Yöntem makalesi

Memeli hücrelerinde peroksizoma özgü problarla peroksizom boyama

DOI:

10.3791/69405

⸱

19 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, University of Southampton, 2The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University, 3Biosciences, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, 4Institute of Bioengineering, Faculty of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), 5Biomolecular Screening Facility, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), 6Conquest

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PeroxiSPY probları, memeli hücrelerinde peroksizomları tespit etmek için kullanılır. Burada, canlı ve sabit hücrelerde peroksizomların nasıl boyalandırılacağını probların nasıl kullanılacağını gösteriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peroksizomlar, insan sağlığında hayati rollere sahip yaygın organellerdir ve işlev bozuklukları çeşitli genetik bozukluklara yol açar. Peroksizomların görselleştirilmesi, peroksisom disfonksiyonunun tanımlanmasında anahtardır; Ancak, peroksizoma özgü probların eksikliği nedeniyle ilerleme sınırlı kaldı. Doğal peroksisom metabolitlerini taklit eden Peroksizoma özgü problar olan PeroxiSPY'yi geliştirerek, canlı memeli hücrelerinde peroksizom dinamiklerinin gerçek zamanlı tespiti, takip edilmesi ve nicelendirilmesini mümkün kılmıştır. Ayrıca, bu tekniğin peroksizom bozuklukları olan hasta hücrelerine uygulanması patolojik fenotipleri ortaya koyar. Burada, canlı memeli hücrelerinde peroksizomların tespit edilmesi ve sabit hücrelerde boyama sonrası peroksizomların tespiti için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Peroksizoma özgü problarla canlı hücrelerde peroksizomların nasıl boyanacağını gösteriyoruz; özellikle hücrelerin hazırlanması, prosedürün zamanlaması, tekrarlanabilirlik ve sorun giderme üzerine odaklanıyoruz. Bu problar, peroksisomların hızlı, spesifik ve toksik olmayan canlı hücre tespitini mümkün kılarak, peroksizomla ilişkili bozukluklarda peroksisom fonksiyonunu ve işlev bozukluğunu değerlendirmek için benzersiz, nicel bir yöntem sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peroksizom, en bol bulunan ökaryot organeldir ve bazı hücreler bin peroksizomdan fazla1. Fonksiyonları, organizma gelişimi ve metabolik adaptasyon için kritik 1,2; bu, genellikle tedavi edilemez nörodejeneratif ve nörometabolik durumlar olan çeşitli insan peroksizom bozukluklarıyla kanıtlanmıştır 3,4. Bildiğimiz kadarıyla, canlı hücrelerde ve dokularda peroksizomları etiketlemek için seçici yöntemler daha önce eksiklik yaşanmıştır. Bu araçlar, araştırma ve tanı uygulamaları için paha biçilmezdir ve peroksizom oluşumu ile fonksiyonunun çeşitli yönlerinin doğrudan ve nicel ölçülmesinisağlar 6. Bu problar, bir yandan hücrelerdeki peroksisom fonksiyonunun nicel bir okumasını sağlayacak kadar çok yönlüdür; diğer yandan ise translasyonel etkinlik testlerinde veya peroksisom bozuklukları için tanı olarak kullanılabilir6. PeroxiSPY boyama, invaziv olmayan canlı hücre peroksizom tespiti için hızlı, özgül, sitotoksik olmayan bir tekniktir. Burada, memeli hücre hatlarında peroksizomların peroksizom probları kullanılarak nasıl boyanacağını açıklıyoruz (problar ayrıca zebrafish embriyolarında spesifik peroksizomal boyama göstermiştir, ancak bitki Arabidopsis thaliana hücrelerinde peroksizom boyamaiçin uygun değildir 6). Boyama işlemi 10 dakikadan kısa sürede gerçekleştirilebilir. Prob saatlerce tespit edilebilir veya daha fazla immünboyama için paraformaldehit fiksasyon protokolü kullanılarak sabitlenebilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Canlı hücrelerin boyalanması

