Yöntem makalesi

Klonlama için Nükleer Donör olarak Kryokonserif At Sperminden Somatik Hücreleri İzole Etmek İçin Basit Bir Mikroaspirasyon Tekniği

DOI:

10.3791/69404

⸱

19 Aralık 2025

 ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, 3Integrated Cell Culture & Bioimaging Laboratory, Division of Science, Mathematics & Agribusiness, Mayville State University, 4Conservation, Genetics & Biotech, LLC, 5Laboratorio de Manejo de la Reproducción Animal, Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kriyokonsertif at menisinden canlı somatik hücreleri (SC'ler) izole etmek için basit bir mikroaspirasyon tekniği sunar. Geleneksel yaklaşımların aksine, bu teknik uzun in vitro kültürlerden kaçınır ve sperm kontaminasyonunu engeller; böylece somatik hücre klonlamasında hemen kullanılmasını sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sperm, spermatozoidlerin yanı sıra, bağışıklık hücreleri, olgunlaşmamış erkek germ hücreleri, epitel hücreleri ve fibroblastlar gibi diğer hücre popülasyonlarını da içeren karmaşık bir sıvıdır. Bu hücreler diploid durumu paylaşır ve bu da onları somatik hücre nükleer transferi (SCNT) klonlaması için nükleer donör olarak uygun kılar. Bu hücreler kullanılarak canlı embriyoların ve yavrular ürediği gösterilmiştir. Onları meniden izole etmek için etkili yöntemler arasında santrifüj ve osmotik gradyan teknikleri bulunur; Ancak, bu izole edilmiş hücrelerden birincil kültürler oluşturmak için uzun in vitro kültür dönemleri gereklidir. Ayrıca, elde edilen örneklerde yüksek miktarda spermatozoidi bulunmakta olup, in vitro kültürlerin kurulması ve bakımını engellemektedir. Bugüne kadar, birincil kültürler yalnızca taze sperm örneklerinden başarılı şekilde belirlenmiş, kriyokonserve edilmiş meniyle yapılan denemeler ise sürekli başarısız olmuştur. Bu sınırlama, kriyokonserve edilmiş sperm örneklerinden klon üretme potansiyelini önemli ölçüde kısıtlar. Mevcut çalışma, kriyokonsertif edilmiş at menisinden somatik hücrelerin izole edilmesi için basit bir mikroaspirasyon tabanlı metodoloji önermektedir. Bu yaklaşım, SCNT klonlama prosedürlerinde hemen kullanılmak üzere yeterli sayıda hücrenin hızlı alınmasını sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somatik hücre nükleer transfer klonlaması, zooteknik ve bilimsel ilgi alanındaki bireylerin kurtarılması ve çoğaltılması için paha biçilmez bir araçtır. Birçok hücre hattı, deri, kas, granüloza, lenfositler ve idrar hücrelerinden türetilen hücreler dahil olmak üzere nükleer donörolarak kullanılmıştır 1,2,3,4. İlginç bir şekilde, sperm klonlama için nükleer bağışçı olarak kullanılmak üzere somatik hücreler (SC) toplamak için yeni bir alternatifolarak ortaya çıkmıştır 5,6. Bu bulgu, yalnızca meninin korunmuş bireylerin kurtarılması için özellikle önemlidir. Ancak, donmuş spermden izole edilmiş SC'lerden birincil kültürlerin oluşturulması başarılı olmamış ve günümüze kadar bu kaynaktan klonlanmış hayvanların elde edilmesinde ana engel olmaya devam etmektedir 7,8,9. Bu hücreler muhtemelen bez epitellerinden ve tübülerin astarından, seminal salgılardan ve en önemlisi idrarla sperm kontaminasyonundan kaynaklanır; sonuncusu yüksek proliferatif ve farklılaşmamış potansiyele sahip somatik hücrelerin iyi bilinen birkaynağıdır 3.

