Gelişmiş İmmünomodülasyon için Sürün Kemik Iliğinden Türetilen Mesenkimal Stromal Hücrelerin Standartlaştırılmış İzolasyonu ve Sitokin Primingi

Özet

Burada, fare kemik iliğinden türetilen mezenkimal stromal hücrelerin izole edilmesi için bir protokol ve BMSC'lerin bağışıklık hücreleri üzerindeki immünosupresif etkisini artırmak için sitokin priming yöntemi gösterilmektedir.

Özet

Mezenkimal stromal hücreler (MSC) güçlü rejeneratif ve immünomodülatör işlevlere sahiptir. Bu özellikler, MSC'leri çoklu bağışıklık hastalığının tedavisinde güçlü hücresel ilaçlar haline getirir. Kemik iliği, MSC'lerin birincil ve en sık kullanılan kaynağıdır. Fare modelleri kullanılarak yapılan preklinik mekanik çalışmalar, insan klinik denemelerinde BMSC'ler için optimal ilaç teslimat stratejileri hakkında bilgi edinmek için çok önemlidir. Bu nedenle, fare MSC'lerinin üretim sürecinin standartlaştırılması, daha iyi terapötik sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bu protokolün temel amaçları, kontrollü interferon-gamma (IFN-γ) priming'in BMSC'lerin içsel immünosupresif özelliklerini nasıl artırdığını göstermektir. İşlenmemiş veya IFN-γ ön lisanslı BMSC'lerden koşullu ortam (CM) oluşumunu tanımlıyor ve birincil peritoneal makrofajlar kullanılarak biyolojik aktivitelerini değerlendiriyoruz. ELISA ve akış-sitometrik profilleme yoluyla protokol, BMSC kaynaklı sekretomun — özellikle IFN-γ astarladığında — yüksek IL-10 üretimi ve M2 ile ilişkili yüzey belirteçleriyle karakterize edilen anti-inflamatuar makrofaj polarizasyonunu nasıl yönlendirdiğini detaylandırıyor. Genel olarak, bu protokol fonksiyonel olarak tutarlı fare BMSC'leri üretmek ve immünomodülatör güçlerini değerlendirmek için birleşik bir çerçeve oluşturur. Teknik değişkenliği azaltarak ve görsel ile prosedürel netlik sağlayarak, preklinik MSC araştırmalarında daha iyi tekrarlanabilirliği destekler ve translasyonel çalışmalar için optimize edilmiş MSC uygulama stratejilerini kolaylaştırır.

Giriş

Kemik iliği kaynaklı mezenkimal stromal hücreler (BMSC) hem preklinik hem de klinik çalışmalarda yaygın uygulamalara sahiptir. Düşük immünojenlikleri, kolay erişilebilirlikleri ve çoklu hattlı farklılaşma kapasiteleri, BMSC'leri klinik ortamlarda hücresel ilaçlar olarak kullanılmak için umut vadeden^{adaylar yapmaktadır 1,2,3}. İmmünosupresif ve yenileyici özellikleri, greft-versus-host hastalığı (GVHD)⁴,^{sepsis 5} ve inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD⁾⁶ gibi inflamatuar bozuklukların tedavisinde klinik çalışmalarda yaygın şekilde kullanılmıştır. Kemik iliği stromal niş, heterojen bir stromal hücre popülasyonundan oluşur. Buna rağmen, tüm MSC'ler Uluslararası Hücresel Tedavi Derneği (ISCT) tarafından tanımlanan kriterlere uygundur; bunlar arasında plastik yapışma, yüzey reseptör ekspresyonu -- insanlarda CD73, CD90 ve CD105, farelerde ise hematopoietik veya endotel belirteçleri - CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, CD79a, HLA-DR ve adipojenik kapasite bulunur, kondrojenik veya osteojenik farklılaşma⁷.

BMSC'ler, sitokinler, kemokinler, büyüme faktörleri, hücre dışı veziküller ve çeşitli çözünür ve temasa bağlı molekülleri içeren parakrin faktörlerin salgılanması yoluyla fonksiyonel^kalır. MSC'lerin sekretomu, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin unsurlarıyla çift yönlü bir şekilde etkileşime girerek nişi modüle^{eder 10}. MSC-makrofaj etkileşimleri sırasında salgılanan faktörler, makrofajları pro-inflamatuar veya anti-inflamatuar fenotip 11,12'ye kaydırabilir. Buna karşılık, MSC'lerin fonksiyonel durumu yerel bağışıklık hücreleri — özellikle makrofajlar — tarafından geri besleme^{mekanizmaları aracılığıyla düzenlenir. 11}. Bu MSC-makrofaj çapraz konuşması, MSC'lerin immünosupresif işlevselliği için vazgeçilmezdir. Benimsenen olarak aktarılan MSC'ler, kolit fare modellerinde gözlemlendiği gibi, makrofajlar varsa doku iltihabını azaltır. Buna karşılık, makrofajlar yokken MSC'lerin B veya T lenfositleriyle etkileşimi, terapötik etkilerini göstermek için yetersizdir¹³.

