Yöntem makalesi

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinde İntergenik/İntojenik Güçlendirici RNA Miktar Tayini için Hesaplamalı Bir Boru Hattı

DOI:

10.3791/69400

⸱

28 Ekim 2025

 ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yeni ortaya çıkan geliştirici transkriptleri ölçmek için kolaylaştırılmış bir hesaplama hattı sağlar. Kromatin erişilebilirliğini, kromatin özelliğini ve transkripsiyonel verileri entegre ederek, karmaşık intragenik bölgelerdeki güçlendirici aktivitenin doğru tespitine ve ipliğe özgü analizine olanak tanırken, kapsamlı biyoinformatik eğitimi olmayan araştırmacılar için de erişilebilir olmaya devam eder.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Güçlendiriciler olarak bilinen çekirdek cis-düzenleyici elementler, çeşitli hücresel fonksiyonları ve gelişimsel süreçleri kontrol eden hedef genlerin hassas transkripsiyonel düzenlemesini sağlamada merkezi bir rol oynar. Bu güçlendiriciler genellikle her iki yönde de kopyalanır ve güçlendirici RNA'lar (eRNA'lar) olarak adlandırılan uzun kodlamayan transkriptler üretir. eRNA'ların ekspresyonu, H3K27ac ve ko-aktivatör alımı gibi aktif kromatin özellikleriyle yakından bağlantılıdır ve hedef genlerin transkripsiyonel aktivasyonuna işlevsel olarak katkıda bulunur. Bununla birlikte, eRNA'ların saptanması ve miktarının belirlenmesi, özellikle konakçı-gen transkripsiyonu ile örtüştüklerinde zor olmaya devam etmektedir. Bunu ele almak için, yeni ortaya çıkan RNA dizileme verilerinden güçlendirici transkripsiyonu analiz etmek için standartlaştırılmış, kullanıcı dostu bir hesaplama iş akışı sunuyoruz. Protokol, kullanıcılara veri ön işleme, okuma haritalama ve kalite kontrol konusunda rehberlik eder, ardından sinyal atamasının karmaşık olduğu intragenik güçlendiriciler için özel prosedürlerle güçlendiriciyle ilişkili transkripsiyonun ipliğe özgü nicelleştirilmesini izler. Görselleştirme modülleri, genomik bağlamlarda güçlendirici aktivitenin net bir şekilde incelenmesini sağlar ve yerleşik seçenekler, hem intergenik hem de intragenik güçlendiricilerin analizlerini destekler. Sınırlı biyoinformatik uzmanlığına sahip araştırmacılar için tasarlanan bu iş akışı, güçlendirici transkripsiyonun tutarlı, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir çalışmaları için pratik bir çerçeve sağlayarak, güçlendirici biyolojinin çeşitli sistemlerde daha geniş bir şekilde uygulanmasını kolaylaştırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arttırıcılar, kromatin döngüsünü düzenleyerek ve transkripsiyonel mekanizmayı 1,2,3 işe alarak hedef gen transkripsiyonunu kontrol eden cis-düzenleyici DNA elementleridir. Dokuya özgü aktiviteleri, gelişim ve soy bağlılığı 4,5,6,7,8 sırasında kesin düzenleme sağlar. Aktif arttırıcılar, H3K4me1 (histon H3 Lizin 4 mono-metilasyonu) ve H3K27ac (histon H3 Lizin 27 asetilasyonu) gibi karakteristik kromatin özellikleri gösterir ve genellikle açık kromatin 9,10,11,12'yi işaretleyen DNase I aşırı duyarlı bölgelerde bulunur. Bu özellikler, transkripsiyon faktörlerinin ve RNA polimeraz II'nin DNA'ya erişmesini sağlayarak, güçlendirici lokuslarda 13,14,15,16 yeni oluşan transkripsiyonu başlatır.

Bu sıralı biyolojik süreç, çift yönlü, kodlamayan ve tipik olarak poliadenile edilmemiş RNA'lar 13,14,15,16 olan eRNA'lar adı verilen güçlendiriciden türetilmiş transkriptler üretir. eRNA'lar, arttırıcı aktivitenin belirteçleri olarak hizmet eder ve kendi başlarına efektörler olarak işlev görür 16,17,18,19,20,21,22,23,24. Duraklatılmış RNA polimeraz II 16,19'dan Negatif Uzama Faktörünü (NELF) serbest bırakarak üretken uzamayı teşvik ederler ve güçlendirici-promotör döngülerini 17,18,20 stabilize etmeye yardımcı olurlar. Ayrıca, potansiyel olarak m6A (N 6-Metiladenozin) modifikasyonu 21,22,23 yoluyla transkripsiyonel kondensatların oluşumunu da desteklerler.

Yine de, gen gövdelerindeki düzenleyici unsurlardan başlatılan intragenik güçlendirici transkripsiyonun işlevi tartışmalıdır. Bazı çalışmalar, intragenik güçlendiricilerden elde edilen eRNA'ların, potansiyel olarak NELF salınımını ve uyarana bağlı üretken uzamayı 26,27 teşvik ederek konakçı gen ekspresyonunu25 arttırdığını bildirmektedir. Buna karşılık, diğer çalışmalar, bu transkripsiyonun, RNA polimeraz II çarpışmaları veya transkripsiyonel girişim yoluyla konakçı genleri engelleyebileceğini ve zayıflamaya veya erken sonlandırmaya yol açabileceğini öne sürmektedir28,29. Bu çelişkili gözlemler, eRNA'ların belirteçler ve düzenleyiciler olarak ikili rolü ile birlikte, dikkatli niceleme ve fonksiyonel diseksiyon ihtiyacını vurgulamaktadır. Yine de, intragenik eRNA'ları ölçmek zordur çünkü bunlar genellikle duyu-iplik konakçı transkriptleri 13,25,26,30 ile örtüşür. Güçlendiriciler, iç içe geçmiş genlere veya her iki iplikçikte örtüşen transkripsiyona sahip bölgelerde bulunduğunda, güçlendiriciye özgü sinyalleri gizlediğinde zorluk daha da artar.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, özellikle intragenik bölgelere odaklanarak, güçlendirici ile ilişkili transkriptleri tespit etmek, ölçmek ve görselleştirmek için bir biyoinformatik boru hattı geliştirdik. Boru hattı, karmaşık genomik bağlamlarda bile geliştirici düzeyinde çözünürlük elde etmek için dizileme (ATAC-seq), Kromatin İmmünopresipitasyon Dizilimi (ChIP-seq), Global Run-on Dizileme (GRO-seq) ve genomik açıklamalar kullanarak Transpozazdan Erişilebilir Kromatin Testini entegre eder.