SC'leri meniden izole etmek içinsantrifüjasyon 5, osmotikgradyanlar 7,8,10 ve akış sitometrisi11 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler uygulanmıştır. Ancak, bu yöntemlerle izole edilen somatik hücreler yine de bağlanma, büyüme ve proliferasyon için optimize edilmişkoşullara ihtiyaç duyar 8. Bu hücrelerin özel gereksinimleri, in vitro kültürü daha karmaşık hale getirir; çünkü birincil hücre kültürlerinin kurulması için uzun kuluçka dönemleri gereklidir9. Ayrıca, örneklerdeki yüksek spermatozoy konsantrasyonu, bu kültürlerin başlangıcını ve sürdürülmesini engeller5.

Daha önce açıklanan yaklaşımların aksine, bu mikroaspirasyon tekniği birkaç belirgin avantaj sunar. Bu strateji, büyüklük ve morfolojiye göre SC'lerin seçilmesineolanak tanır ve hem canlı hem de yaşatmayan hücrelerden çekirdeklerin geri alınmasına olanak tanır; bu strateji, kriyoprotektanlar13 olmadan donmuş doku ve dondurulmuş üremehücreleri 14,15,16 ile başarıyla gösterilmiştir. Önemli olarak, SC'ler meninin çözülmesinden hemen sonra kullanılabilir; böylece hayvan klonlaması için kullanılan primer somatik hücrelerin genişletilmiş in vitro kültüründe tipik olarak ilişkili ploidy hata riskiniazaltır 17,18. Özellikle, bu teknik kriyokonserve edilmiş at menisine odaklanır ve SCNT12 için hemen kullanılabilecek yeterli sayıda SC toplanmasına olanak tanır.

Mikropipetlerin üretimi ve mikroaspirasyon tekniklerinin geliştirilmesi son on yıllarda önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu araçların kullanımı, gametlerin, embriyoların ve onların sitoyapılarının hassas manipülasyonunu mümkün kılarak üreme biyoteknolojisi alanında yeni olanaklar yaratır (https://www.jove.com). Mikromanipülasyon teknikleri, hücresel mekanik özelliklerin değerlendirilmesini sağlar ve fizyolojik durumları hakkında değerli bilgiler sağlar19,20, ancak bu alan hâlâ nispeten keşfedilmemiştir.

Bugüne kadar, herhangi bir mikromanipülasyon yöntemiyle SC'leri spermden izole etmek için etkili bir teknik detaylandırmamıştır. Geleneksel izolasyon yöntemlerinin sınırlamaları göz önüne alındığında, bu çalışma kriyokonsertif edilmiş at menisinden SC'leri izole etmek için pratik mikroaspirasyon tabanlı bir protokol önermekte; böylece toplandıktan sonra somatik klonlama işlemlerinde hemen kullanılmalarını mümkün kılar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

19 yıldan fazla süre sıvı azotta korunan kriyokonsertif sperm örnekleri, Meksika'daki ilgili veterinerlik otoriteleri tarafından yetkilendirilen ticari dağıtıcılardan, evcil hayvanlardan alınan meninin zoosanitar sürecini düzenleyen Meksika Resmi Standardı NOM-027-ZOO-1995'e uygun olarak alınmıştır. Tüm sperm örnekleri, kullanılmış veya analiz için uygun olmayan olsun, inaktif hale getirildi ve Meksika'da biyolojik enfeksîyonel atıkların yönetimi için NOM-087-ECOL-SSA1-2002 dahil olmak üzere kurumsal biyogüvenlik protokolleri ve geçerli düzenlemeler dahil olmak üzere bertaraf edildi. Kalıntı hidroflorik asit (HF), gaz kaposu altında güvenli bir şekilde nötralize edildi; yavaş yavaş plastik bir kapçaya aktarıldı ve kabuklu CaCO3 veya Ca(OH)2'nin küçük bölmeleri eklenerek kabuklanma durana kadar çözünmeyen CaF2 oluştu. Nötralize edilmiş süspansiyonun pH değerinin yerel düzenlemelere göre inorganik kimyasal atık olarak yönetilmeden önce 6 ile 8 arasında olduğu doğrulandı. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Somatik hücre izolasyonu için mikropipet iğne üretimi