Allojenik BMSC'ler kullanılarak yapılan ilk faz III klinik çalışma, ABD'de Osiris Therapeutics tarafından steroid-dirençli GVHD tedavisi için tamamlanmıştır (NCT00366145)¹. O zamandan beri çok sayıda preklinik ve klinik çalışma yapılmıştır, ancak klinik denemelerin başarısı preklinik sonuçlara dayalı beklentileri karşılamamıştır. MSC tabanlı klinik çalışmaların başarı oranını artırmak için ilaç uygulama stratejilerinin optimize edilmesi şarttır. Optimal doğum yolunu, terapötik hücre dozunu ve hücrelerin bakım noktasındaki fizyolojik durumunu anlamak çok önemlidir. Örneğin, in vivo kolit fare modelinde, yapılan çalışmalar kriyokonservatif MSC'lerin veya damar yoluyla teslimatın uygulama yöntemlerinin yetersiz olduğunu^{göstermiştir 14}.

Sitokin ön lisanslama, genetik modifikasyon veya hipoksik ön koşullandırma gibi farklı yaklaşımlar, MSC'lerin in vivo kalıcılığını ve terapötik faydasını artırmak için yaygın olarak^{incelenmiştir 15}. Farenin arka uzuv iskemi modelinde, hipoksi ön koşullandırması (%2 O₂), ısı şoku proteini olan 78-kD glikoz-regüleli protein (GRP78)¹⁶ ile MSC'lerin çoğalma ve göç kapasitesini artırdı. IL-1β (Interleukin-1 beta) ön lisanslama, MSC'lerin nötrofiller, monositler, lenfositler ve eozinofilleri kullanma yeteneğini^{artırır 17}. In vivo teslimattan sonra, MSC'ler aktive T ve NK hücrelerinden türetilen IFNγ'ye maruz kalır; bu da MSC¹⁸ tarafından indoleamine 2,3-dioksijenaz (IDO) üretimini artırır. IDO, MSC'lerin sekretomunda önemli bir bileşendir ve T hücresi proliferasyon oranını azaltır. İlginç bir şekilde, MSC'lerin immünosupresif kapasitesi, IFNγ-/- farelerden türetilen T^{lenfositleri 19} ile birlikte kültürlendiğinde azalır. Çalışmalar, IFN-γ ön lisanslamasının kriyokonservalı MSC'lerde T hücresi aracılı apoptoz oranını^{azalttığını 13,20} göstermiştir. IFNγ priming, BMSC'lerin terapötik sonuçlarını^{iyileştirir 13}. Tüm bu kanıtlar topluca, IFNγ'nin daha güçlü immünosupresif MSC'lerin üretiminde vazgeçilmez rolünü göstermektedir.

En etkili MSC'lerin teslimat yöntemini belirlemek için, hayvan modelleri etik erişilebilirlikleri nedeniyle yaygın olarak kullanılmıştır. Preklinik sonuçlardaki değişkenliği azaltmak için, MSC'lerin üretim süreci için yüksek verim, hücre canlılığı ve zaman içinde tutarlılık sağlayan optimize edilmiş bir yöntem^{oluşturmak çok önemlidir 21}. MSC'lerin geçişi, farklı terapötik sonuçlar üretebilen önemli bir değişkendir. In vitro kültür sırasında, geçiş MSC'lerin karakterizasyonunu ve gücünü düzenleyebilir ve belirli sayıda geçişten sonra hücreler^{yaşlanır 22}. Bu nedenle, herhangi bir klinik veya preklinik çalışmada, MSC geçiş sayısının kullanımıyla tutarlı olmak çok önemlidir. Benzer şekilde, MSC izolasyonu için belirli bir protokolle tutarlılık da MSC kullanımının sonucunda tekrarlanabilirlik sağlanmasında kilit bir faktördür. Birçok yaklaşım arasında, antikor tabanlı hücre^{sıralaması 23}, negatif seçim^{yöntemi 24}, enzimatik sindirim²⁵ MSC izolasyonunda popüler yöntemlerdir. Ancak, bu yöntemlerin uygulanabilirliği kaynağa bağlıdır; çünkü yanlış kullanım verim, potensi ve üçlü çizgi farklılaşma kapasitesini azaltır.