Boru hattı dört ana adımdan oluşur: (i) ön işleme, hizalama, tepe çağrısı ve sinyal üretimi31; (ii) kromatin özelliklerini kullanarak güçlendirici tanımlama; (iii) özellikle gen gövdeleri içinde iplik oryantasyon ataması; ve (iv) yeni ortaya çıkan geliştirici transkriptlerin nicelleştirilmesi ve görselleştirilmesi. Bu çerçeve, bu çalışmada analiz edilen fare embriyonik kök hücreleri gibi yüksek çözünürlüklü dizileme verilerine sahip sistemler için özellikle yararlıdır ve uygun veri kümeleri mevcut olduğunda diğer organizmalara genişletilebilir. Mevcut boru hatlarının yetersiz kaldığı durumlarda geliştiriciye özgü nicelemeyi mümkün kılan bu iş akışı, çeşitli genomik bağlamlarda intragenik eRNA transkripsiyonunun kıyaslanması ve incelenmesi için pratik bir araç sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: İş akışında kullanılan tüm ham veri kümeleri Tablo 1'de listelenmiştir. Biyoinformatik araçlarının ayrıntıları Malzeme Tablosunda verilmiştir. Bu işlem hattında kullanılan iş parçacığı sayısı, her betiğin en üstünde tanımlanan THREADS değişkeni değiştirilerek ayarlanabilir. Kullanıcılar, kullanıcının CPU kaynaklarına bağlı olarak analizi hızlandırmak için sayıyı artırabilir.
Her adımdan sonra bir günlük dosyası oluşturulur. Hızlı hata kontrolleri için, cat StepXX_log.txt; grep -qF "ERROR" StepXX_log.txt && echo "ERROR found" gibi komutları kullanın. Bir sonraki adımdan önce düzeltin." || echo "Tamam: HATA işareti yok". Herhangi bir HATA görünürse, adımı başarısız olarak kabul edin ve önce sorunu çözün.

1. GitHub deposundan tam analiz hattının indirilmesi

(https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/)

  1. Kullanılan işletim sistemine uygun Komut Satırı Arabirimini (CLI) başlatın.
    1. Windows: Linux için Windows Alt Sistemi (WSL) kullanarak bir Linux ortamı kurun. 32'ye geçmeden önce WSL'yi kurmak ve yapılandırmak için resmi talimatları izleyin.
    2. macOS: macOS Unix tabanlı olduğu için ek ayarlama yapmadan devam edin. Terminal33'ü açmak için resmi kılavuza bakın.
    3. Linux kullanıcıları, özellikle Ubuntu kullananlar: Başvurulan talimatlarda34 açıklandığı gibi bir terminal açın.
  2. Geliştirici tanımlama ve geliştirici RNA nicelemesi için boru hattını indirmek için terminalde wget https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/archive/refs/heads/main.zip -O ~/pipeline.zip   çalıştırın.
  3. Terminale unzip ~/pipeline.zip -d ~/ yazın. Bu, gerekli tüm dosyaları ana dizine çıkaracaktır.
  4. Arşivi kaldırmak ve ayıklanan klasörü yeniden adlandırmak için rm ~/pipeline.zip komutunu çalıştırın ve mv ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization-main ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization yazın.
  5. cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/ yazın ve "scripts/" dizinindeki tüm komut dosyalarını yürütülebilir hale getirmek için chmod +x scripts/* komutunu çalıştırın.

2. Analiz hattı için mamba/conda ortamının ayarlanması

  1. Bir mamba sanal ortamı oluşturmak ve çalıştırmak için bash scripts/Step1_conda_environment_formation.sh yazın. Yürütme sırasında istenirse, paket yüklemelerini onaylamak için Y yazın ve Enter tuşuna basın. macOS için Adım 2.1.1'i izleyin; Mamba veya Conda'nın kurulu olduğu sistemler için Adım 2.1.2'yi izleyin.
    1. MacOS: Komut dosyasını açın ve miniconda indirme bağlantısını macOS sürümüyle değiştirin:
      https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-MacOSX-x86_64.sh
      Ardından, 2.1 adımını izleyin.
    2. İstemde (enhancer-env) göründüğünde, aşağı akış analizleri için gerekli paketleri yüklemek üzere bash scripts/Step2_package_installation.sh yazın. Y yazın ve kurulum sırasında istenirse Enter tuşuna basın.
    3. Adım 2.2'yi çalıştırdıktan sonra, herhangi bir hata mesajı için terminal çıkışını kontrol edin. Herhangi bir sorunu çözün; ardından Adım 2.2'yi yeniden çalıştırın.
    4. (İSTEĞE BAĞLI) Malzeme Tablosundaki mamba tarafından yönetilen tüm paketlerin kurulu olduğunu onaylamak için mamba listesini çalıştırın. HOMER manuel olarak kurulur ve mamba listesinde görünmez. "~/homer/" dizininin var olup olmadığını kontrol ederek HOMER'ı doğrulayın.

3. SRA'dan (Sıra Okuma Arşivi) halka açık ChIP-seq, ATAC-seq ve GRO-seq veri kümelerini indirin

  1. Ham okuma işleme için gerekli kabuk komut dosyalarını kopyalamak için cp scripts/Step{3..12}_*.sh ./ komutunu çalıştırın.
  2. 2>&1 Step3_download_file_list.sh > Step3_log.txt bash yazın ve SRA'dan ham sıralama verilerini indirmek ve işlemek için Enter tuşuna basın.
    NOT: Bu komut dosyası, analiz için genel sıralama verilerinin indirilmesini ve hazırlanmasını otomatikleştirir. "MATERIAL/" altında, tahlil türüne göre düzenlenmiş ve çoğaltılmış (biyolojik: rep1/rep2; teknik: trep1/trep2) standartlaştırılmış bir klasör yapısı oluşturur. SRA erişim numaralarının yerleşik bir listesi, depolamayı azaltmak için önceden getirme (v3.2.0) ile almayı, fasterq-dump (v3.2.0) ile FASTQ'ya dönüştürmeyi (çift uçlu: --split-files) ve pigz (v2.8) ile sıkıştırmayı sağlar. İşleme, prefetch, fasterq-dump, pigz'i takip eder ve çıktılar karşılık gelen "00.Rawdata/" dizinlerine yazılır.

