Konak-Patojen Etkileşimlerini İncelemek İçin Fare Prostat Organoid-Tabanlı Modelin Oluşturulması

Summary

Bu protokol, 2D olarak yetiştirilen bir mare prostat organoidi tabanlı modelin oluşturulmasını tanımlar. Organoid ayrıştırma, hücre tohumlama, farklılaşma, epitel bütünlüğü değerlendirmesi ve üropatogenik Escherichia coli ile in vitro enfeksiyonu içerir. Model, apikal erişilebilirlik sağlar ve geleneksel 3B organoid sistemlerin sınırlamalarını aşarak konak-patojen etkileşimlerini incelemek için uygundur.

Abstract

Yaşlanan erkekler, iyi huylu prostat hiperplazisi, prostatit ve prostat kanseri gibi prostat hastalıklarından yoğun şekilde etkilenir. Bu durumlar birlikte küresel sağlık yüküne önemli ölçüde katkıda bulunur ve erkeklerde hastalıkların başlıca nedenlerinden biridir. Organoid modeller, epitel yapısı ve fonksiyonunun ana özelliklerinin in vitro çoğaltılmasına olanak tanıyarak hastalık modellemesini dönüştürmüştür. Ancak, organoidlerin kapalı lümen yapısı, apikal yüzeye deneysel erişimi sınırlar ve konak-patojenler etkileşimlerinin çalışmalarını engeller. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, fare prostat organoidlerinden türetilen hücrelerin iki boyutlu (2D) bir model olarak tohumlandığı fizyolojik olarak ilgili bir kültür sistemi oluşturduk. Bu yaklaşım, temel epitel özelliklerini korurken apikal yüzeye doğrudan erişim sağlar. Bu adım adım protokol, olgun fare prostat organoidlerinin ayrışmasını ve hücre bağlanması, proliferasyon ve farklılaşmayı desteklemek için optimal tohumlama koşullarını tanımlar. İmmünoflüosans mikroskobi, organoid tabanlı modelde prostata özgü belirteçlerin ekspresyonunu doğruladı ve prostat dokusunun hücresel organizasyonunun doğru bir temsilini gösterdi. TEER ölçümleri, F-aktin ve sıkı birleşim boyamalarıyla birlikte, hücre farklılaşmasını ve bariyer oluşumunu daha da doğruladı. Modelin üropatotik Escherichia coli (UPEC) ile enfekte edilmesi, konak-patojen etkileşimlerini araştırmada faydasını göstermiştir. Bu model, prostat epitel biyolojisi ve hastalık mekanizmalarını incelemek için değerli bir platform sağlar ve özellikle konak-patojen etkileşimlerini incelemek ve potansiyel tedavi stratejilerini değerlendirmek için uygundur.

Introduction

Prostat bezi, mesanenin altında yer alan küçük bir organdır ve üretrayı çevreler. Erkek üreme sisteminin temel bir organıdır ve ana işlevi prostat sıvısını üretmektir. Bu sıvı, seminal plazmanın %30'una kadarını oluşturur ve spermin kadın üreme sistemi boyunca yol boyunca beslenmesi ve korunması için^anahtardır. Prostatit, iyi huylu prostat hiperplazisi ve prostat kanseri gibi prostat hastalıkları oldukça yaygındır ve dünya genelinde sağlık hizmetlerine önemli bir yük^oluşturur 2,3,4,5. İyi huylu prostat hiperplazi ve prostat kanseri kapsamlı şekilde inceleniyor olsa da, prostatit ve özellikle bakteriyel prostatit nispeten az incelenmiştir. Prostatit, dünya genelinde erkeklerin %16'sına kadar (^6,7) etkiler ve vakaların yaklaşık %10'unu bakteriyel enfeksiyonlar oluşturur. Yaygınlığına rağmen, bakteriyel prostatit hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır. Escherichia coli (E. coli) suşları, özellikle üropatogenik E. coli (UPEC), bakteriyel prostatitin ^8,9'un başlıca nedenidir.

Prostat enfeksiyonunun moleküler mekanizmalarına yönelik araştırmalar, fizyolojik olarak ilgili in vitro modellerin olmaması nedeniyle sınırlı kalıyor. Prostat hastalığı üzerine yapılan çoğu çalışma geleneksel olarak hücre hatlarına veya hayvan modellerine dayanmıştır. Özellikle, LNCaP veya RWPE-1 gibi kanserli veya dönüştürülmüş hücre hatları, prostat hastalığı ve tedaviye yanıt modellemek^{için yaygın olarak kullanılmıştır} 10,11,12,13. Ancak, bu modellerde hücre bileşimi ve sağlıklı ya da kanserli prostat epitelinin karmaşıklığı yoksundur. Ayrıca, prostat enfeksiyonu, bağışıklık yanıtı, prostat tümörü büyümesi ve^metastaz 14,15,16,17 ile ilgili farklı hipotezleri incelemek için çoğunlukla fare modelleri kullanılmıştır. Bu modeller şimdiye kadar en gelişmiş ve bilgilendirici olsa da, genellikle etik endişeleri gündeme getirir, önemli zaman ve kaynak gerektirir ve pahalı olabilir. Alternatif olarak, ex vivo doku eksplantları ve birincil hücre kültürleri de ilaçlara veya kanser gelişimine yönelik doku yanıtlarının kısa vadeli çalışmaları^{için kullanılmıştır 18,19,20}. Ancak bu modellerin ömrü sınırlıdır ve taze insan dokularının bulunabilirliği genellikle kısıtlıdır.

Yetişkin kök hücrelerden türetilen üç boyutlu (3D) organoid kültürler, epitel dokularının in vitro modellemesi için umut verici bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Geleneksel hücre hatlarının aksine, organoidler orijinal epitelin temel özelliklerini korur; örneğin hücresel heterojenlik, dokuya özgü mimari ve fonksiyonel^özellikler 21,22,23. Birincil hücre kültürleri veya ex vivo explantların aksine, organoid kültürler uzun süre genişlemeden genişletilebilir ve geçebilir. Bu özellikler, organoid sistemleri hastalık ve konakçı-patojen etkileşimlerini fizyolojik olarak ilgili bir bağlamda incelemek için özellikle uygun kılar. Prostat organoidleri, sağlıklı ve kanserli insan dokusundan, ayrıca fare modellerinden üretilmiş ve öncelikle prostat kanseri araştırmalarında^{kullanılmıştır} 24,25,26. Buna rağmen, enfeksiyon çalışmaları için, organoidlerin 3D yapısı, esas olarak luminal hücre yüzeyine sınırlı erişim nedeniyle önemli bir zorluk teşkil eder. Geleneksel olarak, sağlam 3D organoidler ya patojenik ajanı mikroenjekte ederek enfekte edilir ya da organoidi önce parçalara veya tek hücrelere ayırarak ardından^patojen23 ile kuluçka yapılır. Burada, boyut ve 3B yapıdaki değişkenlik, tekrarlanabilirlik ve verimliliği etkileyebilir. Bunun yerine, apikal çıkışlı organoidler, lümenin erişilmez olmasının kısıtlamasını aşmanın bir yolu sunar. Organoidlerin süspansiyonda kültürlenmesi, ya ultra düşük yapışma doku kültür plakalarında ya da yapışmaz yüzeysel yüzeylerle kaplanmış yüzeylerde, organoid polaritesinin tersine dönmesine yol açar. Sonuç olarak, apikal yüzey dışa bakıyor ve patojen enfeksiyonu çalışmalarına doğrudan erişim sağlıyor^27,28. Ancak, bu kültürler uzun vadede sürdürülemez ve organoid boyutu ile hücre sayısındaki değişkenlik, enfeksiyonun çokluğunun (MOI) belirlenmesini zorlaştırır. Ayrıca, polaritenin tersine dönmesinin ve organoid hücreler üzerindeki etkilerinin arkasındaki mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılmamıştır. Organoidlerin in vitro enfeksiyon modelleri olarak sınırlamalarını aşmak için, mide, bağırsak veya akciğer gibi organlardan alınan organoidler kullanılarak apikal erişilebilir organoid tabanlı^{modeller geliştirilmiştir 29,30,31}. Bu tür sistemler ana epitel özelliklerini korur ve daha kolay manipülasyon, görüntüleme ve patojenlere ve/veya ilaçlara kontrollü maruziyete olanak tanır. Ancak, hücre farklılaşmasına izin veren kültür koşulları her zaman organoid kültürlerden 2B kültür modellerine^(31,32) geçmez.