Burada, BMSC'lerin izolasyonu ve karakterizasyonu için standartlaştırılmış bir protokol sunuyoruz; tercih edilen geçiş sayısı, kriyokoruma tekniği ve BMSC'den türetilen koşul ortamı toplama vurgulanıyor. Ayrıca IFN-γ aracılı MSC priming için bir protokol sağlıyor ve nihayet peritoneal makrofajların normal veya IFN-γ ön lisanslı BMSC'lere nasıl farklı yanıt verdiylerine dair karşılaştırmalı bir çalışma sunuyoruz.

Protokol

Mevcut çalışma, ICMR-Ulusal Üreme ve Çocuk Sağlığı Araştırma Enstitüsü (IAEC Projesi No.09/23) hayvan etik komitesi ve Wisconsin-Madison Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'nin onayı ve rehberleriyle yürütülmüştür. Bu çalışmada, belirli patojensiz (SPF) koşullarda yetiştirilen ve barındırılan 6-8 haftalık dişi C57Bl/6J fareleri kullanıldı.

NOT: Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBSC) tarafından belirlenen biyogüvenlik protokollerini in vivo veya in vitro çalışmalar üzerinde çalışırken takip ettik. Kısacası, hayvan çalışmaları için, stresi ve yaralanma riskini azaltmak için nazik müdahale sürdük. Uygun PPE'ler kullandık; örneğin koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, maske ve tek kullanımlık bouffant şapka. DMSO gibi biyolojik tehlike kimyasal reaktifler için, kimyasalları işlemek için bir biyogüvenlik dolabı kullandık. Belirli atık konteynerini biyolojik tehlikeli reagentleri veya keskin nesneleri atmak için kullandık.

1. Fare kemik iliği mezenkimal stromal hücrelerinin izolasyonu

NOT: Arka uzuv toplandıktan sonra, diğer adımlar doku kültürü laminar akış başlığı ve steril aseptik^{tekniklerde yapılmalıdır 26}.

1. Fareyi servikal dislokasyon yoluyla ötenazi yapın, ardından %70 etanol ile iyice durulayın. Oftalmik pens kullanarak, farenin iki kalça eklemi arasındaki karın derisini nazikçe kıvır ve makasla dikkatlice deriyi kesin.
2. Deriyi ayağa doğru nazikçe çekerek ayırın. Kalça eklemlerini ve ayak bileğini keserek her iki arka uzuvu serbest bırakın.
3. Arka uzuvları hızlıca buz gibi soğuk DMEM'de, 1x penisillin/streptomisin ve %2 FBS takviyesi ile birlikte taşıyın ki doku hasarı daha fazla diseksiyona kadar yapılsın.
4. Her bir arka uzuvu buz gibi soğuk malzeme içeren bir Petri kabına alın. Kemiğin diafizini nazikçe kazıyarak femur ve tibia üzerindeki kas ve bağ dokusunu dikkatlice soyun. Temizlenmiş kemiği, buz gibi soğuk ortamı içeren yeni bir Petri kabına aktarın.
5. Femur ve tibia'yı ayırın, ardından tibia ve femur uçlarında ilik boşluğunun hemen altındaki bir kesik yapılacaktır. Femur ve tibia diseksiyon işlemi sırasında ilik boşluğunu maksimum düzeyde koruyun.
6. 1 mL steril bir şırıngayı 21 G iğneyle alın ve maddeyi Petri plakasından çekin. Steril forsepsle, kesilmiş uyluk kemiğini tutun ve iğneyi nazikçe ilik boşluğuna sokuyun. Kemik iliği boşluğunu alıp kemik iliği elde edin. Bu adımı kemik beyazlana kadar tekrarlayın. Tibia'yı da aynı şekilde çekin.
7. Hücre kümelerini Petri kabındaki dağıtmak için nazikçe pipetleyin. 70 mm filtre ağı kullanarak, hücre süspansiyonunu filtreleyerek kemik parçacıklarını çıkarabilirsiniz. Filtratı toplayıp oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 230 x g ile santrifüj yapın.
8. Süpernatantı atın ve pelleti tam ortamla (DMEM, %10 FBS, %5 L-Glutamin, penisilin ve Streptomycin) yeniden askıya alın. Hücrelerin verimi ve yaşamlılığını Trypan mavisi dışlanması ve hemositometre ile sayarak ölçün.
9. Hücreler, tam DMEM^{ortamı 13'te} 5000 hücre/^cm2 hücre yoğunluğuna sahip 75^{cm 2} doku kültürü ile işlenmiş bir şişeye tohumlanın. 48 saatlik kültür sonrası yapışmayan hematopoietik hücreleri ortam değiştirerek çıkarabilirsiniz. Medyayı her 3-4 günde bir taze medyayla değiştirin.
   NOT: Kontaminasyonu önlemek için bir tabak yerine hücre kültürü şişesi kullanın. Hücreleri kontrol etmek için inkubatörden sıkça çıkmayın, çünkü bu hücre büyümesini zorlar.
10. Yapışkan hücreleri ayırmak için hücreleri 1 kez PBS ile yıkayın, %0,25 tripsin-EDTA ekleyin, hücreleri 5 dakika tripsin içinde tutun. Bu, hücrelerin kuyiden ayrılmasına yardımcı olur.
11. Tam malzeme, resüspansiyon ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 230 x g santrifüj ekleyin. Üst yüzeyi at. Pellete tam DMEM ortamı ekin, yeniden süzülür ve hücreleri 5.000 hücre/^cm2 yoğunlukta yeniden tohumlanın.
12. Hücreleri haftalık olarak her 3-4 günde bir ortamı değiştirerek geçirin. 3. pasajdan sonra, MSC'nin akışla kültür analizini 6. adımda açıklandığı gibi analiz edin. Her deney için 3-5 hücre pasajını kullanın.
    NOT: Hücreleri gelecekteki deneysel kullanım için kriyokonserve yapmak amacıyla, hücreleri istenen hacimde santrifüj edin, hücreleri dondurma ortamında yeniden süspansiyona alın, 1 x 10⁶ hücreyi her kriyovialde -80 °C sıcaklıkta 1 mL dondurma ortamında gece boyunca depolayın ve ardından hücreleri uzun süreli kullanım için azota aktarın.
    Dondurma ortamının bileşimi: %70 DMEM, %20 FBS, %10 DMSO.