4. Ham okumaların kalite kontrolünü ve kırpılmasını gerçekleştirin

  1. Ham FASTQ dosyalarının okuma kırpma ve kalite kontrolünü gerçekleştirmek için bash Step4_read_trimming_and_QC.sh > Step4_log.txt 2>&1 yazın.
    NOT: Bu komut dosyası, GRO-seq, ATAC-seq ve ChIP-seq'den (H3K27ac, H3K4me1) ham FASTQ dosyalarını karşılık gelen giriş kontrolleriyle işler. Ham okumalarda FastQC (v0.12.1)35 çalıştırır, ardından teste özgü parametreleri kullanarak adaptörleri Trim Galore (v0.6.10)36 ile keser. GRO-seq için, önce NextSeq G kuyruklarını ve çok kısa okumaları (--nextseq 20, --length 20) kaldırır, ardından 20 nükleotitten daha uzun okumaları korurken uzun poli-A yollarını soymak için Cutadapt (v5.1)37'yi kullanır ( -a A{15}, -m 20). ATAC-seq için çift uçlu kitaplıkları işler ve Tn5/Nextera bağdaştırıcılarını (--paired, --nextera) hedefler. H3K27ac ve karşılık gelen giriş için, çift uçlu ChIP-seq kitaplıklarını (--paired) yönetir. H3K4me1 ve girişi için standart tek uçlu kırpma gerçekleştirir (varsayılan). FastQC, kırpılmış okumalarda yeniden çalıştırılır. Çıktılar her tahlilin "01.Clean/" dizinine yazılır ve ara GRO-seq bağdaştırıcısı kırpılmış dosyalar kaldırılır.

5. Bowtie2 referans indeksini hazırlayın

  1. mm10 (Mus musculus) referans genomu için Bowtie2 (v2.5.4)38 genom indeksini hazırlamak için aşağıdaki iki seçenekten birini seçin.
    1. Geliştiriciler tarafından sağlanan önceden oluşturulmuş Bowtie2 dizinini kullanmak için bash Step5_1_download_reference_index.sh > Step5_1_log.txt 2>&1'i çalıştırın.
    2. Koşmak Vur Step5_2_download_reference_make_index_with_
      Ham mm10       genom dizisini indirmek ve dizini manuel olarak oluşturmak için 2>&1'e bowtie2.sh > Step5_2_log.txt.
      NOT: Her iki yaklaşım da "reference_index/" dizinine bir dizin dosyası oluşturur ve standart hizalama için işlevsel olarak eşdeğerdir.

6. Kırpılmış okumaları mm10 referans genomuna hizalayın

  1. Her tahlilin okumalarını referansa hizalamak ve BAM dosyaları oluşturmak için bash Step6_alignment_to_make_bam.sh > Step6_log.txt 2>&1 yazın.
    NOT: Bu adım, her bir testin okumalarını önceden indekslenmiş mm10 referansıyla eşleştirir. H3K27ac ChIP-seq ve karşılık gelen giriş, varsayılan hassasiyetle dengeli doğruluk (-1, -2) için çift uçlu eşlemeyi kullanır. H3K4me1 ChIP-seq ve karşılık gelen giriş, varsayılan ayarlar (-U) altında tek uçlu eşlemeyi kullanır. ATAC-seq, değişken, uzun Tn5'ten türetilmiş parçaları (--çok duyarlı, -X 2000) çift uçlu girişle (-1, -2) barındırmak için yüksek hassasiyetli eşleme kullanır. GRO-seq, tek uçlu giriş (-U) ile kısa, kırpılmış okumaları (--çok hassas) daha iyi yerleştirmek için yüksek hassasiyetli eşleme kullanır. SAM dosyaları BAM'a dönüştürülür ve ChIP/giriş için orta düzeyde MAPQ (-b, -q 10) ve ATAC-seq ve GRO-seq (-b, -q 30) için daha katı eşikler kullanılarak samtools (v1.22.1)39 görünümüyle filtrelenir; son BAM dosyaları her veri kümesinin "02.Align/" dizinine yazılır.

7. H3K27ac ChIP-seq verilerinin teknik kopyalarını birleştirin

  1. H3K27ac ChIP-seq'in teknik kopyalarını ve karşılık gelen giriş BAM dosyalarını birleştirmek için bash Step7_merge_trep.sh > Step7_log.txt 2>& 1'i çalıştırın.
    NOT: Bu komut dosyası, sambamba (v1.0.1)40 sıralaması ile teknik kopyalar için BAM dosyalarını sıralar ve ardından H3K27ac ChIP-seq ve karşılık gelen girdi kopyalarını sambamba birleştirme ile birleştirilmiş BAM'lerde birleştirir. Kullanıcının veri kümesi herhangi bir teknik kopya içermiyorsa bu adımı atlayın ve tek tek BAM dosyalarıyla devam edin.