Burada, fare prostat organoidleri kullanılarak apikal erişilebilir bir prostat epitel modeli oluşturmak için bir protokol tanımlıyoruz. Bu model daha önce laboratuvarımızda geliştirilip doğrulandı; burada doğal prostat dokusuna güçlü benzerliğini ve UPEC³² ile ilgili enfeksiyon biyolojisi çalışmaları için önemini gösterdik. Sistem, prostat epitelinin hücresel bileşimini ve polaritesini yakından taklit ederken deneysel manipülasyon için daha fazla erişilebilirlik sunar. Ayrıca, prostatta konak-patojenin etkileşimlerini incelemek için uygulanabilirliğini göstererek, in vivo modellere daha kolay uygulanabilir bir alternatif ve geleneksel hücre hatları veya 3D organoid modellerden daha fizyolojik olarak daha ilgili bir sistem sağlıyoruz.

Protocol

Etik beyan: Tüm hayvan prosedürleri, Würzburg Üniversitesi'nin hayvan bakım ve kullanım yönergelerine uygun olup, ilgili kurumsal ve devlet düzenlemeleri kapsamında onaylandı. Bu çalışmada yalnızca enstitümüzde diğer araştırma grupları tarafından bağımsız amaçlarla ötenazi edilen WT fareleri kullanıldı. Bu iş için özel olarak 3R ilkelerine (yenileme, küçültme ve iyileştirme) uygun olarak hiçbir hayvan kurban edilmedi.

NOT: Burada sunulan protokol, yazarlar tarafından yayımlanan^{önceki bir çalışmaya dayanmaktadır 32}. Burada açıklanan tüm adımlar, uygun aseptik teknikler ve uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla steril bir biyogüvenlik kabinde, gerçekleştirilmelidir. Sare prostat organoidleri, C57BL/6 farelerinden üretildi ve daha önce tanımlandığı gibi 3D kültürde^{korundu; 25,26}. 3R ilkelerine uygun olarak, hayvan tesisi tarafından tedavi edilmemiş naif WT farelerinden (en az 6 aylık çocuk) fare prostatları bağışlandı; bu fareler başka nedenlerle kurban edildi. Kısaca, fare prostatları kollajenaz ve TrypLE Ekspres Enzimi kullanılarak iki aşamada doğranıp sindirildi. Hücreler daha sonra ekstrasellüler matriks (ECM) damlalarına yerleştirilerek 3D organoidler üretildi. Kültüre bir medyum eklenip her 3 günde bir yenileniyordu. 3D organoid kültürler haftada bir kez geçirildi ve 3. pasajdan itibaren 2D tohumlama için kullanıldı. Bir haftalık fare prostat organoidleri, mevcut protokole uygun olarak organoid tabanlı modeli 2D bir yüzeye tohumlamak için kullanıldı. Bu protokol için doku kültür plakalarını ECM proteinleriyle kaplamak zorunlu değildir.

1. Prostat organoid tabanlı modelin oluşturulması

1. 3D organoid izolasyonu
   1. 24 kuyruklu bir plakadan istenen sayıda 3D organoid kuyusundan ortamı aspire edin. Bunu her kuyuda 500 μL adDMEM/F12+/+ ile değiştirin ( bkz. Malzeme Tablosu).
   2. ECM düşüşünü mekanik olarak bozmak için bir P1000 pipeti kullanın. Süspansiyonu 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. Tüp başına en fazla iki kuyu toplayın.
   3. adDMEM/F12+/+ ile 10 mL'ye kadar doldurun. Tüpü nazikçe 3-4 kez ters çevirerek karıştırın. 450 x g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
2. 3D organoid bozulması tek hücrelere
   1. Üst natantı aspire edin. Pellet, 10 μM RHOKi ile takviye edilmiş 2 mL önceden ısıtılmış (37 °C) TrypLE Express Enzimi ile yeniden süzülün.
   2. 37 °C'de su banyosunda 15 dakika kuluçka yapın. Hücre süspansiyonunu her 5 dakikada bir P1000 pipeti ile karıştırın.
      NOT: Hücre askısını 4x objektif kullanarak ters mikroskop altında kontrol ederek hücrelerin çoğunun tek olduğunu doğrulayın. 2-3 hücrelik küçük kümeler kabul edilebilir. Genellikle, 15 dakikalık kuluçka yeterlidir, ancak gerekirse bu süre uzatılabilir.
   3. 10 ml adDMEM/F12+/+ ile doldurun. Tüpü nazikçe 3-4 kez ters çevirerek karıştırın. 450 x g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
3. Kaplama tek hücreli süspansiyon
   1. Süpernatantı pelleti rahatsız etmeden aspire edin. Hücre peletini, 10 μM RHOKi ile takviye edilmiş kültür ortamında yeniden süzülür (1.1.1'de kullanılan 3D organoidler için her kuyu başına 300 μL kültür ortamı).
      NOT: Kültür ortamı şunlardan oluşur: Advance Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı/F12, 10 mmol L⁻¹ HEPES, 1x GlutaMAX, 1x B27, 1 mM N-Asetilsistein, %10 Noggin koşullu ortam, %10 R-spondin 1 koşullu ortam, 50 ng·^mL-1 EGF, 1 nM 5α-dihidrotestosteron (DHT), 0.2 μM TGFβi ve 100 ng·^mL-1 Primocin (bkz. Malzeme Tablosu). Enfeksiyon deneyleri için primocin içermeyen kültür ortamı kullanın.
   2. Süspansiyondaki hücre sayısını Neubauer sayma odası kullanarak sayın.
   3. Hücre süspansiyonu, 10 μM RHOKi ile takviye edilmiş kültür ortamında 62.500 hücre·^mL-1 konsantrasyonuna kadar seyreltirin. 48 kuyu başlıklı plakalarda (üreticiden işlenmiş doku kültürü, bkz. Malzemeler Tablosu) tohumlamak için kuyu başına 200 μL hücre süspansiyonu veya bölmeli μ-slide'larda kuyu başına 300 μL (bkz. Malzemeler Tablosu) kullanın. Plakayı 37 °C ve %5_CO2 sıcaklığında hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
      NOT: Her bir 3D organoid, Adım 1.1.1'de kullanılmıştır. genellikle yaklaşık 200.000 hücre verir.
   4. Bir gün sonra, tek hücrelerin çoğu 2D yüzeye bağlanır. Kültür ortamını her 2-3 günde bir değiştirin. Uyum 7 gün içinde sağlanır.
      NOT: RHOKi'nin sadece ilk tohumlama için eklendiğinden emin olun, sonraki ortam değişiklikleri için değil.
4. Organoid tabanlı modeli ayırt etmek.
   NOT: Luminal hücrelerle zenginleştirilmiş farklılaşmış organoid tabanlı bir model elde etmek için sonraki adımları izleyin.
   1. Hücre askıya 10 nM DHT ekleyin (adım 1.3.3). Sonraki (her 2-3 günde bir) değişimler için 10 nM DHT takviyeli kültür ortamı kullanın.
      NOT: Hücre askıya DHT eklenmezse (ve ardından ortam değişiklikleri yapılırsa), organoid tabanlı model bazal hücrelerle zenginleştirilir.

2. Transepitelyal elektrik direnci (TEER) ölçümleri

1. Organoid hücre süspansiyonu, 300 μL (1.3.3. adımda elde edilen) kullanılarak 8 kuyu başına 40 elektrot bulunan bir PET μ-slide üzerinde 62.500 hücre·^mL-1 konsantrasyonda tohumlanarak ( bkz. Malzeme Tablosu). Hücresiz kuyulardan birine 1.3.1'de tanımlanan 300 μL kültür ortamı ekleyin.
   NOT: Hücresiz kuyu ölçümler için boşluk olarak kullanılır.
2. μ slaytı, 16 kuyruklu istasyonu doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirilerek empedans tabanlı hücre analiz sistemine ( bkz. Materyal Tablosu) bağlanın. TEER'i 400 Hz'de 7 gün boyunca ölçün. Kültür ortamını her 2-3 günde bir değiştirin.

3. İmmünofluoresans boyama

NOT: Bu yöntem için, hücrelerin yüksek çözünürlüklü mikroskopi uygulamalarıyla uyumlu olan odalı μ-slaytlara (bkz. Materyal Tablosu) yerleştirildiğinden emin olun.

