Yöntem makalesi

Memeli Hücrelerinde Nicel Görüntüleme Kullanılarak Plazma Zarı ve Hücre İçi Nikotinik Asetilkolin Reseptörlerinin Lokalizasyonu

DOI:

10.3791/69371

⸱

19 Aralık 2025

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, memeli Neuro-2a hücre hattı kullanılarak nöronal nikotinik asetilkolin reseptör alt birimlerinin ifadesi ve nicelendirilmesini açıklar. pH duyarlı floresan etiketler ve konfokal mikroskopi, plazma membranındaki reseptör lokalizasyonunun pH-nötr hücre içi bölmelerdeki ekspresyonlarla karşılaştırıldığında hassas bir şekilde değerlendirilmesini sağlar; bu da nAChR taşığı ve farmakolojik modülasyonun incelenmesini kolaylaştırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli hücrelerinin plazma zarında ifade edilen nöronal nikotinik asetilkolin reseptörlerinin (nAChR) nicelendirilmesi, yeni hedef-seçici tedavilerin geliştirilmesi ve reseptör taşımasını modüle eden şaperon proteinlerinin incelenmesi için önemlidir. Bu çalışma, memeli Neuro2a (N2a) hücrelerinde hem homomerik hem de heteromerik nAChR'leri ifade etmek ve yüzey ile hücre içi lokalizasyonlarını pH-duyarlı floresan etiketler kullanarak niceliklerini ölçmek için sağlam bir metodoloji seti sunmaktadır. pHuji ve süperekliptik pHluorin (SEP), rekombinant proteinleri etiketlemek için mühendislik yapabilen pH-duyarlı proteinlerdir ve böylece nAChR alt birimlerinin mekansal dağılımının görselleştirilmesini sağlar. Bu floresan etiketler nötr pH'da yayılır ancak asidik ortamlarda söndürülür. α7, α4 ve β2 nAChR alt birimlerinin göreli iç ve plazma zar lokalizasyonunu izlemek için, her DNA yapısının C-terminaline pHuji veya SEP bağlanır. α7-pHuji'yi N2a hücrelerinde onun şaperonu NACHO veya (α4-SEP; β2-pHuji) ile birlikte ifade etmek için lipid bazlı DNA transfeksiyon reaktifi kullanılır. Transfeksiyon reaktifi ve plazmid DNA'sı, oda sıcaklığında indirgenişlemli serum ortamında ayrı ayrı kuluçka yapılır, ardından hücrelere plazmid ulaşımını kolaylaştıran lipid-DNA kompleksleri oluşturulur. İnkubasyon sonrası, hücreler hem yüksek hem de düşük pH koşullarında veya alt tip seçici floresan ligandın varlığında canlı hücre konfokal mikroskopisi kullanılarak görüntülenir. Görüntüler, ilgili florofor kanallarında düzeltilmiş toplam hücre floresansı kullanılarak analiz edilir ve plazma zarı ile hücre içi bölmeler arasında floresan etiketli nAChR alt birimlerinin dağılımı hakkında nicel bilgi sağlar. Canlı hücre konfokal görüntüleme, nAChR alt birimi lokalizasyonunun gerçek zamanlı izlenmesini sağlayarak iç ve yüzey reseptör popülasyonları arasındaki farkları ayırt etmeyi sağlar. α7-pHuji veya (α4-SEP; β2-pHuji) sağlam plazma zarı ekspresyonu, 37 °C'de 24 saat içinde sağlanır. Bu yöntem, nAChR ticareti, farmakolojik modülasyon ve nAChR ifadesindeki hastalıkla ilgili değişikliklerin incelenmesi için ek şaperonlar, yardımcı alt birimler veya floresan ligandlar dahil edilecek şekilde uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöronal nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChR), nöronlar, glial hücreler ve bağışıklık hücreleri dahil olmak üzere birçok hücre tipinin plazma zarında eksprese edilen ligand-kapılı transmembran iyon kanallarıdır. Bu reseptörler, homomerik veya heteromerik alt tipler oluşturmak üzere bir araya gelen α (α2-α10) veya β (β2-β4) alt birimlerden oluşur; α7 ve α4β2 nAChR'ler beyinde en çok bulunan 1,2. Bu alt tiplerin düzensizliği Alzheimer hastalığı, nikotin kullanım bozukluğu, uykuya bağlı hipermotor epilepsi, Parkinson hastalığı ve majör depresif bozukluk gibi diğer nörolojik ve psikiyatrik durumlarlailişkilendirilmiştir 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . nAChR'lerin hızlı ve güvenilir ifade edilmesi ve nicelendirilmesi yöntemleri, hastalık mekanizmalarını anlamak ve hedef-seçici tedaviler geliştirmek için gereklidir. Ancak, bu reseptörlerin sağlam plazma zarı ekspresyonunu sağlamak genellikle zorlayıcı ve zaman alıcıdır. Burada açıklanan yöntem, DNA transfeksiyonundan yaklaşık 24 saat sonra güçlü yüzey ifadesini sağlar ve reseptör trafikini modüle eden ligandlar veya şaperon proteinleriyle birleştirilebilir.