  1. Seçilen borosilikat cam kapillyarlar (1,0 mm O.D. × 0,78 mm I.D. × 100 mm).
  2. İnce uçlu kapilyarlar oluşturmak için mikropipet çekici kullanın. Uç çapını değiştirmek için kesme noktasını ayarlayın.
  3. Kapilleri çekiciye yerleştirin ve sıkıca kilitleyin.
  4. Mikropipeti çektikten sonra dikkatlice çıkarın ve mikro dövme makinesine yatay olarak yerleştirin.
  5. Isıtıcıyı ve mikropipeti mikroskobun görüş alanında hizala.
  6. Kesme noktasını okulluk nişangahı ile bulun (Şekil 1A,B).
  7. Mikropipet ucunu cam boncukla (ısıtıcı filamentinde) temas ettirin.
  8. Sıcaklığı yavaşça artırın, ta ki ucu boncukta eriyene kadar.
    1. Isıtıcıyı kapatın.
    2. Ucu boncuğa yapışıp ayırın.
      NOT: Mikropipetin bükülmesine gerek yoktur; düz haliyle kullanılabilir. Ancak, operatör tarafından tercih edilirse bir açı oluşturulabilir (Şekil 1C).
  9. Ucu düzleştirmeyin, çünkü bu adım işlem için gereksizdir.
  10. Pipet uçlarını her ucunu ~10 saniye ardışık olarak içine batırarak temizleyin:
    1. %20 hidroflorik asit (HF).
      DIKKAT: Hidroflorik asit son derece toksik ve aşındırıcıdır. Tedarikçi tarafından belirtilen kişisel koruyucu ekipmanı kullanın. Göz/yüz koruma cihazı, eldiven ve laboratuvar önlüğü kullanımına vurgu yapın ve her zaman fume hood ile çalışın.
    2. Steril, çift damıtılmış su.
    3. Mutlak etanol.
      NOT: Pipet ucu yıkamayı kolaylaştırmak için, yukarıda bahsedilen çözeltileri 15 mL steril Corning tüplerinde hazırlayın.
  11. Mikropipetleri fırında 50 °C'de kurut.
  12. Mikropipetleri steril bir kapta sakla.

2. Mikroaspirasyon sistemi

  1. Mikroaspirasyon sisteminin düzgün çalıştığından emin olun; mikroaspirasyon joystick'i kontrol paneline merkezlenmiş.
  2. Yağ kullanan sistemlerde, sistem içinde hava kabarcıkları olmadığından emin olun, çünkü bunlar hareket hassasiyetini etkileyebilir.
  3. Somatik hücre aspirasyon mikropipetini operatörün baskın elindeki tutma manipülatörüne yerleştirin.
    NOT: Somatik hücre toplanması sırasında ucu tıkanırsa mikropipeti yenisiyle değiştirin.

3. Kryokonsertif edilmiş at meninin erimesi ve seyreltilmesi

  1. Pipetleri sıvı azottan çıkarın, 10 saniye havaya maruz bırakın ve 37 °C'de 30 saniye eritin.
  2. İlk meniye seyreltme: Eritilmiş meniden (250 μL) bir örnek alın ve %10 fetal sığır serumu, 0,1 mg/mL sığır serumu alümini, 12,5 μM β-merkaptoetanol ve %1 antibiyotik-antimikotik takviyesi olan 1,0 mL DMEM/F12 ortamı ile seyreltin.
    1. Karışımı 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
  3. İkinci meniye seyreltmesi: İlk seyreltmeden 25 μL alın, 975 μL 1x DPBS ile incelendirin ve 0,1 mg/mL poli (vinil alkol) (PVA) veya polivinilpirrozidon (PVP) ile takviye olun, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne biriktirin ve nazikçe karıştırın.
    1. Bu karışımı hücre toplama süreci boyunca 37 °C'de tutun.

