) oranlarının ölçülmesine olanak sağlamıştır.

Bu çalışma, Biyo-Katman İnterferometrisi (BLI) kullanılarak deterjan optimizasyonu ve kinetik analiz için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. BLI'nin sensör aşırı yüklenmesi veya kütle taşıma etkilerinden kaynaklanabilecek artefaktlar ve hızlı ilişki oranı (kon) etkileşimlerine uygunluğunun azalması gibi bazı sınırlamaları olsa da, kontrollü deterjanla çözünürülmüş koşullarda membran protein-ligand etkileşimlerini incelemek için faydalı bir yöntemdir. Protokol, genellikle nanomolar ile mikromoler arasında olan orta ve düşük bağlanma afinitelerine sahip sistemler için uygundur ve uygun kontroller ve tampon koşulları uygulandığında diğer hidrofobik hedeflere uyarlanabilir.

Protokol

1. Protein arıtma ve örnek optimizasyonu

  1. Hücre kültürü ve transfeksiyon
    1. HEK293T/SF17 süspansiyon hücrelerini, serumsuz ortamda 20 mM L-glutamin takviyesi ile 120 RPM, 37 °C, %80 nem ve %8 CO₂ sıcaklıklarında sallanan kuluçka makinesinde yetiştirin. Hücreleri beşinci pasaja kadar taşıyarak korumak; hücrelerin yaklaşık 5 × 10⁶ hücre/mL yoğunluğa ulaşmasını sağlar.
    2. Üreticilerin talimatlarına göre pCDNA3.1 vektöründe TMEM120A M207A plazmidi (N-terminal FLAG-Linker-3C-Linker-TMEM120A M207A) ile birlikte hücreleri transfekte edin (bkz. Malzemeler Tablosu).
    3. Pellet hücreleri 5.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjle geçirmiştir. Hücre pelletini -80 °C'de saklayarak arıtın.
  2. Hücre lizisi ve çözünürtülmesi (Şekil 1)
    1. 30 mL hücre pelletini çözünürme tamponu içinde yeniden askıya alın; bu tampon içinde 100 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), pH 7.8; 300 mM NaCl; %0,5 (w/v) veya 4,98 mM lauril maltoz neopentil glikol (LMNG); 1x proteaz inhibitörü kokteyli; 50 μg DNaz I; %10 (v/v) gliserol.
    2. Hücreleri ultrason ile %25 genlikle 20 saniye açık/20 saniye kapalı darbe döngüsü ile 15 dakika boyunca lizize edin; numuneyi aşırı ısınmayı önlemek için buzun üzerinde tutulur.
    3. Lizat 25.800 × g'de 45 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjle temizlenin.
  3. Anti-FLAG reçine kullanarak affinite arıtma
    1. 25 mM HEPES içeren denge tamponu ile anti-FLAG M2 reçinesini dengeleyin; pH 7.8; 200 mM NaCl; %0,05 (kızıl/v) veya 0,4975 mM LMNG; %10 (v/v) gliserol.
    2. Arıtılmış süpernatantı dengelenmiş reçine ile 4 °C'de 2 saat boyunca bir sallayıcı üzerinde kuluçka yapın.
    3. Reçineyi 25 mM HEPES içeren yıkama tamponu ile 2 kez yıkayın, pH 7.8; 150 mM NaCl; %0,05 (kızıl/v) veya 0,4975 mM LMNG; %10 (v/v) gliserol.
    4. Bağlı proteini, 25 mM HEPES içeren elyusiyon tamponu ile elüasyonla elüetle; 400 mM NaCl; %0,001 (k/v) veya 0,00995 mM LMNG; %10 (v/v) gliserol; 200 μg/mL FLAG peptidi.
  4. Konsantrasyon ve boyut dışlama kromatografisi (SEC)
    1. Elutlanan proteini 30 kDa kesme ile santrifüj filtre ünitesi kullanarak ~500 μL'ye yoğunlaştırın.
    2. SEC, referans boyut hariç kolonu kullanılarak 25 mM HEPES ile dengelenerek gerçekleştirilir, pH 7.8; 200 mM NaCl; %0.00015 (v/k/k) veya 0.00149 mM LMNG.
    3. Hedef proteine karşılık gelen pik fraksiyonları toplayın ve bir kenara toplayın.
    4. Biriktirilmiş fraksiyonları ~3 mg/mL nihai konsantrasyona konsantrasyonla konsantre edin. Afinite saflaştırmasından sonra, TMEM120A M207A protein monomerinin SDS-PAGE'de yaklaşık 43 kDa olarak göründüğünü doğrulayın (Şekil 2A). SEC için, LMNG'deki saflaştırılmış proteinin yaklaşık 150 kDa'ya karşılık gelen monodispers bir zirve olarak elüt olduğunu doğrulayın; bu da TMEM120A M207A dimer ile birlikte LMNG deterjan miselini temsil eder (Şekil 2B).
      NOT: Bazen monomer protein bandı 50 kDa civarında görünebilir; bu, deterjanla çözünürülmüş membran proteinleri için yaygındır, çünkü kaynatma membran protein örnekleri tipik değildir.

2. Nano diferansiyel taramalı florometri (NanoDSF) ile termal stabilite analizi

  1. Arıtılmış TMEM120A M207A proteinini SEC tamponunda 0,15 mg/mL'ye seyreldin (25 mM HEPES, pH 7,8, 200 mM NaCl, %0,00015 LMNG).
  2. Her örnekten 10 μL yüksek hassasiyetli kapilyarlara yüklenin.
  3. Termal kaydırma testini bir NanoDSF cihazında 25 °C'den 90 °C'ye sıcaklık rampası ile çalıştırın.
  4. Testi kurmak ve otomatik analiz yapmak için uyumlu yazılım kullanın.
  5. Tek bir termal geçiş (Tm) eğrisinin görünür olduğunu doğrulayın; bu da işbirlikçi açılma olayını gösterir (Şekil 3).

3. Oligomerik durum belirlemesi için kütle fotometrisi

  1. SEC tamponunda 80 nM'ye seyreltilmiş bir örnek hazırlayın (25 mM HEPES, pH 7.8, 200 mM NaCl, %0.00015 LMNG).
  2. Örneği önceden temizlenmiş kütle fotometri uyumlu slaytlara yerleştirin.
  3. Standart ayarlarla veri edinin ve protein standartlarıyla kalibre edin.
  4. Veri işlemek, analiz yazılımıyla kütle dağılımı histogramları oluşturmak için (Şekil 4A-C).

4. Biyokatman interferometrisi (BLI) protokolü

NOT: Bu protokol, FLAG etiketli TMEM120A M207A ile GsMTx4 gibi ligandlar arasındaki etkileşimleri incelemek için tasarlanmış bir BLI kinetik testini tanımlar; bu, 384 kuyu mikroplaka formatı kullanmaktadır. TMEM120A için geliştirilmiş olsa da, iş akışı diğer zar proteinleri için uyarlanabilir. Tüm deneyler, FLAG etiketli M207A'yı hareketsiz hale getirmek için FLAG biyosensör problarıyla optik interferometri platformu TMEM120A kullanılarak gerçekleştirildi. 384 kuyruklu siyah bir mikroplaka, optimize edilmiş boyut-dışlama kromatografi (SEC) tamponu ile kullanıldı; bunlar 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, %0.00015 (w/v) LMNG ve %0.0005 Tween-20, pH 7.8 içeriyordu. Tween-20, özgün olmayan bağlanmayı en aza indirmek için dahil edilmiştir. Protein konsantrasyonu 250 nM'de tutuldu ve tekrarlanabilirliği sağlamak için tüm testler çift olarak yapıldı.