nAChR'ların ifade edilmesi için geçici DNA transfeksiyonu veya istenen alt tipi ifade eden kararlı hücre hatlarının oluşturulması gibi çeşitli yöntemler mevcuttur. Aynı reseptör alt tipini içeren uzun vadeli çalışmalar için kararlı hücre hatları oluşturmak faydalı olsa da, süreç emek yoğun ve birkaç ay sürebilir. Bir kez kurulduktan sonra, bu tür hücre hatları geçişler boyunca değişken reseptör ekspresyonu, zamanla ifade kaybı veya optimal olmayan reseptör fonksiyonu veyayoğunluğu 13 olan klonlar için seçim yanlılığı gösterebilir. İnkubasyon sıcaklığının 37 °C'den 30 °C'ye düşürülmesi, nikotin gibi moleküler şaperonların eklenmesi veya kuluçka süresinin uzatılması, yüzeyifadesini 13,14,15 teşvik edebilir. Bu sınırlamalar özellikle heteromerik nAChR'lar için belirgindir; çünkü bunlar doğru alt birim montajı ve ticareti gerektirir ve chaperon destekli reseptör düzenlemesine odaklanan çalışmalar için geçerlidir. Bu nedenle, stabil nAChR eksprese eden hücre hatlarıyla çalışırken reseptör alt tip ekspresyonun rutin doğrulanması geçişler arasında gereklidir.

Araştırmacılar genellikle nAChR alt birim varyantları ve şaperon veya yardımcı protein alt birimleriyle ilgilenir ve bu nedenle testlerinde hızlı esneklik sağlamak için çeşitli DNA'ları ardışık olarak ifade etmek zorundadır. nAChR'lerin geçici ifadesi bu açıdan avantajlıdır çünkü süreç hızlı tamamlanabilir ve araştırmacılar aylarca beklemeden birden fazla reseptör alt tipini veya deneysel koşulları inceleyebilir. Geçici ifadede bile yaygın bir durum, birçok nAChR'nin indüksiyondan 24 saat sonra hücrede 37 °C'de kalmasıdır; bu da ek kuluçka dönemleri > 48saat 16,17 gerektirir. Örneğin, kolinesteraz (RIC)-3 inhibitörlerine dirençli şaperon proteini olmadan, memeli SHE-P hücrelerinin plazma zarında α7 nAChR'lerin yalnızca ~%1'i eksprese edilir18. RIC-3'ün birlikte ekspresyonunda, yüzeyde yaklaşık %20 α7 nAChR'ler tespit edilir. Bu bir iyileşme anlamına gelse de, toplam reseptör bolluğu düşük kalır. α7 nAChR'lerin NACHO ile birlikte ekspresyonu, yüzey ifadesini daha da artırabilir, ancak toplam reseptör popülasyonunun %40'ından azı plazmamembranına trafik yapar 19. Bir diğer yaklaşım, transfekte edilen hücrelerin 30 °C'de inkubasyon yapılarak plazma zarıifadesini 20,21 artırmasını içerir. α4β2 nAChR için, bu sıcaklık azaltımı yüzey reseptör yoğunluğunda beş kat yukarı regülasyon sağlar ve toplam alt birim protein21'de artış olmaz. Ancak bu iyileştirme en az bir gün ek ve daha fazla tüketim malzemesi, reaktif ve enstrümantasyon kullanımını gerektirir.

Sunulan çalışma, memeli N2a hücrelerinde transfeksiyondan 24 saat sonra spesifik nAChR alt tiplerini ifade etmek ve nicelendirmek için optimize edilmiş yöntemler seti sunmaktadır; α7 için yaklaşık %83, α4 için %77 ve plazma zarına lokal β2 alt birimleri için %56 sağlar. α7 nAChR'ler durumunda, plazma zarı ekspresyonu, α7-seçici floresan olarak işaretlenmiş α-bungarotoksin (αBTX) kullanılarak veya rekombinant floresan etiketleme ile nicelendirilebilir. Her alt birimi etiketlemek için, pH-duyarlı floresan proteinler pHuji ve süperekliptik pHluorin (SEP)22,23,24, bireysel nAChR altbirimleri 25,26'nın C-terminaline mühendislik edilir. pHuji ve SEP, sırasıyla pH 7.4'te floresan olan kırmızı ve yeşil floresan proteinlerin pH-duyarlı varyantlarıdır ancak daha asidikkoşullarda söndürülür 27,28. SEP ve pHuji floresansı pH < 6'da baskılandığından, gözlemlenen herhangi bir hücre içi sinyal, plazma membranında değil, nötr bölmelerde bulunan floroforları yansıtır. Belirtmek gerekir ki, bazı organeller, örneğin Golgi aygıtı, asidik lümene sahiptir; bu nedenle, nAChR alt birimlerinin C-terminal bölgesine bağlı floroforlar, alt birimler sekretor yol29'dan geçerken tespit edilmez. pH 7.5 ile pH < 6 arasındaki toplam floresans arasındaki fark, plazma zarında bulunan nAChR'ler tarafından üretilen sinyali temsil eder. Canlı hücre konfokal mikroskopisiyle görüntü yakalamak, yüksek mekansal çözünürlük sağlar ve alt birim lokalizasyonunun hassas nicelenmesini sağlar. Ayrıca, tüm deneylerin canlı hücreler üzerinde yapılması, her hücrenin kendi kontrolü olarak hizmet vermesini sağlar ve her tedavi grubundaki hücreler arasındaki protein ekspresyonundakideğişkenliği hesaba katır 30. Bu yöntem, nAChR ticaretini araştırmak için NACHO veya diğerleri gibi ek chaperon proteinlerini de dahil edecek şekilde uyarlanabilir. Ek uygulamalar arasında farmakolojik modülasyon, yardımcı alt birimlerin dahil edilmesi ve nAChR ifadesindeki hastalıkla ilişkili değişikliklerin analizi yer alır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Aşağıdaki prosedür, N2a hücre hattını nAChR alt birimleriyle geçici olarak transfekte etmek için başarılı bir şekilde kullanılan yöntemleri tanımlar (Şekil 1). Canlı hücre konfokal mikroskopisiyle yakalandığı şekilde, sağlam plazma zarı ekspresyonu 24 saat içinde sağlanır.

