ML385, ROS/NRF2-otofaji Ekseni Yolu Yoluyla Silika Kaynaklı Akciğer Adenokarsinom Hücrelerinin Malign İlerlemesini Azaltır

Akciğer adenokarsinomu, her yıl tahmini 2 milyon yeni vaka ve 1,76 milyon ölümle dünya çapında kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir¹. Son yıllarda hiç sigara içmemiş kişilerde akciğer adenokarsinomu görülme sıklığı artmıştır ve bu durum hava kirliliği gibi çevresel faktörlerle ilişkili olabilir². Silika yaygın bir çevresel kirleticidir ve insan akciğer adenokarsinomu³ için potansiyel bir patojenik faktör olarak tanımlanmıştır. Silika, makrofajların, lenfositlerin ve nötrofillerin infiltrasyonuna ve reaktif oksijen türlerinin ve enflamatuar faktörlerin salınmasına yol açan kalıcı kronik inflamasyona neden olabilir⁴. Bu uzun süreli inflamatuar mikro ortam, akciğer adenokarsinomu oluşumunu teşvik eder ^5,6. Silika maruziyeti ile akciğer adenokarsinomu arasındaki ilişki doğrulanmış olmasına rağmen, spesifik moleküler mekanizması tam olarak aydınlatılamamıştır.

NFE2L2 geni tarafından kodlanan transkripsiyon faktörü NRF2, oksidatif strese yanıt olarak hücresel redoks homeostazının korunmasında ana düzenleyici olarak çok önemli bir rol oynar ^7,8. Normal şartlar altında, NRF2, KEAP1-CUL3 ubikuitin ligaz kompleksi tarafından etiketlenir ve parçalanır. Oksidatif stres veya elektrofilik maddelerin uyarılması altında, KEAP1'in aktivitesi inhibe edilir, NRF2'nin stabil bir şekilde birikmesine ve çekirdeğe girmesine izin verir, böylece çekirdeğin⁹ savunma ve düzenleyici rolünü uygular. Bununla birlikte, tümör mikroçevresindeki aşırı NRF2 aktivasyonu, ROS birikimini durdurarak ve apoptotik direnci artırarak glikolizi ve tümör hücrelerinin hayatta kalmasını artırabilir^10,11. Çalışmalar, silika maruziyetinin NRF2 sinyal yolunun^12,13 anormal aktivasyonuna neden olabileceğini kanıtlamıştır. Bu nedenle, NRF2'yi hedeflemek, silika^14'ün neden olduğu akciğer adenokarsinomunun malign ilerlemesine müdahale etmek için etkili bir strateji olabilir.

Bu çalışma, NRF2 inhibitörü ML385'in ROS/NRF2-otofaji ekseni yolunu düzenleyerek akciğer adenokarsinomunun silika kaynaklı malign ilerlemesini inhibe edip etmediğini açıklığa kavuşturmayı amaçlamaktadır. Hastalığın temel özelliklerini yeniden üretmek için silika kaynaklı bir fare modeli oluşturduk ve makrofajlar ile tümör hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek için in vitro deneysel yöntemler kullandık. Silikanın inflamatuar ve immün moleküllerin ekspresyonunu indüklediğini ve ROS/NRF2-otofaji ekseni yolu yoluyla tümör oluşumunu daha da desteklediğini bulduk. NRF2 inhibitörü (ML385) kullanıldığında, silikanın tümör oluşumu üzerindeki teşvik edici etkisi yavaşladı, bu da NRF2 inhibitörünün silika kaynaklı akciğer tümörlerinin tedavisinde rol oynayabileceğini düşündürdü.

Tüm donör blokları, Nanjing Tıp Üniversitesi Bağlı Huai'an NO.1 Halk Hastanesi'nde 2016 ve 2018 yılları arasında toplanan arşiv patolojik örneklerinden elde edildi. Numuneler kullanılmadan önce kimliksizleştirildi ve onaylanmış protokollere uygun olarak işlendi. Nanjing Tıp Üniversitesi'ne bağlı Huai'an 1 Nolu Halk Hastanesi'nin etik kurulu, KY-2024-250-01. Deney farelerinin yetiştirilmesi, imhası ve uygulanması, Laboratuvar Hayvanlarının İdaresine İlişkin Yönetmeliklere ve uluslararası yönergelere sıkı sıkıya uygundur.