  1. Test tasarımı değerlendirmeleri
    1. Sıcaklık dengesi
      1. BLI testine başlamadan önce, tüm analiz bileşenlerini - tamponlar, örnekler ve biyosensör probları dahil - oda sıcaklığına (yaklaşık 20-25 °C) dengeleyin. Veri toplama sırasında, protein stabilitesi, ligand bağlanması ve tekrarlanabilirliği optimize etmek için kinetik analizler için önerilen analiz sıcaklığını 30 °C'de tutun.
        NOT: Bu dengeleme adımı, deney sırasında sıcaklık dalgalanmalarından kaynaklanan artefaktları tutarlı kinetik profiller sağlar ve en aza indirir. Tüm reaktiflerin ve biyosensörlerin termal dengeye ulaşması için yeterli zaman (en az 10-15 dakika) tanıyarak teste başlamadan önce alın.
    2. Sensör hidratasyonu ve yenilenmesi
      1. Yeni FLAG biyosensörlerini, 250 μL BLI uyumlu tampon (SEC tamponu, 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, %0.00015 w/v LMNG ve %0.00005 Tween-20, pH 7.8) içeren SEC tamponunda en az 10 dakika önce Max plakada hidratlayın.
        NOT: Biyosensörleri temiz, tozsuz cımbızlarla dikkatlice kullanın; bu kontaminasyondan kaçının; bu sinyal alımını engelleyebilir ve tutarsız sonuçlara yol açabilir. Sensör yeniden kullanımı için, Q tamponu (0.3 M glisin, pH 3.8) kullanılarak rejenerasyon yapılabilir. Doğru hidrasyon ve yenilenme, sensör performansını ve tekrarlanabilirliğini korumak için kritik öneme sahiptir; özellikle çevresel koşullara duyarlı olan deterjanla çözünürülmüş membran proteinleriyle çalışırken.
    3. Tampon yönetimi
      1. Sıvı dağıtırken hava kabarcıklarından kaçının, çünkü bunlar optik sinyal alımını engelleyebilir.
    4. Tampon bileşimi ve tutarlılığı
      1. Protein fonksiyonunu koruyor, spesifik olmayan etkileşimleri en aza indiren bir tampon kullanın. M207A TMEM120A için, 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, %0.00015 (w/v) LMNG, %0.0005 (w/v) Tween 20, pH 7.8 içeren tampon hazırlanır.
    5. Protein immobilizasyonu
      1. Ligand yüklemesini optimize ederek %50-80 sensör doygunluğu elde edin. 250 nM'de sabit bir protein konsantrasyonu kullanın ve tipik yük süresi yaklaşık 120 saniyedir. FLAG etiketli TMEM120A M207A (250 nM) ile biyosensöre 120 saniye yükleyin, böylece %50-80 doygunluk sağlanır.
      2. Yükleme aşamasında biyosensör sinyalinin maksimum bağlama kapasitesinin %50-80'ine ulaştığını doğrulayın.
        NOT: %50'nin altındaki sinyaller protein immobilizasyonunun yetersiz olduğunu gösterebilirken, %80'in üzerindeki sinyaller kitle taşımacılığı kısıtlamaları veya sterik engeller yaratabilir ve kinetik ölçümleri tehlikeye atabilir.
      3. Potansiyel kütle taşıma etkilerini değerlendirmek için, analit konsantrasyonunun (örneğin, 100 nM GsMTx4) sabit tutulduğu ve FLAG biyosensörlerinde TMEM120A-M207A'nın yük seviyelerinin değiştirildiği bir kontrol deneyi yapılmalıdır (Ek Şekil S1).
        NOT: Sonraki kinetik ölçümler—ilişki, ayrışma, küresel bağlanma uyumları ve kon ile koff belirlenmesi gibi ölçümler—ana testte elde edilenlerden anlamlı şekilde farklı olmadı. Bu sonuç, %50-80 aralığında TMEM120A yüklemenin önemli kütle taşıma artefaktları oluşturmadığını ve biyosensör yük seviyesinin güvenilir kinetik analiz için uygun olduğunu doğruladığını göstermektedir.
    6. KD tahmini
      1. Bağlanma afinitesini (KD) 0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM ve 100 μM olan analit (GsMTx4) konsantrasyonları test ederek belirleyin.
    7. Arka plan sinyal kontrolleri
      1. Arka plan sinyallerini doğru şekilde çıkarmak ve güvenilir kinetik ölçümler sağlamak için uygun kontrolleri dahil etmek.
      2. Test sırasında ortaya çıkabilecek spesifik olmayan bağlanma veya kaymayı hesaba katmak için referans FLAG probu kullanın.
        NOT: Bu referans probunda hedef protein immobilize edilmemeli ve örnek içeren problardan alınan sinyali düzeltmek için bir temel olarak hizmet vermelidir.
      3. Referans sinyalini örnek sinyalinden çıkararak yalnızca FLAG etiketli TMEM120A M207A ile analitler arasındaki spesifik etkileşimleri analiz edin.
        NOT: Referans FLAG probun test boyunca minimum sinyal gösterdiğini doğrulayın. Stabil ve düşük bir taban, önemsiz spesifik olmayan bağlanmayı gösterir. Referans sinyali dalgalanırsa veya artarsa, kinetik analizden önce tampon bileşimini, prob kullanımını veya örnek hazırlığını yeniden değerlendirerek spesifik olmayan etkileşimleri azaltabilirsiniz.
  2. Kinetik analizi için temel analiz parametrelerinin konfigürasyonu
    1. Veri toplama frekansını 5 Hz'ye ayarlayarak 5 veri noktası/s toplayın (tüm kinetik testler için önerilir).
    2. Plaka formatı olarak 384 kuyuyla plaka seçin.
    3. Shaker hızını 1.000 RPM'ye ve sıcaklığı ortam ile 30 °C arasında ayarlayın (bu deneyde en iyi kinetik sonuçlar için 30 °C kullanılmıştır).
  3. Plaka kurulumunu yapılandırın.
    1. Plaka Kurulumu Sekmesine gidin ve hem 384 kuluklu plaka hem de Max plaka için kuyu atamalarını tanımlayın.
    2. 384 kuyu plakasında kuyu fonksiyonlarını ata.
      NOT: Hem 384 kuyuyla levha hem de Max Plate için kullanılan semboller ve açıklamalar, Ek Tablo S1'de özetlenmiştir.
      1. Kuyrukları role göre etiketleyin: tampon, protein (yükleme), ligand (örnek).
      2. Protein yükleme kuyularını konsantrasyonlu (örneğin, 250 nM) kinetik testler için nota edin.
        NOT: Doğru etiketleme, küzerinde ve KD hesaplamak için gereklidir ( bkz. Ek Şekil S2A).
    3. Max plaka haritasını (prob plakası) yapılandırın.
      1. Uygun kuyulara biyosensör probları atanın.
      2. Eğer sonda yenilenmesi planlanıyorsa, rejenerasyon ve nötralizasyon tamponları için kuyular atayın. Bu kuyular yazılımda açıkça etiketlenerek rejenerasyon sırasında doğru otomasyonu sağlamak için ( bkz. Ek Tablo S2).
        NOT: Test tamponu 25 mM HEPES (pH 7.8), 200 mM NaCl, %0.00015 (w/v) LMNG ve %0.0005 (v/v) Tween-20'den oluşuyordu. Anti-FLAG biyosensör problarının rejenerasyon adımı, %0,3 glisin (pH 3,8) içeren Q tamponu kullanılarak gerçekleştirildi, ardından test tamponu ile nötralize adım yapıldı (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, %0,00015 LMNG ve %0,0005 Tween-20, pH 7,8).
  4. Assay Steps sekmesini seçin.
    1. Kinetik test iş akışını yapılandırmak için Assay Steps sekmesine gidin. Her test aşaması için kuyuyu pozisyonlarını belirtin; başlangıç, protein yükleme, birleşim ve ayrışma dahil olmak üzere (bkz. Ek Şekil S3).
    2. Açılır menüden uygun adım türünü seçin. Doğru kinetik analiz için ilişkilendirme ve ayrışma adımlarının doğru etiketlendiğinden emin olun.
    3. Tüm etkileşim aşamaları için pozlama sürelerini belirlemek için her adımın süresini saniye cinsinden girin.
      1. Protein yüklenmeden önce sensör dengelenmesine izin verecek temel adım süresini ayarlayın (60 s).
      2. Protein yükleme adım süresini istenen ligand immobilizasyon seviyelerine (60 s) ulaşmak için ayarlayın (Şekil 5).
      3. Yeterli analiz bağlanmasına izin verecek şekilde ilişki adım süresini ayarlayın (300 sn) (Şekil 5).
      4. Dissosiyasyon adım süresini, analit bağlanmama kinetiklerini (600 s) yeterli şekilde yakalayacak şekilde ayarlayın (Şekil 5).
    4. Her adım için sarsıntı hızını (RPM) ayarlayın, böylece tutarlı karıştırma ve optimal veri kalitesi (1.000 RPM) korunuyor.
  5. Hizalama ve filtreleme adımı ( bkz. Ek Şekil S4 ve Ek Şekil S5)
    1. Kinetik adımlardan artefaktları çıkarmak için veri aralığını gerekli şekilde ayarlayarak ham veri düzeltmesi gerçekleştirin.
    2. Y eksenini hizalamak için, Align Step Type altında Association seçerek ve Begin seçeneğini etkinleştirerek verileri birleştirme adımının başında hizalayın.
    3. Standart kinetik testler sırasında adımlar arasında sürekliliği korumak için Aralık düzeltme seçeneğini etkinleştirin.
    4. Filtreleme: Sinyal gürültüsünü azaltmak için veri yumuşatması uygulanır ve trendleri bozmadan. Düzleştirilmiş verileri ham sinyallerle karşılaştırmak için İşlemen'i seçin.
  6. Bir referans adımı belirleyin ( bkz. Ek Şekil S6).
    1. Referans probu seçerek referans probu belirleyin ve Ref. Probe butonuna tıklayın.
    2. Örnek probları seçerek örnek probların ilgili sütun numaralarına tıklayın.
    3. Çıkarma fonksiyonunu tanımlamak için Formül Düzenleyici'yi açın, Formülü Düzenle düğmesine tıklayın ve arka planı kaldırmak için çıkarma fonksiyonunu tanımlayın.
    4. Referans çıkarmanın doğru uygulandığını doğrulamak için Tablo görünümünü inceleyin.
  7. Bağlama basaması
    1. Fiting sekmesine gidin ve analiz parametrelerini tanımlayın (Ek Şekil S7).
    2. Veri seçimi: Yerel kinetik uyum için hem ilişki hem de ayrışma aşamalarını dahil edin. Kötü eğri uyumu veya düzensiz sinyal gösteriyorlarsa istisna olguları manuel olarak hariç tutun.
    3. Bağlama modeli seçimi: Karmaşık davranış gözlemlenmedikçe verilere uyacak şekilde 1:1 bağlama modelini seçin. Model uygunluğunu doğrulamak için eğri üstleme ve artıkları gözden geçirin.
    4. Uyum stratejisi: Veri kalitesi ve deneysel hedeflere bağlı olarak aşağıdaki uyum stratejilerinden birini seçin:
      1. Lokel: Her analit konsantrasyonuna ayrı ayrı uyarlar, böylece ilişki ve dissosiyasyon kinetiklerinin bağımsız değerlendirilmesine olanak tanır.
      2. Küresel: Tüm analit konsantrasyonlarını tek bir kinetik parametre seti kullanarak aynı anda uyarlar, veri seti için genel bir model sağlar.
      3. Full: Tüm yoğunlaşmalarda hem ilişki hem de ayrışma aşamalarına küresel olarak uyar.
      4. Kısmi: Sadece ilişki aşamasına uyuyor, dissosiyasyonu görmezden geliyor.
        NOT: BLI verileri, lokal tam uyumlu 1:1 Langmuir bağlama modeli kullanılarak analiz edilmiştir. Yerel uyum, her analit konsantrasyonunun bağımsız olarak işlenmesini sağlar; böylece ilişki kinetiklerinin doğru temsili sağlanır ve ayrışma aşamasında heterojenlikten kaynaklanan artefaktları en aza indirir. Bu yaklaşım, değişken veya kararsız sinyallere sahip bölgelerde aşırı uyum sağlamayı önler ve kinetik parametrelerin (kaçık ve kkapalı) daha güvenilir tahminini sağlar (Tablo 1 ve Tablo 2).
  8. Kinetik analiz
    1. Uyarlanan eğriler ve köküntülerin gözden geçirilmesi: Modelin kalitesini ve geçerliliğini değerlendirmek için uyarlanan eğrileri ve ilgili kalıntıları inceleyin. Kalıntıların sistematik sapmalar olmadan sıfır civarında rastgele dağıtıldığı doğrulanır (temsil kalıntılar için Şekil 4E'ye bakınız).
    2. Kötü uyan verilerin dışlanması: Düz, gürültülü veya başka şekilde güvenilmez sinyaller gösteren analit konsantrasyonları çıkarılarak genel model doğruluğunu artırın.
      NOT: Örneğin, 10 μM konsantrasyonu, 5 μM veri setiyle örtüşmesi nedeniyle uyumdan çıkarılmıştır; bu da kinetik parametre tahminini bozabilirdi (bkz. Şekil 6A,B).