1. Seçilen zaman noktasında, ortamı çıkarın ve hücreleri 1x PBS ile 3 kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında %4 paraformaldehit (PFA) ile 15 dakika boyunca sabitleyin (ışığa maruz kalmaktan kaçının).
   DIKKAT: %4 paraformaldehit alerjik cilt reaksiyonuna, ciddi göz hasarına yol açabilir ve kansere yol açtığı şüphesi var. Her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanın. Toz, dumanı, gazı, sisleri, buharları veya spreyleri solumaktan kaçının. Koruyucu eldiven takın ve kontamine giysilerin laboratuvarda kalmasını sağlayın, ta ki düzgün dezenfekte edilene kadar. İçerik ve kapları onaylı bir atık bertaraf tesisi aracılığıyla bertaraf et.
2. Fiksasyondan sonra hücreleri 1x PBS ile 3 kez yıkayın (her biri 5 dakika). Hücreleri oda sıcaklığında %0,5 Triton X-100 ile (bkz. Malzeme Tablosu) 15 dakika boyunca permeabilize edin.
   DIKKAT: Triton X-100 cilt tahrişi ve ciddi göz hasarına neden olur. Sucul yaşama için çok toksiktir ve uzun süreli etkileri vardır ve çevrede endokrin bozulmalara neden olabilir. Dokunurken koruyucu eldiven, göz ve yüz koruması kullanın. İçerik ve kapları onaylı bir atık bertaraf tesisi aracılığıyla bertaraf et. Çevreye salınmaktan kaçının.
3. Hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın (her biri 5 dakika). Hücreleri bloklama tamponu (PBS'de %1 BSA, bkz. Malzeme Tablosu) ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bloklayın.
4. Birincil antikorları bloklayıcı tamponda seyreldin (1x PBS'de %1 BSA) ve hücrelerle birlikte gece boyunca 4 °C'de sallanan bir platformda kuluçka yapın. Ertesi gün, oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın. (bkz. Antikor seyreltmeleri için Malzeme Tablosu ).
   NOT: F-aktinin falloidin ile veya plazma zarının CellMask ile boyaması için ( bkz. Materyal Tablosu), 3.4. adımı atlayın.
5. Hücreleri 1x PBS ile 3 kez yıkayın (her biri 5 dakika). İkincil antikorları, falloidin veya CellMask'i ( bkz. Materyal Tablosu) bloklama tamponunda (1x PBS'de %1 BSA) seyreldin ve hücrelerle oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
6. Hücreleri 1x PBS ile 3 kez yıkayın (her biri 5 dakika). Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka ile Hoechst ( bkz. Malzeme Tablosu) ile 1x PBS ile seyreltirin ve çekirdekleri boyandırın.
7. Hücreleri 3 kez 1x PBS ile (her biri 5 dakika) yıkayın ve hücreleri 1x PBS ile bırakın. 4 °C'de depolayın.
8. Kameralı μ-slides slaytlarını (bkz. Materyal Tablosu) lazer taramalı konfokal mikroskopi veya floresan mikroskopla görebilirsiniz.
   NOT: Genel enfeksiyon verimliliği ve dağılımı değerlendirmek için 20x objektif kullanılarak floresan mikroskopunda genel görüntü alınabilir. Daha yüksek çözünürlüklü görüntüler, epitel hücrelerine bağlı veya içselleştirilen bakterilerin bireysel bakterilerini görselleştirmek için 40x suya daldırma hedefiyle donatılmış konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Floroforlar, kullanılan floroforlara bağlı olarak 405, 499, 590 ve 653 nm frekanslarında lazer hatları kullanılarak uyarıldı. Emisyon, Hoechst için 415 ila 516 nm, GFP veya Alexa 488 için 509 ila 573 nm, mcherry veya Alexa 594 için 600 ila 651 nm ve Alexa 647 için 663 ila 720 nm arasında ayarlanmış emisyon pencereleriyle tespit edildi. Z yığınları, epitel tabakasının tam kalınlığını kaplayan 0,5 μm basamak boyutuyla elde edildi. Görüntüler 1024 x 1024 piksel çözünürlükte alındı; tarama frekansı 400 Hz ve çerçeve ortalaması 4 olarak ayarlandı; bu da iyi görüntü kalitesi sağlıyordu. Lazer gücü ve dedektör kazancı aynı deney içindeki tüm koşullarda sabit tutuldu. Lazer gücü, dedektör kazancı, tarama hızı ve ortalama gibi tüm görüntüleme parametreleri, kullanılan konfokal mikroskopa bağlı olarak optimize edilip ayarlanmalıdır.

4. Üropatonik E. coli (UPEC) bakteriyel enfeksiyon

NOT: Aşağıdaki adımlar için 7 gün boyunca Primosin kullanmadan ( bkz. Malzeme Tablosu) organoid tabanlı bir model kullandığınızdan emin olun.

Bu çalışmada pFPV-mCherry plazmidinden (ampisilin dirençli) bir mCherry proteinini oluşturan üropatogenik E. coli suşu UTI89 kullanılmıştır.

DIKKAT: Enfeksîyonel patojenlerle (Biyogüvenlik Seviye 2) ilgilenirken eldiven ve uygun göz ile yüz koruması takın. Her zaman tam düğmeli bir laboratuvar önlüğü giyin. Tüm işlemleri sertifikalı biyolojik güvenlik kabininde yürütün. Biyolojik malzemelerle işledikten sonra çalışma yüzeylerini dezinfekte edin ve ellerinizi iyice yıkayın. BSL-2 atıklarını otoklavlama için uygun belirlenmiş biyolojik tehlike konteynerlerinde toplayın. Atık maddeleri bertaraf edilmeden önce otoklavlama veya uygun bir dekontaminasyon yöntemiyle dezinfekte edin.

1. Enfeksiyon deneyinden üç gün önce, UPEC suşunu LB agar plakasında ve ilgili antibiyotikle (bu protokolde ampisilin 100 μg·^mL-1 kullanılmıştır) takviye edilmiş şekilde izleyin ve 37 °C'de 16-24 saat kuluçka yapın.
   DIKKAT: Bazı antibiyotikler temasta alerjik reaksiyon veya tahrişe neden olabilir ve yanlış atılırsa antimikrobiyal direnç yaratabilir. Her zaman biyolojik güvenlik dolabına antibiyotik hazırlayın ve ekleyin; uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven ve göz koruması) takın. Antibiyotik içeren çözeltileri onaylı bir atık bertaraf tesisi aracılığıyla kimyasal atık olarak bertaraf etmelidir.
2. Enfeksiyon deneyinden iki gün önce, agar plakasından tek bir UPEC kolonisi kullanılarak (adım 4.1) karşılık gelen antibiyotikle (ampisilin 100 μg·^mL-1) takviye edilmiş 3 mL LB suyu aşılanın. 37 °C'de statik olarak 12-16 saat kuluçka yapın.
3. Enfeksiyon deneyinden bir gün önce, 4.2. adımdan bakteri kültürünü girdabla alıp OD₆₀₀ ölçün. Bu kültürün ampisilin (100 μg·^mL-1) ile takviye edilmiş LB suyu 0.05 başlangıç_{OD 600'e} aşılamak için gereken bu kültür hacmini aşağıdaki formülü kullanarak hesaplayın: Hacm (μL) = (0.05 * 3.000 μL) / ölçülen OD₆₀₀. 4.2. adımdan hesaplanan kültür hacmini ekleyin. taze LB suyuna alınır ve 24 saat boyunca 37 °C'de statik inkübe edilir.
   NOT: 4.2. adımdan itibaren gece kültüründeki OD₆₀₀ değeri 1.7 ile 2.2 arasında olmalıdır.
4. Enfeksiyon gününde, 4.3. adımdan bakteri kültürünü girdabla ölçün ve OD₆₀₀ ölçün. Kültürden OD₆₀₀ 1 alın, ardından oda sıcaklığında 12.000 x g ile 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst yüzeyi çıkarın.
5. DHT içermeyen 1 mL primocin içermeyen organoid kültür ortamında yeniden süzülür. MOI 100'e kadar seyrelti.
   NOT: 7. günde 48 kuyuyla bir plakadaki her kuyu yaklaşık 150.000 hücreye sahip olarak kabul edilir. Bu tahmin, enfeksiyondan çok önceki hücrelerin sayısı ile elde edilmiştir; bu tahmin birden fazla deneyde gerçekleşmiştir. MOI'yi doğru ayarlamak için, enfeksiyondan önce hücre sayımı için ekstra bir tohum ekmek önerilir. Gerekli bakteri süspansiyon hacmini (adım 4.4) belirlemek için, bir kuyu başına hücre sayısını MOI ile çarparak kuyu başına gereken toplam bakteri sayısını elde edin, ardından bu sayıyı bakteri konsantrasyonuna (8 × 10⁵ bakteri/μL) bölerek hacmi μL cinsinden elde edersiniz.
6. Organoid bazlı modelin kültür ortamını, bakteri içeren kültür ortamı ile değiştirin. Hacmi kültür yüzeyine göre ayarlayın: 48 kuyu plakaları için kuyu başına 200 μL, μ slaytları için ise 300 μL kullanın. Hücre kültüründe 37 °C ve %5_CO2 sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
7. Kuluçka döneminden sonra, organoid bazlı modelden bakteri içeren ortamı aspire edin. Kuyuyu adDMEM/F12+/+ ile 3 kez yıkayarak ekstrahücre bakterileri giderin.
8. Ekstrahücre bakterileri öldürmek için 50 μg·^mL-1 gentamisin içeren kültür ortamı ekleyin. 30 dakika kuluçka yapın.
   NOT: Gentamisin konsantrasyonu, kullanılan bakteri suşuna bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. 50 μg·^mL-1'in üzerinde bir konsantrasyon kullanılıyorsa, hücresel sitotoksisitenin kontrol edilmesi önerilir.
9. Ortamı çıkarın ve kalan enfeksiyon süresi için 10 μg·^mL-1 gentamisin takviyesi olan taze ortamla değiştirin.
   Enfekte hücreleri floresans boyama için ( bölüm 3) veya bölüm 5'ten sonra akış sitometrisi ile nicelik için işleyin.