2. Kültürlenmiş MSC'lerden koşullu ortamın hazırlanması

1. Hücreleri 5000 hücre/cm² 6 kuyu plaka yoğunluğunda tohumlayın. Kültür MSC'leri %80 birleşene kadar.
2. Hücre kültür plakasından koşullanmış ortamı toplayıp 230 x g sıcaklıkta oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın, filtreleyin ve tedavi için kullanın.

3. Kültürlenmiş MSC'lerden IFNγ ile hazırlanmış koşullu ortamın hazırlanması

1. Hücreleri 6 kuyu plakada 5000 hücre/^cm2 yoğunlukta tohumlayın. Hücreleri 48 saat boyunca 25 ng/mL IFNγ ile tedavi edin. IFNγ'nin MSC'ler üzerindeki optimal etkisini almak için doza bağımlı bir çalışma yapın. Bu deney için, MSC'lerin ön lisanslanması için 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL gibi bir IFNγ konsantrasyon aralığı seçilir. 5 ve 10 ng/mL konsantrasyonları makrofaj polarizasyonunda anlamlı derecede daha az etkiliydi ve optimal konsantrasyon olarak 25 ng/mL tespit edildi (Ek Şekil 1).
2. IFN-γ içeren ortamı boşalttıktan sonra, IFN-γ'nin tamamen temizlenmesi için kuyuyu PBS ile 2 kez yıkayın. Herhangi bir kalıntı IFN-γ çalışmanın sonucunu etkileyebilir.
3. Hücreleri normal DMEM ortamında 37 °C'de 24 saat daha kuluçka edin. 24 saat sonra, 2. adımda koşullu ortamı toplayın.

4. Periton boşluğundan kaynaklanan makrofajların izolasyonu ve kültürü

1. Farelerin peritoneal boşluğuna 5 mL buz gibi soğuk PBS (%3 FBS ile) enjekte edin, ardından karın bölgesine nazik masaj yapın.
2. PBS çözeltini steril bir şırınga kullanarak geri kazanın. 10 mL'lik bir tüpte toplayın. Çözeltiyi 300 x g ile 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
3. Üst yüzeyi çıkarın. Pelleti tam RPMI ortamında (RPMI, %10 FBS, 1x Penisilin ve Streptomisin) çözün. Hücreleri 5000 hücre/^cm2 olarak kaplamak.
4. Yapışmayan hücreleri 24 saat sonra çıkarıp birleşene kadar kültürleyin. Gerekirse daha fazla deneysel işlem için hücreleri kullanın.