Silika kaynaklı bir fare modelinin oluşturulması
Farelerin ve silika süspansiyonunun hazırlanması: 6-8 haftalık erkek C57BL/6 farelerini, oda sıcaklığı 20-25 °C ve 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık döngüsüne sahip bir hayvan odasında büyütün. Silikon tozu süspansiyonunu hazırlamak için, 300 mg silikon tozu tozu hassas bir şekilde tartıldı ve 10 mL steril 1x fosfat tamponlu salin içinde süspanse edildi. Daha sonra, karışım kuvvetli bir şekilde vortekslendi ve 5 dakika boyunca salındı ve daha sonra parçacıkların düzgün dağılımını sağlamak ve topaklanmayı önlemek için bir su banyosu ultrasonik makinesinde 30 dakika boyunca ultrasonik olarak işlendi. Bu rezerv süspansiyonun nihai konsantrasyonu 30 mg/mL'dir. 121 °C'de 30 dakika otoklavlayarak sterilize edin. Her kullanımdan önce, çöken parçacıkları yeniden süspanse etmek için girdap yapmak ve 2-3 dakika tekrar sallamak gerekir.

Fareler silika süspansiyonunu burundan soludu. Mikropipet, çözeltiyi farelerin burun boşluğuna yavaşça ve damla damla sokmak için kullanıldı. Fareler, her grupta 20 fare olacak şekilde 6 gruba ayrıldı. Her grubun inhalasyon hacmi 10 μL, 30 μL, 50 μL, 70 μL, 90 μL ve 200 μL olup, konsantrasyonu 30 mg/mL olup, art arda 40 gün boyunca günde bir kez. Parfüm yaparken, sol elin başparmağı ve işaret parmağıyla farenin kulağının arkasındaki cildi kavrayın ve diğer parmaklarla farenin gövdesini ve kuyruğunu sabitleyin. Süspansiyonun solunum yoluna doğal olarak solunmasını sağlamak için farenin başı hafifçe geriye eğik olacak şekilde sırtüstü pozisyonda olduğundan emin olun. Farelerde 10 μL, 30 μL, 50 μL ve 70 μL silika süspansiyonunun solunmasının ikinci gününden sonra ölüm olayı olmadığını, farelerde ise 90 μL ve 200 μL silika süspansiyonunun solunmasının ikinci gününden sonra bir ölüm olayı olduğunu bulduk. Bu nedenle, farelerde maksimum silika inhalasyon hacmi günde 70 μL idi.

Kristal silika ile çalışırken, bir biyogüvenlik kabininde veya çeker ocakta gerçekleştirilmeli ve işlem boyunca N95 maskeleri, toz geçirmez gözlükler, nitril eldivenler ve koruyucu giysiler giyilmelidir. Süspansiyon hazırlanırken hareketler yumuşak olmalı ve aerosol oluşumunu önlemek için bir tartım odası kullanılmalıdır. Tüm silika temas atıkları, delinmeye karşı dayanıklı kapalı kaplarda toplanmalı ve tehlikeli kimyasal atık yönetmeliklerine uygun olarak bertaraf edilmelidir. Genel çöplerle karıştırılması veya kanalizasyona dökülmesi kesinlikle yasaktır. Hücre kültürü ortamı gibi biyolojik atıklar, dezenfektan içeren özel çöp kutularında toplanmalı ve yüksek basınç altında sterilize edilmelidir. Hayvan karkas ve dokuları biyolojik atık torbalarına konulmalı ve zararsız tedavi için yüksek basınç altında sterilize edilmelidir.

Silika kaynaklı fare modelinin başarısını değerlendirin. Hayvanları silika inhalasyonundan sonra farklı zaman noktalarında, yani 3., 14. ve 40. günlerde değerlendirin. Fareler profesyonel hayvan ötenazi cihazlarına yerleştirildi ve %30-%50 hacim/dak dolum oranında karbondioksit verildi. Nefes almayı bırakana kadar sürekli maruz kaldılar. Ölümün doğrulanmasının ardından sonraki operasyonlar gerçekleştirildi. Akciğer dokusu çıkarıldı. Akciğer dokusu oda sıcaklığında %4'lük paraformaldehit solüsyonunda 48 saat fikse edildi. Fiksasyondan sonra doku gradyan alkol ile dehidre edildi, ksilen ile şeffaf hale getirildi ve daha sonra parafine gömüldü. Daha sonra histolojik boyama ve immünohistokimyasal analiz için 4-5 μm kalınlığında bir parafin kesit makinesi kullanılarak sürekli kesitler yapıldı. Akciğer dokusu kireç çözme tedavisi gerektirmez. Başarılı model üretimini değerlendirmek için akciğer dokusunun patolojik incelemesi yapıldı. Silikozis model yapımının başarı kriterleri şu şekildeydi: belirgin pulmoner inflamasyon, fibrozis ve silikozis nodüllerinin oluşumu.