5. Akış sitometrisiyle enfeksiyon niceliği

1. Kültür ortamını aspire edin ve hücreleri 1x PBS ile 3 kez yıkayın. Hücreleri ayırmak için 100 μL TrypLE Ekspres Enzimi kullanın. Tüm hücreler ayrılana kadar 5-10 dakika kuluçka yapın.
   NOT: 48 kuyuyla bir plakadan alınan bir kuyu, her koşul için yeterlidir.
2. Hücre süspansiyonunu topla ve 96 kuyuyla (konik alt) bir plakaya aktar. Üstüne 100 μL akış sitometre tamponu (1x PBS, %10 FBS, 5 mM EDTA) eklenerek TrypLE Express Enzimi inaktive edilir.
3. 96 kuyululu plakayı 450 x g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Üst sıvıyı çıkarın ve pelleti 150 μL akış sitometre tamponunda yeniden süzülür.
4. Akış sitometresi kullanarak enfekte hücreleri edinin ve niceliklerini belirleyin ( bkz. Materyaller Tablosu).
   NOT: Akış sitometrisi, mCherry-pozitif hücrelerin tespiti için 488 nm uyarılma lazeri ve 615/20 nm emisyon filtresi kullanılarak gerçekleştirildi. Veriler yüksek bir akış hızında (66 μL·min⁻¹) elde edildi; örnek başına en az 10.000 olay toplandı ve yalnızca 80.000'den büyük ileri saçılma yüksekliği değerlerine sahip olaylar dahil edildi. Enfekte hücreler, enfekte olmayan (naif) bir kontrol ile karşılaştırıldığında mKiraz floresansına dayanarak tespit edildi; böylece kalıntı ve dubletler hariç tutuldu. Hücre canlılığını değerlendirmek için kapı stratejisine bir canlılık belirteci (örneğin, propidium iyodid veya diğer canlı/ölü boyalar) dahil edilebilir. Bu, özellikle modelle ilk kez çalışırken hücre ayrışmasının hücreleri olumsuz etkilemediğinden emin olurken faydalı olabilir.

Results

Bu protokol, fare prostat epitelinin organoid tabanlı bir modelinin oluşturulmasını ve doğal dokunun epitel bölmesinin hücre tipini ve transkripsiyonel ifadesini özetlediğini açıklar. Bu model, yetişkin fare prostat dokusundan üretilen 3D yetişkin kök hücre organoidleri kullanılarak oluşturulmuştur. Bu organoid kültürler daha sonra kültürde tutulur ve haftalık olarak geçiş yapılır. Organoid tabanlı model için, iş akışının ilk adımı (Şekil 1A) 7 günlük 3D organoitlerin kullanılmasıyla başlar. Bu süre, sonraki tohumlama için uygun boyut ve hücre yoğunluğuna ulaşmaları için gereklidir. Geçtikten sonra, küçük organoid parçaları (Şekil 1B, 0. Gün) ECM'ye tohumlanarak büyümelerine izin verildi. Zamanla, 7. güne kadar belirgin bir iç lümene sahip büyük, küresel yapılara dönüşürler (Şekil 1B). 7 günlük organoidler tek hücrelere ayrıldıktan sonra, hücreler doku kültürü ile işlenmiş bir plakaya (Şekil 1C, Gün 0) tohumlanarak 3D organoid kültürler (1nM DHT) ile aynı kültür ortamı kullanılarak tek tabaka oluşturuldu. Birinci güne gelindiğinde, yapışkan hücreler üremeye başlamıştı. Sonraki günlerde, tek tabaka genişledi ve parlak alan mikroskopisiyle gözlemlendiği üzere 3. ve 5. gün arasında birleşme noktasına ulaştı (Şekil 1C). Zaman içindeki morfolojik değişiklikleri karakterize etmek ve organoid tabanlı modelin birleşme noktasına ulaştığı zamanı izlemek için plazma zarını CellMask ile boyadık ve birden fazla zaman noktasında floresan görüntüleme yaptık (Şekil 1D).

Androjen reseptörü (AR) sinyalleri, prostatta hücre farklılaşmasının önemli bir düzenleyicisi olduğundan, organoid kültür ortamındaki testosteron (veya DHT) konsantrasyonunun modüle edilmesi, kök hücrelerin bazal veya luminal hücrelere farklılaşmasını yönlendirdiği^{gösterilmiştir 32}, kültür ortamındaki DHT seviyelerini ya luminal hücrelerin (DHT 10 nM) ya da bazal hücrelerin (DHT yok) zenginleşmesini teşvik etmek için ayarladık. Control; Yöntem1, Şekil 2A). Şekil 2'de (B-F) gösterildiği gibi, hücre büyümesinde veya birleşmede önemli bir fark gözlemlenmemiştir. Beklendiği gibi, kontrol durumunda (DHT olmayan organoid kültür ortamında), çoğu hücre prostat bazal kök hücrelerinin bir belirteji olan sitokeratin 5'i (KRT5) ifade etti (Şekil 2B,E). Buna karşılık, sadece birkaç hücre CD24a'nın düşük seviyelerini ifade etti; bu da farklılaşmış luminal prostat hücrelerinin bir belirtgesidir (Şekil 2B,F).

Daha önce tarif^{ettiğimiz 32} nM DHT takviyesi, hem bazal hem de luminal hücreleri içeren karışık bir popülasyon elde etti. Ancak CD24a ekspresyonu düşük kaldı ve bu da luminal hücrelere tam farklılaşmanın olmadığını gösteriyor (Şekil 2C,F ³²). DHT'nin 10 nM'ye yükseltilmesi luminal hücrelerin tam farklılaşmasını teşvik ederken 7 günlük kültür sonrası bazı bazal hücreleri korumaya devam etti (Şekil 2D-F). Organoid tabanlı modellerin farklılaşması da parlak alan mikroskopisi kullanılarak değerlendirilebilir. Hücreler seyrektikte (0-5. Gün, Şekil 1C, Ek Şekil 1A) koşullar arasındaki farklar çok net olmasa da, hücre morfolojisi ve görünümü, 7. Gün parlak alan mikroskopisiyle üç kültür koşulları arasında belirgin ve fark edilir hale gelir (Şekil 1C, Ek Şekil 1A,B). DHT yokluğunda hücreler daha düz ve düzensiz görünürken, 10 nM DHT'de hücreler çok genel bir düzenle sıkıca yerleştirilmişti, bu da bir taş morfolojisine benziyordu (Ek Şekil 1B).

Özellikle, 3D organoid kültürler farklı DHT konsantrasyonlarında kültürlendiğinde morfolojik değişiklikler de yaşamıştır. Özellikle, organoid boyutunda doza bağlı belirgin bir artış gözlemlenmiş, en büyük organoidler 10 nM DHT varlığında oluşuyor (Şekil 1B, Ek Şekil 2A,B). Bu sonuçlar, AR yolunun sadece hücre farklılaşması için değil, aynı zamanda fare prostat organoidlerinin büyüme dinamiklerini modüle etmek için de kritik olduğunu göstermektedir.