Sonuçlar

TMEM120 M207A mutantı, N-terminal FLAG etiketi kodlayan pCDNA3.1 vektörü kullanılarak HEK293SF-17 süspansiyon hücrelerinde ifade edildi Şekil 1. Geçici transfeksiyon, rekombinant protein ekspresyonunu mümkün kıldı. Hücre hasadından sonra, membran proteinleri %0,5 lauryl maltoz neopentil glikol (LMNG) içinde çözünürüldü ve bu deterjan membran proteininin çözünürlüğünü korumaya uygun iyon olmayan bir deterjan oldu.

Çözünürülmüş fraksiyon, anti-FLAG M2 reçinesi kullanılarak afinite saflatmasına tabi tutuldu. Reçine, spesifik olmayan proteinleri çıkarmak için %0,01 LMNG içeren tampon ile yıkanmış ve TMEM120 M207A, %0,001 LMNG içeren tamponda elüasyon yapılmıştır. Elülasyon, örnek verimine bağlı olarak 30 kDa veya 100 kDa moleküler ağırlık kesimlerine sahip santrifüj filtreler kullanılarak yoğunlaştırıldı. Daha fazla arındırma boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile gerçekleştirildi. Son SEC adımı, %0.00015 LMNG içeren bir tamponda gerçekleştirildi ve sonraki yapısal ve fonksiyonel analizler için uygun homojen ve stabil bir protein hazırlamasıyla uyumlu monodispers elülasyon profili oluşturuldu (Şekil 2B).

FLAG etiketli TMEM120 M207A'nın optimizasyonu ve biyofiziksel karakterizasyonu Şekil 2'de özetlenmiştir. İfade ve arındırma, yaklaşık 50 kDa olarak tek bir bant gösteren SDS-PAGE ile doğrulandı. Gözlemlenen göç, monomerik formun beklenen moleküler ağırlığının biraz üzerindeydi (Şekil 2A), muhtemelen elektroforezden önceki kaynatılmamış örnekten kaynaklanıyordu. SEC kromatogramı, yaklaşık %0.00015 (w/v) LMNG'de yaklaşık 150 kDa görünen moleküler kütleye karşılık gelen tek bir simetrik zirve elüasyonu gösterdi (Şekil 2B), LMNG deterjan misellerindeki TMEM120A M207A dimeriyle uyumludur. Bu elusyon davranışı, homojen ve monodispers bir protein popülasyonu sergiler, bu da onu aşağı akış biyofiziksel karakterizasyonu için uygun kılar.

LMNG'nin deterjan miselleri deneysel tampon koşullarında kütle fotometrisi kullanılarak analiz edildi. Protein yokluğunda farklı LMNG konsantrasyonlarına sahip SEC tamponunda ölçümler, deterjan misellerinin şeffaf moleküler kütleye katkısını değerlendirmek için yapıldı. %0,001 (w/v) LMNG'de, kritik misel konsantrasyonu (CMC) üzerinde bir konsantrasyonda, baskın zirve yaklaşık 69 kDa olarak tespit edildi; bu, yalnızca LMNG misellerine karşılık gelir ve herhangi bir ilişkili protein olmadan (Şekil 4A). LMNG konsantrasyonu CMC'nin altına %0.0001 (w/v) düşürüldüğünde, ana tür ~48 kDa'ya kaymış ve bu da proteinsiz daha küçük kalıntı LMNG agregaları veya submiseller yığıncakların varlığını gösterir (Şekil 4B). Daha sonra (Şekil 4C), TMEM120A M207A, farklı LMNG konsantrasyonları içeren SEC tamponunda seyreltilerek oligomerik durumunu kütle fotometrisiyle değerlendirdi. %0.00001 LMNG (CMC, magenta'nın ~20 kat altında) yaklaşık 42 kDa'da baskın bir zirve gözlemlendi; bu, TMEM120A M207A'nın monomerine karşılık geldi. %0.00015 LMNG (CMC, mavi'nin ~10 kat altında) olan ana popülasyon ~86 kDa dimerlerin varlığını gösterdi. LMNG konsantrasyonunun %0,001'e (CMC, turuncudan ~2 kat üstün) yükseltildiğinde, protein-deterjan kompleksleriyle uyumlu olan ~150 kDa büyük bir tür elde edilmiştir. %0,002 LMNG (CMC'nin ~4 kat üzerinde, yeşil) 180 kDa civarında merkezlenmiş geniş bir dağılım tespit edildi; bu dağılım daha büyük misel-ilişkili yapımları veya daha yüksek dereceli oligomerleri temsil ediyordu. Bu sonuçlar, SEC tamponu içindeki LMNG konsantrasyonunun TMEM120A M207A'nın açık oligomerik durumunu güçlü şekilde etkilediğini; CMC'nin altında monomer-dimer dengesi gözlemlendiğini ve CMC'nin üzerinde baskın olan deterjan-protein kompleksi oluşumunu göstermektedir.