figure-protocol-1
Şekil 1: Protokolde sunulan bireysel yöntemlerin şematik sunumu. Hücreler, görüntüleme tabak içinde %70-80 birleşene kadar büyütülür. Hücreler daha sonra transfeksiyon reaktifi ve DNA kompleksiyle işleniyor. (Üst) 24 saat sonra, hücreler plazma zarında ifade edilen alt birimleri etiketlemek için floresan etiketli ligandla tedavi edilebilir ve ardından konfokal mikroskopla görüntülenebilir. (Altta) Alternatif olarak, transfeksiyondan 24 saat sonra pH duyarlı bir proteinle etiketlenecek şekilde modifiye edilmiş nAChR alt birim genleri için, hücreler konfokal mikroskopla canlı görüntülenerek hücrelerin toplam floresansını yakalayabilir. pH 7.4 görüntüleme tamponu daha sonra pH 5.5 söndürme tamponuna dönüştürülür. Bu, hücrenin plazma zarında bulunan nAChR alt birimlerine etiketlenmiş pH-duyarlı proteinlerin floresansını durduracak ve sadece iç alt birimlerin floresan kalmasına izin verecektir. Aynı hücreler tekrar görüntülenir. Görüntü analizi, iç ve dış alt birimlerin ifadesini nicelendirmek için ImageJ kullanılarak gerçekleştirilir. Bu prosedürler, şaperon ve yardımcı proteinleri dahil edecek şekilde değiştirilebilir. BioRender'da oluşturuldu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

1. N2a nAChR geçici transfeksiyon

NOT: N2a hücre hattı, nöron fenotipi ve düşük endogen nAChR ekspresyonu nedeniyle seçilmiştir. α7-pHuji, α4-SEP ve β2-pHuji alt birim genleri, memeli pcDNA3.1(+) ifade vektöründe ayrı ayrı yer alır. Chaperon proteini NACHO, pREP9'dan (Dr. R. Loring tarafından cömertçe hediye edilmiş) Northeastern Üniversitesi'nden eksprese edilir. Tüm adımlarda steril teknikler kullanın ve bir biyogüvenlik dolabında çalışın. Temiz bir laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve eldiven giyin. Biyogüvenlik dolabına giren veya çıkan tüm malzemeleri %70 etanol ile temizleyin. Aşağıdaki adımlar, görüntüleme için uygun olan 35 mm poli-D-lizin kaplı cam tabanlı bir çanakta transfeksiyonu tanımlar. Hacimler, farklı kültür kapları için ihtiyaç duyulduğunda ayarlanabilir.

  1. Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) içeren bir T25 (veya benzeri) doku kültürü şişesinde kültür N2a hücreleri, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve gerekirse 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile takviye edilmiştir. Hücreler %90 birleşime ulaşana kadar 37 °C, %5 CO₂ sıcaklığında kuluçka yapın. 4x ışık mikroskobu objektif kullanarak görselleştirin.
  2. Birleşmeyi her gün ışık mikroskobu ile izleyin ve optimal koşulları korumak için büyüme ortamını her 1-2 günde bir değiştirin. Hücreler %90 birleşmeye ulaştığında, görüntüleme çanaklarına gönderilmeye hazır olurlar.
  3. Tüm reaktifleri su banyosunda 37 °C'ye kadar önceden ısıtın. İşleme başlamadan önce biyogüvenlik dolabını ve tüm malzemeleri %70 etanol ile temizleyin.
    DIKKAT: %70 etanol, ciddi göz tahrişine neden olabilen son derece yanıcı bir sıvı ve buhardır. Isı, kıvılcımlar, açık alevler ve diğer ateşleme kaynaklarından uzak durun. İyi havalandırılan bir alanda, kaplar sıkıca kapalı şekilde saklanın. Dokunurken koruyucu eldiven ve göz/yüz koruması takın. Cilt veya gözlerle temas durumunda, hemen suyla durulayın ve tahriş devam ederse tıbbi yardım alın. Bunun yerine %5-10 oranında çamaşır suyu çözeltisi gibi alternatif bir dezenfektan kullanılabilir.
  4. Eski ortamı şişeden aspire edin ve hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın. Şişeye 1 mL tripsin ekleyin ve hafifçe karıştırın. Hücreler kalkınca kadar kuluçka yapın (<5 dakika). Aşırı sindirimi önlemek için hemen 4 mL EMEM büyüme ortamı ekleyin ve nazikçe pipetleyin, böylece tek hücreli bir süspansiyon oluşturulur.
  5. Bir hemositometre kullanarak, hücre konsantrasyonunu belirleyin ve gerekli EMEM büyüme ortamı hacmini hesaplayarak süspansiyonu ayarlayarak 1 mL'nin 0,5-2 x 10⁵ hücreleri içermesini sağlar.
  6. 35 mm çanak başına 1 mL hücre süspansiyonu levha ve toplam hacmi 2 mL'ye çıkarmak için yeterli EMEM büyüme ortamı ekleyin. Gece boyunca 37 °C, %5 CO₂ sıcaklıkta kuluçka yapın. Hücreler %70-80 birleşimde transfeksiyona hazırdır.
  7. Transfeksiyon gününde, reaktifleri 37 °C'ye kadar önceden ısıt, nAChR alt birimi DNA'larını tamamen eritecek ve transfeksiyon reaktifini oda sıcaklığına getirecek. Tüm reaktifleri biyogüvenlik dolabına koymadan önce %70 etanol ile temizleyin.
  8. α7 nAChR'leri ifade etmek için: Bir mikrosantrifüj tüpünde, 4 μg α7 (1 μg/μL) ve 1 μg NACHO (1 μg/μL) plazmid DNA'larını indirgenmiş serum ortamına (antibiyotiksiz) damla damla olarak inceltin ve son hacmi 250 μL'ye kadar inceleyin. DNA eklendikten sonra pipetle nazikçe karıştırın.
    1. α4β2 nAChR'leri ifade etmek için: Her alt birim DNA'dan 4 μg toplamda 250 μL indirgenmiş serum ortamında seyreltirin. Nazikçe pipetle karıştırın. Her alt birimin oranını, belirli reseptör izoformlarının ekspresyonunu optimize etmek için ayarlayın.
    2. α4β2 nAChR'leri ek plazmidle ifade etmek için, her plazmid DNA'sından eşit miktarda eklenir. pcDNA3.1(+)'daki mavi floresan protein mTagBFP2³¹ kontrol plazmisi olarak görev yapar ve herhangi bir α4β2 şaperonla değiştirilebilir.
  9. Kullanmadan önce DNA transfeksiyon reaktifini nazikçe karıştırın. Ayrı bir mikrosantrifüj tüpünde, 8 μL transfeksiyon reaktifini 250 μL indirgenişlemiş serum ortamında damla olarak seyreltin. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın. 25 dakika içinde bir sonraki adıma geçin.
  10. 5 dakika sonra, seyreltilmiş DNA'ları seyreltilmiş transfeksiyon reaktifiyle (toplam = 500 μL) damla birleştirin. Nazikçe pipetle karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın. DNA-lipid kompleksleri 6 saate kadar stabil kalır.
  11. Kompleksler oluşurken, kuluçkadan kültür tabak çıkarın ve ortamı 1 mL serumsuz EMEM (antibiyotiksiz) ile değiştirin.
  12. Her kaba 500 μL DNA-transfeksiyon reaktif kompleksini damla olarak ekleyin (nihai hacim = 1,5 mL). Tabağı sallayarak nazikçe karıştırın, böylece tabak boyunca, özellikle cam taban yüzeyinde eşit dağılım sağlansın. 37 °C'de 24 saat kuluçka yapın, ardından hücre sağlığını artırmak için 4-6 saat sonra ortamı değiştirin.