5. Enzimle bağlantılı immünosorbent testi

1. BMSCs-CM ile işlenmiş makrofajlardan türetilen IL-10'u tespit etmek için aşağıdaki adımları izleyin.
   1. Makrofajları 24 saat boyunca BMSC-CM ile tedavi edin ve ertesi gün süpernatantı alın.
   2. IL-10 ELISA kiti ile IL-10 miktarını üreticinin talimatlarına uygun olarak ölçün.
2. BMSC'lerden veya IFNγ ile işlenmiş BMSC'lerden türetilen CCL2'yi tespit etmek için, üreticinin talimatlarına uygun olarak CCL2 ELISA kitini kullanın.

6. MSC'ler ve makrofaj fenotipleri için akış sitometrisi analizi

1. Hücreleri 6 kuyu plakaya tohumlayın ve birleşmesini yapın. PBS (1 mL) ile 1 kez yıkayın ve ardından tripsinizasyon yapın. %0,25 oranında tripsin ekleyin ve hücreleri tamamen tabaktan kaldırmak için 5 dakika tripsin içinde inkübe yapın.
2. Tripsin aktivitesini devre dışı bırakmak için medya ekleyin. Hücreleri 10 mL'lik polistiren tüpte toplayın. Makrofajlar için 300 x g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika, BMSC'ler için ise 4 °C'de 5 dakika 230 x g santrifüj.
3. Üst maddeyi çıkarın ve hücreleri 2 mL leke tamponunda (%2 FBS ve %0,05 azid ile buz gibi soğuk PBS) yeniden süzüldürün. 230 x g ile 7 dakika boyunca spin yapın. Pelleti boşaltıp bozun. 1 mL Ghost kırmızı 780 canlılık boyası ve 50 mL FACS tamponu ekleyin, tekrar süzültün ve akış tüpüne yerleştirin. Karanlıkta 30 dakika leke.
4. 30 dakika sonra hücreleri 1 mL leke tamponu ile yıkayın. Pelleti boşaltıp bozun. İstediğiniz hacimde antikor veya izotip kontrolü ekleyin. Karanlıkta 30 dakika daha kuluçka yapın. Hücreleri leke tamponu, dekant ile yıkayın ve 400 mL leke tamponunda yeniden süzülün. Numune tüpü alınmaya hazır.
5. Canlı ölü boyama kontrolünü hazırlamak için, tripsizasyon ve santrifüjlemeden sonra peleti 2 mL leke tamponunda çözür. Başka bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL çıkarın ve buna hücreleri öldürmek için 10 mL DMSO ekleyin. Girdabda kalıp 10 dakika kuluçka yapın. Şimdi bunu, hücre içeren diğer 1 mL çözeltiyle akış tüpünde karıştırın.
6. 1 mL boyama tamponu ekleyin ve 230 x g sıcaklıkta 7 dakika boyunca çevirin. Pelleti boşaltıp bozun. 1 mL Ghost kırmızı 780 canlılık boyası ve 50 mL FACS tamponu ekleyin, tekrar süzültün ve akış tüpüne yerleştirin. Karanlıkta 30 dakika leke. 30 dakika sonra hücreleri 1 mL leke tamponu ile yıkayın. Pelleti boşaltıp bozun. 400 mL leke tamponunda tekrar askıya alın. Canlı-ölü lekelenmiş örnek alınmaya hazır.
   NOT: Fare makrofaj boyama için, standart boyama protokolünden önce ek bir boyama aşaması eklenmelidir. Akış verilerindeki doğrusuzluğu önlemek için, FC reseptörünün bloklanması kritik bir adımdır ve hücrelerdeki Fc reseptörlerine spesifik olmayan antikor bağlanmasını engeller. Fc reseptörünü bloke etmek için, hücre süspansiyonuna 1 mL Fc bloklayıcı reaktif (arıtılmış fare karşıtı CD16/CD32 antikoru) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın. Kalan akış antikor boyama adımlarını Fc bloklayıcı reaktifi yıkamadan yapın.
7. Akış verilerini analiz etmek için başlangıçta, ileri saçılmış ve yan saçılma parametrelerine göre tek hücreler seçilmelidir. Bu adım, kalıntıları ve hücre agregalarını temizlemek için çok önemlidir. Sonra tek hücreler canlı-ölü boyama temelinde kaplı hale getirilir. Canlı hücre popülasyonuna göre daha fazla analiz yapmak (Ek Şekil 2).