Ana SEC zirvesinden toplanan ve SEC tamponunda tutulan TMEM120A M207A'nın termodinamik kararlılığı (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, %0.00015 (w/v) LMNG, pH 7.8) termal denatürasyon analiziyle değerlendirildi. Protein, bu deterjanla çözünürülmüş koşullarda erime sıcaklığına (Tm) karşılık gelen yaklaşık 46 °C sıcaklıkta bir dönüş noktası göstermiştir. Bu Tm değeri, orta derecede termal stabiliteyi gösterir; TMEM120A M207A'nın LMNG miselleri içinde doğru kıvrılmış bir konformasyonu koruduğunu, ancak daha yüksek sıcaklıklarda açılmaya veya birikmeye başlayabileceğini gösterir.

Biyokatman interferometrisi (BLI), TMEM120A M207A'nın GsMTx4T'ye μM bağlanma afinitesini gösterir. Şekil 5'teki izler beş deneysel adımı gösterir: (1) başlangıç, (2) M207A örnek yüklemesi TMEM120A, (3) özgün olmayan bağlanma ve fazla M207A'yı TMEM120A çıkaran başlangıç, (4) ilişki ve (5) ayrışma. Dalga boyu kayması (nm), immobilize edilmiş M207A ile etkileşime giren GsMTx4 (0, 5, 10, 20, 30, 50 ve 100 μM) konsantrasyonları için zaman TMEM120A içinde çizilir.

İlk başlangıç aşamasında (adım 1), sinyal stabil kaldı ve tamponda sensör dengesini doğruladı. TMEM120A M207A yüklemesi (adım 2), sensörler arasında prob doygunluğuna karşılık gelen karakteristik bir sinyal artışı sağladı. Yükleme aşaması, keskin bir plato yerine hafifçe kavisli bir yanıt gösterdi; bu da kısmi kütle taşıma sınırlamasını yansıtıyor olabilir; burada M207A'nın sensör yüzeyine difüzyonu, bağlanma hızından daha yavaş TMEM120A — bu, membran veya deterjanla çözünürülmüş proteinler için yaygın bir etki olup görünür yüzey kapsayışını etkileyebilir.

Sonraki temel adım (adım 3) M207A'yı fiilen bağlanmamış veya gevşek şekilde TMEM120A çıkardı. Bağlantı aşamasında (4. adım), GsMTx4 konsantrasyonlarının artması, dalga boyu kaymasında belirgin ve konsantrasyona bağlı artışlara yol açtı. Dissosiyasyon sırasında (5. adım), biyosensör CMC'nin ~10x altında LMNG içeren SEC tamponuna yerleştirildi. Dissosiyasyonun ilk 5-10 saniyesi hızlı bir sinyal azalması gösterdi; muhtemelen kolayca erişilebilen bölgelerden GsMTx4'ün hızlı salınımını temsil ediyor, ardından daha yavaş bir bozunma görüldü; bu da yavaş ayrışma kinetiği TMEM120A daha stabil M207A-GsMTx4 komplekslerini yansıtabilir. Referans prob sinyalleri deney boyunca düz kaldı ve bu da minimal özgün olmayan bağlanmayı gösteriyordu. Genel olarak, bu veriler M207A-GsMTx4 TMEM120A spesifik etkileşimlerini göstermektedir; Ancak, gözlemlenen kinetikler, deterjan ortamı ve potansiyel kütle taşımacılığı etkileri nedeniyle dikkatli yorumlanmalıdır.

Referans prob çıkarmasından sonra işlenen verilerin ilişkilendirilme ve dissosiyasyon sensörgramları (Şekil 6A), GsMTx4 için 5-100 μM aralığında konsantrasyona bağlı yanıtlar göstermiştir. Ligand konsantrasyonlarının artması, dalga boyu kaymalarının kademeli olarak artmasına yol açmış, ardından 200 saniyelik ayrışma aşamasında yavaş ve kademeli bir azalma olmuştur. 10 μM'lik veri seti, 5 μM iziyle örtüşmesi nedeniyle uyarlanmaktan çıkarıldı ve bu da genel model kalitesini iyileştirdi.

Kinetik analiz, bireysel analit konsantrasyonlarının paylaşılan kinetik çerçeve içinde bağımsız olarak uydurulduğu yerel tam uyum stratejisiyle 1:1 Langmuir ilişki-ayrışma modeli kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 6B). Uyumlu eğriler (kırmızı) deneysel izlerle iyi uyum sağladı ve düşük mikromolar aralığında tahmini bir dissosiyasyon sabiti (KD) verdi. Kalıntı analizi (Şekil 6C) önemli sistematik sapmalar ortaya koymadı; bu da uygulanan modelin veri seti için uygun olduğunu gösterdi. Erken ilişki aşamasında gözlemlenen küçük farklılıklar, kütle taşınmasındaki sınırlamaları veya deterjan misel ortamının etkilerini yansıtabilir. Uyum sağlayan ilişki ve ayrışma eğrileri, kalıntı grafikler ve çoklu test replikasyonları ve prob pozisyonlarında uyum istatistiklerine ek örnekler, Ek Şekil S8'de gösterilmiştir.

Ham verilerde (Şekil 5), dissosiyasyonun ilk 5-10 saniyesi hızlı bir sinyal azalması gösterdi; muhtemelen kolayca erişilebilen alanlardan GsMTx4'ün hızlı salınmasını temsil ediyor ve ardından daha yavaş bir bozunma gelmiş ki bu da yavaş dissosiyasyon kinetiği TMEM120A daha stabil M207A-GsMTx4 komplekslerini yansıtabilir. Bu nedenle, Tablo 2'de ayrışmanın ilk 100 saniyesi uyumdan çıkarılmıştır. Sistematik sapmanın olmaması, TMEM120A M207A için tüm test edilen konsantrasyonlarda yerel tam uyumlu Langmuir 1:1 modelinin iyi uyumunu gösterir (Şekil 7).

GsMTx4'ün TMEM120A M207A'ya bağlanmasının kinetik analizi, 5-100 μM ligand aralığında konsantrasyona bağlı ilişki ve dissosiyasyon davranışlarını ortaya koydu (Tablo 1). Gözlemlenen ilişki oranı sabit (kon) GsMTx4 konsantrasyonu arttıkça mütevazı bir şekilde arttı; yaklaşık 1.0 × 10⁻⁶'den 3.2 × 10-6 1/M·s'e kadar değişirken, tahmini ayrışma oranı sabitleri (koff) deneysel hatada sıfıra yakın kaldı ve test edilen koşullarda yavaş veya önemsiz bir ayrışma aşamasını önerdi. Hesaplanan denge dissosiyasyon sabitleri (Kd) düşük ve orta mikromolar aralığında (~0.8-3.3 μM) bulunuyordu ve bu da orta düzeyde bir affinite etkileşimiyle tutarlı. Langmuir 1:1 bağlama modeli kullanılarak yapılan yerel tam uyum, tüm GsMTx4 konsantrasyonlarında yüksek kaliteli uyumlar sağladı; korelasyon katsayıları 0.99'u aştı ve hem ilişki hem de ayrışma fazları için düşük göreli χ2 değerleri elde edildi (Tablo 1). Hesaplanan denge ayrışma sabitleri, konsantrasyonlar ve tekrarlar arasında tutarlıydı; KD değerleri düşük mikromolar aralığında (~1-2 μM) bulunuyordu; bu da TMEM120A M207A ile GsMTx4 arasında orta ama spesifik bağlanmayı gösteriyordu.