2. αBTX Alexa Fluor 647 kullanılarak plazma membranı ile eksprese edilen α7 nAChR'ların canlı hücre etiketlenmesi

NOT: Aşağıdaki işlem genellikle transfeksiyondan 24 saat sonra yapılır. αBTX Alexa Fluor 647 (αBTX-AF647) floroforun foto yok oluşunu önlemek için ışıktan korun.

  1. Tüm reaktifleri 37 °C'ye kadar önceden ısıtın ve αBTX-AF647 stok (2.3 μM) çözeltisini eritin. %70 etanol ile temizleyin ve biyogüvenlik dolabına yerleştirin.
  2. İnkübatörden α7 ve NACHO DNA'larıyla transfekte edilmiş hücreleri içeren kabı alın, dışını %70 etanol ile temizleyin ve biyogüvenlik dolabına yerleştirin.
  3. Eski ortamı vakum emiş ile at. Hücreleri yıkamak için 2 mL taze EMEM büyüme ortamı ekleyin.
  4. Yıkama ortamını vakum emmesiyle çıkarın. Yemeklere 2 mL EMEM büyüme ortamı ekleyin.
  5. Uygun miktarda ortamı αBTX-AF647 ile değiştirerek nihai konsantrasyon 80 nM'ye ulaşın. 37 °C'de gece kuluçka yapın.
  6. Sabahları, PBS veya tercih edilen görüntüleme ortamını önceden ısıtın ve %70 etanol ile temizleyin. Biyogüvenlik dolabına aktarın.
  7. Transfekte edilen hücreleri kuluçka makinesinden çıkarın, temizleyin ve biyogüvenlik dolabına yerleştirin.
  8. αBTX-AF647 içeren eski ortamı çıkarın ve uygun bir atık konteynerine yerleştirin.
  9. Hücreleri 2 mL PBS ile oda sıcaklığında 3 kat, her biri 10 dakika boyunca yıkayın. Durulamalar, bağlanmamış ligand ve kalıntıları temizler ve süre, araştırmacının ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir. Her yıkamadan sonra PBS'yi çıkarın.
  10. 2 mL PBS veya tercih edilen görüntüleme ortamı ekleyin ve hücreleri konfokal mikroskopla görüntüleyin.

3. Toplam ve iç α7-pHuji nAChR'ların canlı hücre görüntülemesi

NOT: Aşağıdaki prosedür, NACHO şaperonuyla birlikte transfekte edilmiş kendi yapımı α7-pHuji pcDNA3.1 plazmidini kullanır. Benzer bir protokol, kontrol plazmidi mTagBFP2 pcDNA3.1 ile pcDNA3.1'de α4-SEP ve β2-pHuji'nin ifade edilmesinde kullanıldı; bu, Sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi. İşlem boyunca floroforun foto yok oluşunu önlemek için örnekleri ışıktan koruyun.