Epitel bütünlüğünü ve modellerin polarizasyonunu değerlendirmek için, DHT veya 10 nM ile yetiştirilen organoid tabanlı modelde transepitelial elektriksel direnç (TEER) ölçümleri yaptık. TEER değerleri her iki durumda da zamanla arttı ancak 10 nM DHT varlığında (Şekil 3A) önemli ölçüde daha yüksekti, bu da epitel bariyer fonksiyonunun arttığını gösteriyor. Bu sonuçlar, luminal prostat epitel hücrelerinde hücre-hücre birleşimlerinde tipik olarak apikal halka şeklinde organize edilen aktin filamentlerinin falloidin boyamasıyla desteklenmiştir. 10 nM DHT durumunda, aktin halkası kontrol koşuluna kıyasla daha belirgin görünüyordu ve hücre polaritesinin artması ve epitel organizasyonuyla uyumlu (Şekil 3B). Ayrıca, zonula occludens 1 (ZO-1) için immünboyama, 10 nM DHT durumunda sıkı bağlantılarda artış gösterdi (Şekil 3C), bu da pekiştirilmiş epitel bariyer bütünlüğünü ve luminal fenotipe doğru farklılaşmayı destekledi. Ortogonal projeksiyonlar, 10 nM DHT ile kültürlenen organoidlerin iyi tanımlanmış epitel polaritesi sergilediğini ortaya koymaktadır (Ek Şekil 3A). Bazal KRT5⁺ hücreleri alt kısımda yer alırken, luminal CD24a⁺ hücreleri epitel tabakası boyunca dağılmıştır ve apikal tarafa doğru daha güçlü boyama yoğunluğu gösterir. Bu mimari, fare prostat dokusunda gözlemlenenlere benzerdir (Ek Şekil 3B). Dikkate değer olan bir şey, İnsan Protein Atlas'ından alınan veriler, bu belirteçlerin insan prostat dokusunda benzer bir lokalizasyona sahip olduğunu, KRT5⁺ bazal hücrelerinin CD24a⁺ ışık tabakasının altında olduğunu göstermektedir (Ek Şekil 3C)³³. Buna karşılık, kontrol altında veya 1 nM DHT koşullarında kültürlenen hücreler, bazal ve luminal belirteçler arasında net bir uzamsal ayrım göstermez ve hücre yüksekliği 10 nM koşulundan çok daha düşüktür (Ek Şekil 3A). Bu, 10 nM DHT takviyesinin, 2D modelde epitel farklılaşmasını ve polarizasyonu doğal prostat epiteliyle karşılaştırılabilir şekilde teşvik ettiğini gösterir. 10 nM DHT ile yetiştirilen organoid tabanlı model, yerli fare prostat epitelini çok benzediğinden (Şekil 2D, Ek Şekil 3A,B), konak-patojen etkileşimlerini araştırmak için ilgili bir platform olarak hizmet eder. Modelin uygulanabilirliğini göstermek için, özellikle genitourürinar yol alanında en yaygın kullanılan UPEC suşlarından biri olan UPEC suşlarından biri olan UPEC ile enfeksiyonları örnek olarak kullandık. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, bakteriler LB çorbasında 24 saat yetiştirildi (Yöntem 4'te açıklandığı gibi) ve hücrelerle birlikte bir saat kuluçka içinde tutuldu. Sonrasında ekstraselüler bakteriler, istila ve hücre içi çoğaltmayı niceliklendirmek için gentamisin ile öldürüldü. Organoid tabanlı modelin enfekte edilmesinde, UPEC epitel hücrelerine yüksek sayılarda (0 hpi; Şekil 4B, sol panel; Şekil 4C). Daha sonra, gentamisin tedavisinden (1 hpi) sonra, ekstrahücre bakteri ölümü nedeniyle UPEC-pozitif hücre sayısı önemli ölçüde azaldı (Şekil 4B, orta panel; Şekil 4C). 24 hpi seviyesinde enfekte hücre sayısı değişmedi (Şekil 4C), ancak konfokal mikroskopi görüntülemede hücre içi bakterilerin çoğalmaya devam ettiğini ve daha önce mesane epitelinde tanımlananlara benzer topluluk benzeri yapılar oluşturduğunu gösterdi (Şekil 4B, sağ panel). Enfekte hücreler, enfekte olmayan (naif) kontroller referans olarak kullanılarak, kalıntı ve dubletlerin hariç tutulmasından sonra mCherry floresansı ile tanımlanmıştır (Ek Şekil 4).

Şekil 1: Prostat organoidlerinin ve organoid tabanlı modellerin zaman içinde iş akışı ve morfolojik evriminin genel büzümü. (A) Deneysel iş akışının şematik temsili (Yöntem 1). (B) Prostat organoidlerinin morfolojik gelişimini 1 nM DHT ile desteklenen parlak alan görüntüleri, 0, 1, 3, 5 ve 7. günlerde (soldan sağa) çekilmiştir. Ölçek çubuğu: 200 μm. (n = 3). (C) Organoid tabanlı modelin 1 nM DHT ile desteklenen parlak alan görüntüleri, 0, 1, 3, 5 ve 7. günlerde (soldan sağa). Ölçek çubuğu: 200 μm. (n = 3). (D) 1, 3, 5 ve 7. günlerde (soldan sağa) organoid tabanlı modelin temsil immünoflüoresans mikroskopi görüntüleri, 1 nM DHT ile takviye edilmiş ve CellMask (kırmızı) ile boyanmış. Çekirdekler Hoechst 33342 (mavi) ile karşı boyandı. Ölçek çubuğu: 50 μm. (n = 3) Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: DHT, organoid tabanlı modelde soy farklılaşmasını modüle eder. (A) Farklılaştırma için kullanılan farklı koşulların şematik temsili. (B-D) (B) yokluğu (Ctrl) veya (C) 1 nM veya (D) 10 nM DHT varlığında 7 gün boyunca yetiştirilen organoid tabanlı modelin temsil immünoflüoresans mikroskopi görüntüleri. Görüntüler 1., 3., 5. ve 7. günlerde (soldan sağa) çekildi. Organoid tabanlı modeller CD24a (luminal hücre belirteç, yeşil) ve KRT5 (bazal hücre belirteci, magenta) için boyandı. Çekirdekler Hoechst 33342 (mavi) ile karşı boyandı. Ölçek çubuğu: 50 μm. (n = 4). (E,F) DHT (Ctrl), 1nM veya 10nM olmadan yetiştirilen organoid tabanlı modelde (E) KRT5⁺ ve (F) CD24a⁺ hücrelerinin görüntü nicelliği. Veriler, görüş alanı başına pozitif hücrelerin %'si olarak gösterilir. İstatistiksel test: tek yönlü ANOVA ve Tukey'nin sonradan yaptığı test. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: 10 nM DHT ile farklılaşan organoid tabanlı model, kontrol sistemine kıyasla daha yüksek hücre polarizasyonu göstermektedir. (A) DHT (10 nM; yeşil) yokluğu ve varlığı nedeniyle 7 gün boyunca yetiştirilen organoid tabanlı modelin TEER analizi. Hata çubukları SD'yi temsil eder (n = 3). İstatistiksel test: tek yönlü ANOVA ve Tukey'nin sonradan yaptığı test. (B,C) Organoid tabanlı modelin temsil immünofloresan mikroskopik görüntüleri; 7 gün boyunca (Ctrl; üst) veya 10 nM DHT (altta) ile yetiştirilmiş ve (B) F-aktin (kırmızı) ve (C) ZO-1 (kırmızı) için boyanmış. Çekirdekler Hoechst 33342 (mavi) ile karşı boyandı. Ölçek çubuğu: 50 μm. (n = 3) Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Organoid tabanlı modelde enfeksiyon dinamiklerinin analizi. (A) Enfeksiyon protokolünün şematik temsili (bölüm 4). (B) Enfekte organoid tabanlı modeli enfeksiyon sonrası 0, 1 ve 24 saat içinde gösteren temsil immünoflüoresans mikroskopi görüntüleri (hpi; soldan sağa). UPEC kırmızı renkte görselleştiriliyor. Çekirdekler Hoechst 33342 (mavi) ile karşı boyandı. Ölçek çubuğu: 50 μm. (n = 3). (C) 0, 1 ve 24 hpi'de UPEC-pozitif hücrelerin (mCherry pozitif, enfekte hücreler) akış sitometrisi analizi. Kapı stratejisi, Ek Şekil 4'te gösterilmiştir. Hata çubukları SEM'i temsil eder (n = 3). İstatistiksel test: tek yönlü ANOVA ve Tukey'nin sonradan yaptığı test. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Organoid tabanlı modelin zaman içinde morfolojik evrimi. (A,B) (A) yokluğunda (Ctrl) ve (B) 10 nM DHT varlığında organoid tabanlı modelin parlak alan görüntüleri, 0, 1, 3, 5 ve 7 günlerde (soldan sağa) çekilmiştir. Ölçek çubuğu: 200 μm. (n = 3) Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: DHT konsantrasyonu 3D prostat organoid büyümesini etkiler. (A) Organoid tabanlı modelin yokluğunda (Ctrl; üst) ve varlığında (altta) parlak alan görüntüleri, 0, 1, 3, 5 ve 7. günlerde (soldan sağa). Ölçek çubuğu: 200 μm. (n = 3). (B) 7. Günde üç farklı koşulda yetiştirilen 3D organoid boyutunun nicelendirilmesi: DHT yok (Ctrl; pembe), 1 nM DHT (mor) ve 10 nM DHT (yeşil). İstatistiksel test: tek yönlü ANOVA ve Tukey'nin post hoc testi (n = 3). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Prostat organoid morfolojisi ve epitel polaritesinin karakterizasyonu. (A) Farklı DHT konsantrasyonları (Ctrl, 1 nM ve 10 nM DHT) altında epitel organizasyonu ve apikal-bazal kutupluğu gösteren konfokal z-yığınlarının ortogonal projeksiyonları. Bazal hücreler KRT5 (magenta) ve luminal hücreler CD24a (yeşil) için boyandı. Ölçek çubuğu: 50 μm.(B) OCT gömülü fare prostat dokusunun immünoflüoresans boyamasında bazal (KRT5, magenta) ve luminal (CD24a, yeşil) epitel belirteçleri gösteriliyor. Çekirdekler DAPI (mavi) ile karşı boyanmıştır. Ölçek çubuğu: 50 μm. Kısa süreliğine, fare dokusu parçaları %4 PFA ile sabitlendi, gece boyunca %30 sukroz ile dehidratlandı ve OCT ile^{gömülü 32} oldu. Slaytlar daha sonra 10 dakika boyunca PBS'de yeniden nemlendirildi ve bölüm 3'e göre immün boyama yapıldı. (C) İnsan prostat dokusunda CD24a ve KRT5 protein ekspresyonunun immünohistokimya analizi (Panel C , İnsan Protein Atlas Veritabanı'ndan (sürüm 25.0; İnsan Protein Atlası proteinatlas.org), Uhlén, M. ve ark. (2015)³³, https://www.proteinatlas.org/ENSG00000186081-KRT5/tissue/prostate). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: Enfekte hücrelerin tanımlanması için akış sitometrisi kapı stratejisi. Hücreler önce yan saçılma yüksekliği (SSC-H) ile ileri saçılma yüksekliği (FSC-H) ile birlikte döküntü dışlanması nedeniyle kapalı olarak belirlendi, ardından tek hücreler seçilmek için SSC-H ile yan saçılma alanı (SSC-A) arasındaki kapı yapıldı. mCherry-pozitif (enfekte) hücreler, Counts ile PE-Texas Red-H floresansı (Histogram) kullanılarak tanımlandı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