Her konsantrasyondaki çoğaltma veri setleri, hem ilişkilendirme hem de ayrışma uyumları için yüksek korelasyon katsayıları (R² > 0.99) ile gösterildiği gibi tekrarlanabilirlik göstermiştir. Tam ve göreceli χ² değerleri düşük ve replikalar arasında karşılaştırılabilir olup, analizde uygulanan 1:1 Langmuir bağlanma modelinin sağlamlığını daha da destekledi. Daha yüksek ligand konsantrasyonlarında (≥50 μM), hafif artan kon ve KD değerleri gözlemlendi; bu da gerçek afinite değişikliklerinden ziyade küçük kütle taşıma etkileri veya yerel yüzey heterojenliğini gösterebilir. Birden fazla replikat ve prob pozisyonları arasında kinetik tutarlılık, Ek Şekil S9'da daha ayrıntılı olarak gösterilmiştir.

Kinetik profiller, GsMTx4'ün TMEM120A M207A ile spesifik ve istikrarlı bir şekilde etkileşime girdiğini, yavaş ayrışma ve mikromolar bağlanma afinitesi ile karakterize edilen nispeten stabil kompleksler oluşturduğunu göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: HEK293SF-17 süspansiyon hücresinde ifade edilen TMEM120A M207A mutantının arıtma iş akışı. Protein arıtma prosedürünün şematik genel bakışı. TMEM120A M207A, HEK293SF-17 hücrelerinde pCDNA3.1 plazmidlerinden eksprese edildi. Hücreler %0,5 LMNG'de çözünürüldü ve ardından anti-FLAG M2 reçine kullanılarak afinite saflaştırması yapıldı. Reçine, spesifik olmayan proteinleri almak için %0,01 LMNG içeren tampon ile yıkanmıştır. TMEM120A M207A, %0.001 LMNG içeren tampon içinde eluasyon yapıldı. Eluat, 100 kDa veya 30 kDa moleküler ağırlık kesme filtreleriyle yoğunlaştırıldı ve %0.00015 LMNG içeren bir tampon içinde boyut dışlama kromatografisiyle daha da saflaştırıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: LMNG deterjanında arıtılmış M207A'nın boyut dışlama kromatografisi ve SDS TMEM120A SAYFASI (A) FLAG etiketli TMEM120A M207A'nın SDS-SAYFASI, boyut dışlama kromatografisiyle arıtılmış. Protein bandı, beklenen monomere karşılık gelen koridor 1'de ~50 kDa olarak görünür. (B) SEC tamponunda bir SEC kolonunda saflaştırılmış TMEM120A M207A'nın SEC profili (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, %0.00015 LMNG, pH 7.8). Protein elülasyonu, aşağı akış biyofiziksel testler için uygun baskın monodispers türü gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: LMNG'de saflaştırılmış TMEM120A M207A'nın diferansiyel taramalı florometrisi. DSF, 46 °C sıcaklıkta bir termodinamik dönüş noktası gösterir; bu da proteinin test edilen tampon koşullarında termal stabilitesini gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: LMNG deterjanında temizlenmiş TMEM120A M207A'nın kitle fotometri tekniğiyle karakterizasyonu. (A,B) Farklı LMNG konsantrasyonlarında SEC tamponunun kütle fotometrisi. %0.001 LMNG (kritik misel konsantrasyonu CMC'nin üzerinde) görünen moleküler ağırlık ~69 kDa'dır ve esas olarak LMNG misellerine karşılık gelir. %0.0001 LMNG (CMC'nin on katı altında) ile zirve ~48 kDa olarak görülür. (C) LMNG konsantrasyonuna bağlı etkilerin kütle fotometri analizi, TMEM120A oligomerizasyonu üzerine. TMEM120A %0.00001 LMNG'de (CMC, magenta'nın ~20 katı altında) ana popülasyonu yaklaşık 42 kDa (monomer) olarak gösterir. %0.00015 LMNG'de (CMC'nin ~10 kat altında, mavi), dimerle tutarlı olan ~86 kDa bir popülasyon gözlemlenir. %0.001 LMNG'de (~CMC'nin 2 katı üzerinde, turuncu), ~150 kDa ile ana tür protein-deterjan komplekslerine karşılık gelir. %0,002 LMNG'de (CMC'nin ~4 kat üzerinde, yeşil), ~180 kDa merkezli geniş bir dağılım, daha büyük misel ilişkili yapımları veya daha yüksek dereceli oligomerleri gösterir. Bu sonuçlar, LMNG konsantrasyonunun TMEM120A'nin görünen oligomerik durumunu güçlü şekilde etkilediğini; monomer-dimer dengesinin CMC'nin altında gözlemlendiğini ve CMC'nin üzerinde protein-deterjan kompleksi oluşumunun baskın olduğunu göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: M207A-GsMTx4 etkileşimlerini gösteren TMEM120A yazılımdan ham veriler. Biyokatman interferometrisi, TMEM120A (M207A) mekanik duyarlı kanal inhibitörü GsMTx4'e mikromolar afiniteyle bağlandığını göstermektedir. Şekil, Gator Prime yazılımından elde edilen ham BLI yanıt verilerini göstermekte olup, beş temel test aşamasını tanımlıyor: (1) Sinyalin stabil kaldığı başlangıç temeli; (2) Protein immobilizasyonu (yükleme), bu da dalga boyu kaymasında yaklaşık 1,5 nm artışa yol açar; (3) İkinci başlangıç çizgisi, bağlanmamış veya gevşek ilişkili proteinin çıkarılmasına izin verir; (4) Birleşme aşaması (ligand bağlanması), burada GsMTx4 konsantrasyonlarının artması, 300 saniye içinde ~5,5 nm'ye kadar yanıt artışı sağlar; ve (5) Dissosiyasyon evresi (ligand salınımı), 600 saniye üzerinde kademeli sinyal düşüşünü gösteriyor. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: TMEM120A M207A'nın GsMTx4 peptidi ile bağlanma kinetiği . (A) GsMTx4 ile beş konsantrasyonda etkileşime giren TMEM120A M207A'nın ilişki ve dissosiyasyon sensorgramları: 5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM ve 100 μM. 10 μM'lik veri seti, 5 μM eğrisi ile örtüşmesi nedeniyle uyarlamadan çıkarıldı ve bu da genel model uyumunu iyileştirdi. Dikey kesik kırmızı çizgiler, ayrışma aşamasının başlangıç ve sonunu gösterir. (B) Sensatorgramların uydurulması, Yerel Tam Uyumlu Langmuir 1:1 ilişki-ayrışma modeli kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kırmızı eğriler uyumlu modeli temsil ederken, deneysel izler her GsMTx4 konsantrasyonu için ölçülen ilişki ve ayrışma verilerine karşılık gelir (her koşul başına iki tekrar). (C) Deneysel veriler ile uyumlu model arasındaki sapmayı hem ilişkilendirme hem de ayrışma aşamaları için gösteren kalıntı grafikler, uyumun iyiliğini doğrular. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Gösterilen uyarlanmış bağlama eğrilerine karşılık gelen kalıntı grafikler. Her grafik, tek bir GsMTx4 konsantrasyonu için kalıntıları (deneysel veriler ile uyumlu model arasındaki farkı) temsil eder: 5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM ve 100 μM. Kalıntılar, kayma sapması (nm) ve zaman (lar) karşısında gösterilir ve hem ilişki hem de ayrışma fazlarında sıfır civarında rastgele dağılım gösterir. Sistematik sapmanın olmaması, TMEM120A M207A için tüm test edilen konsantrasyonlarda Yerel Tam Uyum Langmuir 1:1 modelinin iyi bir uyumunu göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: GsMTx4'e bağlanan TMEM120A M207A için kinetik parametrelerin özeti. Kinetik parametreler, Langmuir 1:1 bağlama modeli kullanılarak Local Full fiting'den elde edilmiştir. Her GsMTx4 konsantrasyonu için ilişki (kaçık), dissosiyasyon (kkapalı), gözlemlenen hız sabitleri (kobs) ve denge dissosiyasyon sabitleri (KD) rapor edilir ve çoğaltılır. Uyum kalitesi, tam, ilişki ve dissosiyasyon aşamaları için R² ve χ² değerleri kullanılarak değerlendirildi. Tüm konsantrasyonlarda uyumlar yüksek korelasyon katsayıları (R² > 0.99) ve düşük göreli χ² değerleri gösterdi; bu da güvenilir model performansını gösteriyor. Notlar: M Conc. GsMTx4 (μM) konsantrasyonunu gösterir. kobs, birleşik ilişki ve ayrışma süreçlerini yansıtan gözlemlenen hız sabitini temsil eder. kobs, kaçık ve kkapalı için bildirilen hatalar uyum belirsizliğini yansıtır. R² değerleri tam, ilişki ve ayrışma evreleri için uygunluk iyiliğini gösterir. Göreceli χ² değerleri normalleştirilmiş uygunluk metriklerini temsil ederken, mutlak χ² değerleri gözlemlenen ve uyarlanan veriler arasında kalıntı sapmayı gösterir. Kısaltmalar: küzerinde = ilişkilendirme oranı sabiti (1/M·s); kkapalı, = dissosiyasyon hızı sabiti (1/s); kobs = gözlemlenen hız sabiti (1/s); KD = denge ayrışması sabiti; Rmax = maksimum yanıt; Req = denge tepkisi. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Kinetik uyumun parametreleri ve kalıntıları işleme. İşleme parametreleri: Bağlantı başlangıcı, 0 s; Association End, 300 S; dissosiyasyon başlangıcı, 100 saniye; dissosiyasyon sonu, 300 s. Minimum R² değeri, 0.9; maksimum χ² değeri, 8. Hizalama adımı: tek adımlı uç (indeks = 1, ortalama = 0). Bağlantı aşamasında adımlar arası düzeltme uygulandı. Dernek ortalaması 50; Dissosiyasyon ortalaması, 0. Savitzky-Golay düzgünleştirme devre dışı bırakıldı. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: GsMTx4 peptidi sabitlenmiş konsantrasyonlu anti-FLAG problara farklı TMEM120A konsantrasyonların yüklenmesi için optimizasyon deneyi. (A) Kinetik ölçümün beş adımını gösteren ham BLI sensorgramları: (1) SEC tamponu veya analiz tamponunda temel (25 mM HEPES, pH 7.8; 200 mM NaCl; %0.00015 (w/v) LMNG; %0.0005 (v/v) Tween-20); (2) FLAG probuna dört farklı TMEM120A M207A konsantrasyonunun yüklenmesi; referans probu (turuncu) negatif kontrol olarak kullanılarak spesifik olmayan bağlanmanın yokluğunu doğrulamak; (3) ikinci bazda adımda; (4) ilişkilendirme aşaması ve (5) ayrışma aşaması. (B) 100 nM GsMTx4 peptid ile etkileşime giren dört TMEM120A M207A konsantrasyonu için küresel 1:1 bağlanma modeli uygundur. (C) Hem ilişki hem de ayrışma aşamaları için kalıntı grafikler, uyumlu modelden minimum sapmalar gösteren (<0,05 nm). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: Plaka kurulumu ve analiz yapılandırması. (A) Farklı parametrelerin atanabildiği 384 kuyruklu bir plaka için plaka tasarımı. Örnekler, çeşitli konsantrasyonlarda ligandla (GsMTx4) eşleşir. Portakal kuyuları 250 nM'de TMEM120 M207A proteinini gösterir. Kuyular 250 nM'de protein çoğaltmalarını temsil eder ve aynı tampon başlangıç, ilişkilendirme ve ayrışma adımları için kullanılmıştır. (B) Dört anti-FLAG biyosensör probunu gösteren Max Plaka görünümü: bir referans prob ve protein çoğaltıcıları için üç prob. Tüm problar test tamponunda önceden ıslanmış, Q tamponunda yeniden oluşturulmuş ve test tamponunda nötralize edilmiştir. Aynı tampon başlangıç, ilişkilendirme ve ayrışma adımlarında kullanıldı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S3: Temel seviye, protein yüklemesi, ikinci başlangaz çizgisi, ilişki ve ayrışma dahil olmak üzere analiz kurulum döngüleri. Kısaltmalar: B = buffer; L = yük; 0, 5, 10, 20, 30, 50 ve 100 = μM cinsinden GsMTx4 konsantrasyonları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S4: Yeni kinetik (K) analiz iş akışı. Tek bir deneyde yapılan tüm testlerin genel bir görünümünü sağlayan Deney simgesini seçin. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S5: Yeni kinetik (K) analiz iş akışı.Hizalama ve Filtre simgesi; hem ilişkilendirme hem de ayrışma aşamalarına ait ham verilerin incelenip analiz edilebildiği simge. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S6: Yeni kinetik (K) analiz iş akışı.Referans simgesi ayarla, arka plan çıkarma ve doğru veri yorumu için uygun referans sensörünü seçmek için kullanılır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S7: Kinetik analiz iş akışında bağlama uyum adımları. Bağlama etkileşim verilerini analiz etmek için kullanılan kinetik uyum parametre ayarları. Model, tek bir ligand bağlanma noktasıyla 1:1 etkileşim varsayar. Uyum türü Yerel olarak ayarlanır ve her yoğunlaşma eğrisi küresel değil, bağımsız olarak uyarlanır. Full Stitch etkinleştirilmiş Full fitting seçeneği, tüm sürekli ilişkilendirme ve ayrışma eğrilerini içerir. Çağrışım ve ayrışma aşamaları için zaman aralıkları sırasıyla 0 ile 300 saniye ve 0 ile 200 saniye arasında belirlenmiştir. Arka planda, bağlama uyum grafiği, kalıntı grafiği ve bireysel analiz eğrileri uyum kalitesini ve deneysel değişkenliği gösterir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S8: Kinetik analiz iş akışında bağlama uyum adımları. Birden fazla test replikasyonları ve prob pozisyonları (C1 ve D1) boyunca ilişki ve ayrışma fazlarını gösteren bağlanma uyum grafiği. Aşağıdaki kalıntı grafik, deneysel veriler ile uyarlanan model arasındaki farkları gösteren kalıntılar ile uyum kalitesini değerlendirir; sıfıra yakın değerler iyi bir uyumu yansıtır. Eşlik eden tablo, her bir çoğaltma için Tam R², İlişkilik R², Dissosiyasyon R² ve Ki-kare (X²) değerleri dahil olmak üzere uyum istatistiklerini özetler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S9: Kinetik analiz iş akışında bağlama uyum adımları. Birden fazla replikat ve prob pozisyonundan (C1 ve D1) bağlanma etkileşimlerinin kinetik analizi. Sensör yanıt kayması (nm) zamanla (nm) ilişkilendirme ve ayrışma aşamalarını gösterir; her eğri test ve prob konumuyla renk kodlanır. Dikey kesik kırmızı çizgi, ilişki (0-300 s) ile ayrışma aşamaları arasındaki geçişi işaret eder. Aşağıda, tablo 1:1 bağlama modeli uyumundan türetilen kinetik parametreleri gösterir; bunlar arasında analit konsantrasyonu (M Conc.), ilişki oranı sabiti (kaçık), dissosiyasyon hızı sabiti (kkapalı), hatalar ve denge ayrışması sabiti (KD) yer alır. Tutarlı uyum kalitesi, kinetik ölçümlerin sağlamlığını destekler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S1: Hem 384 kuyuyla levhada hem de Max Plaka'da kullanılan sembolleri gösteren tablo. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S2: 100 nM GsMTx4 peptid ile etkileşime giren FLAG biyosensörlerine yüklenen dört TMEM120A M207A konsantrasyonu için elde edilen kinetik parametreler, sabit kon ve koff değerleri kullanılarak. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Membran protein etkileşimlerinin karakterizasyonu, titiz protein arıtma, deterjan konsantrasyonunun dikkatli optimizasyonu ve hassas test tasarımı gerekliliği nedeniyle hâlâ zordur. Bu çalışma, TMEM120A M207A için ayrıntılı bir iş akışı sunar ve hem arıtma hem de kinetik analizi GsMTx4 ile biyokatman interferometrisi (BLI) ile göstermektedir.

