Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Antiviral Tarama Çalışmaları İçin Alphavirus Enfeksiyonunun Kantitatif Floresan Görüntülemesi

64 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69384

⸱

14 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG), 2Department of Pest and Vector Insect Control, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources, 3Institute for Insect Biotechnology, Justus-Liebig University, 4BMFTR Junior Research Group in Infection Research "ASCRIBE", Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, alfavirüs enfeksiyonlarının sürekli görselleştirilmesi için sağlam ve uyarlanabilir bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, floresan görüntüleme tabanlı olarak hücresel düzeyde alfavirüs replikasyonunun araştırılması ve antiviral bileşiklerin etkinliğinin değerlendirilmesi için bir yaklaşım sağlar.

Özet

Floresan mikroskopi, alfavirüs enfeksiyonlarının hücresel düzeyde incelenmesi için son derece hassas ve çok yönlü bir yaklaşım sunar. Floresan işaretli virüslerin kantitatif görüntü analizi ile birleştirilmesi sayesinde bu yöntem, replikasyon kinetiğindeki ince farklılıkların ve hücreden hücreye yayılımın tespitini içeren, enfeksiyon dinamiklerinin ayrıntılı mekansal ve zamansal karakterizasyonuna olanak tanır. Bu protokolün temel amaçlarından biri, antiviral tarama analizlerinde uygulanmasıdır. Floresan yoğunluğunun görüntü tabanlı kantifikasyonu, antiviral bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir araç sunarak, enfekte hücrelerdeki inhibitör etkilerin erken ve hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Bu durum, gelecek vaat eden antiviral adayların belirlenmesini kolaylaştırır ve doza bağlı yanıtların değerlendirilmesini destekler. Replikasyon davranışı ve yayılım modellerindeki varyasyonlar kolayca belirgin hale geldiğinden, bu yaklaşım farklı alfavirüs suşlarının veya mutantlarının karşılaştırmalı çalışmaları için de oldukça uygundur. Esnekliği, birden fazla hücre hattıyla uyumluluğu ve otomatik görüntüleme platformlarına kolay entegrasyonu, yöntemi ölçeklenebilir kılarak yüksek kapasiteli tarama kampanyaları için uygun hale getirir. Genel olarak bu protokol, antiviral stratejilerin keşfini ve değerlendirilmesini ileri taşımaktadır. Birçok alfavirüsün ciddi insan ve veteriner hastalıklarına yol açtığı, onaylanmış antiviral tedavilerin eksik olduğu ve ortaya çıkan salgınlarla coğrafi olarak yayılmaya devam ettiği göz önüne alındığında, yeni antivirallerin tanımlanması acil bir öncelik olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, floresan tabanlı bu iş akışı, modern alfavirüs araştırmalarına değerli ve zamanında bir katkı teşkil etmektedir.

Giriş

Alfavirüsler, Togaviridae ailesine ait zarflı, pozitif anlamlı, tek zincirli ribonükleik asit (RNA) virüsleridir1,2,3. Temel olarak sivrisinekler tarafından bulaştırılırlar ve insanlarda ile hayvanlarda bir dizi hastalığın sorumlusudurlar. Alfavirüs cinsi, Chikungunya virüsü (CHIKV), Sindbis virüsü, Doğu at ensefaliti virüsü ve Venezuela at ensefaliti virüsü gibi tıbbi açıdan önemli birkaç virüsü içerir4,5. Bu patojenler, ateşli hastalıklar ve döküntülerden ciddi nörolojik komplikasyonlara kadar değişen semptomlara neden olurlar6. Endişe verici bir şekilde, CHIKV yeniden ciddi bir halk sağlığı sorunu haline gelmiştir. Sadece 2025 yılının başından bu yana 14 ülkede 220.000'den fazla vaka rapor edilmiş ve bu durum en az 80 ölümle sonuçlanmıştır7. Mortalite oranı düşük olsa da, enfekte bireylerin önemli bir kısmında, uzun süreli engelliliğe ve hareket kısıtlılığına yol açabilen kronik eklem ağrıları gelişmektedir8. Hedefe yönelik antiviral stratejiler geliştirmek için alfavirüs replikasyonu ve konakçı-patojen etkileşimlerinin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılması gereklidir. Öte yandan, Semliki Forest virüsü (SFV) gibi bazı alfavirüsler, daha virulent alfavirüslerle yüksek genetik ve yapısal benzerlik göstermelerine rağmen insanlarda düşük patojenite sergilerler. Bu durum, SFV'yi insan sağlığı için yüksek risk oluşturmadan alfavirüsleri çalışmak için ideal bir model haline getirir9,10,11.