  1. Canlı hücre görüntüleme için hücre kültürü hazırlığı (süre: 24 saat)
    NOT: Çalışma, tüm deneyler için standart hücre kültürleme protokollerini takip etti. SH-SY5Y için hücre hatları DMEM veya DMEM/F12 olarak tutuldu, %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 penisilin/streptomisin takviyesi ile 37 °C ve %5 CO2 ile desteklendi. Bazı görüntüleme sistemleri medya bileşimine duyarlıdır. Mikroskop ortamda fenol kırmızısı sinyali algılarsa, fenol kırmızısı olmayan alternatifler kullanın. Ayrıca, mikroskopCO2 odası ile donatılmış değilse, ortamı HEPES (pH 7.4) içeren bir ortamla değiştirin.
    1. Deneyden bir gün önce, hücreleri cam tabanlı görüntüleme plakasına ayırarak ertesi gün %30-70 birleşim elde edin.
      NOT: Bu protokolde 4 kuyruklu 35 mm plakalar kullanılmıştır.
      1. (Kritik) Deney için aç veya stresli hücreleri ayırmak için kullanmayın. Hücre hatlarının düzenli olarak (en az 2-3 günde bir) taze medya değişimi olduğundan ve %90 birleşime ulaşmadan önce ayrıldığından emin olun. Amaç, düzgün bir boyama sağlamak için sağlıklı bir hücre hattı sağlamaktır.
        NOT: Bazı hücreler, örneğin kök hücreler, boyamaya müdahale etmeyen uygun bir kaplama katmanı olan Matrigel gibi cam kaplama gerektirir.
  2. Görüntüleme kurulumunun hazırlanması (süre: 1 saat)
    NOT: Organellerin ve organel dinamiğinin görüntülenmesi yüksek mekansal çözünürlük gerektirir. Bu protokol için, GaAsP fotoçoğaltıcı modülü, CO2 odası ve sıcaklık kontrol ünitesi ile donatılmış konfokal mikroskop kullanıldı. Görüntüleme, CFI Plan Apo Lambda 60x yağ NA 1.42 objektif ile çift yönlü galvanometre tarama modunda gerçekleştirildi ve 555 probu için 561 nm (50 mW) lazer kullanıldı. 650 prob için 640 nm lazer veya eşdeğeri kullanın. Peroksizomlar insan hücre hatlarında görselleştirildi. Problarla kuluçka süresi farklı hücre hatları için değişiklik gösterebilir. Boyamadan sonra hücrelerin farklı zaman noktalarında görselleştirilmesi için zamanlamanın optimize edilmesi önerilir (Şekil 2A).
    1. Konfokal sistemi başlatın. Boyamaya başlamadan ve hücreleri mikroskopa sokmadan önceCO2 ve sıcaklığın (37 °C) 20 dakika boyunca stabil olduğundan emin olun.
      NOT: (Kritik) Deney boyunca hücrelerin sağlıklı kaldığını görsel incelemeyle doğrulamak ve ortamın pH ile sıcaklığının korunduğunu doğrulamak önemlidir. Bu, parametreler için kontrol üniteleri kullanılarak ve fenol kırmızısı kullanılırsa ortam rengini görsel olarak inceleyerek sağlanabilir. Bunun için sıcaklık veCO2 kontrolörleri kullanılabilir.
    2. Konfokal mikroskop yazılımını kurun. Yazılımı başlatın ve 555 prob boyama için 561 nm lazeri açın. Kazanım ve lazer gücü parametrelerini ayarlayın. Bu protokol, hücreleri görüntülemek için %1 lazer gücü, 100 HV (kazanç) ve 1024 1024 piksel çözünürlük ile 3 zoom ile görüntü kullanır.
  3. Peroksizom boyama (Süre: 1-5 dakika)
    1. Sondanın bir aliquotu için son çalışma konsantrasyonu 1 μM, örneğin 0,5 mL ortam için, probun 0,5 μL pipeti için pipet yapın.