8. Kopyaları ve gerekli olmayan kromozomları kaldırın

  1. Yinelenenleri kaldırın ve ChIP-seq ve GRO-seq için eşlenmiş okumaları sıralayın.
    1. Histon ChIP-seq veri kümelerinden kopyaları kaldırmak ve hem ChIP-seq hem de GRO-seq çıkış BAM'lerini sıralamak için bash Step8_1_duplicate_removal_sorting-ChIP_GRO.sh > Step8_1_log.txt 2>&1 yazın.
      NOT: Bu komut dosyası, sambamba işaretlemesi (-r) ile PCR kopyalarını ve sambamba sıralaması ile koordinat sıralamalarını kaldırır. H3K27ac için işleme, birleştirilmiş teknik kopyalardan BAM'leri hedefler, ChIP ve girişi ayrı ayrı işler. H3K4me1 için, her çoğaltma ve eşleşen girdi ayrı ayrı işlenir. GRO-seq için yinelenen kaldırma atlanır ve yalnızca koordinat sıralaması uygulanır. Çıkışlar her veri kümesinin "02.Align/" dizinine kaydedilir.
  2. Kopyaları kaldırın ve ATAC-seq'den mitokondriyal kromozom eşlemeli okumaları filtreleyin.
    1. PCR kopyalarını kaldırmak, mitokondriyal okumaları (chrM) filtrelemek ve ATAC-seq BAM'leri sıralamak için bash Step8_2_duplicate_chrM_removal_sorting_ATAC.sh > Step8_2_log.txt 2>&1 yazın.
      NOT: Bu komut dosyası, ATAC-seq veri işleme için ENCODE işlem hattı önerilerine başvurur. Samamba sıralaması (-n) ile ad sıralaması gerçekleştirerek ve samtools fixmate (-m) kullanarak eş çifti bilgilerini sabitleyerek başlar. Bu adım, kopyaları işaretlemeden önce montaj ilişkisi bilgilerinin doğru şekilde atanmasını sağlar. Daha sonra, PCR kopyaları sambamba işaretlemesi (-r) kullanılarak kaldırılır. Mitokondriyal okumalar, samtools idxstats'tan bir tutma listesi oluşturularak (chrM ve * hariç) ve yalnızca samtools görünümü (-b) ile listelenen referanslar tutularak kaldırılır. Son koordinat sıralaması sambamba sıralama ile gerçekleştirilir. Temizlenen BAM'ler her çoğaltmanın "02.Align/" dizinine yazılır.

9. Her veri kümesi için en yüksek çağrıyı gerçekleştirin

  1. ChIP-seq ve ATAC-seq verileri için en yüksek çağrıyı gerçekleştirmek için bash Step9_peak_calling.sh > Step9_log.txt 2>&1 yazarak 9. adım betiğini çalıştırın.
    NOT: Bu komut dosyası, ATAC-seq ve ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) için MACS3 (v3.0.3)41 ile en yüksek çağrıyı gerçekleştirir. ATAC-seq, tüm kopya BAM'leri kaydırma/genişletme ile modelsiz modda sinyal olarak sağlayarak tepe noktaları üretir (-f BAMPE, --nomodel, --shift -100, --extsize 200, -q 0.01). H3K27ac, eşleşen girdi (-f BAMPE, --broad) ile birleştirilmiş teknik kopyalardan geniş tepe noktaları çağırır. H3K4me1 işlemlerinin her biri, tek uçlu geniş modda (-f BAM, --geniş) eşleşen girdisi ile ayrı ayrı çoğalır ve yatak aletleri (v2.31.1)42 kesişimi ile örtüşen tepe noktaları elde edilir. Çıktılar, her veri kümesinin "peak_calling/" dizinine yazılır ve "peak_calling/overlapped_peak/" altında yüksek güvenilirlikli H3K4me1 zirveleri bulunur.

10. Aşağı akış sinyal analizi için ChIP-seq ve ATAC-seq BAM dosyalarının biyolojik kopyalarını birleştirin

  1. BAM dosyalarını ATAC-seq ve H3K4me1 ChIP-seq'in biyolojik kopyalarından birleştirmek için bash Step10_merge_rep_forMakingSignal.sh > Step10_log.txt 2>&1'i çalıştırın.
    NOT: Bu komut dosyası, ATAC-seq, H3K4me1 ChIP-seq ve karşılık gelen H3K4me1 girişi için sambamba birleştirme ile çoğaltma BAM'lerini birleştirir. Birleştirilmiş BAM'ler aşağı akış analizlerini destekler (örneğin, bigWig sinyal üretimi, normalleştirme). Çıkış BAM'leri, her örnek yolun altındaki "merge/02.Align/" dizinlerine kaydedilir.

11. Etiket dizinleri oluşturun ve eşlenmiş okumalardan bigWig dosyalarına sinyal verin

  1. Etiket dizinleri oluşturmak ve her veri kümesinin eşlenmiş okumaları için bigWig sinyal dosyaları oluşturmak için bash Step11_make_tag_to_signal.sh > Step11_log.txt 2>&1'i çalıştırın.
    NOT: Bu komut dosyası, makeTagDirectory ile HOMER etiket dizinleri oluşturur ve ardından HOMER (v5.1)43 ve ucsc-bedgraphtobigwig (v482)44 paketlerini kullanarak makeUCSCfile komutuyla bigWig sinyal izleri oluşturur. Tüm sinyal izleri, UCSC Genome Browser'dan (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/) alınan kromozom boyutu dosyaları kullanılarak oluşturulur. GRO-seq, diziye özgü sinyal izleri üretir (-style rnaseq, -strand + / -, -bigWig). ATAC-seq, birleştirilmiş BAM'lerden (-bigWig) normalleştirilmemiş parçalar üretir. ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1), sözde sayısı 1 (-bigWig, -i, -pseudo 1) olan giriş normalleştirilmiş parçalar üretir. Çıktılar "03.TagDir/" ve "04.bigwig/" altında düzenlenmiştir.

12. Geliştirici tanımlaması için dosyalar hazırlayın

  1. Geliştirici tanımlaması için gerekli dosyaları ve referansı hazırlamak için terminale bash Step12_E_identification_material.sh > Step12_log.txt 2>&1 yazın.
    NOT: Bu adım, geliştirici tanımlaması için gerekli tüm dosyaları "ATAC/", "Histone/" ve "Annotation/" klasörlerinde düzenlenmiş "01.E_identification/material/" klasöründe toplar. Tepe dosyalarını (ATAC-seq, H3K27ac, H3K4me1) uygun dizinlere kopyalar. GENCODE M23 açıklama dosyası (mm10) otomatik olarak indirilir ve ENCODE kara listesi45 (mm10-blacklist.v2.bed) ve kromozom boyutu dosyası (mm10.chrom.sizes) dahil olmak üzere referans dosyaları önceden tanımlanmış bir yoldan kopyalanır.