Plak analizleri, %50 doku kültürü enfeksiyöz dozu (TCID50) analizi ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizi gibi geleneksel yöntemler, viral titrelerin ve gen ekspresyonunun kantifikasyonu için değerlidir ancak uç nokta ölçümleriyle sınırlıdır ve hücre lizisi veya fiksasyonu gerektirir. Sonuç olarak, aynı hücrelerdeki enfeksiyon dinamiğini zaman içinde doğrudan yakalayamazlar12,13. Bu sınırlamaları gidermek için gerçek zamanlı floresan görüntüleme, birden fazla zaman noktasında enfeksiyon kinetiğini izlemek için güçlü ve tahribatsız bir yaklaşım sunar. mCherry etiketli SFV gibi floresan işaretli virüslerin kullanımı, reporter virüs sinyalinin ve yayılımının canlı hücrelerde doğrudan görselleştirilmesini ve kantifikasyonunu sağlar14,15. Burada açıklanan deneyler için arbovirüs araştırmalarında yaygın olarak kullanılan hücre hatlarından yararlanılmıştır. Aedes albopictus larvalarından türetilen U4.4 hücreleri, birçok arbovirüsün etkin replikasyonunu destekleyen ve vektör-virüs etkileşimleri üzerine çalışmaları kolaylaştıran sivrisinek hücreleridir16,17. Paralel olarak, bebek hamster böbrek dokusundan köken alan fibroblast benzeri bir memeli hücre hattı olan BHK-21 hücreleri, viral propagasyon ve moleküler viroloji analizleri için sıklıkla kullanılan permisif bir omurgalı konak sistemi sağlar18.

Bu protokol, furin inhibitörlerini örnek olarak kullanarak, viral raporlayıcı ekspresyonunun izlenmesini ve antiviral bileşiklerin karakterizasyonunu ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Furin, birçok ökaryotta bulunan bir proprotein konvertazdır ve büyüme faktörleri, hormonlar, matriks metalloproteinazlar, plazma proteinleri ve reseptörlerin öncüllerini aktive etmede kilit bir rol oynar19,20. Birçok alfavirüs, yüzey proteinlerini kesmek ve aktive etmek için furinden yararlanır ki bu, başarılı replikasyon için kritik bir adımdır20. Furin inhibitörleri, furin aktivitesini bloke ederek viral replikasyonu azaltan sentetik olarak tasarlanmış bileşiklerdir21,22,23. Hücre görüntüleme özellikli çok modlu bir okuyucu kullanılarak alfavirüs enfeksiyonlarının otomatik floresan mikroskopi tabanlı analizi için standart protokollerin sınırlı olması nedeniyle, aedine hücrelerinde antiviral bileşiklerin karakterizasyonu için ayrıntılı bir iş akışı sunulmaktadır. Protokol; hücre kültürü, virüs üretimi, enfeksiyon, antiviral bileşik (furin inhibitörü) uygulaması, floresan görüntüleme ve görüntü analizi aşamalarını ana hatlarıyla belirtmektedir. Bununla birlikte, burada açıklanan yöntemler diğer virüslere ve alternatif floresan işaretleyicilere kolaylıkla uyarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Biyogüvenlik

NOT: Bu protokolde kullanılan rekombinant mCherry etiketli Semliki Forest virüsü (SFV-mCherry) genetik olarak modifiye edilmiştir24,25,26. Floresan bir raporcu genin eklenmesi, onu genetik olarak modifiye edilmiş bir organizma olarak sınıflandırır ve bu durum onu ek muhafaza ve düzenleyici gerekliliklere tabi kılar. Diğer alfavirüsleri, özellikle CHIKV gibi daha patojenik virüsleri içeren çalışmalar ek muhafaza ve izinler gerektirebilir.

  1. Biyogüvenlik kabinini uygun bir dezenfektanla temizleyin ve viral analizlerden önce ve sonra en az 30 dk boyunca UV uygulayın.
  2. Tüm kontamine materyalleri yerel biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak atın. Katı ve sıvı atıkları otoklavlanabilir kaplarda ayrı ayrı toplayın ve bertaraf etmeden önce otoklavlayın.

2. Antiviral bileşiklerin hazırlanması

NOT: Bu çalışmada kullanılan furin inhibitörleri MI-113027 (trans-4-(aminomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide), MI-113127 (trans-4-(guanidinomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide) ve MI-114822,23 (4-(guanidinomethyl) phenylacetyl-arginine-tert.-leucine-arginine-4-amidinobenzylamide), test edilmek üzere seçilen antiviral bileşik örnekleridir. Furin inhibitörü MI-1148, sitotoksisite analizinde negatif kontrol, antiviral analizde ise pozitif kontrol olarak kullanılmıştır.