Kritik adımlar ve optimizasyon:
Önemli kritik adımlardan biri, protein stabilitesinin önemli belirleyicisi olarak belirlenen deterjan konsantrasyonuydu. Arıtma süreci, %0,5 LMNG içeren bir tamponla hücre çözünürlüğünü, ardından %0,005 LMNG ile sıralı yıkama, %0,001 LMNG ile elülasyon ve %0,00015 LMNG içeren bir tamponda nihai boyut dışlama kromatografisini (SEC) içeriyordu. Bu deterjan stratejisi, LMNG'nin düşük kritik misel konsantrasyonu (CMC) ve yavaş ilerleme hızına dayanarak, arıtma sırasında misellerdeki proteinin daha iyi stabilitesini sağladı. SEC tamponu, LMNG'nin CMC'sinin (%0,001) 10 kat altında bir konsantrasyonda deterjan içeriyordu ve böylece sonraki biyofiziksel testler üzerindeki etkisini etkili bir şekilde en aza indirdi. Protein homojenliği ve agregasyonun olmaması, kütle spektrometrisi ve termal kararlılık analiziyle doğrulandı. Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4 , alt CMC deterjan konsantrasyonlarında saflaştırma ve protein stabilizasyonunun başarılı optimizasyonunu göstermektedir.