13. Ek açıklamadan promotör adaylarını ve gen gövdelerini tanımlayın

  1. Çalışma dizinine girmek için cd 01.E_identification/ yazın, ardından cp .. /scripts/Step{13..20}_*.sh ./ geliştirici tanımlama komut dosyalarını kopyalamak için.
  2. GENCODE ek açıklamasını kullanarak promotör bölgeleri, gen gövdeleri ve Protein Kodlayan Genler (PCG'ler) için BED dosyaları oluşturmak üzere bash Step13_promoter_candidates_genebody_identification.sh > Step13_log.txt 2>&1'i çalıştırın.
    NOT: Bu komut dosyası, promotör adayları, tüm gen gövdeleri ve PCG gövdeleri için BED dosyaları oluşturmak üzere indirilen GENCODE M23 Gen Transfer Formatını (GTF) işler ve çıktıları "malzeme/Ek Açıklama/" olarak kaydeder. Promotörler, yatak araçları eğimi (-b 2000, -g mm10.chrom.sizes) ile her transkriptin TSS'si (Transkripsiyon Başlangıç Sitesi) etrafında 2 kb'lik bir pencere olarak tanımlanır. Gen ve protein kodlayan cisimler, gen olarak açıklamalı GTF girişlerinden türetilir ve protein kodlayan girişler ayrıca "gene_type = protein_coding" ile filtrelenir.

14. Geliştirici tanımlaması için süreç zirveleri

  1. Geliştirici tanımlaması için ATAC-seq ve histone ChIP-seq tepe dosyalarını önceden işlemek için bash Step14_ATAC_ChIP-seq_processing.sh > Step14_log.txt 2>&1'i çalıştırın.
    NOT: Bu komut dosyası, geliştirici çağrısı için tepe kümelerini önceden işler. ATAC-seq için, yatak aletleri çıkarma (-A) ile çakışan kara liste bölgelerini kaldırır ve ardından yatak aletleri çıkarma (-A) ile çakışan promotör adaylarını hariç tutar; histon işaretleri için (H3K27ac, H3K4me1), yatak aletleri eğimi (-b 1000 -g mm10.chrom.sizes) ile her bir tepe noktasını her iki tarafta 1 kb simetrik olarak genişletir ve ardından yatak aletleri çıkarma ile promotör çakışmalarını kaldırır.

15. Arttırıcıları tanımlayın ve sınıflandırın

  1. Kromatin tepe verilerini kullanarak güçlendiricileri tanımlamak ve sınıflandırmak için bash Step15_inter_intragenic_E_sets_identification.sh > Step15_log.txt 2>&1'i çalıştırın.
    NOT: Bu adım, yatak araçlarını kullanarak geliştiricileri tanımlar ve açıklama ekler. ATAC-seq tepe noktaları ile eğimle genişletilmiş H3K4me1 tepe noktaları arasındaki örtüşmeler kesişme (-wa, -u) ile elde edilir ve aynı zamanda yan taraftaki H3K27ac tepe noktalarıyla örtüşen bölgeler, kesişen (-wa, -u) aktif güçlendiriciler olarak sınıflandırılır; Aktif olmayan geliştiriciler, aktif bölgelerin tam geliştirici setinden çıkarma ile çıkarılmasıyla türetilir. Her bir güçlendirici setle örtüşen ATAC-seq zirveleri kesişim (-u) ile toplanır, daha sonra zirveler, gen gövdesine karşı kesişme (-v veya -u) ile intergenik ve intragenik olarak ayrılır. Arttırıcı aralıklar son olarak, tepe noktasının kesişim (-u) ile ilişkili zirvesine dayalı olarak intergenik/intragenik sınıflara atanır. Tüm sonuçlar "01.allE/", "02.interE/" ve "03.intraE/" altındaki "01.E_identification/" dosyasına kaydedilir.

16. İntragenik güçlendiricilere geçici iplik bilgisi atayın

  1. İntojenik güçlendirici BED'e geçici iplik bilgisi atamak için bash Step16_assign_temp_strand_from_gene_overlap.sh > Step16_log.txt 2>&1 yazın.
    NOT: Bu adım, yatak araçları kesişimi (-wa, -wb) kullanılarak gen gövdeleri ile örtüşen güçlendirici aralıkları ile örtüşerek intragenik güçlendiricilere gen ipliği etiketleri atar. 1, 2, 3, 4, 5, 16 numaralı sütunlar awk ile korunur, ardından kayıtlar sıralanır ve tekilleştirilir. Çıktı "03.intraE/strand_designation/01.overlapped_gene_strand/ES_E_intragenic_strand_with_dup.bed" olarak kaydedilir.

17. Her iki iplikçik genleriyle örtüşen güçlendiriciler için iplik atamasına öncelik verin

  1. Her iki iplikçikte de örtüşen genler için iplik yönünü çözmek için bash Step17_initial_strand_assignment_for_both_strand_enhancers_PCG_based.sh > Step17_log.txt 2>&1 yazın.
    NOT: Bu komut dosyası, PCG örtüşmelerine öncelik vererek her iki iplikçikte de örtüşen genlerle örtüşen intragenik güçlendiriciler için iplik belirsizliğini çözer. Her iki iplikte de bulunan güçlendiriciler ilk önce izole edilir (krom/başlangıç/bitiş/id/ipliğe göre awk gruplaması), aynı iplikçik üzerindeki PCG örtüşen vakalar yatak aletleri kesişimi (-s, -wa, -u) ile seçilir ve PCG olmayan vakalar yatak aletleri kesişimi (-v) ile tutulur. Seçilen ve korunan kümeler birleştirilir ve sıralanır. Çıktı: "03.intraE/strand_designation/02.enhancer_with_PCG_priority/ES_E_intragenic_PCG_priority.bed".