  1. Antiviral bileşikleri uygun bir çözücü içinde çözün. Sitotoksik etkilerden kaçınmak için mümkün olduğunda steril su kullanın. Dimetil sülfoksit veya metanol maksimum %2 (v/v) oranında kullanılabilir. Steril su içinde 10 mM'lık stok çözeltilerin kullanılması önerilir.
  2. Üretici tarafından aksi belirtilmedikçe, stabilite ve çözünürlüğe bağlı olarak stok çözeltileri -20 °C'de saklayın.

3. Hücre kültürü

  1. U4.4 hücrelerini %10 fetal bovin serum (FBS), %1  MEM temel olmayan amino asitler, %1 tryptose fosfatlı besiyeri, %1 glutamin ve %1 penisilin/streptomisin (Pen/Strep) ile desteklenmiş Leibovitz's L-15 Besiyerinde kültüre edin (ekim yoğunluğu: yaklaşık 1 × 106 hücre/T25 flask, kültür hacmi: 5 mL). Hücreleri 28 °C'de muhafaza edin. U4.4 hücrelerini haftada bir kez 1:6 oranında pasajlayın, ancak ekim yoğunluklarını deneysel ihtiyaçlara göre ayarlayın.
    NOT: C6/36 hücreleri gibi ek hücre hatları da bu protokolle uyumludur. Uygun görüldüğünde alternatif besiyerleri ve destekleyiciler kullanılabilir. Antibiyotik eklenmesi isteğe bağlıdır ve ihmal edilebilir.
  2. Baby hamster böbrek (BHK-21) hücrelerini %10 FBS, %1 glutamin veya Statik denge, ΣFx=0, grafik, kuvvet dengesi analizi, mekanik stabilite diyagramı.‑alanyl‑Statik denge, ΣFx=0, grafik, kuvvet dengesi analizi, mekanik stabilite diyagramı.‑glutamin ve %1 Pen/Strep ile desteklenmiş Dulbecco's Modified Eagle's Medium'da kültüre edin (ekim yoğunluğu: yaklaşık 1 × 106 hücre/T75 flask, kültür hacmi: 10 mL). Hücreleri %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de muhafaza edin. Hücreleri her 4-5 günde bir 1:12 oranında pasajlayın; ekim yoğunluklarını gereksinimlere göre değiştirme esnekliği sağlayın.
  3. Hücrelerin sağlıklı kaldığından ve aktif olarak çoğaldığından emin olun.

4. Virüs üretimi

  1. BHK-21 hücrelerinde SFV-mCherry (SFV6-2SG-mCherry) stoklarının hazırlanması.
    1. BHK-21 hücrelerini (ekim yoğunluğu: yaklaşık 1 × 105 hücre/kuyu, kültür hacmi: 500 µL), yukarıda açıklanan koşullar altında şeffaf bir hücre kültürü 24 kuyucuklu plakasında kültüre edin.
    2. Yaklaşık %90 konflüenseye ulaşıldığında (hedef konflüens: yaklaşık 2 × 105 hücre), BHK-21 hücrelerini enfeksiyon besiyerinde (1% Pen/Strep ve 0,2% sığır serum albumin ile desteklenmiş DMEM) bir transfeksiyon reaktifi kullanarak SFV6-2SG-mCherry plazmidi ile transfect edin. Bunun için, 1 µL transfeksiyon reaktifini 25 µL düşük serumlu besiyerinde seyreltin.
    3. Ayrı bir tüpte, 0,5 µg plazmid DNA'sını ve 1 µL tescilli bir katkı maddesini 25 µL düşük serumlu besiyerinde seyreltin. Seyreltilmiş DNA çözeltisini, seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi içeren çözeltiye ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dk inkübe edin. Ardından, oluşan kompleksin 50 µL'sini hücrelere ekleyin.
      NOT: Spesifik hücre hattı ile uyumlu oldukları sürece diğer transfeksiyon reaktifleri kullanılabilir ve talimatlar kullanılan reaktife göre değişiklik gösterebilir.
    4. Transfeksiyondan 48 saat sonra, virüs içeren süpernatantı bir pipet kullanarak toplayın, DNA/RNA içermeyen tüplere 250 µL'lik alikotlar halinde paylaştırın ve -80 °C'de saklayın.
  2. TCID50 analizi ile titrasyon.
    1. BHK-21 hücrelerini (ekim yoğunluğu: yaklaşık 2 × 104 hücre/kuyu, kültür hacmi: 100 µL), yukarıda açıklanan koşullar altında siyah görüntüleme sınıfı 96 kuyucuklu plakada kültüre edin.
    2. Bir virüs alikotunu çözün, virüs örneğinin enfeksiyon besiyerinde on katlı seri dilüsyonlarını hazırlayın (15 µL virüs örneği + 135 µL enfeksiyon besiyeri), eski besiyerini uzaklaştırın ve dilüsyonların 100 µL'sini hücrelere ekleyin.
    3. Hücreleri %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 1 saat boyunca inkübe edin ve ardından inokülumu 100 µL taze enfeksiyon besiyeri ile değiştirin.
    4. Enfeksiyondan 48 saat sonra (hpi), çok modlu görüntüleme kuyucuk plaka okuyucusu kullanarak floresan ölçümü ile viral replikasyonu değerlendirin (ayrıntılı açıklama bölüm 7'de) ve virüs enfeksiyonunun neden olduğu sitopatik etkiyi belirleyin. TCID50 değerini Reed-Muench28 yöntemine göre hesaplayın ve 1 TCID50'nin 0,7 PFU'ya karşılık geldiği standart Poisson tabanlı yaklaşımı kullanarak tahmini viral titrelere (PFU/mL) dönüştürün.