Biyosensör üzerindeki protein immobilizasyonu dikkatlice kontrol edilerek %50-80 prob doygunluğu sağlandı. %50-80 yükleme seviyesi, toplu taşıma kısıtlamalarına yol açabilir; ancak bu aralık, test sırasında probların kuyular arasında hareket ettiği BLI sisteminde yeterli sinyal gücü sağlamak için seçildi. Bu ligand immobilizasyon seviyesine ulaşmak, sinyal kalitesinin tutarlı kalmasına yardımcı oldu, ancak bu yük seviyelerinin hem avantajları hem de potansiyel sınırlamaları vardır. BLI deneyleri için referans prob eklemek kritik önemdeydi.

Tek bir peptit konsantrasyonu (100 nM) ile dört farklı seviyede immobilize edilmiş TMEM120A test edilen ek bir kontrol deneyi. Bu veriler artık revize edilmiş el yazmasına dahil edilmiştir (Ek Şekil S1). İmmobilize edilmiş protein miktarının artırılması daha yüksek yük sinyalleri üretir, ancak tüm durumlarda kayma başlangıç seviyesinden 1 nm'nin altında kalmıştır (Ek Şekil S1A). Uyumlu ilişki ve dissosiyasyon eğrilerini küresel 1:1 bağlanma modeli kullanarak raporladık ve ayrıca uyarlanan ve deneysel veriler arasında küçük anlamsız farklar gösteren kalıntı grafikleri de dahil ettik.

Ana kinetik testlerde (5-100 μM analit), uyarlanan oran sabitleri beklenen konsantrasyona bağlı eğilimleri gösterdi. Koff değerleri yaklaşık 1.48 × 10⁻⁴ ile 1.43 arasında× 10⁻³ s⁻¹ arasında değişirken, kdeğerleri 1.12 × 10²'ye 1.26 × 10¹ M⁻¹s⁻¹ arasında değişiyordu. Konsantrasyon serisindeki bu kademeli değişiklikler, normal analize bağlı ilişki ve dissosiyasyon davranışıyla tutarlıdır.

Kontrol deneyinde, farklı prob yükleme seviyeleri tek bir analit konsantrasyonunda (100 nM) test edildiğinde, dört iz de çok benzer kinetik sabitler verdi. Koff değerleri tutarlı olarak 1.42 × 10⁻¹ s⁻¹ idi, kon değerleri ise tüm yükleme seviyelerinde tutarlı olarak 2.76 × 10³ M⁻¹s⁻¹ idi. Bu varyasyon eksikliği, ne ilişki ne de ayrışma aşamalarının prob yoğunluğu, kütle taşıma sınırlamaları veya analitlerin yeniden bağlanmasından etkilenmediğini göstermektedir.

Ayrıca, kontrol deneyinde 100 nM'deki ayrışmanın daha hızlı görülmesi beklenmektedir. 100 nM analit konsantrasyonu KD'nin yaklaşık bir mertebesi altındadır ve KD'nin çok altındaki konsantrasyonlarda kompleks daha az kararlıdır ve etkin doluluk oranı düşüktür. Bu koşullarda, bağlanma afinitesi düşük analit konsantrasyonlarında daha zayıf olduğu ve dissosiyasyon aşamasında yeniden ilişkilendirilme minimaliz, dissosiyasyon daha hızlı ilerler. Bu davranış, analit konsantrasyonu KD'den önemli ölçüde düşük olduğunda genellikle gözlemlenenle örtüşür.

Bir arada, sonda yüklemeler üzerindeki kinetik parametrelerin tutarlılığı ve düşük analiz konsantrasyonlarında beklenen davranış, gözlemlenen hız sabitlerinin yüzey yükü veya kütle taşıma etkilerinden kaynaklanan artefaktlar yerine gerçek bağlanma özelliklerini yansıttığı fikrini destekler.

Bağlama kinetiği ve yorumlama:
Kinetik analiz, bireysel analit konsantrasyonlarının paylaşılan kinetik çerçeve içinde bağımsız olarak uydurulduğu yerel tam uyum stratejisiyle 1:1 Langmuir ilişki-ayrışma modeli kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 6B). Bu yaklaşım, özellikle daha düşük ligand konsantrasyonlarında, belirli veri setlerinde, kütle taşıma sınırlamaları ve deterjan misel proteini üzerindeki etkilerinden kaynaklanan küçük örtüşmeler veya erken faz sapmaları gösterdiği için geleneksel küresel uyum yerine seçildi. Küresel uyum, tüm izlerin kesinlikle aynı kinetik davranışı takip ettiğini varsayar; bu davranış, yüzey erişilebilirliği veya yerel mikro ortam konsantrasyonlar arasında biraz farklılık gösterdiğinde zarar görebilir. Yerel tam uyum, her analit konsantrasyonunun bağımsız olarak modellenmesini sağlarken tutarlı bir kinetik çerçeve korunmasını sağladı ve türetilen parametrelerin her konsantrasyondaki davranışı doğru şekilde yansıtmasını sağladı. Uydurulan eğriler (kırmızı) deneysel izlerle yakından eşleşiyordu ve düşük mikromolar aralıkta tahmini bir dissosiyasyon sabiti (KD) elde etti. Kalıntı analizi (Şekil 6C) büyük sistematik sapmaları ortaya koymadı; bu da modelin bu deterjanla çözünürülmüş membran protein etkileşimleri için uygunluğunu destekledi.

TMEM120A M207A ve GsMTx4, düşük mikromolar aralıkta (∼0,8-3,3 μM) KD değerleri gösterdi. Ligand konsantrasyonuyla birlikte ilişki oranı (kon) ılımlı olarak artarken, dissosiyasyon oranı (koff) çok yavaş kaldı ve bu da stabil kompleks oluşumunu gösteriyordu. Dissosiyasyonun ilk 5-10 saniyesindeki ilk hızlı sinyal bozumu muhtemelen kolayca erişilebilen bağlanma noktalarını yansıtırken, daha yavaş aşama daha kararlı etkileşimleri temsil ederdi (Şekil 6A). Bu gözlemler, deterjanla çözünürülmüş membran proteinlerini analiz ederken dissosiyasyon pencerelerinin dikkatle seçilmesinin ve kütle taşıma sınırlamalarının dikkate alınmasının önemini vurgulamaktadır (Tablo 2).

Sınırlamalar ve sorun giderme:
Deterjanla çözünürülmüş membran proteinleri TMEM120A M207A için birkaç sınırlama göz önünde bulundurulmalıdır. Erken ilişki aşamasında protein yavaşça biyosensör yüzeyine yayılabilir ve bu da kinetik ölçümleri hafifçe bozabilir. Sensör aşırı yüklenmesi, prob doygunluğu önerilen %50-80 aralığı aşırsa mümkündür; bu da küresel kinetik analizin doğruluğunu sınırlayabilir ve kon ile koff değerlerini etkileyebilir. Deterjan bağımlı etkiler, özellikle CMC'nin üzerindeki veya yakınındaki konsantrasyonlarda protein stabilitesi, oligomerik durum veya yüzey erişilebilirliğini etkileyebilir. Ek faktörler arasında küçük temel kayma, spesifik olmayan bağlanma ve çok yavaş ayrışmanın kinetik kavramasında zorluklar yer alır.

Bu sorunların birçoğu basit ayarlamalarla hafifletilebilir: aşırı doygunluğu önlemek için protein yükünü azaltmak, tampon bileşimini optimize etmek ve temel kaymayı veya özgün olmayan sinyalleri düzeltmek için referans probların eklenmesi. Bu çalışmada, %0.00015 LMNG ve düşük Tween-20 konsantrasyonları içeren SEC tamponu, protein stabilitesini korurken özgül olmayan bağlanmayı etkili bir şekilde en aza indirmiştir. Kinetik uyum için dissosiyasyon penceresinin dikkatlice seçilmesi, tekrarlama ölçümleri ve kalıntı analizleri de kinetik parametrelerin güvenilirliğini doğrulamak için önemliydi. Bu stratejiler genellikle tekrarlanabilirliği artırır ve daha sağlam ve yorumlanabilir verilerin oluşturulmasına yardımcı olur. Bireysel ligand konsantrasyonlarındaki izler arasındaki küçük farkları hesaba katmak için küresel uyum yerine yerel tam uyum uygulandı ve kinetik parametrelerin her veri setinin davranışını doğru şekilde yansıtmasını sağladı.