18. PCG öncelikli intragenik güçlendiricilerle örtüşen genler için ipliğe özgü Milyon haritalanmış okuma başına Kilobaz Başına Okuma (RPKM) değerlerini hesaplayın

  1. Aynı iplikçik üzerinde örtüşen güçlendiriciler için ipliğe özgü RPKM'yi hesaplamak için Step18_RPKM_cal_from_partially_strand_assigned_enhancers.sh > Step18_log.txt 2>&1 bash yazın.
    NOT: Bu adım, (i) bir iplikçik üzerinde bir PCG ile örtüşen ve bir iplik alan, (ii) her iki iplikçikte de örtüşen PCG'ler ve belirsiz kalan veya (iii) PCG örtüşmesi olmayan ve her iki ipliği de koruyan güçlendiricileri içeren Adım 17'deki "ES_E_intragenic_PCG_priority.bed" kullanır. Aynı iplikli örtüşen genler, yatak aletleri kesişimi (-s, -wa, -u) ile seçilir, awk aracılığıyla GTF'ye dönüştürülür ve featureCounts (v2.1.1)46 ipliğe özgü sayım modu (-s 1, -t geni, -g gene_id, -O, --fraction) ile GRO-seq'den ölçülür. Toplam eşlenmiş okumalar sambamba flagstat ile elde edilir ve RPKM gen uzunluğu, sayımlar ve toplamlardan hesaplanır. Çıkışlar "03.intraE/strand_designation/03.RPKM_calculation_of_overlapped_gene/" dizinine yazılır.

19. Örtüşen genlerin gen ekspresyonuna (RPKM) dayalı son iplik ataması

  1. İntragenik güçlendiriciler için iplik atamasını tamamlamak için bash Step19_second_strand_assignment_by_RPKM.sh > Step19_log.txt 2>&1 yazın.
    NOT: Bu adım, Adım 18'deki gen ekspresyonu desteğini kullanarak iplikleri intragenik güçlendiricilere atar. Güçlendiriciler (ES_E_intragenic_PCG_priority.bed) ve genler arasındaki aynı iplikçik örtüşmeleri, yatak aletleri kesişimi (-s, -wa, -wb) ile bulunur. Gen RPKM değerleri, awk/sort/join yoluyla gen aralıklarına bağlanarak gen-RPKM BED üretilir. Her güçlendirici için, en yüksek RPKM'ye sahip örtüşen gen seçilir ve güçlendirici o genin zincirini miras alır. Sonuçlar "03.intraE/strand_designation/04.enhancer_strand_designation_by_RPKM_of_gene/ES_E_intragenic_PCG_priority_strand_by_gene_RPKM.bed" adresine kaydedilir.

20. İplik bilgilerini intragenik güçlendiricilere ve güçlendirici zirvelere atayın

  1. Tüm intragenik güçlendiricilere ve her zirveye karar verilen iplik bilgilerini atamak için bash Step20_strand_assignment_for_intragenicE_and_summits.sh > Step20_log.txt 2>&1 yazın.
    NOT: Bu adım, yatak aletleri kullanarak intragenik güçlendiriciler ve eşleşen zirveler için iplik atamasını tamamlar. Zıt iplik aralıkları çıkarma (-S) ile kaldırılır, iplik olarak belirlenmiş güçlendiriciler, kesişim (-wa, -u) kullanılarak aktif ve aktif olmayan kümelerle kesişir ve zirve dosyaları, kesişme yoluyla iplik olarak belirlenmiş güçlendiricilerle örtüşen zirveler tarafından yeniden açıklanır (-wa, -wb) ve awk ile iplik elde edin. Sonuçlar "03.intraE/final_strand_IntragenicE/" ve "summit/" alt klasörüne" kaydedilir.

21. Geliştirici doğrulaması, eRNA ölçümü ve görselleştirme için girdi dosyalarını hazırlayın

  1. Tip cd .. / veya cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization işlem hattı köküne taşımak için, ardından aşağı akış analizinin hazırlanması için komut dosyasını kopyalamak için cp scripts/Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh ./ yazın.
  2. Geliştirici toplama, GRO-seq sinyal işleme ve eRNA nicelemesi için gerekli tüm dosyaları hazırlamak için bash Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh > Step21_log.txt 2>&1'i çalıştırın.
    NOT: Bu adım, "02.E_visualization_quantification/" altında geliştirici doğrulama, eRNA nicelemesi ve sinyal görselleştirme için girdi dosyalarını ve dizin yapısını hazırlar. BigWig dosyaları, geliştirici BED'ler, BAM'ler, sinyal matrisleri, sayımlar ve grafikler için alt klasörler oluşturulur. Zirve BED'leri, bigWig'ler, geliştirici listeleri ve GRO-seq BAM'ler gibi önemli girdiler uygun konumlara kopyalanır.

22. Geliştirici doğrulaması için toplama grafikleri oluşturun

  1. Çalışma dizinine girmek için cd 02.E_visualization_quantification/ yazın, ardından cp .. /scripts/Step{22..24}_*.* ./ aşağı akış analizi için gerekli komut dosyalarını kopyalamak için.
  2. Her bir güçlendirici zirve türü etrafında kromatin sinyallerinin toplama grafiklerini oluşturmak için 2>&1 Step22_generation_of_aggregation_plot.sh > Step22_log.txt bash çalıştırın.
    NOT: Bu adım, deepTools'tan (v3.5.6)47 computeMatrix ve plotProfile kullanarak geliştirici zirvelere odaklanan ortalama kromatin sinyal zenginleştirmesini görselleştirir. Tanımlanan her geliştirici kümesi için computeMatrix başvuru noktası (--referencePoint center, -a 5000, -b 5000, --missingDataAsZero), ATAC-seq, H3K27ac ve H3K4me1 için bigWig dosyalarını kullanarak geliştirici zirveleri etrafındaki 10 kb'lik bir pencere içinde sinyal yoğunluğunu hesaplar. Çıkış matrisi, geliştirici gruplar arasında karşılaştırma için sinyal toplama eğrileri oluşturan plotProfile'a iletilir. Toplama grafikleri "01.Profiling/04_1.aggregation/" dizinine kaydedilir.