4. SC koleksiyonu için yemeklerin hazırlanması

  1. SC'leri 35 mm çapında kültür kaplarından iki kapak kullanarak toplayın.
  2. İlk kapağı aşağıdaki şekilde hazırlayın (kapak #1, Şekil 2A).
    1. İkinci sperm seyreltmesinden 100 μL alın ve kapağın ortasına bırakın (bkz. Şekil 2A).
    2. İlk damlanın üzerine 0.1 mg/mL PVA veya PVP takviyesi ile 1x DPBS'den ikinci bir mikrodamla (10 μL) yapın (bkz. Şekil 2A).
    3. Her iki mikrodamlayı tamamen parafin yağı ile kaplayın; böylece buharlaşmayı önleyin ve SC aspirasyonu sırasında sıcaklık stabilitesini koruyun.
  3. İkinci kapağı hazırlanarak hücresel kalıntıları ve eşlik eden spermatozoidleri (kapak #2, Şekil 2B).
    1. Kapağın ortasına üç adet 30-50 μL damla, 0.1 mg/mL PVA veya PVP takviyesi ile 1x DPBS yerleştirin; Üzerlerini mineral yağla kaplamayın.
      NOT: Bu kültür kabını, DPBS çözeltinin hava maruziyetinden kaynaklanan fizikokimyasal özelliklerindeki değişiklikleri önlemek için tüm somatik hücreler seçildikten sonra hazırlanır.
  4. Tüm mikroaspirasyon adımlarını oda sıcaklığında ters mikroskop altında gerçekleştirin. Ani sıcaklık değişimlerinden kaçının.

5. Kriyokonsertif at meninden SC'lerin izole edilmesi için mikroaspirasyon prosedürü

  1. İlk kapağı (kapak #1, Şekil 2A) mikroskop aşamasına yerleştirin, SC'lerin toplanmasına hazır hale getirilin.
  2. SC'leri toplamak ve mekanik aspirasyon sistemine bağlamak için doğru çapta bir mikropipet seçin.
  3. Mikropipeti dikkatlice mikrodrop'a yerleştirin ve tabak kapağının dibine hizalayın. Pipet aspirasyon kültür ortamına sahip olunduktan sonra, SC'lerin bireysel olarak yakalanmasına başlayabilirsiniz.
  4. Çanakın alt kısmında çeşitli hücre morfolojileri görünmelidir (Şekil 3).
  5. Mikropipet ucunu her SC'nin yanına yerleştirin ve onları negatif basınç altında aspire edin. Boyutları ne olursa olsun tüm yuvarlak ve uzun hücreleri aspire edin. Aspirasyon hacmi SC yakalamaları arasında değişir.
  6. 10 hücre yakaladıktan sonra, onları üstteki mikro damlaya (10μL) yatırın (Şekil 2A). Bu adımı, klonlama deneyi için gerekli SC sayısı elde edilene kadar tekrarlayın.
  7. Toplanma süreci boyunca yakalanan tüm somatik hücreleri bu mikro damla içinde tutun.
  8. Klonlama için gerekli sayıda SC elde edildikten sonra, eşlik eden spermatozoidleri, hücresel kalıntıları ve mikrobiyal kirleticileri çıkarmak için mikrodamlalarla basit bir yıkama işlemi uygulayın.
  9. İkinci kapağı alın ve SC'lerin ardışık üç aşamalı yıkamasını yapın (kapak #2, Şekil 2B):
    1. Somatik hücreleri mikropipetle yakalayın ve dikkatlice ilk damlanın yüzeyine yerleştirin. 3-5 dakika boyunca yerleşmelerine izin verin (Şekil 2B; Drop #1).
    2. 5.9.1 adımını tekrarlayın ve bunları ikinci damlaya yatırın (Şekil 2B; Drop #2).
    3. 5.9.1 adımını tekrarlayın ve somatik hücreleri üçüncü damlaya bırakın (Şekil 2B; Drop #3).
  10. Son bir adım olarak, izole edilmiş somatik hücreleri somatik hücre nükleer transfer prosedürlerinde daha sonra kullanılmak üzere hazırlanmış son bir mikrodamla içine yatırın (Şekil 4D).
    NOT: Her yeniden yakalamada sperm, kalıntı ve mikrobiyal kirleticileri en aza indirmek için SC'leri mümkün olan en küçük orta hacimde aspire edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tablo 1, mikroaspirasyon tekniğinin, üç aygır arasında kriyokonsertif edilmiş at menisinden somatik hücreleri verimli bir şekilde geri kazandığını ve yakalama oranlarının 317,7 ± 9,60'a ± 424,7 33,65 hücre/saat arasında değiştiğini göstermektedir. En yüksek verimli aygır #03 oldu ve bu yöntemin uzun süreli depolanmış örneklerde bile etkinliğini gösterdi. Veriler, tekniğin somatik hücreleri meniden tutarlı ve etkili şekilde izole ettiğini, ortalama yakalama oranları ve sta...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelerin ve gametlerin mikromanipülasyonu, karmaşık destekli üreme tekniklerini basitleştirmeyi mümkün kıldı. Bunlara örnek olarak El YapımıKlonlama 21 ile somatik klonlama, destekli çatlama22, intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI)23 ve zigotlar24'te pronükleer mikroenjeksiyon gibi yöntemler yer alır.