  1. pH 7.4 görüntüleme tamponu (Tablo 1) ve pH 5.5 söndürme tamponu (Tablo 2) tarifedildiği gibi hazırlanın 23.
  2. Reaktifleri 37 °C'ye kadar önceden ısıt, %70 etanol ile temizleyin ve biyogüvenlik kabine aktarın. Transfekte edilen hücreleri kuluçka makinesinden çıkarın, %70 etanol ile temizleyin ve biyogüvenlik dolabına yerleştirin.
  3. Eski ortamı emiş yoluyla çıkarın. Kabı 2 mL PBS ile 3 kat, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca durulayın. 2 mL pH 7.4 görüntüleme tamponu ekleyin.
  4. Tabağı konfokal mikroskopa götür. pH 7.4 görüntüleme tamponu olan görüntüleme kabını slayt tutucusuna yerleştirin ve tutucuyu konfokal mikroskopta önceden ısıtılmış çevre odasına yerleştirin.
  5. Peristalttik pompa borusunu görüntüleme çanaklı tutucuya bağlayın ve hazneyi kapatın.
  6. Görüntüleme yazılımını açın ve ilgilenilen floroforlar için lazerler seçin (pHuji 566/598 nm, α4-SEP 499/520 nm, β2-pHuji 568/603 nm ve mTagBFP2 359/461 nm).
  7. Tabağı taramak için hücreleri 10x-60x bir objektif ile tarayın. İsterseniz büyütmeyi artırın ve gerektiğinde odak derinliğini ayarlayın.
  8. Floresansı arka plan sinyali olmadan görselleştirmek için lazer yoğunluğunu ve dedektör hassasiyetini ayarlayın. Gerekirse floresan sinyalini artırmak için diyaframı ayarlayın.
  9. Tercih edilen çözünürlüğü seçin ve istenen hedefi kullanarak (örneğin 60x) tek bir görüntüyü yakalayın.
  10. Tampon pH 5.5 söndürme tamponuna geçtikten sonra aynı hücreleri yeniden konumlandırmak için yeri tabak haritasına kaydedin.
  11. Görüntüleme işlemini anananın birkaç bölgesi için tekrarlayın, her yeni konumu kaydedin. Tüm görüntüler (deneysel ve kontrol grupları) için aynı yakalama ayarlarını kullanarak geçerli karşılaştırmalar yapılabilir.
  12. Sadece çıkış hattını peristaltik pompaya bağlı tutarak, pH 7.4 tamponunu çanaktan yavaşça atık konteynerine çekin.
  13. Tamponun çoğu çıkarıldığında (kurutma hücreleri olmadan), giriş hattını pH 5.5 söndürme tamponuna aktarın.
  14. Peristalttik pompayı açarak çanak içine pH 5.5 tampon (1.5 mL/dakika) yavaş yavaş ekleyin, böylece hücrelerin bağlı kalmasını sağlarsınız.
  15. Pompayı 20 dakika çalıştırın, tamponun düzgün şekilde ananağa girip çıktığını gözlemleyin.
  16. Pompayı kapatın ve hücreleri pH 5.5 söndürme tamponu ile denge sağlamak için ek 20 dakika kuluçka yapın.
  17. Görüntülemeyi tekrarlamak için, önceki oturumdan kaydedilen konumları yükleyerek aynı bölgelere geri dönün.
  18. Odak derinliği ve konumunun doğru olduğunu doğrulayın, çünkü tampon değişiminden sonra kayabilirler.
  19. PH-söndürülmüş koşulla kaydedilen tüm yerlerde tekrar görüntüleme yapılsın.
ReaktifKonsantrasyon (mM)
NaCl135
KCl5
MgCl21.8
HEPES20
d-glikoz1
Çözeltiyi pH 7.4'e ayarlayın

Tablo 1: Görüntüleme tamponu tarifi. Aşağıdaki reaktifler birleştirildi ve çözelti pH 7.4'e ayarlandı.

ReaktifKonsantrasyon (mM)
NaCl135
KCl5
MgCl20.4
CaCl21.8
MES20
d-glikoz1
Çözeltiyi pH 5.5'e ayarlayın

Tablo 2: Soğutma tampon tarifi. Aşağıdaki reaktifler karıştırıldı ve ortaya çıkan çözelti pH 5.5'e ayarlandı.

4. Görüntü niceliği

NOT: Bu prosedür, hücre görüntülerinin ImageJ (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) ve düzeltilmiş toplam hücre floresansı (CTCF)yöntemi 32 kullanılarak nasıl analiz edileceğini açıklar.