    2. Lekelemek için kuyuyu seçin ve dışarısını kalem kalemiyle etiketleyin.
    3. Seçilen kuyuyun, tüm (0.5 mL) madde pipetlenir ve 1.3.1. adımdan prob aliquot'u içeren mikrosantrifüj tüpüne dağıtılır.
      NOT: Bu adımda kuyunun üzerindeki tüm ortamların temizlenmesi ve düzgün bir lekelenme sağlanması kritik öneme sahiptir.
    4. Medya ve probu karıştırmak için 3 kez yukarı aşağı pipet yapın. Toplam karışımı pipete aspire edin.
      NOT: Pipetleme yerine vortexleme ile karıştırma kullanılabilir.
    5. Karışımı damla damla seçilen kuyuya geri dağıtarak pipetin kuyunun duvarına temas ettiğinden emin olun. Karışımı tekrar kuyuya ekledikten sonra 10 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın.
    6. Kapağı kapatın, objektîfe bir damla daldırma yağı ekleyin (bu protokol 60× yağ objektif kullanır) ve plakayı görüntüleme için mikroskopa yerleştirin.
      NOT: Her hücre hattı için probun konsantrasyonunun optimize edilmesi, eşit bir boyama sağlamak için önerilir. 0.25, 0.5, 1 ve 2 μM'de 5-20 dakika boyunca test edilmesi önerilir; düşük konsantrasyonlar genellikle daha düşük arka planla boyanır (Şekil 2A). Hücre hattı ve mikroskop dedektörü hassasiyetine bağlı olarak, boyalı hücreler prob eklendikten 5 dakika sonra en kısa süreden eklendikten 24 saat sonraya kadar görüntülenebilir. Bazı durumlarda, örneğin kök hücrelerin görüntülemesinde, prob eklendikten sonra sinyalde değişiklik olmadan hücrelerin görselleştirilmesi 180 dakikadan fazla yapılabilir. Her an medya, probu tamamen yok etmek için değiştirilebilir. Bu, HEK293T hücre için yaklaşık 30 dakika içinde boyamanın kademeli kaybına yol açar.
  4. Canlı hücrelerde peroksizomların konfokal görüntülemesi (süre: 10 dakika-3 saat)
    1. Plaka mikroskopa yerleştirildikten sonra, lekeli hücrelere odaklanın ve görüntülemeye başlayın.
    2. Hücreler odaklandıktan sonra, kazanç (HV veya dedektör hassasiyeti) ve lazer güç ayarlarını standart konfokal mikroskop kurulum kılavuzlarıyla ayarlayın.
    3. Hücre grubunu bulup konumlandırın (Yakınlaştırma). Hücrelere odaklandıktan sonra, alınım parametrelerini gerekli görüntü kalitesine göre ayarlayın.
      1. Görüntü alımı için görüntüleme parametrelerini ayarlayın: %0,5-1 lazer gücü, 100 HV (kazanç) NIS-Elements Yazılımı'nda. Görüntünün aşırı doygun olmadığından emin olun (eğer öyleyse, yoğunluk ve kazancı değiştirin).
      2. Tarama boyutunu seçin. Yapılan görüntülemeye uygun 1024 adet 1024 piksel görüntü, tarama hızı (1/2-1/4), çizgi ortalaması (2), yakınlaştırma (3) alın.
        NOT: Peroksizomlar görüntü alımı sırasında hareket eder, bu da artefaktlara yol açabilir. Önerilen parametreler, hareket izlerini en aza indirmek ve görüntünün yeterli kalitesini sağlamak için optimize edilmiştir. Zaman geçişi oluştururken, videoyu başlatmadan önce aralık, süre ve döngülerin belirtildiğinden emin olun. Problar fotostabil.
    4. Tüm görselleri erişilebilir etiketlerle edinin ve kaydedin (burada, .nd2 NIS-Elements Nikon Software formatı kullanılır).