Silika kaynaklı fare modelinde bağışıklık hücresi infiltrasyonunun analizi
Silika inhalasyonundan sonraki 14. günde farelerin akciğer dokuları, CD3e (1:200 seyreltme oranı), CD8a (1:200 seyreltme oranı), CD86 (1:200 seyreltme oranı), F4/80 (1:200 seyreltme oranı) ve Nk1.1 (1:200 seyreltme oranı) içeren floresan belirteçlerle boyandı. Spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için hücre veya doku kesitlerini sabitleyin ve 1 saat boyunca %5 sığır serum albümini (BSA) ile bloke edin. Bloke edici antikorla aynı tür kökenli normal serum kullanın, serumu PBS ile 1:10 oranında seyreltin ve numuneye 100 μL seyreltilmiş serum ekleyin. Ardından, serumun endojen antikorları bloke etmesine izin vermek için oda sıcaklığında 30 dakika bloke edin. Kapattıktan sonra PBS ile 2 kez hafifçe durulayın. CD3e (1:200 seyreltme oranı), CD8a (1:200 seyreltme oranı), CD86 (1:200 seyreltme oranı), F4/80 (1:200 seyreltme oranı) ve Nk1.1 (1:200 seyreltme oranı) içeren birincil antikorlar, gece boyunca 4 °C'de veya oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edildi. PBS ile yıkandıktan sonra floresan sekonder antikor ilave edildi ve karanlıkta 1 saat inkübe edildi.

Masson boyama ve immünohistokimyasal analiz
Parafin kesitleri ksilen ile mumdan arındırıldı ve gradyan alkol ile hidratlandı ve daha sonra yüksek basınçlı termal iyileştirme ile pH 6.0 olan sodyum sitrat tamponunda antijen alımı gerçekleştirildi. Yüksek basınçlı termal iyileştirme için, onarım tamponuna batırılmış doku dilimlerini orta ateşte 8-12 dakika mikrodalga fırına koyun. Endojen peroksidaz aktivitesi 20 dakika boyunca %3 hidrojen peroksit çözeltisi ile bloke edildi ve daha sonra spesifik olmayan bağlanma bölgesi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %5 BSA ile bloke edildi. Birincil antikorlar NRF2 (1:200), CDK1 (1:400) ve VDAC1'i (1:500) ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. PBS ile 3 kez yıkadıktan sonra, HRP etiketli keçi anti-tavşan ikincil antikoru (1:500) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Parafin kesitleri, karşılık gelen moleküler immünohistokimya sonuçlarını elde etmek için DAB boyama, hematoksilen karşı boyama, dehidrasyon şeffaflığı ve nötr jel sızdırmazlığına tabi tutuldu. Renk gelişimi için DAB kullanıldığında, orta renk gelişimi kahverengimsi sarı ila kahverengimsi kahverengi olmalı ve arka plan net olmalıdır. Hem aşırı (koyu kahverengi) hem de yetersiz (açık sarı) renk gelişimi, renk gelişim süresinin optimizasyonunu gerektirir.

Pulmoner fibrozun derecesi Ashcroft skorlama yöntemi¹⁵ kullanılarak yarı kantitatif olarak analiz edildi: Masson boyalı kesitler 100x büyütme mikroskobu altında gözlendi ve akciğer dokusu rastgele 8 bölgeye ayrıldı. Her bölge fibrozis derecesine göre puanlandı (0-8 puan), nihai puan tüm bölgelerin ortalaması oldu: 0 puan (normal akciğer dokusu), 1-2 puan (hafif fibrozis), 3-4 puan (orta fibrozis), 5-8 puan (şiddetli fibrozis).