Sonuçlar

Genel deneysel şematik Şekil 1'de açıklanmıştır. Fare kemik iliği hem femur hem de tibia'dan toplanmış, tohumlu, geçişli ve akış sitometrisi karakterize edilmiştir (Şekil 1A). IFNγ ön lisansı olan veya olmayan BMSC koşul ortamları (BMSC-CM) toplandı ve birkaç şişe BMSCs-CM gelecekteki deneysel ihtiyaçlar için -80 °C'de saklandı (Şekil 1B).

Kemik iliği kaynaklı hücreler hemositometre ile sayıldı (Şekil 2A) ve tam DMEM ortamında 5000 hücre/^cm2 yoğunlukta tohumlandı. 48 saat sonra, ilk ortam değiştirildi, ardından her 3/4 günde bir tam birleşime kadar her 3/4 günde bir ortam değiştirildi. Hücreler %80 birleşimine ulaştığında geçiş yaptık (Şekil 2B). 4. pasajda, hücreleri MSC-spesifik belirteç ekspresyonu temelinde karakterize ettik. Hücreler CD44, CD29 ve CD90 pozitif, CD45, CD11b ve CD34 için negatif çıktı (Şekil 2C). BMSC'ler adipogenik, osteojenik ve kondrojenik hatlara^{ayrılabilir,} 14,27,28,29. Bu, Uluslararası Hücresel Terapi Derneği kimlik yönergelerini sürdürmektedir.

MSC-CM'nin immünosupresif etkisini anlamak için peritoneal boşluğun köken makrofajlarını (PMφ) tedavi ettik ve bunları BMSC-CM ile tedavi ettik (Şekil 3A). BMSC-CM ile işlenmiş makrofajların akış sitometrisi analizini yaptık (Şekil 3B,C). Peritoneal boşluğun yerleşik kültüre adapte edilmiş makrofajları, M1 ve M2-spesifik yüzey işaretleyicileriyle boyanmıştır. Hücresel belirteçlerin gerçek boyamasından önce, makrofajları saflaştırılmış anti-fare CD32/CD16 (boyama antikorları eklenmeden önce Fare Fc Bloku) ile inkübe ederek spesifik olmayan antikor bağlanmasını engelledik. M1-spesifik belirteçler CD86 ve iNOS ile M2-spesifik belirteçler CD206 ve CD163'ün ekspresyonu incelendi. Hücreler ilk olarak hematopoietik belirteç CD45.2 (C57BL6 için) temelinde kapalı olarak belirlendi. IL-10, M2 fenotipinin imza sitokinidir. MSC-CM ile işlenmiş makrofajlar tarafından salınan IL-10, bir ELISA çalışmasıyla ölçüldü (Şekil 3D). LPS/IFNg M1^{polarizasyonunu 30} indük ettiğinden, bu tedavi negatif kontrol olarak hizmet verdi.

CCL2, MSC'lerin sekretomunda tanımlanan imza sitokinlerden biridir ve makrofaj^{polarizasyonunu tetikler.} MSC'ler tarafından serbest bırakılan CCL2, ELISA ile tespit edildi (Şekil 3E). CCL2'nin makrofaj polarizasyonundaki rolünü doğrulamak için, makrofajları CCR2 inhibitörü ile önceden tedavi ettik ve ardından MSC-CM tedavisi uyguladık (Şekil 3F) ve makrofaj polarizasyonu tekrar IL-10 ELISA çalışmasıyla tespit edildi (Şekil 3F).

Sonuçlarımız, MSC'lerin sekretomunun anti-inflamatuar makrofaj polarizasyonunu indükleyebileceğini açıkça göstermektedir; bu, koşullu ortam tedavisinden sonra bağırsaktan türetilen makrofajlarda artan IL-10 üretimiyle kanıtlanmış (Şekil 3).