5. Sitotoksisite tayini

  1. U4.4 hücrelerini (ekim yoğunluğu: yaklaşık 3 × 104 hücre/kuyu, kültür hacmi: 100 µL) şeffaf bir hücre kültürü 96 kuyucuklu plakada, yukarıda açıklanan koşullar altında kültürleyin.
    NOT: Dış kuyucuklara (A ve H sıraları; 1 ve 12. sütunlar) artan buharlaşma dahil olmak üzere kenar etkilerini önlemek için hücre ekilmiş ancak deneysel analiz dışı tutulmuştur.
  2. %90 konfluens seviyesinde (hedef konfluens: yaklaşık 6 × 104 hücre), hücreleri toplam 100 µL hacimde 100, 50, 25 ve 12,5 µM furin inhibitörleri MI-1130 ve MI-1131 ile işlemden geçirin. MI-1148'i (MI-1130 ve MI-1131 ile aynı konsantrasyonlarda), işlem görmemiş hücreleri ve su ile işlem görmüş hücreleri negatif kontrol; ionomycin'i (analizde 100 µM) ise sitotoksisite için pozitif kontrol olarak ekleyin.
  3. İşlemden 48 saat sonra (hpt), ATP kantifikasyonuna dayalı lüminesans analizi kullanarak hücre canlılığını değerlendirin. Her kuyucuğa eşit hacimde lüminesans analiz reaktifi ekleyin (kültür ortamına göre 1:1 oranında), hücre lizini sağlamak için plakayı 2 dk boyunca sallayın ve lüminesans ölçümü yapmadan önce 10 dk karanlıkta inkübe edin.
    NOT: Farklı tespit prensiplerine dayanan diğer hücre canlılığı analizleri de kullanılabilir.
  4. Lüminesans değerlerini, multimode okuyucu kullanarak siyah veya beyaz bir 96 kuyucuklu plakada kaydedin.

6. Viral enfeksiyon ve antiviral bir bileşik ile tedavi

  1. U4.4 hücrelerini (ekim yoğunluğu: yaklaşık 3 × 104 hücre/kuyu, kültür hacmi: 100 µL), yukarıda açıklanan koşullar altında siyah görüntüleme kalitesinde 96 kuyucuklu bir plakta kültüre edin.
    NOT: Dış kuyucuklar (A ve H sıraları; 1 ve 12. sütunlar), artan buharlaşma dahil olmak üzere kenar etkilerini önlemek amacıyla hücrelerle ekilmiş ancak deneysel analizlerin dışında tutulmuştur.
  2. Hücreleri (hedef konfluens: yaklaşık 6 × 104 hücre), takviye edilmemiş L-15 medyumunda 100 µL'lik bir inokülasyon hacmi kullanarak 0,01 enfeksiyon çokluğu (MOI) ile SFV-mCherry ile enfekte edin ve 28 °C'de 1 saat inkübe edin.
    NOT: Özellikle çok düşük MOI'lar ve çok günlük enfeksiyonlarla çalışırken yalnızca düşük pasajlı reporter virüs stokları kullanılmalıdır.
  3. Furin inhibitörleri MI-1130, MI-1131 ve MI-1148'i, takviye edilmiş L-15 medyumunu kullanarak ayrı bir 96 kuyucuklu V-tabanlı plakta 100, 50, 25 ve 12,5 µM nihai konsantrasyonlarına seyreltin. %10'luk bir fazlalık payı bırakmak için kuyu başına 110 µL hazırlayın ve 100 µL'yi (nihai hacim) hücrelerin üzerine aktarın. Kontroller için, antiviral bileşiklerin çözücüsü ile işlem görmüş enfekte hücreleri ve negatif kontrol olarak yalnızca virüs içeren enfekte hücreleri kullanın. Arka plan floresansı ölçümü için enfekte edilmemiş, işlem görmemiş hücrelerin de eklenmesi gerekmektedir.
  4. 1 saatlik enfeksiyon süresinden sonra inokülumu uzaklaştırın ve V-tabanlı plakalardaki seyreltilmiş furin inhibitörlerinden 100 µL'yi siyah görüntüleme kalitesindeki plakalara aktarın.
  5. Hücreleri 28 °C'de inkübe edin.