İmmünohistokimyasal sonuçlar Image yazılımı kullanılarak kantitatif olarak analiz edildi. Beş yüksek büyütmeli alan rastgele seçildi ve her alanın ortalama optik yoğunluk değeri (MOD), protein ekspresyon seviyesinin bir göstergesi olarak ölçüldü.

RAW264.7 hücrelerinde silika ve ML385'in otofaji ve ROS üzerindeki etkisinin incelenmesi
Hem RAW264.7 hem de A549 hücreleri (Anhui Bilim ve Teknoloji Üniversitesi tarafından sağlanmıştır), %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin bispesifik antikor çözeltisi ile desteklenmiş DMEM yüksek glikoz ortamı kullanılarak kültürlendi. 1 x 10⁷ hücre, 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de sabit sıcaklıklı bir inkübatörde homojen bir şekilde kültürlendi . 1 x 10^{5 hücre/}mL RAW264.7 hücresine 5 μL 30 mg/mL silika süspansiyonu ilave edildi. 24 saat inkübasyondan sonra hücreler PBS 3x ile durulandı ve otofaji ve oksidatif stres ROS, LC3 ve lizozom probları ile tespit edildi. Aynı zamanda, NRF2'nin ekspresyonunu inhibe etmek için bir NRF2 inhibitörü olan ML385 ¹⁶ kullanıldı (ML385'in nihai konsantrasyonu: 5 mM/L). Otofaji ve oksidatif stres yukarıdaki deneysel adımlara göre tespit edildi. İki grubun oksidatif stres ve otofaji akımı istatistiksel olarak analiz edildi.

Akciğer adenokarsinom dokusunda VDAC1, CDK1, p62 ve NRF2 ekspresyonlarının immünohistokimyasal analizi
30 hastada VDAC1, CDK1, p62 ve NRF2 ekspresyonları kontrol edildi. Akciğer adenokarsinomu olan dokular ve bitişik sağlıklı dokular, Nanjing Tıp Üniversitesi Bağlı Huai'an NO.1 Halk Hastanesinden elde edildi ve immünohistokimya (IHC) ile analiz edildi. İHK ve pulmoner fibrozis sonuçları istatistiksel olarak analiz edildi. Hastane sistemindeki hasta bilgilerine göre hasta verilerini toplayın. Spesifik deneysel adımlar aşağıdaki gibidir: Parafin kesitleri ksilen ile mumdan arındırıldı ve gradyan alkol ile hidratlandı ve daha sonra yüksek basınçlı termal iyileştirme ile pH 6.0 olan sodyum sitrat tamponunda antijen iyileştirmesi gerçekleştirildi. Endojen peroksidaz aktivitesi 20 dakika boyunca %3 hidrojen peroksit çözeltisi ile bloke edildi ve daha sonra spesifik olmayan bağlanma bölgesi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %5 BSA ile bloke edildi. Birincil antikorlar NRF2 (1:200), CDK1 (1:400), p62 (1:500) ve VDAC1'i (1:500) ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. PBS ile 3 kez yıkadıktan sonra, HRP etiketli keçi anti-tavşan ikincil antikoru (1:500) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. DAB renk gelişimi, hematoksilen karşı boyama, susuz şeffaf, nötr diş eti sızdırmazlığı. Renk gelişimi için DAB kullanıldığında, orta renk gelişimi kahverengimsi sarı ila kahverengimsi kahverengi olmalı ve arka plan net olmalıdır. Hem aşırı (koyu kahverengi) hem de yetersiz (açık sarı) renk gelişimi, renk gelişim süresinin optimizasyonunu gerektirir.