Şekil 1: Çalışma akış şeması. (A) C57BL/6 fareleri ötenazi edildi. Hem uyluk hem de tibia'dan ilik temizlendi, santrifüjlendi ve bir hafta boyunca kültürlendi, her 3 günde bir medya değiştirildi. MSC'ler geçiş yaptı ve 4. pasajda akış sitometrisi ve adipogenez çalışması ile karakterize edildi. (B) 4. Geçiş MSC'leri, bir sette 25 ng/mL konsantrasyonda IFNγ eklenerek 6 kuyulu plakalara tohumlanmış, başka bir sette ise tedavi edilmemiş şekilde tutulmuştur. 48 saat sonra, normal taze tam DMEM ortamı ile değiştirin. 24 saat sonra, levhadan, santrifüjden ve filtreden ortamı toplayın. Durum malzemesini ileride kullanmak üzere -80 °C'de sakla. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Fenotipik karakterizasyon. (A) Kemik iliği kaynaklı hücreler, tohumlanmadan önce hemositometre ile sayıldı. (B) Hücrelerin her geçişten önce %80 birleşime kadar büyümesine izin verildi. (C) 4. geçiş hücreleri, fare MSC-spesifik belirteçlerle akış sitometrisi analiziyle karakterize edildi. Ölçek çubuğu 100 mM'yi temsil eder. Şekil 2C ,^14'ten değiştirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: BM-MSC sekretom analizi. (A) Deneylerin şeması. (B) MSC-CM ile işlenmiş PMφ'in temsil akış sitometrik analizi. Peritoneal türevli hücreler, hematopoietik belirteçler CD45.2-pozitif popülasyonu temelinde kapatılmıştır. Seçilen popülasyon, M1-spesifik işaretleyiciler CD86 veya iNOS, M2-spesifik işaretleyiciler CD206 veya CD163 ile ayrıca her durumda CD11b çift boyama ile boyandı. (C) M1 veya M2 hücre popülasyonunun yüzdesi nicelendirildi. LPS/IFNγ ile tedavi edilen bir hücre popülasyonu negatif kontrol olarak hizmet verdi. (D) ELISA, MSC-CM ile tedavi edilen PMφ tarafından salınan IL-10'u nicelendirmek için gerçekleştirilmiştir. ELISA, MSC-CM tarafından yayımlanan (E) CCL2, PMφ tarafından yayımlanan (F) IL-10'u nicelendirmek için gerçekleştirildi. Şekilde belirtildiği gibi, bir deney seti CCR2 antagonisti varlığında gerçekleştirilmiştir. Hata çubukları, ortalama ± SEM'i temsil eder. Veriler, her grup başına 3 MSC örneği olan 3 bağımsız deneyin temsilcisidir. Öğrencinin t-testi tüm deneylerin istatistiksel analizini yapmak için kullanıldı. ∗p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001, ∗∗∗∗p < 0.0001. Şekil 3B-F 13'ten değiştirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: BMSC'ler 0, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL IFNg ile ön lisanslıydı. Makrofajlar, IFNγ ön lisanslı MSC-CM ile tedavi edildi. MSC-CM ile işlenmiş PMφ ile serbest bırakılan IL-10'u niceli olarak belirlemek için ELISA gerçekleştirildi. Hata çubukları, ortalama ± SEM'i temsil eder. Veriler, her grup başına 3 MSC örneği olan 3 bağımsız deneyin temsilcisidir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: (A-C) Tek hücreler, öne saçılma ve yan saçılma parametrelerine göre seçildi. (D) Tek hücreler canlı-ölü boyama temelinde kaplı olarak kapatıldı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Fare kemik iliği kaynaklı mezenkimal stromal hücrelerin izolasyonu, in vivo hayvan modellerinde MSC'lerin içsel immünosupresif ve rejeneratif özelliklerini anlamak için kritik bir tekniktir. Yöntem basit ve takip edilmesi kolay görünse de, bakteriyel kontaminasyonu önlemek ve optimal hücresel verimini sağlamak için birkaç adım hassasiyetle gerçekleştirilmelidir. İşlemin her adımı, ultra temiz bir ortamda aseptik olarak yapılmalıdır.

Düşük hücre verimini önlemek için, 6-8 haftalık yaş grubundaki fareleri seçin. Femur ve tibia uçları kesilirken, ilik boşluğu mümkün olduğunca korunmalı ve yıkama işlemi tam ilik çekimini sağlamak için sert ama nazik olmalıdır. İzole edilen hücreler uygun CO₂ konsantrasyonu altında ve nemli koşullarda kuluçka yapılmalıdır. Medya değişimleri sırasında, kirletici hematopoietik hücreleri ortadan kaldırmak için hücrelerin fosfatla tamponlu tuzlu (PBS) ile nazikçe yıkanması gerekir. Hematopoietik hücre kontaminasyonunu önlemek için, yeniden geçiş sırasında tripsizasyon 5 dakikayı geçmemelidir. Erken aşamada, ortam değişimi çok hızlı olmamalıdır, çünkü sık ortam değişikliği bakteriyel kontaminasyona yol açabilir.

Her geçişte, tutarlılık ve erişilebilirliği korumak için hücrelerin birden fazla partide kriyokonserve edilmesi gerekir. IFN-γ priming için, MSC ile koşullandırılmış ortam için en etkili ön lisanslama koşullarını belirlemek amacıyla doza bağlı bir deney yapılmalıdır. Deneylerimizde, MSC'lere önceden lisans vermek üzere 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL gibi çeşitli IFNγ konsantrasyonlarını test ettik. Daha sonra, optimal konsantrasyon olarak 25 ng/mL belirlendi.