7. Canlı hücre floresan görüntüleme, kantitatif görüntü analizi ve veri sunumu

  1. Floresan mikroskobu aracılığıyla viral raporlayıcı ekspresyonunun ölçümü (program kurulumu için bkz. Ek Şekil 1, Ek Şekil 2, Ek Şekil 3, Ek Şekil 4, Ek Şekil 5, Ek Şekil 6 ve Ek Şekil 7).
    1. Enfeksiyondan sonraki (hpi) 24. ve 48. saatlerde, kuyuk başına 8 µL hücre geçirgen nükleer karşıt boyama çözeltisi ekleyerek hücre çekirdeklerini boyayın. 28 °C'de 30 dk inkübe edin.
      NOT: Enfeksiyon birden fazla zaman noktasında izlenebilir. Ancak, enfeksiyondan sonraki 48. saatteki ölçümler en güçlü sinyali sağlar (bkz. Ek Şekil 8) ve antiviral etkilerin en güvenilir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır. 24. saat veya ara zaman noktalarındaki okumalar mümkündür, ancak inkübasyonun 48 saati aşması hücre aşırı büyüme riskini artırır. Okuma için seçilen zaman noktasına kadar hücrelerin aşırı büyümediğinden emin olmak için deneyin başında uygun bir hücre konfluensi seçin. Bu, doğru hücre sayımının engellenmesini önleyecektir.
    2. İnkübasyondan sonra (şeffaf kapak kapağına ek olarak), güvenlik için plakanın üst kısmını kapatan şeffaf bir görüntüleme sızdırmazlık folyosu ekleyin.
      NOT: Bir görüntüleme cihazı kullanılırken doğru plaka tipini seçmek esastır. Aydınlatma, entegrasyon süresi ve kazanç (gain) ayarları, raporlayıcı gene bağlı olarak değişiklik gösterecektir. Optimal parametreleri belirlemek için ön ölçümler yapılması şiddetle önerilir. Belirtilen koşullar altında protokolü oluşturmak için kullanılan başlangıç aydınlatma, entegrasyon ve kazanç ayarları, program kurulumunun ayrıntılı olarak açıklandığı Ek Şekil 2'de verilmiştir.
    3. Multimod okuyucu kullanarak görüntü birleştirme (her kuyuk için 4x büyütmede dört alan) ile tüm kuyuk görüntülerini edinin.
    4. Texas Red filtre küpü (Eksitasyon: 586/15 nm; Emisyon: 647/57 nm) kullanarak kırmızı floresan yoğunluğunu ölçün.
    5. Aşağıdaki ayarlar ile DAPI kanalı kullanılarak toplam hücre sayısını belirleyin (Eksitasyon: 377/50 nm; Emisyon: 447/60 nm).
  2. Kantitatif görüntü analizi (ham veriler için bkz. Ek Tablo 1).
    NOT: Floresan ölçümleri için bir mikroplaka görüntüleme okuyucusu kullanılmıştır. Bu analiz için kullanılan ayrıntılı parametreler Ek Şekil 2'de bulunabilir.
    1. Görüntüleri uygun görüntüleme yazılımı kullanarak işleyin.
    2. Veri indirgeme panelini kullanarak, kuyuklardan tek bir görüntü oluşturmak için DAPI ve Texas Red kanallarına Görüntü Birleştirme (Image Stitching) seçeneğini belirleyin.
    3. Görüntü İstatistikleri'ni (Image Statistics) ekleyin ve Texas Red Birleştirilmiş kanalında Toplam yoğunluğu (Total intensity) seçin. DAPI Birleştirilmiş kanaldan arka plan gürültüsünü gidermek için Görüntü Ön İşleme (Image Preprocessing) uygulayın.