Hücre göçü ve istila analizi
Silikanın RAW385 hücreleri ile birlikte inkübasyonundan elde edilen ML264.7 ve süpernatantın, akciğer adenokarsinomu hücre dizisi A549 ile inkübe edildikten sonra hücre göçü ve istilası üzerindeki etkisi incelenmiştir. 24 saat boyunca silika ile birlikte kültürlenmiş RAW264.7 hücrelerinin süpernatanı A549 hücrelerine eklendi. Hücreler silika grubu, silika+ML385 grubu ve PBS grubuna ayrıldı. Silika grubu: 1 x 10⁵ hücre/mL RAW264.7 hücresine 5 μL 30 mg/mL silika süspansiyonu ilave edildi. 24 saat inkübasyondan sonra, daha sonra kullanmak üzere hücre süpernatanını çıkarın. Silik+ML385 grubu: 5 x 30^{5 hücre/} mL RAW5 hücresine 385 μL 1 μL ML264.7 silika süspansiyonu ve 5 mM/L ML385'lik bir nihai konsantrasyon ilave edildi. 24 saat inkübasyondan sonra, daha sonra kullanmak üzere hücre süpernatanını çıkarın. PBS grubu: 1 x 10⁵ hücre/mL RAW264.7 hücresine 5 μL PBS eklendi. 24 saat inkübasyondan sonra, daha sonra kullanmak üzere hücre süpernatanını çıkarın. Çizik tahlili sırasında, A549 hücreleri ilk olarak kuyu başına 5 x 10⁵ yoğunlukta 12 oyuklu plakalara ekildi. Hücreler %95-%100 füzyona ulaştıktan sonra, 200 μL'lik steril bir pipetin ucu kullanılarak tek tabakalı hücreler üzerinde çizikler yapıldı. Pul pul dökülen hücreler PBS ile nazikçe yıkandı. Daha sonra, 7 günlük deney süresi boyunca hücre canlılığını korumak için kültür koşulları, %1 FBS bazik ortamını ve her tedavi grubunun süpernatantlarını içerecek şekilde değiştirildi. Aynı pozisyondaki görüntüler, çizikten sonra sırasıyla 0 saatte (0. gün) ve 7. günde (7. gün) ters mikroskop altında toplandı. Son olarak, çizik alanı kantitatif olarak analiz edildi ve farklı tedavi gruplarından süpernatantın A549 hücrelerinin göç kabiliyeti üzerindeki etkisini değerlendirmek için ImageJ yazılımı kullanılarak çizik kapanma oranı hesaplandı.

Hücreler, belirli boyutta istila testinin gözeneklerinden geçerken, bir bazal membran bariyeri oluşturmak için 1:8 oranında seyreltilmiş hücre dışı ortamı simüle eden jel ile önceden kaplanmış üst oda membranı ile 8 μm'lik bir polikarbonat membran odası kullanıldı. A549 hücreleri, serumsuz ortamın her bir tedavi grubunun süpernatanları ile 1:1 oranında karıştırılmasıyla yapılan bir süspansiyon içinde yeniden süspanse edildi ve daha sonra üst bölmeye (oda başına 2 x 10,⁴ hücre) aşılandı. Alt bölmeye, %20 FBS içeren bir ortamın karşılık gelen tedavi gruplarının (Silika+ML385 grubu, Silika grubu ve PBS grubu) süpernatanları ile aynı oranda karıştırılmasıyla yapılan bir çözelti, kimyasal cezbedici olarak ilave edildi. Karşılık gelen tedavi gruplarının süpernatantları, silikanın RAW264.7 Hücre fagositozunda bir pipet tabancasından emilerek toplandı. Hücreler 37 °C'de ve %5_CO2'de 7 gün boyunca sürekli inkübe edildikten sonra, üst odacıktaki non-invaziv hücreler pamuklu çubuklarla çıkarıldı ve zara nüfuz eden ve alt odaya ulaşan hücreler %4 paraformaldehit ile sabitlendi ve% 0.1 kristal viyole ile boyandı. Son olarak, invaziv hücrelerin sayısı optik mikroskopla 5 görüş alanından rastgele seçildi.