İyi huylu prostat hiperplazisi, prostatit ve prostat kanseri gibi çeşitli hastalıklar prostatı etkileyebilir. Bu hastalıklar oldukça yaygındır ve hastaların yaşam kalitesini önemli ölçüde^{etkiler 2}. Sağlık hizmetleri üzerindeki önemli etkilerine rağmen, bu hastalıklar, özellikle kanser olmayan durumlarda altta yatan mekanizmalar ve konak yanıtları hakkındaki anlayışımız sınırlıdır. Bu büyük ölçüde fizyolojik olarak ilgili deneysel modellerin eksikliğinden kaynaklanır. Bir yandan, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları normal prostat epitelinin karmaşıklığını veya farklılaşma durumunu yakalamaz. Öte yandan, hayvan modelleri, özellikle kemmirgenler, etik endişeler doğurur ve maliyet açısından etkili değildir. Alternatif bir yaklaşım ise insan birincil hücreleri veya hasta kaynaklı doku explantlarının kullanılmasıdır. Ancak, taze prostat dokusunun sınırlı bulunması, yaygın kullanımlarını kısıtlamaktadır. Bu sınırlamalar, fizyolojik olarak alakalı, kullanımı kolay ve deneysel olarak yönetilebilir diğer in-vitro sistemlere olan ihtiyacı vurgular. Bu bağlamda, yetişkin kök hücre organoid teknolojisi hastalık modellemesini dönüştürmüştür. Bu 3B kültürler, epitel kimliğini ve epitel hücresel çeşitliliğini koruyarak kendini organize etme^{kapasitesine sahiptir} 23,34,35,36,37,38. 3D mimarileri kanser araştırmaları, ilaç testi ve rejeneratif tıpta uygulama imkanı^{sağlamış olsa da 23,34,35,36,37,38,39,40,41}, kapalı yapıları ve apikal yüzeyi içe bakıyor olup, özellikle in-vitro olarak deneysel erişim için pratik zorluklar yaratmaktadır enfeksiyon modelleri. Apikal çıkışlı organoidler, epitel polaritesini tersine çevirerek bu sınırlamayı gider ve apikal yüzeyi doğrudan enfeksiyon çalışmaları için açığa^{çıkarır 27,28}. Ancak, enfeksiyon modeli olarak etkinliği, boyutlarındaki değişkenlik, patojenlere eşit olmayan maruziyet ve uzun süreli enfeksiyon sırasında kırılganlık nedeniyle sınırlı olabilir.

Burada, fare prostatının organoid tabanlı bir modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz; bu model, yerli fare epitelinin epitel hücre bileşimini ve transkripsiyonel profilini özetleyerek, apikal yüzeye kolay erişim sağlar. Önceki^{çalışmamızda optimize edilen bu model,} tohumlama yoğunluğu, uyaranlara eşit maruziyet, tanımlanmış bakteri-hücre oranları (MOI) ve geleneksel 3B organoid sistemlerde standartlaştırılması zor olan yüksek verimli görüntüleme parametreleri gibi temel deneysel değişkenler üzerinde hassas kontrol sağlar.

Hayvan deneyleri için 3Rs prensibine (Değiştir, Azalt, Rafin)^{uygun olarak 42}, bu model için birincil hücre kaynağı olarak kullanılan organoidler, yetiştirme gibi alakasız amaçlarla kurban edilen vahşi tipte saf farelerden türetilmiştir. Prostatlar yakınlardaki hayvan tesislerinden yapılan bağışlarla elde edilir, böylece bu protokol için özel olarak ek hayvan kurban etme ihtiyacını azaltır.

Organoidler ile organoid tabanlı modellerin sağlam ve güvenilir şekilde ayırt edilmesi, doğal dokunun hücresel bileşimi ve fonksiyonel özelliklerini sada bir şekilde kopyalamak için kritik öneme sahiptir ve bu özelliklerin in vitro modeller olarak önemliliğini garanti altına alır. Organoidler içindeki hücre farklılaşması, kültür ortamının spesifik bileşimi, büyüme faktörleri ve farmakolojik ajanların (örneğin ilaç inhibitörlerinin) hassas konsantrasyonları dahil olmak üzere, güçlü şekilde etkilenir. Bu faktörlerin manipüle edilmesi, çeşitli organoid sistemlerde gösterildiği gibi belirli hücre hatlarına doğrudan farklılaşmayı mümkün kılar. Örneğin, bağırsak organoidlerinde, WNT'nin alınması, enterosit farklılaşmasını teşvik eder ve bu interferon gamma ile daha da güçlendirilebilir (^38'de incelenmiştir). Goblet hücrelerine farklılaşma, p38 inhibitörü ve nikotinamid çıkarılması veya DAPT/DBZ ile Notch inhibisyonu ile sağlanabilir (^38'de incelenmiştir). IGF-1 ve FGF-2'nin ayrıca sekretor hücre zenginleştirilmiş kültürlerin uzun vadeli genişlemesini desteklediği^{gösterilmiştir 43}. Ayrıca, IL-22 Paneth hücre farklılaşmasını artırır ve enteroendokrin hücreler, Notch ve BMP³⁸ gibi yolların inhibisyonu yoluyla ortaya çıkar. Benzer şekilde, mide organoidleri ve organoid bazlı monotabakalar WNT kültür ortamından çekildiğinde pit hücrelerine doğru farklılaşma gösterirken, ortama nikotinamid eklendiğinde hücreler bir bez fenotipine (boyun ve baş hücrelere) ^{yönlendirilir.31,44,45}.

Prostatta, androjen reseptörü (AR), doku^{homeostazını korumada kritik rol oynar} 46,47,48,49. Testislerde Leydig hücreleri tarafından üretilen testosteron, 5α-redüktaz tarafından prostat epitel hücrelerinde DHT'ye dönüştürülür. DHT, AR'yi aktive eder; AR, dimerize olur, çekirdeğe taşınır ve androjen yanıt elementlerine bağlanarak hücre farklılaşması ve^{homeostaz 50'de} rol alan genleri düzenler. Önceki çalışmalar, 3D fare prostat organoidlerinde 1 nM takviyesinin hücre ferferentasyonu için yeterli olduğunu^{göstermiştir 51}. Diğerleri ise vitamin D (özellikle 1,25-dihidroksivitamin D) takviyesinin insan prostat organoid büyümesini teşvik ettiğini ve kanonik WNT aktivitesini engelleyerek ve WNT ailesi üyesi DKK3^52'yi baskılayarak farklılaşmayı hızlandırdığını göstermiştir. Ancak bu çalışmalarda yalnızca 3D organoid kullanıldı. Önceki^{çalışmalarımız 32} ve diğerleri⁵³, 3D organoidlerde 10 nM DHT takviyesinin tam farklılaşma sağlamak için yeterli olmadığını gösterdi. Buna karşılık, burada açıklanan 2D modelin kullanılması, yani hücrelerin 10 nM DHT ile 2D içinde tohumlanması, modeli doğal doku^32'ye benzer bir duruma ayırmak için yeterlidir. 3D ve 2D modeller arasındaki bu farkı anlamak için daha fazla çalışma gerekecek, ancak bu durum sistemler arasındaki farklı mekanik-fiziksel ipuçları veya 3D modelde büyüme faktörleri içeren ECM'nin varlığıyla açıklanabilir.