    4. Ön İşlemli DAPI Birleştirilmiş kanalında Hücresel Analiz (Cellular Analysis) işlemini çalıştırın.
    5. Enfekte edilmemiş, işlem görmemiş kontrol kuyuklarının ortalama floresanını her bir işlem görmüş kuyuktan çıkarıp, ardından sonucu ilgili kuyuktaki toplam hücre sayısına bölerek hücre başına ortalama kırmızı floresan yoğunluğunu hesaplayın.
  3. Sorun Giderme
    1. Ölçüm sırasında, özellikle uzun görüntüleme ölçümleri için veya sıcaklığa duyarlı plakalar kullanıldığında odak stabilitesini izleyin.
    2. Odak kayması gözlemlenirse otomatik odaklamayı etkinleştirin ve otomatik odaklama sıklığını artırın. Kayma devam ederse, görüntüleme öncesinde edinim hızını düşürün veya plakaların cihaz sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
    3. Edinim sırasında tutarlı sinyal kalitesi sağlamak için görüntüleme sınıfı plakalar kullanın. Aşırı aydınlatma ve uzun entegrasyon sürelerinden kaçınarak sinyal sızıntısını (bleed-through) ve aşırı pozlamayı önleyin.
    4. Sinyal doygunluğu önlenene kadar eksitasyon yoğunluğunu düşürün, entegrasyon süresini kısaltın veya kazancı azaltın. Florofor kanallarının iyi ayrıldığını doğrulayın ve gerektiğinde filtre ayarlarını düzenleyin.
      NOT: DAPI ve mCherry arasındaki sinyal sızıntısı genellikle düşüktür ancak kullanılan raporlayıcı yapıya (örneğin GFP) bağlıdır.
    5. Uygun enfeksiyon kinetiğini ve analiz hassasiyetini korumak için hücrelerin aşırı konfluensinden kaçının. Aşırı konfluens meydana gelirse, ölçüm öncesi inkübasyon süresini azaltın.
    6. Özellikle yüksek konsantrasyonlarda, boya ile ilgili hücre canlılığı ve sinyal kalitesi üzerindeki etkileri izleyin. Boya kaynaklı toksisite veya aşırı doygun arka plan gözlemlenirse boya konsantrasyonunu düşürün veya inkübasyon sürelerini kısaltın.
    7. Sinyal stabilitesini korumak için boyaları üretici önerilerine göre hazırlayın ve saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, çok kuyucuklu plaka formatında floresan mikroskopi kullanılarak alfavirüs yayılımının izlenmesi ve antiviral bileşiklerin (örneğin, furin inhibitörleri) değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Viral raporlayıcı ekspresyonu üzerindeki inhibitör etkilerin görselleştirilmesini kanıtlamak amacıyla, daha önce sentezlenmiş üç furin inhibitörü (MI-1148, MI-1130 ve MI-1131) U4.4 aedine hücre hattında test edilmek üzere seçilmiştir. Deneysel iş akışının genel görünümü Şekil ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Alfavirüs replikasyonunu gerçek zamanlı olarak gözlemleme kapasitesi, geleneksel son nokta testlerine göre ardışık ve kümülatif bir bakış açısı sunar. Bu çok zamanlı canlı hücre görüntüleme protokolü, viral yayılımı gözlemlemek için dinamik bir platform sağladığından, alfavirüslerin incelenmesi için faydalı bir modeldir.