Akış sitometrisi kullanılarak silika ve ML385'in A549 hücrelerinin apoptozu üzerindeki etkisinin analizi
Hücre hazırlama ve gruplama: Her tedavi grubunun (PBS grubu, silika grubu, silika + ML385 grubu) süpernatanları ile tedavi edilen A549 hücreleri toplandı. Hücreler, önceden soğutulmuş PBS ile 2 kez nazikçe yıkandı, daha sonra 1x bağlanma tamponu içinde yeniden süspanse edildi ve hücre yoğunluğu, tüp başına 1 x 10⁶ hücre/100 μL'ye ayarlandı. Daha sonra, hücre süspansiyonuna 5 μL Annexin V-FITC ve 5 μL PI boyama solüsyonu ilave edildi, karıştırmak için hafifçe vortekslendi ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, her tüpe 400 μL 1x bağlama tamponu eklendi ve hemen makinede test edildi. Tespit, bir akış sitometresi kullanılarak gerçekleştirildi. 488 nm'lik bir lazerle uyarılan Annexin V-FITC'nin floresan sinyali FITC kanalı aracılığıyla toplandı ve PI'nin floresan sinyali PE kanalı aracılığıyla toplandı. Deneyden önce, spektral örtüşmeyi ortadan kaldırmak için floresan telafisi ayarlaması için tek boyamalı numuneler kullanıldı. Veri analizi yaparken, önce FSC-A/SSC-A dağılım grafiğinde hedef hücre popülasyonunu tanımlayın ve parçaları ortadan kaldırın. Daha sonra, FSC-H/FSC-A dağılım grafiği kullanılarak hücre adezyonları hariç tutuldu; Son olarak, canlı hücreler, erken apoptotik hücreler, geç apoptotik/nekrotik hücreler ve mekanik olarak hasar görmüş hücreler arasında ayrım yapmak için bir kapı kuruldu. Veriler FlowJo V10 yazılımı kullanılarak elde edildi ve analiz edildi.

Silika fare modeli
Şekil 1'de, farelere art arda 40 gün boyunca 30 mg / mL ve 70 μL'lik bir dozda intranazal olarak silika uygulandı, bu da farelerde hiçbir ölüm olayının meydana gelmemesini ve silika fare modelinin başarılı bir şekilde kurulabilmesini sağladı. Bu arada, negatif kontroller olarak PBS'li fareler gavajı kullanıldı. Amaç, işlemin ve çözücünün kendisinin etkisini ortadan kaldırmak ve fenotipin spesifik olarak silika tarafından indüklenmesini sağlamaktı. Bu silika kaynaklı akciğer hasarı modelinin başarılı bir şekilde replikasyonu, malign ilerleme mekanizması ve ilaç müdahalesi üzerine sonraki araştırmalar için gerekli bir in vivo temel sağlar.

Silika kaynaklı farelerin nodüllerinde bağışıklık hücresi infiltrasyonunun analizi
Şekil 2'de, silika farelerin nodüllerinde immün hücre infiltrasyonu tespit edilerek, silika akciğer hastalığının oluşumunda ve gelişiminde rol oynayan nodüllerde çok sayıda immün hücre infiltrasyonu (CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ ve Nk1.1+ hücreleri) olduğu bulunmuştur. Bu, silikanın, tümör oluşumu ve gelişimi için önemli bir teşvik faktörü olan ve ayrıca ROS/NRF2 yolunun katılımı için patofizyolojik temel olan kalıcı bir inflamatuar tümör mikroçevresini indüklediğini gösterir.

Farelerde silika kaynaklı pulmoner fibroz ile NRF2, CDK1 ve VDAC1 arasındaki ilişki
Nodüllerde immün moleküllerin ekspresyonunun saptanmasıyla, NRF2 (ML385 inhibitör hedef), CDK1 (hücre döngüsü ile ilgili) ve VDAC1'in (mitokondriyal oksidatif stresle ilgili) nodüllerin çevresinde ve içinde yüksek oranda eksprese edildiği ve pulmoner fibrozis ile ilişkili olduğu bulunmuştur (Şekil 3).

Silika ve ML385'in RAW264.7 hücrelerinde otofaji ve ROS üzerindeki etkisi
Silika ve RAW264.7 hücrelerinin birlikte kültürü yoluyla, silikanın otofagozom üretimini indükleyebildiği bulundu. 24 saatlik kültürden sonra, otofagozom ve lizozomun birlikte lokalizasyonu azaldı, otofaji akışı inhibe edildi ve ROS üretimi de azaldı. ML385 (NRF2 inhibitörü) eklendiğinde, otofagozom ve lizozomun birlikte lokalizasyonu arttı, otofaji akışı da arttı ve ROS da buna bağlı olarak arttı (Şekil 4).

Akciğer adenokarsinom dokusunda VDAC1, CDK1, p62 ve NRF2 ekspresyonlarının IHC ile analizi
Şekil 5'te gösterildiği gibi, NRF2 (ML385'in inhibitör hedefi), CDK1 (hücre döngüsü ile ilgili), VDAC1 (mitokondriyal oksidatif streste yer alır) ve p62 (otofajide yer alır) akciğer adenokarsinom dokularında yüksek oranda eksprese edilir ve komşu dokulara kıyasla önemli farklılıklar gösterir.