Veri bütünlüğünü korumak için, belirli bir geçiş sayısından hücreler tüm deneysel testlerde tutarlı şekilde kullanılmalıdır. MSC'lerin akış sitometrik karakterizasyonu için, yüzey reseptör ifadesinin güvenilir şekilde tespit edilmesi için 3. veya üst pasajdan hücreler kullanılmalıdır. Akış sitometrisi boyama sırasında canlı/ölü hücre ayrımcılığı gereklidir, çünkü yanlış olumsuz sonuç olasılığını azaltır.

Sonuçlar, dış yolla verilen BMSC'lerin kolit sırasında bağırsak iltihabını zayıflatmasının önemli bir mekanizmasını temsil etmektedir. IFN-γ priming, MSC ile koşullandırılmış ortamın makrofaj polarizasyonu üzerindeki etkisini artırır. BMSC'lerden salınan CCL2, makrofajlar üzerinde M2 polarizasyonunu tetikleyen kritik bir kemokindir. Önceki bulgularımız, CCL2 ve CXCL12 kemokinlerinin makrofajlar üzerinde iş birliği içinde etkileyerek polarizasyonlarını teşvik ettiğini göstermiştir. Bu olay, T hücresi ve B hücresi^{fenotipleri 13'ün} sonraki modülasyonu yoluyla anti-inflamatuar sinyalin yayılması için gereklidir.

Çalışmamızda, MSC'lerin plastik yapışma özelliğine dayanan BMSC izolyasyonu için basit bir protokol takip ettik. Akış sitometrisi veya immünomanyetik ayırma, MSC'ye özgü yüzey belirteçlerine dayalı BMSC'leri izole etmek için kullanılabilir. Ancak, her iki yöntemde de örnek hazırlığı sırasında çok sayıda hücre kaybetme ihtimali vardır. Fare kemik iliği çok düşük sayıda MSC içerdiğinden (kemik iliği hücrelerinin yaklaşık %0,001 ila %0,08'i tahmin edilen), standart plastik yapışkan özellik tabanlı izolasyon yöntemini tercih ettik. Ancak, bu yöntemin birkaç dezavantajı vardır. En büyük risk, MSC'lerin terapötik kapasitesini azaltabilecek hematopoietik hücre kontaminasyonudur. Bu nedenle, belirli bir geçiş sayısının belirlenmesi çok önemlidir; çünkü önemli bir hücre popülasyonu MSC'ye özgü yüzey reseptörlerini ifade eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dikey laminar akışlı hücre kültürü başlığı, UV ışığı ile donatılmış;
Steril Cerrahi Makas
25/75-cm2 flask
27G iğneli 5/10-mL şırıngalar
6-well kültürü tabakları
Accutase	Corning	#AT104
Anit-Mouse F4/80 APC	Biolegend	#123116
Fare Karşıtı CD 11b PE	BD PharMingen	#557397
Anti-Fare CD 45.2 APC	BD PharMingen	#558702
Fare Karşıtı CD163 Percp eFluor710	eBioscience	#46-1631-80
Fare karşıtı CD206 PE	Biolegend	#141706
Fare karşıtı CD86 FITC	BD PharMingen	#553691
Fare karşıtı iNOS PE-Cy7	eBioscience	#25-5920-80
CCL2 ELISA kiti	Invitrogen	#554722
CCR2 antagonisti (RS 102895)	Sigma	#R1903
Santrifüj
DPBS	Corning	#21-031-CV
Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM)	Corning	# 10-013-CV
Fetal sığır serumu	Sigma	#F8067
Filtre ağı (70 mm)
Hayalet kırmızı 780 canlılık boyası	Tonbo biyobilimi	#13-0865-T100
IL-10 ELISA Kiti	Invitrogen	#88-7105-88
L-Glutamin	Corning	#25-005-CI
Faz kontrast ekipmanlı mikroskop
Murine IFNγ	R& D sistemleri	#485-MI-100
Penisillin-streptomisin	Corning	#30-002-CI
Fare anti-fare CD16/CD32	BD PharMingen	#553142
RPMImedium	Corning	#10-040-CV
Steril cerrahi forseps (düz ve kavisli)
Sıcaklık ve gaz bileşimiyle kontrollü kuluçka makinesi
Tripsin	Corning	#25052-cl
Sıcaklık kontrolü olan su banyosu