Bu protokolün başarısı birkaç parametreye dayanmaktadır. Öncelikle, hücre ölümü nedeniyle oluşabilecek yanlış pozitif sonuçları dışlamak için antiviral analizden önce bileşikl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

pCMV-SFV6-2SG-mCherry'yi sağladıkları için Tartu Üniversitesi, Estonya'dan Prof. Dr. Andres Merits'e ve Münih Teknik Üniversitesi, Almanya'dan Prof. Dr. Andreas Pichlmair'e teşekkür ederiz. C6/36 hücreleri için Veteriner Tıp Üniversitesi, Hannover, Almanya'dan Prof. Dr. Stefanie Becker'e teşekkür ederiz. Furin inhibitörlerini sağladıkları için Marburg Üniversitesi, Marburg, Almanya'dan Prof. Dr. Torsten Steinmetzer'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52 finansman kodu ile LOEWE Translasyonel Biyoçeşitlilik Genomiği Merkezi (LOEWE-TBG) aracılığıyla Hessen Yükseköğretim, Araştırma ve Sanat Bakanlığı'nın Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz Programı ve BMFTR (Proje ASCRIBE-Hibe Numarası 01KI2024) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Albumin Bovine Fraksiyon V, pH 7.0SERVA Electrophoresis11930.03
BenchStable DMEMThermo Fisher ScientificA4192101
BHK-21 hücreleriCLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Almanya603126
HÜCRE KÜLTÜR BALONU, 50 ML, 25 cm2, PS, Kırmızı filtreli vidalı kapak, Şeffaf, CELLSTAR, TC, sterilGreiner Bio-One690175
Hücre kültürü mikroplakası, 24 kuyucuklu, PS, F-tabanlı, (Chimney well), Şeffaf, CELLSTAR, TC, kondenzasyon halkalı kapak, sterilGreiner Bio-One662160
Hücre kültürü mikroplakası, 96 kuyucuklu, PS, F-tabanlı, (Chimney well), µCLEAR, Siyah, CELLSTAR, TC, kondenzasyon halkalı kapak, sterilGreiner Bio-One655090
Hücre kültürü mikroplakası, 96 kuyucuklu, PS, F-tabanlı, (Chimney well), Şeffaf, CELLSTAR, TC, kondenzasyon halkalı kapak, sterilGreiner Bio-One655180
Hücre kültürü mikroplakası, 96 kuyucuklu, PS, V-tabanlı, ŞeffafGreiner Bio-One651101
Hücre kazıyıcıVWR734-2602
CellTiter-Glo Lüminesans Hücre Canlılık AnaliziPromegaG7573
Cytation 5 Hücre Görüntüleme Çok Modlu OkuyucuBiotek
DAPI filtre kübü 1225100Biotekex: 377/50 nm; em 447/60 nm
Dulbecco Modifiye Eagle Besiyeri (DMEM GlutaMAX)Thermo Fisher ScientificA4192102
Fetal Bovine SerumFisher Scientific11550356
Furin inhibitörü MI-1130Bu çalışma
Furin inhibitörü MI-1131Bu çalışma
Furin inhibitörü MI-1148Hardes et al. 2015.  https://doi.org/10.1002/cmdc.201500103 
Gen5 Prime YazılımıBiotek
İyonomisin Kalsiyum Tuzu, %99Thermo Fisher ScientificJ60628
Leibovitz L-15 Besiyeri, GlutaMAX Takviyeli Thermo Fisher Scientific31415029
Lipofectamine 3000 Transfeksiyon reaktifiThermo Fisher ScientificL3000001
MEM esas olmayan amino asitler (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
Mikroplaka, PS, 96 kuyucuklu, F-tabanlı, (Chimney well), Siyah, Fluotrac, Orta bağlamaGreiner Bio-One655076
NucBlue Live ReadyProbes Reaktifi (Hoechst 33342)Thermo Fisher ScientificR37605
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985062
Penisilin-Streptomisin (10, 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
SFV6–2SG-mCherryProf. Dr. Andres Merits (Tartu Üniversitesi, Estonya) ve Prof. Dr. Andreas Pichlmair (Münih Teknik Üniversitesi, Almanya)
Texas Red filtre kübü 1225102 Biotekex: 586/15 nm; em: 647/57 nm
Tryptose Fosfatlı Besiyeri Thermo Fisher Scientific18050039
U4.4 hücreleriFriedrich-Loeffler-Enstitüsü, Federal Hayvan Sağlığı Araştırma Enstitüsü, Greifswald, Almanya
Viewseal Sızdırmazlık Filmi, ŞeffafGreiner Bio-One676070