Yetişkin prostat dokusunda üç ana epitel hücre tipi bulunabilir: luminal, bazal ve nöroendokrin hücreler. Bunlardan yalnızca luminal ve bazal hücreler, şimdiye kadar yayımlanan tüm organoid modellerde mevcuttur. Nadir nöroendokrin hücrelerin eksikliği, mevcut organoid protokollerin tam olarak optimize edilmemiş olabileceğini gösteriyor. Luminal ve bazal hücreler arasında, prostat ara hücre popülasyonu da hem luminal (yani CD24a) hem de bazal (yani SCA-1) belirteçlerini^18,51 ifade eden geçiş durumu olarak tanımlanmıştır. Bu alt popülasyon genellikle periüretral prostat bölgesinde bulunur, bu yüzden genellikle periüretral luminal hücreler^{olarak adlandırılır.} Bu, bazı 3B organoid sistemlerde belirli farklılaşma veya sinyal^{koşulları altında bildirilmiş olsa da sistemimizde} luminal ve ara hücreler arasında net bir ayrım^{gözlemlememektedir 32}. Olası bir açıklama, 3D organoid üretimi sırasında farklı prostat bölgelerini ayırt etmememiz ve üretra hücreleriyle kontaminasyonu önlemek için üretral prostat bağlantısının hemen bitişiğindeki dokuyu çıkarmamızdır. Bu nedenle, proksimal veya üretra bitişik bölgelerden türetilen organoid kültürler muhtemelen ara hücreler üretme konusunda daha yeteneklidir.

Bariyer bütünlüğü, olgun ve farklılaşmış epitelin ayırt edici özelliği olarak kabul edilir ve alttaki dokuya ulaşan toksinlere ve mikroplara karşı koruyucu bir bariyer sağlar. Sıkı bağlantılar (ZO-1^{proteinleri açısından} zengindir) parasellüler geçirgenliğin düzenlenmesinde ve epitel^{bariyerinin bütünlüğünü korumada hayati bir rol oynar 57}. Epitel hücreleri farklılaştıkça, bu hücrelerarası birleşimlerin olgunlaşması^{bariyeri güçlendirir 58}. Bu nedenle, bariyer bütünlüğünün değerlendirilmesi, in vitro epitel modeli için önemli bir okumadır. Bu protokolde, bariyer bütünlüğünü değerlendirmek için üç tamamlayıcı yöntem gösterilmiştir: TEER ölçümü, ZO-1 immünboyama ve F-aktin boyama. Her üç yöntem de bariyer bütünlüğünü etkili bir şekilde değerlendirse de, gerekli ekipman ve kaynaklar açısından önemli ölçüde farklılık gösterirler. TEER ölçümleri, zaman içinde takip edilebilen nicel bir değer sağlar ve bariyer fonksiyonuna dinamik bir bakış sunar; ancak bu teknik, her laboratuvarda bulunmayabilecek özel donanım ve yazılım gerektirir. Buna karşılık, anti-ZO-1 antikorları veya falloidin ile boyama zaman ve maliyet açısından çok daha yönetilebilirdir (örneğin, falloidin boyama yaklaşık 3 saat içinde yapılabilir - bölüm 3).

Bu protokol, 3D fare prostat organoidlerinin apikal erişilebilir bir 2D model oluşturmak için nasıl kullanılacağını açıklar. Birçok inceleme, organoidlerin ve organoid bazlı sistemlerin konak-patojen etkileşimlerini incelemede avantaj ve dezavantajlarını ortaya koymuştur 23,36,59. Enfeksiyon çalışmalarında, patojenler ile konak epitelyumu arasındaki doğal etkileşim alanını dikkate almak kritik öneme sahiptir. Prostatta, luminal hücreler genellikle ilk temas noktasıdır ve bu nedenle enfeksiyon dinamiklerinin doğru modellenmesi için apikal yüzeye erişim çok önemlidir. Geleneksel 3D prostat organoidlerinde, apikal yüzey organoid lümene bakar ve doğrudan erişilemez. Bu durumlarda, patojenlere maruz kalma düşük verimlilikli ve teknik olarak zorlayıcı olan mikroenjeksiyon yoluyla veya organoidlerin bozulmasıyla sağlanabilir; bu da epitel polaritesini bozup fizyolojik olmayan etkileşim noktalarına yol açar²³. Buna karşılık, bu protokolde sunulan apikal erişilebilir 2B model, aydınlatma yüzeyine doğrudan erişim sağlar. Bu, patojenlere kontrollü ve fizyolojik olarak ilgili maruziyeti, MOI'nin hassas düzenlenmesini ve yüksek verimlilik, yüksek çözünürlüklü veya canlı hücre görüntüleme platformlarıyla uyumluluğu sağlar. Burada, bu modelin in vitro enfeksiyon sistemi olarak kullanıldığını, bakteriyel prostatit^9'dan sorumlu ana bakteri türünü temsil eden yaygın kullanılan UTI89 suşunu kullanarak sergiliyoruz. Ancak bu model, Enterococcus faecalis veya Pseudomonas aeruginosa gibi diğer prostat patojenlerini incelemek için kolayca uyarlanabilir; bu da onu prostat enfeksiyon biyolojisi için çok yönlü bir platform haline getirir.

3D organoidlerin ayrışması, organoid tabanlı modelin başarılı bir şekilde kurulması için kritik bir adımdır. 3D organoidlerin tam olarak ayrılamaması, büyük parçalara yol açark, hücrenin kültür yüzeyine yapışmasını bozabilirken, dissosiyasyon reaktifonuna 30 dakikadan uzun süre maruz kalmak hücre canlılığını azaltır. Ayrıca, ayrışma ve tohumlanmadan önce yaklaşık yedi günlük tutarlı geçiş aralığı sürdürmek önemlidir; çünkü organoidlerin fizyolojik durumu onların bağlanma ve farklılaşma yeteneklerini güçlü şekilde etkiler. Prostat organoid tabanlı modelin başarılı gelişimini etkileyen bir diğer kritik değişken ise tohumlama yoğunluğudur. Burada kullanılan tohumlama yoğunluğu 7 gün boyunca farklılaştırma için optimize edilmiştir. Bu konsantrasyonun artırılması veya azaltılması muhtemelen farklı farklılaşma sürelerine yol açar. Ayrıca, kaplamadan önce yetersiz hücre yeniden süspansiyonu, hücrelerin kuyular arasında eşit olmayan dağılımına yol açabilir ve bu da değişken hücre yoğunluklarına yol açabilir ve bu da hem çoğalmayı hem de farklılaşmayı etkiler. Ayrıca, diğer organoid modellerde olduğu gibi, farklı ECM partileri veya büyüme faktörleri büyüme ve farklılaşma kapasitesini etkileyebilir. Bu nedenle, organoid tabanlı modelin büyüme faktörü partisi veya parti sayısındaki herhangi bir değişiklikten sonra tutarlı bir fenotipi koruduğunu doğrulamak önemlidir.

Organoid tabanlı model kurulduktan sonra, enfeksiyon parametreleri de dikkatlice optimize edilmelidir. Bakteri suşuna ve seçilen okumaya bağlı olarak sağlam ve tekrarlanabilir enfeksiyon seviyeleri elde etmek için genellikle farklı MOI'ler gereklidir. UPEC süzü UTI89 (burada ve^32'de kullanılmıştır) ve birkaç prostatit^{izolat 32} için, 100 MOI, yapışma, invaziya ve çoğalma zaman noktaları boyunca güvenilir sayıda enfekte hücre elde etmek için yeterliydi. Ancak, bakteri içeren hücrelerin kuluçka süresi 1 saatin üzerine uzatılması gerekirse, ortamda UPEC'in hücre dışı aşırı büyümesini ve ardından hücrelere toksisiteyi önlemek için daha düşük MOI kullanılmalıdır. Bu protokolde enfeksiyon iki yöntemle değerlendirildi: I) enfekte hücrelerin oranını nicelendirmek için akış sitometrisi ve II) bakteriyel lokalizasyonu değerlendirmek için konfokal mikroskopi. Ancak, bakteriyel^32'yi ölçmek için koloni oluşturma birim testleri, konak veya bakteriyel^{belirteçleri 32'yi} tespit etmek için immünboyama veya konak yanıtlarını profillemek için transkriptomik analizler gibi başka yöntemler de kullanılabilir.