BLI ve diğer biyofiziksel teknikler:
Yüzey plazmon rezonansı (SPR) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) ile karşılaştırıldığında, biyokatman interferometrisi (BLI), membran protein-ligand etkileşimlerini analiz etmek için çeşitli pratik avantajlar sunar. SPR ve ITC gibi, BLI de karmaşık mikrofluidik sistemler veya yüksek proteinkonsantrasyonu 14 gerektirmeden, bağlanma oranları (k açık), dissosiyasyon oranları (kkapalı) ve denge ayrışma sabitleri (K D) dahil olmak üzere bağlanma etkileşimleri hakkında ayrıntılı bilgiler sağlayabilir. Açık kuyu ve dip-okuma formatı, hızlı tampon değişimi ve birden fazla örnekin paralel işlemesini sağlar ve daha yüksek deneysel veri sağlar. ITC'nin aksine, yüksek miktarda çok saf protein gerektiren ve termodinamik veri sağlayan ITC'nin aksine, BLI hem nanomolar içinde minimum örnek konsantrasyonundan hem kompleks oluşum hızlarını hem de ayrışma oranlarını ölçebilir. BLI ayrıca deterjan veya lipid içeren tamponlar ile uyumludur; bu da onu diğer biyofiziksel yöntemlerle incelenmesi zor olan düşük verimli veya kararsız membran proteinleri için uygundur. Bu avantajlara rağmen, SPR veya ITC gibi tamamlayıcı teknikler, termodinamik tutarlılığı doğrulamak ve deterjan içermeyen koşullarda bağlanma parametrelerini çapraz doğrulamak için faydalı olmaya devam eder ancak yüksek proteinkonsantrasyonu gerektirir 3.

Gelecek yönler:
Bu iş akışı, diğer membran proteinlerini, protein-lipid etkileşimlerini veya küçük molekül modülatörlerinin taramasını incelemek için genişletilebilir. GLI'yi kütle fotometrisi, yapısal karakterizasyon veya kriyo-EM gibi ortogonal yaklaşımlarla birleştirmek, oligomerizasyon, stoikiometri ve bağlanma mekanizmaları hakkında daha ayrıntılı bilgiler sağlayabilir. Daha fazla optimizasyon ayrıca yüksek afiniteli ligandların, çok valentli etkileşimlerin veya daha doğal benzeri lipid ortamlarındaki komplekslerin analizini mümkün kılabilir.

Sonuç olarak, protein immobilizasyonu, deterjan konsantrasyonu ve tampon koşullarının dikkatli kontrolü, BLI'nin TMEM120A M207A ve benzeri zorlu membran proteinleri için güvenilir, tekrarlanabilir kinetik veri üretmesini sağlar. Doğasında bazı sınırlamalar olsa da, yöntem iyi tanımlanmış deneysel koşullarda özgül, orta afiniteli protein-ligand etkileşimlerini incelemek için sağlam bir platform sağlar.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Protein arıtımı ve karakterizasyonu konusunda desteği için Melbourne Üniversitesi'nin araştırma platformu olan Melbourne Protein Karakterizasyon (MPC) Tesisi'ne içtenlikle teşekkür ediyoruz. Araştırma, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) Fikir Hibesi (2020/GNT2000934 I.R.) ve Avustralya Araştırma Konseyi (Endüstriyel Dönüşüm Eğitim Merkezleri, IC200100052 I.R. ve M.M.'ye kadar desteklenmiştir).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
384-well black microplateGreiner Bio-One781906BLI
Amicon Ultra Santrifüj Filtresi, 30 kDa MWCOSigma-AldrichUFC903008Purification
Anti-FLAG probGator Bio160036BLI
ANTI-FLAG M2 Afinite JelSigma-AldrichA2220-10MLPurification
BioRenderBioRenderhttps://biorender.comŞekil 1 oluşturma 
Bovin Serum AlbuminiSigma-Aldrich9048-46-8Kütle fotometrisi
CD 293 Medium (1x)Thermofisher11913019Hücre kültürü
Centrifuge 5920 R: Büyük Kapasiteli ve Yüksek PerformansEppendorfNAPurification
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease İnhibitör KokteyliMerck11836170001Purification
Deoksiribonükleaz I, boğaz pankreasındanSigma-Aldrich9003-98-9Purification
ExpiFectamine 293 Transfeksiyon KitiThermofisherA14524Transfeksiyon
Gator Bio yazılımıGator BioNABLI
Gator PlusGator BioNABLI
GlutaMAX TakviyeThermofisher35050061Hücre kültürü
GsMTx4 trifloroasetaatSigma-AldrichSML3140-1MGBLI
Süspansiyon büyümesine adapte edilmiş HEK293T/SF17 hücreleriATCCATCC CRL11268Hücre kültürü
LMNG (Lauril maltoz neopentyl glikol)ThermofisherA50940Purification
Max PlateGator Bio130062BLI
Fenilmetilsulfonil florür (PMSF)Sigma-Aldrich11359061001Purification
Prometheus Yüksek Hassasiyetli KapilerlerNano TemperPR-C006Termodinamik kararlılık
Prometheus PantaNano TemperNATermodinamik kararlılık
Q Buffer (%0,3 Glisin pH 3,8)Gator Bio120010BLI
Qsonica Q500 Sonikatör Ultrasonik Hücre Bozma CihazıQsonicaNAPurification
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytivaGE28-9909-44Purification
Sentezlenmiş TMEM120A (M207A) geni, FLAG-3C-Linker ile pCDNA 3.1 plazmidine klonlanmışGenScript BiotechNAPlasmid
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379-25MLBLI
Two MPRefeynNAKütle fotometrisi

Kaynaklar

  1. Rong, Y., et al. TMEM120A contains a specific coenzyme A-binding site and might not mediate poking- or stretch-induced channel activities in cells. eLife. 10, e71474(2021).
  2. Livnat-Levanon, N., Vigonsky, E., Lewinson, O. Real-time measurements of membrane protein-receptor interactions using surface plasmon resonance (SPR). J Vis Exp. (93), e51937(2014).
  3. Kovachka, S., Soule, P., Mus-Veteau, I. Microscale thermophoresis to evaluate the functionality of heterologously overexpressed membrane proteins in membrane preparations. Methods Mol Biol. 2507, 445-461 (2022).
  4. Ciesielski, G. L., Hytönen, V. P., Kaguni, L. S. Biolayer interferometry: a novel method to elucidate protein-protein and protein-DNA interactions in the mitochondrial DNA replisome. Methods Mol Biol. 1351, 223-231 (2016).
  5. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12, 791-800 (2009).
  6. Apiyo, D. O. Biolayer interferometry (Octet) for label-free biomolecular interaction sensing. Handbook of Surface Plasmon Resonance. Schasfoort, R. B. N. , 2nd edn, Royal Society of Chemistry. 356-397 (2017).
  7. Egan, D., Slaybaugh, C., Wang, R. Getting started: kinetics assay using bio-layer interferometry. Gator Bio Technical Note. , (2023).
  8. Beaulieu-Laroche, L., et al. TACAN is an ion channel involved in sensing mechanical pain. Cell. 180 (5), 956-967.e17 (2020).
  9. Niu, Y., et al. Analysis of the mechanosensor channel functionality of TACAN. eLife. 10, (2021).
  10. Xue, J., et al. TMEM120A is a coenzyme A-binding membrane protein with structural similarities to ELOVL fatty acid elongase. eLife. 10, e71220(2021).
  11. Chen, X., et al. Cryo-EM structure of the human TACAN in a closed state. Cell Rep. 38, 110445(2022).
  12. Suchyna, T. M. Piezo channels and GsMTx4: two milestones in our understanding of excitatory mechanosensitive channels and their role in pathology. Prog Biophys Mol Biol. 130, 244-253 (2017).
  13. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J Pharm Biomed Anal. 72, 150-154 (2013).
  14. Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic surface plasmon resonance sensors: from principles to point-of-care applications. Sensors (Basel). 16 (8), 1175(2016).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Membran Proteini Ba lanmasProtein nhibit r Etkile imiGsMTx4 PeptidiTMEM120A MutantuDeterjan OptimizasyonuK tle FotometrisiDiferansiyel Tarama FlorimetrisiFLAG Etiketi mmobilizasyonuKinetik l mler
Video yakında

İlgili makaleler