Kaynaklar

  1. Powers, A. M. Togaviruses: Alphaviruses. eLS. , (2014).
  2. Shaw, A. R., Feinberg, M. B. Vaccines. Clinical Immunology. , Elsevier. (2008).
  3. Gould, E. A., et al. Understanding the alphaviruses: recent research on important emerging pathogens and progress towards their control. Antiviral Research. 87 (2), 111-124 (2010).
  4. Lim, E. X. Y., Lee, W. S., Madzokere, E. T., Herrero, L. J. Mosquitoes as suitable vectors for alphaviruses. Viruses. 10 (2), (2018).
  5. de Caluwé, L., Ariën, K. K., Bartholomeeusen, K. Host factors and pathways involved in the entry of mosquito-borne alphaviruses. Trends in Microbiology. 29 (7), 634-647 (2021).
  6. Adizie, T., Adebajo, A. O. Travel- and immigration-related problems in rheumatology. Best practice & research. Clinical Rheumatology. 28 (6), 973-985 (2014).
  7. ECDC Chikungunya virus disease worldwide overview: Situation update. , (2025).
  8. Paixão, E. S., et al. Chikungunya chronic disease: a systematic review and meta-analysis. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 112 (7), 301-316 (2018).
  9. Atkins, G. J., Sheahan, B. J., Liljeström, P. The molecular pathogenesis of Semliki Forest virus: a model virus made useful. The Journal of General Virology. 80 (Pt 9), 2287-2297 (1999).
  10. Contu, L., Balistreri, G., Domanski, M., Uldry, A. -C., Mühlemann, O. Characterisation of the Semliki Forest Virus-host cell interactome reveals the viral capsid protein as an inhibitor of nonsense-mediated mRNA decay. PLoS Pathogens. 17 (5), (2021).
  11. Teppor, M., et al. Semliki Forest virus chimeras with functional replicase modules from related alphaviruses survive by adaptive mutations in functionally Important Hot Spots. Journal of Virology. 95 (20), (2021).
  12. Smither, S. J., et al. Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 565-571 (2013).
  13. Shan, L., Yang, D., Wang, D., Tian, P. Comparison of cell-based and PCR-based assays as methods for measuring infectivity of Tulane virus. Journal of Virological Methods. 231, 1-7 (2016).
  14. Omokungbe, B., et al. Gene silencing in the aedine cell lines C6/36 and U4.4 using long double-stranded RNA. Parasites & Vectors. 17 (1), 255(2024).
  15. Centurión, A., Omokungbe, B., Stiehler, S., Vilcinskas, A., Hardes, K. Inhibition of Semliki Forest virus replication with long double-stranded RNA in Aedes albopictus cells. Virus Research. 357, 199584(1995).
  16. Weger-Lucarelli, J., et al. Adventitious viruses persistently infect three commonly used mosquito cell lines. Virology. 521, 175-180 (2018).
  17. Attarzadeh-Yazdi, G., et al. Cell-to-cell spread of the RNA interference response suppresses Semliki Forest virus (SFV) infection of mosquito cell cultures and cannot be antagonized by SFV. Journal of Virology. 83 (11), 5735-5748 (2009).
  18. Gahmberg, C. G., Simons, K. Isolation of plasma membrane fragments from BHK21 cells. Acta pathologica et microbiologica Scandinavica. Section B: Microbiology and immunology. 78 (2), 176-182 (1970).
  19. Thomas, G. Furin at the cutting edge: from protein traffic to embryogenesis and disease. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 3 (10), 753-766 (2002).
  20. Garten, W. Characterization of proprotein convertases and their involvement in virus propagation. Activation of Viruses by Host Proteases. , Springer. Cham. 205-248 (2018).
  21. Becker, G. L., Hardes, K., Steinmetzer, T. New substrate analogue furin inhibitors derived from 4-amidinobenzylamide. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (16), 4695-4697 (2011).
  22. Hardes, K., et al. Novel furin inhibitors with potent anti-infectious activity. ChemMedChem. 10 (7), 1218-1231 (2015).
  23. Hardes, K., et al. Elongated and shortened peptidomimetic inhibitors of the proprotein convertase furin. ChemMedChem. 12 (8), 613-620 (2017).
  24. Pennemann, F. L., et al. Cross-species analysis of viral nucleic acid interacting proteins identifies TAOKs as innate immune regulators. Nature Communications. 12 (1), 7009(2021).
  25. Andersen, L. L., et al. Systematic P2Y receptor survey identifies P2Y11 as modulator of immune responses and virus replication in macrophages. The EMBO Journal. 42 (23), (2023).
  26. Huang, Y., Urban, C., Hubel, P., Stukalov, A., Pichlmair, A. Protein turnover regulation is critical for influenza A virus infection. Cell Systems. 15 (10), 911-929 (2024).
  27. Hardes, K. Synthese, Charakterisierung und Anwendung neuer Inhibitoren der Proproteinkonvertase Furin [Doctoral Dissertation]. , Philipps-Universität Marburg. (2014).
  28. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
  29. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  30. Yang, P., et al. Imaging of viral replication in live cells by using split fluorescent protein-tagged reporter flaviviruses. Virology. 603, 110374(2025).
  31. Jose, J., Taylor, A. B., Kuhn, R. J. Spatial and temporal analysis of alphavirus replication and assembly in mammalian and mosquito cells. mBio. 8 (1), (2017).
  32. Eckert, N., et al. Influenza A virus encoding secreted Gaussia luciferase as useful tool to analyze viral replication and its inhibition by antiviral compounds and cellular proteins. PloS One. 9 (5), (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Antiviral TaramaFloresan MikroskobuGörüntü AnaliziEnfeksiyon DinamikleriReplikasyon KinetiğiHücreden Hücreye YayılımYüksek Kapasiteli TaramaAntiviral Bileşikler
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.