Somatik hücreleri meniden izole etmek için etkili yöntemler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, çıkar çatışmaları olmadığını belirtirler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco (UAM-X) Tarım ve Hayvan Üretimi Bölümü Üreme Yönetimi Laboratuvarı'na teknik ve lojistik destekleri için teşekkür etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2 beta MerkaptoetanolSIGMAM7522Somatik hücreler kültürü
1x DPBSGIBCOREF-21600010Somatik hücrelerin manipülasyonu
Mutlak etanolHYCELEL CRISOL 50181-1L73Pipet üretimi için
Antibiyotik-antimikotik 100 katINVITRO SA. Mé xicoSomatik hücreler kültürü
Borosilikat kapillyarlar (1,0 mm O.D. & Times; 0,78 mm K.D. & Times; 100 mm Uzunluk)HARVARD APPARATI, ABDEC1-30-0035Pipet üretimi için
BSASIGMAA3311Somatik hücreler kültürü
DMEM/F12 ortaGIBCOREF-12500-062Somatik hücreler kültürü
At kriyokonservalı menin örneğiKriyokonserve edilmiş menî örnekleri ticari bir dağıtıcıdan alınmış ve 19 yıldan fazla bir süre sıvı azotta korunmuştur. Tüm dondurulmuş at spermi örnekleri, Meksika'daki ilgili veterinerlik otoriteleri tarafından yetkilendirilen ticari dağıtıcılardan alınmıştır; bu örnek Meksika Resmi Standardı NOM-027-ZOO-1995, Ev Hayvanlarından Spermin Zoosaniter Süreci'ne uygun olarak alınmıştır.
Okulluk nişangahıPipet üretimi için araçGerekli ekipmanlar
Fetal Sığır SerumuGIBCOREF-26140-079Somatik hücreler kültürü
Hidroflurik asitSIGMA-ALDRICH339261Pipet üretimi için
Ters Optik MikroskobuEclipse, TE 200NIKONSomatik hücrelerin mikromanipülasyonu
Laboratuvar  Kuru fırınPipet üretimi için araçGerekli ekipmanlar
Mikro DökümhanePipet üretimi için araçGerekli ekipmanlar
Ters Mikroskop için mikromanipülatör setiHücrelerin mikromanipülasyonuGerekli ekipmanlar
Mikropipet çekiciP-97, SUTTER ALETIPipet üretimi için araçAşağıdaki ayarlar— Isınma: 720; Çekme: 30; Hız: 50; Süre: 220; Basınç
Mineral yağSIGMAM8410Somatik hücrelerin manipülasyonu
Nunclon  hücre kültürü tabakları, kısırlık ve zamanlar; H 35 mm ve zamanlar; 10 mmNUNCLONNunc 153066
PVASIGMAP8136Somatik hücreler kültürü
PVPSIGMAP5288Somatik hücreler kültürü
Tripan mavi çözeltisi %0,4GIBCOREFERANS 15250061Hücre boyası