Silikanın RAW264.7 hücreleri ile birlikte inkübasyonundan elde edilen ML385 ve süpernatantın A549 hücrelerinin göçü ve istilası üzerindeki etkisi
Silika ve RAW264.7 hücre kültürü süpernatanı, A549 hücrelerinin göçünü ve çoğalmasını teşvik edebilirken, ML385 bu süreçleri önemli ölçüde inhibe edebilir ( Şekil 6'da gösterildiği gibi). Bu sonuç, silika tarafından indüklenen makrofaj mikroçevresinin tümör teşvik edici etkisinin NRF2 yoluna bağlı olduğunu göstermektedir. NRF2'nin inhibe edilmesi, bu tümör teşvik edici etkiyi etkili bir şekilde bloke edebilir, böylece tümör hücrelerinin malign ilerlemesini azaltabilir.

Silika ve ML385'in A549 hücrelerinin apoptozu üzerindeki etkisi
Şekil 7 , silika ve RAW264.7 hücre kültürü süpernatantının A549 hücre apoptozu üzerinde belirli bir inhibitör etkiye sahip olduğunu ve ML385'in A549 hücre apoptozunu destekleyebileceğini göstermektedir.

Bu çalışma, silika maruziyetinin hem in vivo hem de in vitro yöntemler kullanılarak ROS/NRF2/otofaji ekseni yoluyla akciğer adenokarsinomunun malign ilerlemesini desteklediği mekanik yolu ortaya koymuştur. Hayvan deneyleri, NRF2 sinyal yolunun anahtar moleküllerinin, silika tarafından indüklenen pulmoner fibrozun mikro ortamında önemli ölçüde aktive olduğunu doğrulamıştır. Hücre deneyleri, silikanın makrofajlarda otofajik akışı doğrudan inhibe ettiğini ve ROS seviyelerini düşürdüğünü göstermiştir ve bu etki, NRF2 inhibitörü ML385 tarafından spesifik olarak tersine çevrilebilir. Mekanizma çalışmaları, silika ile tedavi edilen makrofajların, salgılayan faktörler tarafından akciğer adenokarsinom hücrelerinin göçünü, istilasını ve apoptozunun inhibisyonunu desteklediğini ve bu tümör teşvik edici etkinin tamamen NRF2 yolunun aktivasyonuna bağlı olduğunu göstermiştir.

Veri kullanılabilirliği:
Bu makalenin sonucunu destekleyen veri kümeleri makaleye dahil edilmiştir.