23. Güçlendirici RNA ekspresyonunu ölçün ve görselleştirin

  1. FeatureCounts kullanarak GRO-seq'ten eRNA ekspresyon seviyelerini ölçmek için bash Step23_quantifing_eRNA_RPKM.sh > Step23_log.txt 2>&1'i çalıştırın.
    NOT: Bu adım, tanımlanmış güçlendirici bölgelerden eRNA transkripsiyonunu, GRO-seq kullanarak ipliğe özgü bir şekilde ölçer. İntergenik arttırıcılar, ipliksiz modda (-s 0, -t arttırıcı, -g gene_id, -O, --fraksiyon) özellik sayımları ile sayılır ve intragenik arttırıcılar, örtüşen gen transkripsiyonundan gelen sinyali dışlamak için antisens modunda (-s 2) ölçülür. BED bölgeleri saymadan önce awk ile GTF'ye dönüştürülür. Toplam eşlenen okumalar sambamba flagstat'tan gelir ve sayımlar, geliştirici uzunluğu, okuma sayıları ve toplam eşlenen okumalar kullanılarak RPKM'ye normalleştirilir. Çıktılar "02.eRNA_quantification/03.count_normalized_with_RPKM/" altında "inter/" ve "intra/" ile düzenlenir.
  2. Rscript Step24_visualization_of_enhancer_transcript'i çalıştırın. R> Step24_log.txt 2>&1'i kullanarak güçlendirici gruplar arasında eRNA ekspresyon seviyelerini görselleştirmek ve karşılaştırmak için.
    NOT: R betiği, RPKM değerlerine dayalı olarak aktif ve aktif olmayan geliştirici ifadesini karşılaştıran keman ve kutu grafikleri oluşturmak için ggplot2 (v3.5.2)48 ve cowplot (v1.2.0)49 paketlerini kullanır. Görselleştirme ve istatistiksel testler için RPKM değerleri log2'ye (RPKM + 1) dönüştürülür. İstatistiksel anlamlılık, Wilcoxon sıralama toplamı testi kullanılarak değerlendirilir. Hem özet grafikler hem de p-değer tablosu, aşağı akış yorumlaması için "03.eRNA_visualization/" olarak kaydedilir.
    NOT: Bu işlem hattındaki herhangi bir adım başarısız olursa ve yeniden çalıştırıldıktan sonra bile devam ederse, sorunu görselleştirme/sorunlar https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to bölümünde bildirin. Başarısız adımın açıkça belirtilmesi ve günlük dosyasının eklenmesi, doğru sorun giderme desteği sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geliştirici transkript niceleme işlem hattı için şematik iş akışı
Halka açık ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1), ATAC-seq ve GRO-seq veri kümeleri (Tablo 1), öncelikle doğrulama için tasarlanmış standartlaştırılmış bir işlem hattıyla işlendi. Adaptör kırpma ve kalite filtreleme, Trim Galore ve Cutadapt ile gerçekleştirildi, ardından Bowtie2 kullanılarak mm10 referans genomuna hizalama yapıldı (protokol Adım 6'da ayrıntılı olarak açıklanmıştır). ChIP-seq ve AT...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arttırıcıdan türetilmiş transkriptlerin 13,14,15 keşfinin ardından, eRNA'ların doğru bir şekilde ölçülmesi, özellikle eRNA'ların genellikle konakçı gen transkriptleri ile örtüştüğü intragenik bağlamlarda büyük bir zorluk olmaya devam etmiştir. Bu örtüşme, iplik atamasını ve sinyal ilişkilendirmesini karmaşıklaştırarak, gerçek güçlendirici transkripsiyonunu arka plan gen ekspresyonu

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Güney Kore'deki Chungnam Ulusal Üniversitesi [2022-0582-01 (S.-K.K.) ve 2023-0545-01 (S.-K.K.)] araştırma fonu tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 , BioRender (https://biorender.com/) kullanılarak oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Yatak aletleriQuinlan Laboratuvarı, Utah Üniversitesi  v2.31.1BED dosyalarını düzenlemek için yardımcı programlar
papyon2Langmead Laboratuvarı, Johns Hopkins Üniversitesiv2.5.4Okumaları referans genomla eşlemek için çok iş parçacıklı hizalayıcı
CowplotWilke Laboratuvarı, Teksas Üniversitesiv1.2.0ggplot2 tabanlı figürleri birleştirmek ve hizalamak için araçlar
cutadaptScience For Life Laboratuvarı, Stockholm Üniversitesiv5.1Adaptör ve poli-A/G kuyruk trimmeri
DeeptoolsMax Planck Enstitüsü Biyoinformatik Tesisiv3.5.6Tanımlı genomik bölgelerde okumaları nicelendirmek için okuma sayma aracı
FASTQCBabraham Biyoinformatik, Babraham Enstitüsüv0.12.1Okuma dizileme kalite kontrolü
featureCounts (subread)Shi Laboratuvarı, Monash Üniversitesiv2.1.1Belirli genomik bölgeler için ham okuma sayma araçları
HomerosBenner Laboratuvarı, Kaliforniya Üniversitesi San Diego (UCSD)v5.1ChIP-dizi, ATAC-dizisi ve yeni başlayan RNA analizi için araç seti; etiket dizin oluşturma ve sinyal profilleme içerir
MacS3Chan Zuckerberg Girişimiv3.0.3ChIP-seq ve ATAC-seq veri setleri için zirve çağrısı
Pigz.v2.8gzip sıkıştırılmış dosyalar oluşturmak için çok iş parçacıklı sıkıştırma aracı
sambambaPetersburg Devlet Üniversitesiv1.0.1Çok iş parçacıklı SAM/BAM dosya işleme araç takımı
samtoolsWellcome Trust Sanger Enstitüsüv1.22.1SAM/BAM dosyalarını işlemek ve işlemek için araçlar
SRA-toolsUlusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI)v3.2.0NCBI SRA veritabanından SRR dosyalarını indirmek için
tidyversePBC pozitiv2.0.0Veri işleme ve görselleştirme için R paketlerinin toplanması
Trim-bolAltos Laboratuvarları, Cambridge Bilim Enstitüsüv0.6.10Adaptör ve düşük kaliteli taban kesme ile çoklu iplik
Ubuntu 20.04Boru hattının geliştirilmesi ve test edilmesi
ucsc-bedgraphtobigwig Kent Laboratuvarı, Kaliforniya Üniversitesi Santa Cruzev482bigWig sinyal izleri üretmek için araçlar