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, A., Gupta, S. C., Gupta, N. Comparative potential of cultured skin fibroblast, cumulus, and granulosa cell to produce somatic cell nuclear transfer (SCNT) preimplantation embryos in buffaloes (Bubalus bubalis) in relation to gene expressions. Cell Reprogram. 12 (3), 357-368 (2010).
  2. Galli, C., Duchi, R., Moor, R. M., Lazzari, G. Mammalian leukocytes contain all the genetic information necessary for the development of a new individual. Cloning. 1 (3), 161-170 (1999).
  3. Olsson, P. O., Yeonwoo, J., Park, K., Yoo, Y. M., Hwang, W. S. Live births from urine derived cells. PLoS One. 18 (1), e0278607(2023).
  4. Vignon, X., et al. Developmental potential of bovine embryos reconstructed from enucleated matured oocytes fused with cultured somatic cells. C R Acad Sci III. 321 (9), 735-745 (1998).
  5. Nel-Themaat, L., et al. Isolation, culture and characterisation of somatic cells derived from semen and milk of endangered sheep and eland antelope. Reprod Fertil Dev. 19 (4), 576-584 (2007).
  6. Kjelland, M. E., Liu, J., Hyatt, D., Kraemer, D. Collection, isolation, and culture of somatic cells from avian semen. Avian Biol Res. 6 (4), 255-260 (2013).
  7. Nel-Themaat, L., et al. Cloned embryos from semen. Part 1: in vitro proliferation of epithelial cells on embryonic fibroblasts after isolation from semen by gradient centrifugation. Cloning Stem Cells. 10 (1), 143-160 (2008).
  8. Liu, J., et al. Evaluation of culture systems for attachment and proliferation of epithelial cells cultured from ovine semen. Anim Reprod Sci. 115 (1-4), 49-57 (2009).
  9. Liu, J., et al. Embryo production and possible species preservation by nuclear transfer of somatic cells isolated from bovine semen. Theriogenology. 74 (9), 1629-1635 (2010).
  10. Saini, M., et al. Isolation and culture of epithelial cells from stored buffalo semen and their use for the production of cloned embryos. Reprod Fertil Dev. 31 (10), 1581-1588 (2019).
  11. Brom-de-Luna, J. G., Canesin, H. S., Wright, G., Hinrichs, K. Culture of somatic cells isolated from frozen-thawed equine semen using fluorescence-assisted cell sorting. Anim Reprod Sci. 190, 10-17 (2018).
  12. Ramos, B., Rodríguez, A. A., Rosales, A. M., Montiel, A. J., Hernández, J. E. Identification of somatic cell populations in cryopreserved equine semen as a source of donor nuclei for somatic cloning: preliminary results. Reprod Fertil Dev. 37 (1), (2025).
  13. Moulavi, F., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer in Asiatic cheetah using nuclei derived from post-mortem frozen tissue in absence of cryo-protectant and in vitro matured domestic cat oocytes. Theriogenology. 90, 197-203 (2017).
  14. Wakayama, S., Ito, D., Ooga, M., Wakayama, T. Production of mouse offspring from zygotes fertilized with freeze-dried spermatids. Sci Rep. 12 (1), 18430(2022).
  15. Wakayama, S., Ito, D., Hayashi, E., Ishiuchi, T., Wakayama, T. Healthy cloned offspring derived from freeze-dried somatic cells. Nat Commun. 13 (1), 3666(2022).
  16. Loi, P., Fulka, J., Hildebrand, T., Ptak, G. Genome of non-living cells: Trash or recycle. Reproduction. 142 (4), 497-503 (2011).
  17. Wakayama, S., Wakayama, T., Wells, D. N. Encyclopedia of Life Sciences. , 1-10 (2023).
  18. Lanza, R., et al. Extension of cell life-span and telomere length in animals cloned from senescent somatic cells. Science. 288, 665-669 (2000).
  19. González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophys J. 116 (4), 587-594 (2019).
  20. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. J Biomech. 33 (1), 15-22 (2000).