Şekil 1: Farelerde bir silika modelinin oluşturulması. (A) Fareleri farklı hacimlerde (10 μL, 30 μL, 50 μL, 70 μL, 90 μL ve 200 μL) nazal silika inhalasyonu (30 mg / mL) ile tedavi edin. İnhalasyon dozu başına 20 fare. (B) Fare hayatta kalma eğrisi. Maksimum inhalasyon miktarı 70 μL/gün'dür. (C) Silika grubu ve PBS grubu farelerde 3. gün, 14. gün ve 40. günlerde akciğer histopatolojik HE boyamasının gözlem sonuçları. (D) Düşük büyütme altında farelerde gözlenen pulmoner nodül sayısının istatistiksel sonuçları, t-testi, ***p <0.001, p= 0.004, t =10.61 (14. gün), p =0.0006, t =10.02 (40. gün). N =9. Hata çubukları standart hatayı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Floresan boyama yoluyla farelerin nodüler dokusunda bağışıklık hücresi infiltrasyonunun gözlemlenmesi. Farelerde silika kaynaklı pulmoner nodüllerin nodüllerinde bağışıklık hücrelerinin (CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ ve NK1.1+) yüksek infiltrasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: NRF2, CDK1, VDAC1 ve silika kaynaklı fibroz ekspresyonları arasındaki ilişkinin immünohistokimya (IHC) ve Masson boyama yoluyla analiz edilmesi. (A) NRF2, CDK1 ve VDAC1 ifadeleri ve Masson boyamanın sonuçları. (B) IHC'nin sonuçları. (C) Pulmoner fibrozun istatistiksel analizi, silika grubu ile PBS fare grubu arasında yapıldı. t-testi, ***p <0.001, p =0.0002, t =13.42 (NRF2), p=0.0008, t =9.247 (CDK1), p =0.0009, t =8.944 (VDAC1), p =0.0003, t =11.76 (pulmoner fibrozis). N =9. Hata çubukları standart hatayı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Silikanın RAW264.7 hücrelerinde otofaji üzerindeki etkisi ve NRF2 inhibitörü ML385'in otofaji düzenleyici etkisi. (A) Silikanın RAW264.7 hücreleri ile 24 saat birlikte inkübe edilmesinden sonra, otofagozomların (LC3) ve lizozomların birlikte lokalizasyonu azaldı (Yeşil). Bununla birlikte, ML385'in eklenmesiyle, otofagozomların ve lizozomların birlikte lokalizasyonu arttı (Sarı). (B) Silikanın RAW264.7 hücreleri ile 24 saat birlikte inkübe edilmesinden sonra, silika grubu tarafından üretilen ROS azaldı, ancak ML385 ilavesinden sonra arttı. (C) İki grubun ROS ve otofaji akışının istatistiksel analizi, t-testi, ***p <0.001, p =0.0005, t =10.59 (ROS), p <0.0001, t =17.08 (Otofagolizozom). N =6. Hata çubukları standart hatayı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: İnsan akciğer adenokarsinom dokusunda VDAC1, CDK1, p62 ve NRF2 ekspresyonlarının immünohistokimyasal analizi. (A) İnsan akciğer adenokarsinom dokusu ile komşu kanserli olmayan doku arasındaki diferansiyel ifadeler (VDAC1, CDK1, p62 ve NRF2). (B) Nanjing Tıp Üniversitesi Bağlı Huai'an NO.1 Halk Hastanesi'nden 30 kanser vakası ve komşu kanserli olmayan dokular arasındaki diferansiyel ekspresyonun istatistiksel analizi, t-testi, ***p <0.001, p <0.0001, t =8.322 (CDK1), p <0.0001, t =16.4 (NRF2), p <0.0001, t =15.47 (p62), p <0.0001, t =17.75 (VDAC1). N =30. Hata çubukları standart hatayı gösterir. (C) Akciğer adenokarsinom dokusunda ve komşu kanserli olmayan dokuda fibrozisin istatistiksel analizi, t-testi, ***p <0.001, p =0.0009, t =8.854 (fibrozis). N =30. Hata çubukları standart hatayı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Silikanın RAW264.7 hücreleri ile birlikte inkübasyonundan elde edilen ML385 ve süpernatantın, akciğer adenokarsinom hücre hattı A549 ile inkübe edildikten sonra hücre göçü ve istilası üzerindeki etkisi. (A) Hücre çizilmesi, süpernatant ve ML385'in A549 hücreleri ile birlikte inkübasyonundan sonraki 0. ve 7. günlerde sonuçlanır. (B) Süpernatant ve ML385'in A549 hücreleri ile birlikte inkübasyonundan sonraki 7. günde hücre invaziv sonuçlar. (C) Hücre çizik tahlili sonuçları üzerinde istatistiksel analiz yapmak. *p <0.05, **p <0.01. t-testi, p =0.0020, t =22.43 (Silika+ML385'e karşı Silika), p =0.0135, t =8.510 (Silika+ML385'e karşı PBS), p =0.0143, t =8.281 (Silika'ya karşı PBS). N =6. Hata çubukları standart hatayı gösterir. (D) Hücre invaziv tahlil sonuçları üzerinde istatistiksel analiz yapmak. *p <0.05, **p <0.01, t-testi, p =0.0097, t =10.06 (Silika+ML385'e karşı Silika), p =0.0472, t =4.437 (Silika+ML385'e karşı PBS), p =0.0125, t =8.857 (Silika ve PBS). N =6. Hata çubukları standart hatayı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Akış sitometrisi yoluyla silika ve ML385'in A549 hücrelerinin apoptozu üzerindeki etkisinin analizi. (A) A549 hücrelerinin apoptoz sonuçlarını akış sitometrisi yoluyla tespit edin. (B) Apoptotik hücrelerin yüzdesi üzerinde istatistiksel analiz yapmak. *p <0.05, **p <0.01, t-testi, p =0.0013, t =27.29 (Silika+ML385'e karşı Silika), p =0.0022, t =6.973 (Silika+ML385'e karşı PBS), p =0.0048, t =5.649 (Silika'ya karşı PBS). N =6. Hata çubukları standart hatayı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.