  1. ImageJ'yi açın ve analiz edilecek görüntüyü açın. Görüntü, aynı çerçevede ayrılmış her yakalanan kanal halinde bir yığın olarak görünecektir.
  2. Faz kanalına geçin. Eğer görüntü aşırı parlaksa (boş veya arka plan bölgelerinde yaygın), Contrast'ı Artır > Süreci'ni seçin ve Tamam'a tıklayın.
  3. Büyüteç aracı kullanarak bir hücreye (+) yakınlaştırın. Freehand seçim aracı kullanarak, Phase kanalında hücrenin konturunu takip edin.
  4. İlgilendiğiniz florofora karşılık gelen floresan kanala geçin. İstediğiniz ölçümleri Analiz > Set Ölçümlerini seçerek ayarlayın. Alan, Ortalama Gri Değeri ve Entegre Yoğunluğun kontrol edildiğinden emin olun.
  5. Seçilen bölgeyi ölçmek için Analyze > Measure seçeneğini seçin veya Command + M (Mac) / Ctrl + M (Windows) tuşlarına basın.
  6. Hücre yakınındaki boş alanları takip ederek üç arka plan ölçümü alın. İstenilen hücre sayısı için adımları tekrarlayın.
  7. Ölçüm verileri, ImageJ'de ayrı bir Sonuçlar penceresinde görünecektir. Bu verileri analiz için Excel'e kopyalayıp yapıştırın.
  8. Üç arka plan ölçümünden ortalama arka plan ortalamasını hesaplayın.
  9. Her hücre için CTCF değerini aşağıdaki formülle hesaplayın:
    CTCF=Entegre yoğunluk−(Hücre alanı x Ortalama arka plan floresansı)
  10. Bu işlemi her deneysel grup için birden fazla hücre ve görüntü için tekrarlayın (ve varsa pH koşunu). Tüm sonuçları istatistiksel işlem için bir veri analiz yazılımına dışa aktarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki transfeksiyon prosedürlerinin ardından, α7 nAChR ve NACHO şaperon proteini N2a hücrelerinde birlikte eksprese edildi. Hem transfekte edilmeyen hem de transfekte edilen hücreler, DNA transfeksiyonundan 24 saat sonra αBTX-AF647 ile etiketlendi. αBTX membran geçirgenliği olmadığından, tespit edilen tüm floresans plazma zarında bulunan reseptörlerden kaynaklanır. Şekil 2A,A′'da, beklendiği gibi transfeksiyon yapılmamış N2a hücrelerind...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli N2a hücrelerinde nAChR alt birimlerinin ifade edilmesi ve nicelendirilmesi için sunulan metodolojiler, ilaç keşfi, lokalizasyon ve taşıma çalışmaları için hızlı (~24 saat) ve bol miktarda plazma zarı ekspresyonuna (%> %60) ulaşma konusundaki uzun süredir devam eden zorlukları ele almaktadır. Bu protokol setinin temel gücü hem homomerik (α7) hem de heteromerik (α4β2) nAChR'lara uyum sağlayabilmesidir ve muhtemelen diğer nAChR alt tiplerine ve şaperon proteinlerinin birlikte ekspres...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, teknik mikroskopi uzmanlığı için James Janoso'ya ve Alaska Üniversitesi Fairbanks Mikroskopi Çekirdeği'ni destekledikleri için Metabolizmada Dönüşümlü Araştırma Merkezi'ne (Ulusal Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüsü Ödül Numarası P20GM130443) teşekkür etmek isterler. LW'nin çabaları, kısmen Alaska eyaleti tarafından Alaska Üniversitesi aracılığıyla sağlanan Yüksek Eğitim Yatırım Fonu'ndan finansman sağlandı. SMS'nin çabaları, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nün Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden P20GM103395 numaralı hibe kapsamında verilen Kurumsal Kalkınma Ödülü (IDeA) ile desteklendi. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü (MMW ödül numarası R03MH135358) ve Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (MMW ödül numarası R16GM150455) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,25 Tripsin-EDTA (1X) Gibco25200-056Hücre ayrılma reaktifi
Alfa-Bungarotoksin Alexa Fluor 647InvitrogenB35450Alfa-Bungarotoksin konjugatı
BSL-seviye 1 Biyogüvenlik Kabinesi NuaireNU-425-400Steril hücre kültürü çalışma alanı
Kalsiyum klorürAventor/VWRBDH9224Tampon bileşeni
D-(+)-GlikozMilliPore Sigma G8270Tampon bileşeni
EMEM ile L-glutaminATCC30-2003Hücre ortamı
Endotoksin içermeyen DNAZymo kitleriyle kendi evimizde üretildiGeçerli değilHücre geçici transfeksiyonları için kullanılacak nAChR DNA'ları
Endotoksin içermeyen mikrosantrifüj tüpleri, 0,5 mL Aventor/VWR89000-010DNA ve transfeksiyon hazırlığı
Endotoksin içermeyen mikrosantrifüj tüpleri, 1.5 mL Aventor/VWR20170-038DNA ve transfeksiyon hazırlığı
Fetal Sığır SerumuAventor/VWR97068-085Serum takviyesi
Fluoview FV10iOlympusFV10iKonfokal Mikroskop
Cam Tabanlı MatTek TabaklarMatTekP35GC-0-10-Cİmaj tabanlar
GraphPad Prism v. 10GraphPad Prizmasıhttps://www.graphpad.com/featuresVeri analiz yazılımı
HEPESMilliPore Sigma H3375Tampon bileşeni
Lipofektamin 2000Invitrogen11668019Transfeksiyon reaktifi
Magnezyum klorür heksahidratTermobilimsel413410025Tampon bileşeni
MES hidratıMilliPore Sigma M5287Tampon bileşeni
mTagBFP2-pBADAddGene 54572Hücre geçici transfeksiyonu için kullanılacak kontrol DNA'sı 
Nöro 2 a (N2a) hücreleriAmerikan Tip Kültürü KoleksiyonuCCL-131DNA transfeksiyonları ve nAChR ifadesi için kullanılan hücreler
Opti-MEMGibco31985-070İngengenç serum ortamı
Penisilin/StreptomisinAventor/VWRK952-100mLAntibiyotik
Peristalsis pompasıGilsonMiniPuls3Tampon görüntüler 
Fosfatla tamponlanmış tuzlu suKaliteli Biyolojik119-069-131Salin tamponu
Pipet YardımıDrummond 140084Hassas sıvı transferi
Pipet uçları (steril ve endotoksinsiz, 1000uL)Rainin30389216Hassas sıvı transferi
Pipet uçları (steril ve endotoksinsiz, 20uL)Rainin30389229Hassas sıvı transferi
Pipet uçları (steril ve endotoksinsiz, 250uL)Rainin30389246Hassas sıvı transferi
Pipetler, P10Rainin L-10XLSHassas sıvı transferi
Pipetler, P100Rainin L-100XLSHassas sıvı transferi
Pipetler, P1000Rainin L-1000XLSHassas sıvı transferi
Potasyum klorürMilliPore Sigma P3911Tampon bileşeni
Serolojik pipetler (steril ve endotoksinsiz, 10 ML)Aventor/VWR89130-898Hassas sıvı transferi
Serolojik pipetler (steril ve endotoksin içermemiş, 25 mL)Aventor/VWR89130-900Hassas sıvı transferi
Serolojik pipetler (steril ve endotoksinsiz, 5 mL)Aventor/VWR76201-710Hassas sıvı transferi
Serolojik pipetler (steril ve endotoksinsiz, 50 mL)Aventor/VWR75816-088Hassas sıvı transferi
Sodyum klorürAventor/VWRBDH9286Tampon bileşeni
Doku Kültürü MatarasıFalcon353109Yetiştirme tabakları
ZymoPure II plazmid Maxiprep KitiZYMO ARAŞTIRMASID4203-A + D4203-BEndotoksin içermeyen DNA üretimi
α 4-SEP ThermoFisher Scientific GeneArt Gen Sentezi Hizmetleri   https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.htmlÖzel gen sentezi hizmetleri
α 7-pHujiTwist Biosciencehttps://www.twistbioscience.com/Özel gen sentezi hizmetleri
β 2-pHujiThermoFisher Scientific GeneArt Gen Sentezi Hizmetleri   https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.htmlÖzel gen sentezi hizmetleri