  21. Vajta, G., et al. Production of a healthy calf by somatic cell nuclear transfer without micromanipulators and carbon dioxide incubators using the handmade cloning (HMC) and the submarine incubation system (SIS). Theriogenology. 62 (8), 1465-1472 (2004).
  22. Alteri, A., et al. Revisiting embryo assisted hatching approaches: A systematic review of the current protocols. J Assist Reprod Genet. 35 (3), 367-391 (2018).
  23. Briski, O., Salamone, D. F. Past, present and future of ICSI in livestock species. Anim Reprod Sci. 246, 106925(2022).
  24. Wall, R. J. Pronuclear microinjection. Cloning Stem Cells. 3 (4), 209-220 (2001).
  25. Selokar, N. L., et al. Hope for restoration of dead valuable bulls through cloning using donor somatic cells isolated from cryopreserved semen. PLoS One. 9 (3), e90755(2014).
  26. Selokar, N. L., et al. Buffalo (Bubalus bubalis) SCNT embryos produced from somatic cells isolated from frozen-thawed semen: Effect of trichostatin A on the in vitro and in vivo developmental potential, quality and epigenetic status. Zygote. 24 (4), 549-553 (2016).
  27. Guevorkian, K., Maître, J. L. Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo. Methods Cell Biol. 139, 187-201 (2017).
  28. Duah, E. K., et al. Production of hand-made cloned buffalo (Bubalus bubalis) embryos from nonviable somatic cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 52 (10), 983-988 (2016).
  29. Loi, P., et al. Nuclei of nonviable ovine somatic cells develop into lambs after nuclear transplantation. Biol Reprod. 67 (1), 126-132 (2002).
  30. Fahrudin, M., Otoi, T., Suzuki, T. Developmental competence of bovine embryos reconstructed by the transfer of somatic cells derived from frozen tissues. J Vet Med Sci. 63 (10), 1151-1154 (2001).
  31. Podico, G., et al. Single-layer colloid centrifugation as a method to process urine-contaminated stallion semen after freezing-thawing. J Equine Vet Sci. 87, 102910(2020).
  32. Zhang, Y. T., et al. Evaluation of porcine urine-derived cells as nuclei donor for somatic cell nuclear transfer. J Vet Sci. 23 (2), e40(2022).
  33. Mizutani, E., et al. Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells. Sci Rep. 6, 23808(2016).
  34. Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: a guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129(2022).
  35. Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
  36. Graber, M., Lane, B., Lamia, R., Pastoriza-Munoz, E. Bubble cells: Renal tubular cells in the urinary sediment with characteristics of viability. J Am Soc Nephrol. 1 (7), 999-1004 (1991).
  37. Rahmanian, N., Bozorgmehr, M., Torabi, M., Akbari, A., Zarnani, A. H. Cell separation: Potentials and pitfalls. Prep Biochem Biotechnol. 47 (1), 38-51 (2017).
  38. Håård, M. Use of frozen stallion semen in Europe. Acta Vet Scand Suppl. 88, 123-127 (1992).
  39. Klug, E., Treu, H., Hillmann, H., Heinze, H. Results of insemination of mares with fresh and frozen stallion semen. J Reprod Fertil Suppl. 23, 107-110 (1975).
  40. Pukazhenthi, B., Comizzoli, P., Travis, A. J., Wildt, D. E. Applications of emerging technologies to the study and conservation of threatened and endangered species. Reprod Fertil Dev. 18 (1-2), 77-90 (2006).
  41. Swanson, W. F., Magarey, G. M., Herrick, J. R. Sperm cryopreservation in endangered felids: developing linkage of in situ-ex situ populations. Soc Reprod Fertil Suppl. 65, 417-432 (2007).
  42. Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: Advancements and problems. Cell Reprogram. 15 (5), 374-384 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Microaspiration TechniqueSomatic Cell IsolationCryopreserved Equine SemenNuclear Donor CellsSomatic Cell Nuclear TransferEquine CloningCell Morphology SelectionMicropipette AspirationSequential Cell WashingDiploid Cell Recovery

İlgili makaleler