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  2. Smith, E., Shilatifard, A. Enhancer biology and enhanceropathies. Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).
  3. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nat Rev Genet. 17 (4), 207-223 (2016).
  4. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  5. Plank, J. L., Dean, A. Enhancer function: mechanistic and genome-wide insights come together. Mol Cell. 55 (1), 5-14 (2014).
  6. Alexander, J. M., et al. Brg1 modulates enhancer activation in mesoderm lineage commitment. Development. 142 (8), 1418-1430 (2015).
  7. Huang, J., et al. Dynamic control of enhancer repertoires drives lineage and stage-specific transcription during hematopoiesis. Dev Cell. 36 (1), 9-23 (2016).
  8. Xiong, L., et al. Genome-wide identification and characterization of enhancers across 10 human tissues. Int J Biol Sci. 14 (10), 1321-1332 (2018).
  9. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  10. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  11. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why. Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  12. Barakat, T. S., et al. Functional dissection of the enhancer repertoire in human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 23 (2), 276-288 (2018).
  13. Kim, T. -K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  14. Melgar, M. F., Collins, F. S., Sethupathy, P. Discovery of active enhancers through bidirectional expression of short transcripts. Genome Biol. 12 (11), R113(2011).
  15. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  16. Gorbovytska, V., et al. Enhancer RNAs stimulate Pol II pause release by harnessing multivalent interactions to NELF. Nat Commun. 13 (1), 2429(2022).
  17. Mousavi, K., et al. eRNAs promote transcription by establishing chromatin accessibility at defined genomic loci. Mol Cell. 51 (5), 606-617 (2013).
  18. Hsieh, C. -L., et al. Enhancer RNAs participate in androgen receptor-driven looping that selectively enhances gene activation. Proc Natl Acad Sci. 111 (20), 7319-7324 (2014).
  19. Schaukowitch, K., et al. Enhancer RNA facilitates NELF release from immediate early genes. Mol Cell. 56 (1), 29-42 (2014).
  20. Pnueli, L., Rudnizky, S., Yosefzon, Y., Melamed, P. RNA transcribed from a distal enhancer is required for activating the chromatin at the promoter of the gonadotropin α-subunit gene. Proc Natl Acad Sci. 112 (14), 4369-4374 (2015).
  21. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), eaar3958(2018).
  22. Nair, S. J., et al. Phase separation of ligand-activated enhancers licenses cooperative chromosomal enhancer assembly. Nat Struct Mol Biol. 26 (3), 193-203 (2019).
  23. Lee, J. -H., et al. Enhancer RNA m6A methylation facilitates transcriptional condensate formation and gene activation. Mol Cell. 81 (16), 3368-3385 (2021).
  24. Chen, Q., et al. Enhancer RNAs in transcriptional regulation: recent insights. Front Cell Dev Biol. 11, 1205540(2023).
  25. Moon, J., et al. Embryonic stem cell-specific intragenic enhancer RNA essential for NSUN2-mediated stem cell fate regulation. Int J Biol Macromol. 245, 470(2025).
  26. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. Elife. 10, e65161(2021).
  27. Cheng, F., et al. Intronic enhancers of the human SNCA gene predominantly regulate its expression in brain in vivo. Sci Adv. 8 (47), eabq6324(2022).
  28. Hobson, D. J., Wei, W., Steinmetz, L. M., Svejstrup, J. Q. RNA polymerase II collision interrupts convergent transcription. Mol Cell. 48 (3), 365-374 (2012).
  29. Cinghu, S., et al. Intragenic enhancers attenuate host gene expression. Mol Cell. 68 (1), 104-117 (2017).
  30. Bressin, A., et al. High-sensitive nascent transcript sequencing reveals BRD4-specific control of widespread enhancer and target gene transcription. Nat Commun. 14 (1), 4971(2023).
  31. Lee, J., et al. Introductory analysis and validation of CUT&RUN sequencing data. J Vis Exp. (214), e67359(2024).
  32. How to install Linux on Windows with WSL. , Microsoft. https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install (2025).
  33. Terminal user guide. , Apple. https://support.apple.com/guide/terminal/welcome/mac (2025).
  34. How to open terminal in Linux. , GeeksforGeeks. https://www.geeksforgeeks.org/linux-unix/how-to-open-terminal-in-linux/ (2025).
  35. Simon, A. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Version 0.10.1, (2010).
  36. Krueger, F. Trim Galore!: a wrapper around Cutadapt and FastQC to consistently apply adapter and quality trimming to FastQ files, with extra functionality for RRBS data. Babraham Inst. , (2015).
  37. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 3(2011).
  38. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  39. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  40. Tarasov, A., Vilella, A. J., Cuppen, E., Nijman, I. J., Prins, P. Sambamba: fast processing of NGS alignment formats. Bioinformatics. 31 (12), 2032-2034 (2015).
  41. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  42. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  43. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  44. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  45. Amemiya, H. M., Kundaje, A., Boyle, A. P. The ENCODE blacklist: identification of problematic regions of the genome. Sci Rep. 9 (1), 9354(2019).
  46. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  47. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160(2016).
  48. Wickham, H. ggplot2: elegant graphics for data analysis. , Springer. 189-201 (2016).
  49. Wilke, C. O. cowplot: streamlined plot theme and plot annotations for ggplot2. CRAN Contrib. Packages. , (2015).
  50. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  51. Spicuglia, S., Vanhille, L. Chromatin signatures of active enhancers. Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).
  52. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  53. Blinka, S., Reimer, M. H., Pulakanti, K., Rao, S. Super-enhancers at the Nanog locus differentially regulate neighboring pluripotency-associated genes. Cell Rep. 17 (1), 19-28 (2016).
  54. Zhao, S., Ye, Z., Stanton, R. Misuse of RPKM or TPM normalization when comparing across samples and sequencing protocols. RNA. 26 (8), 903-909 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ntergenik Enhancerlarntragenik EnhancerlarGRO seq AnaliziATAC seq VerileriH3K27 AsetilasyonuKromatin Pik VerileriZincire zg NicelendirmeAgregasyon Grafikleri

İlgili makaleler