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whiting, P. J., et al. Expression of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in brain and retina. Mol Brain Res. 10 (1), 61-70 (1991).
  2. Albuquerque, E. X., et al. Nicotinic Receptor Function in the Mammalian Central Nervous System. Ann New York Acad Sci. 757 (1), 48-72 (1995).
  3. Picard, F., et al. Alteration of the in vivo nicotinic receptor density in ADNFLE patients: a PET study. Brain. 129 (8), 2047-2060 (2006).
  4. Breese, C. Abnormal Regulation of High Affinity Nicotinic Receptors in Subjects with Schizophrenia. Neuropsychopharmacology. 23 (4), 351-364 (2000).
  5. De Luca, V., Voineskos, S., Wong, G., Kennedy, J. L. Genetic interaction between α4 and β2 subunits of high affinity nicotinic receptor: analysis in schizophrenia. Exp Brain Res. 174 (2), 292-296 (2006).
  6. Maskos, U., et al. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436 (7047), 103-107 (2005).
  7. Picciotto, M. R., et al. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391 (6663), 173-177 (1998).
  8. Staley, J. K. Human Tobacco Smokers in Early Abstinence Have Higher Levels of β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors than Nonsmokers. J Neurosci. 26 (34), 8707-8714 (2006).
  9. Gotti, C., Zoli, M., Clementi, F. Brain nicotinic acetylcholine receptors: native subtypes and their relevance. Trends Pharmacol Sci. 27 (9), 482-491 (2006).
  10. Mineur, Y. S., Mose, T. N., Blakeman, S., Picciotto, M. R. Hippocampal α7 nicotinic ACh receptors contribute to modulation of depression-like behaviour in C57BL/6J mice. British J Pharmacol. 175 (11), 1903-1914 (2018).
  11. Fernandes, S. S., et al. Enhanced cholinergic-tone during the stress induce a depressive-like state in mice. Behav Brain Res. 347, 17-25 (2018).
  12. Ren, J. M., Zhang, S. L., Wang, X. L., Guan, Z. Z., Qi, X. L. Expression levels of the α7 nicotinic acetylcholine receptor in the brains of patients with Alzheimer's disease and their effect on synaptic proteins in SH-SY5Y cells. Mol Med Rep. 22 (3), 2063-2075 (2020).
  13. Letchworth, S. R., Whiteaker, P. Progress and Challenges in the Study of α6-Containing Nicotinic Acetylcholine Receptors. Biochem Pharmacol. 82 (8), 862-872 (2011).
  14. Nelson, M. E., et al. Functional Properties of Human Nicotinic Achrs Expressed by Imr-32 Neuroblastoma Cells Resemble Those of α3β4 Achrs Expressed in Permanently Transfected Hek Cells. J General Physiol. 118 (5), 563-582 (2001).
  15. Cooper, S. T., Harkness, P. C., Baker, E. R., Millar, N. S. Up-regulation of Cell-surface α4β2 Neuronal Nicotinic Receptors by Lower Temperature and Expression of Chimeric Subunits *. J Biol Chem. 274 (38), 27145-27152 (1999).
  16. Harkness, P. C., Millar, N. S. Inefficient cell-surface expression of hybrid complexes formed by the co-assembly of neuronal nicotinic acetylcholine receptor and serotonin receptor subunits. Neuropharmacology. 41 (1), 79-87 (2001).
  17. Dhara, M. Polyamine regulation of ion channel assembly and implications for nicotinic acetylcholine receptor pharmacology. Nat Commun. 11 (1), (2020).
  18. Vallés, A. S., Roccamo, A. M., Barrantes, F. J. Ric-3 chaperone-mediated stable cell-surface expression of the neuronal α7 nicotinic acetylcholine receptor in mammalian cells. Acta Pharmacol Sinica. 30 (6), 818-827 (2009).
  19. Dawe, G. B., et al. α7 nicotinic acetylcholine receptor upregulation by anti-apoptotic Bcl-2 proteins. Nat Comm. 10 (1), (2019).
  20. Peng, J. H., et al. Inducible, heterologous expression of human α7-nicotinic acetylcholine receptors in a native nicotinic receptor-null human clonal line. Brain Res. 825 (1-2), 172-179 (1999).
  21. Cooper, S. T., Harkness, P. C., Baker, E. R., Millar, N. S. Up-regulation of Cell-surface α4β2 Neuronal Nicotinic Receptors by Lower Temperature and Expression of Chimeric Subunits. J Biol Chem. 274 (38), 27145-27152 (1999).
  22. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  23. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  24. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  25. O'Brien, B. C. V., Weber, L., Hueffer, K., Weltzin, M. M. SARS-CoV-2 spike ectodomain targets α7 nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 299 (5), 104707(2023).
  26. O'Brien, B. C. V., et al. The human alpha7 nicotinic acetylcholine receptor is a host target for the rabies virus glycoprotein. Front Cell Infect Microbiol. 14, (2024).