Prostat organoidi tabanlı model fizyolojik olarak ilgili bir sistem sağlamakla birlikte, enfeksiyon araştırmalarına uygulanırken birkaç sınırlama göz önünde bulundurulmalıdır. Bu modelin başlıca kısıtlamalarından biri, yerleşik veya çevresel bağışıklık hücrelerinin olmamasıdır; bu da enfeksiyona karşı konak yanıtını tam olarak yakalama yeteneğini sınırlandırır (örneğin bağışıklık hücresi toplama veya bağışıklık aracılı temizlenme). Modelde eksik olan diğer temel bileşenler arasında damarlar, stroma ve sinirler yer alır; bunların hepsi konak-patojen etkileşimlerini etkileyebilir. Stromal fibroblastlar, bağışıklık hücreleri ve endotel hücreleri gibi ek hücre tiplerinin dahil edilmesi, daha eksiksiz bir doku mikro ortamı yaratmaya yardımcı olur. Gelişmiş ko-kültür sistemleri veya mikrofluidik organ-on-a-chip platformları, karmaşık hücresel etkileşimleri daha da destekleyebilir ve enfeksiyonun dinamik çalışmalarını mümkün kılar. Ayrıca, hayvan modellerinden türetilen organoidler kullanılırken, özellikle insana özgü patojenler incelenirken, türe özgü farklılıklar dikkate alınmalıdır. Önceki^{çalışmamız 32} , fare prostat organoid tabanlı modelin bulgularının insan dokusunda yeniden üretilebileceğini gösterse de, gen regülasyonu, reseptör ifadesi veya hormon yanıtlarındaki türler arası varyasyonlar modelin insan fizyolojisiyle doğrudan ilgisini hâlâ sınırlayabilir. İnsan kaynaklı organoidlerin dahil edilmesi, mümkün olduğunda, insana özgü patojen etkileşimleri ve yanıtlarının incelenmesini mümkün kılarak translasyon değerini artıracaktır. Bu ekler, prostat biyolojisi, enfeksiyon patogenezi ve terapötik gelişimi incelemek için organoid tabanlı modelleri güçlü araçlar olarak güçlendirebilirken, sunduğumuz tamamen epitel modeli basitleştirilmiş ve bölümlere ayrılmış bir sistem sunar. Bu, epitelyal-spesifik konak-patojen etkileşimlerinin diğer doku bileşenlerinden müdahale olmadan odaklanmış şekilde incelenmesini sağlar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
48 kuyu plakası	Sarstedt	83.3923	Alt şekli: düz
5&alfa;-Androstan-17β-ol-3-bir dihidrotestosteron	Sigma-Aldrich	A8380	DHT olarak adlandırıldı. Stok çözeltisi 10μ M %100 etanol içinde
Her kuyu başına 40 elektrot içeren 8 kuyruklu PET sürgü;	Uygulamalı Biyofizik	8W10E+	TEER ölçümleri için kullanılan slaytlar
96 kuyulu plaka	Sarstedt	82.1583	Alt şekli: konik
Dulbecco'yu ilerlet' s modifiye edilmiş Eagle orta/F12	Thermo Fisher Scientific	12634028	10 mmol L&minus ile takviye edildiğinde adDMEM/F12+/+ olarak adlandırıldı; 1 HEPES ve 1 kez GlutaMAX
Ampicilin	Roth	K029.2	Konsantrasyon stoku 100 mg/mL
Anti-CD24a antikor	Proteintech	10600-1-AP	Birincil antikor; 1x PBS 1%BSA içinde 1:100 seyreltme
Anti-Sitokeratin 5 Alexa Fluor 647 antikor	Abcam	ab193895	Birincil antikor; 1x PBS 1%BSA içinde 1:100 seyreltme
anti-Tavşan IgG Alexa Fluor 488  Antikor	Invitrogen	A21441	İkincil antikor; 1x PBS 1%BSA içinde 1:500 seyreltme
Anti-ZO-1 Poliklonal antikor	Proteintech	21773-1-AP	Birincil antikor; 1x PBS 1%BS'de 1:750 seyreltme
B27, 50x	Thermo Fisher Scientific	12587010
Sığır Serumalbumini (BSA) Fraktion V, Yeni Zelanda Kökeni	Roth	8076.3	1x PBS'de %1 oranında kullanılan bloklama tamponunun bileşeni
odalı &mikro;-Slide 8 Kuyu	İbidi	80806	Yüzey modifikasyonu: ibiTreat
Konik tüp (15 mL)	Sigma Aldrich	T1943	Düz taban küçük peletler için daha iyidir.
Disodiyum etilen diamintetra-asetat 2H2O (EDTA)	Roth	8043.2	Ev yapımı: 400 mL H2O'da 93.0 g, pH 8.0'a ayarlayın, sadece H2O ile 500 mL'ye kadar hacim; 0,5 M EDTA; Akış sitometre tamponunun bileşeni
Dulbecco'nun Dengeli Tuz Çözeltisi (DPBS)	Gibco	14190-144	PBS
ECHO Döner Mikroskobu	EKO
ECIS  Z-Theta -  Empedans tabanlı hücre analiz sistemi	Uygulamalı Biyofizik	ECIS  Z-Theta	Sistem şunları içerir: 16 ve/veya 96 kuyulu istasyon; harici kontrol modülü; Dizüstü bilgisayar; ECIS kontrol, edinim ve görüntüleme yazılımı; otomatik hücre göçü ve elektroporasyon için yükseltilmiş alan modülü;
Fetal Bovine Serum (FBS) Superior	Sigma Aldrich	S0615	Akış sitometre tamponunun bileşeni; 293T Hücre Hattı kültür ortamının bileşeni; kültür ortamının HEK293T hücre hattı bileşeni
Flaş Falloidin Kırmızı 594	Biolegend	424203	1 PBS 1%BS'de 1:250 seyreltme
Akış sitometre tamponu			1x PBS, %10 FBS, 5 mM EDTA
Gentamicinin	Sigma Aldrich	G1272
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-038	adDMEM/F12+/+ 'nin bileşeni olan L-alanil-L-glutamin dipeptidi;
Harvard Biochrom Ultrospec 10 Hücre Yoğunluk Ölçer	Fisher Scientific	10704417
HCS CellMask Koyu Kırmızı leke	Yaşam Teknolojileri	H32721	1x PBS %1BS'de 1:1.000 seyreltme
HEK293T hücre hattı fare Noggin-Fc ifade vektörüyle transfekte edildi	Prof. Dr. Clevers'tan hücre hattı		Noggin üretiminde kullanılmıştır; kültür ortamı: 500ml DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX, piruvat (Gibco Life Technologies, 31966)+ 50ml FBS; Farin ve ark. Gastroenterology 143.6 (2012): 1518-1529
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630056	adDMEM/F12+/+  bileşeni;
Hoechst 33342	Yaşam Teknolojileri	H3570	1x PBS'de 1:5.000 seyreltme
İnsan epidermal büyüme faktörü (EGF) & nbsp;	Peprotech	AF-100-15	Konsantrasyon stoku 500 ve mikro; g/mL
Aşılama döngüleri	Sarstedt	86.1567.010
Aşılama tüpleri	Sarstedt	62.515.006
Leica Stellaris 5 konfokal mikroskobu	Leica
Luria Bertani Bulbası (LB çorbası)	Roth	X968.1
Matrigel	Corning	356231	Ekstraselülük Matris (ECM)
N-Asetilsistein	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Konsantrasyon stoku 500 mM
Noggin CM
NovoCyte Quanteon	Çevik		Akış Sitometresi
Paraformaldehit (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	%4 oranında 1x PBS, %4 sakaroz kullanılır
Primocin	Invivogen	Ant-pm-1
Q-VETTES yarı-mikro	Ratiolab	2712120
RHOKi (Y-27632)	AbMole	M1817	RhoA/ROCK inhibitörü; Konsantrasyon stoku 10 mM
R-spodin1 CM
R-Spondin1, 293T hücre hattını ifade ediyor	Sigma Aldrich	SCC111	R-spo1 CM üretiminde kullanılmıştır; kültür ortamı: 500ml DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX, piruvat (Gibco Life Technologies, 31966)+ 60ml FBS
TGFβ i (A-83-01)	Tocris	2939	ALK4/5/7 inhibitörü; Konsantrasyon stoku 5 mM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284	PBS 1x içinde %0,5 seyreltilmiştir
TrypLE Express Enzimi	Gibco	12605028	3D fare prostat organoidlerini sindirmek için enzimatik hücre ayrıştırma ajanı
Uropatogenik Escherichia coli stür UTI89	Prof. Dr. Dobrindt'ten WT suşu		pFPV-mCherry ile dönüştürüldü (addgene #20956)