  27. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  28. Sankaranarayanan, S., Angelis, D. D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophy J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  29. Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J General Physiol. 143 (1), 51-66 (2013).
  30. Nichols, W. A., et al. Lynx1 Shifts α4β2 Nicotinic Receptor Subunit Stoichiometry by Affecting Assembly in the Endoplasmic Reticulum. J Biol Chem. 289 (45), 31423-31432 (2014).
  31. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An Enhanced Monomeric Blue Fluorescent Protein with the High Chemical Stability of the Chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).
  32. Fitzpatrick, M. Measuring cell fluorescence using ImageJ. , http://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html#measuring-cell-fluorescence-using-imagej (2025).
  33. Srinivasan, R., et al. Nicotine up-regulates α4β2 nicotinic receptors and ER exit sites via stoichiometry-dependent chaperoning. J Gen Physiol. 137 (1), 59-79 (2011).
  34. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An Enhanced Monomeric Blue Fluorescent Protein with the High Chemical Stability of the Chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).
  35. Matta, J. A., et al. NACHO Mediates Nicotinic Acetylcholine Receptor Function throughout the Brain. Cell Rep. 19 (4), 688-696 (2017).
  36. Flores, C. M., Rogers, S. W., Pabreza, L. A., Wolfe, B. B., Kellar, K. J. A subtype of nicotinic cholinergic receptor in rat brain is composed of alpha 4 and beta 2 subunits and is up-regulated by chronic nicotine treatment. Mol Pharmacol. 41 (1), 31-37 (1992).
  37. Mazzaferro, S., Whiteman, S. T., Alcaino, C., Beyder, A., Sine, S. M. NACHO and 14-3-3 promote expression of distinct subunit stoichiometries of the α4β2 acetylcholine receptor. Cell Mol Life Sci. 78 (4), 1565-1575 (2021).
  38. Nichols, W. A., et al. Lynx1 Shifts α4β2 Nicotinic Receptor Subunit Stoichiometry by Affecting Assembly in the Endoplasmic Reticulum. J Biol Chem. 289 (45), 31423-31432 (2014).
  39. Fasoli, F., et al. In vivo chronic nicotine exposure differentially and reversibly affects upregulation and stoichiometry of α4β2 nicotinic receptors in cortex and thalamus. Neuropharmacology. 108, 324-331 (2016).
  40. Wada, E., et al. Distribution of alpha2, alpha3, alpha4, and beta2 neuronal nicotinic receptor subunit mRNAs in the central nervous system: A hybridization histochemical study in the rat. J Comparative Neurol. 284 (2), 314-335 (1989).
  41. Zoli, M., Léna, C., Picciotto, M. R., Changeux, J. P. Identification of Four Classes of Brain Nicotinic Receptors Using β2 Mutant Mice. J Neurosci. 18 (12), 4461-4472 (1998).
  42. Briggs, C. A., et al. and Low-Sensitivity Subforms of α4β2 and α3β2 nAChRs. J Mol Neurosci. 30 (1-2), 11-12 (2006).
  43. Weltzin, M. M., George, A. A., Lukas, R. J., Whiteaker, P. Distinctive single-channel properties of α4β2-nicotinic acetylcholine receptor isoforms. PLoS One. 14 (3), e0213143(2019).
  44. Moroni, M., Bermudez, I. Stoichiometry and Pharmacology of Two Human α4β2 Nicotinic Receptor Types. J Mol Neurosci. 30 (1-2), 95-96 (2006).
  45. Nelson, M. E., Kuryatov, A., Choi, C. H., Zhou, Y., Lindstrom, J. Alternate Stoichiometries of α4β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors. Mol Pharmacol. 63 (2), 332-341 (2003).
  46. Tapia, L., Kuryatov, A., Lindstrom, J. Ca2+ Permeability of the (α4)3(β2)2 Stoichiometry Greatly Exceeds That of (α4)2(β2)3 Human Acetylcholine Receptors. Mol Pharmacol. 71 (3), 769-776 (2007).
  47. Eaton, J. B., et al. The Unique α4(+)/(−)α4 Agonist Binding Site in (α4)3(β2)2 Subtype Nicotinic Acetylcholine Receptors Permits Differential Agonist Desensitization Pharmacology versus the (α4)2(β2)3 Subtype. J Pharmacol Exp Ther. 348 (1), 46-58 (2014).
  48. Mazzaferro, S., et al. Additional Acetylcholine (ACh) Binding Site at α4/α4 Interface of (α4β2)2α4 Nicotinic Receptor Influences Agonist Sensitivity. J Biol Chem. 286 (42), 31043-31054 (2011).
  49. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Bio Chem. 286 (36), 31241-33124 (2011).
  50. Asokan, A., Cho, M. J. Exploitation of Intracellular pH Gradients in the Cellular Delivery of Macromolecules. J Pharma Sci. 91 (4), 903-913 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Plazma Membran LokalizasyonuH cre i LokalizasyonCanl H cre Konfokal MikroskopisipH Hassasiyetli FloresanResept r Trafi iaperon ProteinlerNeuro2a H creleriImageJ Analizi

İlgili makaleler