2. Sabit hücrelerin boyama

  1. Canlı hücre görüntüleme için hücre kültürü hazırlığı (süre: 24 saat)
    NOT: Tüm deneyler için standart hücre kültürleme protokolleri uygulandı. Huh7 hücreleri, %10 FBS, %1 penisillin/streptomisin takviyesi ile DMEM/F12'de 37 °C ve %5 CO2 ile desteklenmiştir.
    1. Deneyden bir gün önce, hücreleri örtülü bir plakaya ayırarak ertesi gün %30-70 birleşim elde edin.
      NOT: 18 mm örtülü 12 kuyu plakalarında 50.000 hücre/kuyu tohumu veya 13 mm örtü slipli 24 kuyu plakalarında 15.000 hücre/kuyu tohumu ekin.
  2. Peroksizom boyama (Süre: 1-5 dakika)
    1. Probu yeni ortamla son çalışma konsantrasyonuna kadar 4 μM sonlandırın; boş, ışığa duyarlı mikrosantrifüj tüpünde, örneğin 0,5 mL ortam için, probun 2 μL pipeti (stok çözeltisi: 1 mM).
    2. Lekelemek için kuyuyu seçin ve dışarısını kalem kalemiyle etiketleyin.
    3. Seçilen kuyuyun, tüm (0.5 mL) ortamı aspire edin ve 2.2.1. adımdan itibaren prob ortamı ile değiştirin. Prob ortamını seçilen kuyuya damla damla dağıtın, böylece pipetin kuyu duvarıyla temas ettiğinden emin olun.
    4. Karışımı tekrar kuyuya ekledikten sonra, hücreleri 37 °C'de 10-15 dakika kuluçka altına alın.
      NOT: Bu andan itibaren hücreler ışığa duyarlıdır ve alüminyum folyo ile kaplanması gerekir.
  3. Sabit hücrelerde boyama sonrası fiksasyon ve peroksizomların görüntülemesi
    1. Boyandıktan sonra ortamı dikkatlice çıkarın ve hücreleri fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) ile iki kez yıkayın.
    2. Oda sıcaklığında PBS'de %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi 20 dakika uygulayın.
    3. PFA'yı dikkatlice özel olarak belirlenmiş bir atık konteynerine çıkarın. Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.
      DIKKAT: PFA toksiktir ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak bertaraf edilmelidir.
    4. İmmünoflüoresansla devam etmek için aşağıdaki adımları izleyin
      1. Hücreleri geçirimlileştirmek için %0,5 Triton-X (PBS ile seyreltilmiş) ekleyin. 2,5 dakika bırakın.
      2. Triton-X'i dikkatlice çıkarın. Hücreleri iki kez, 10 dakika boyunca PBS ile yıkayın.
      3. Oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 °C'de PBS'de %5 sığır serum albümini (BSA) çözeltisiyle bloklayın.
      4. Standart immünofloresan prosedürüne devam edin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PeroxiSPY probları, peroksizomların doğal substratlarını - dallanmış ve çok uzun zincirli yağ asitlerini taklit edecekşekilde tasarlanmıştır 5. Bu nedenle, boyama, sitoplazmadan peroksizomlara adenozin trifosfat (ATP) Bağlayıcı Kaset Alt Ailesi D (ABCD) bağlı ithalata yol açar. Hücre metabolik durumuna bağlı olarak, ATP'ye bağlı ABCD taşıması probları verimli ve hızlı ithal edebilir; bu da floresan yoğunluğunda yüksek bir peroksizom-sitoplazma oranına yol açar (Şekil 1A). Yüksek oranı sağlamak için kritik adımlar, hücre ortamını düzenli olarak değiştirerek hücrelerin aç kalmasını önlemek ve yüksek birleşimde hücreler büyümemesini önlemeyi içerir.

Peroksisom boyamanın özgüllüğünü doğrulamak için birkaç kontrol sistemi eklenmesi önerilir (Şekil 1B,C). Referans peroksisomal belirteç ile birlikte lokalizasyon analizi, örneğin protein ithalat belirteci - GFP-SKL (Şekil 1B,C). Ayrıca, peroksisom eksikliği olan hücre hatları mevcutsa, örneğin PEX19 KO, bu hücrelerde boyama yoktur (Şekil 1B)5,8.

Peroksisom probları, peroksisom yoğunluğunu ölçmek için kullanılabilir (Şekil 1C)5,9 ve substrat ithalatı, peroksisom dinamikleri ve etkileşimleri değerlendirmek için geliştirilmektedir. Kantitatif görüntüleme için, boyama prosedürünün, görüntü alımının zamanlamasının (örneğin, boyamadan 10-20 dakika sonra), hücre hattı hazırlığının ve alınım parametrelerinin standartlaştırılması önemlidir. Bazı hücre hatları, peroksizomların sitozolik arka plana göre sinyal yoğunluğunu artırmak için prob konsantrasyonunun ve zamanlamanın optimize edilmesini gerektirir; örneğin, COS-7 hücreleri için 250 nM ve 20 dakika daha iyi çalışır (Şekil 2A). Hücreler probları metabolize eder ve bu da zamanla peroksizom boyalanmasının kademeli azalmasına yol açar; ancak peroksizomun sitoplazmaya oranı 24 saat içinde iyileşebilir (Şekil 2B). Ayrıca, antikorlarla birlikte boyama yapılmasına ve peroksizomların daha sonra görselleştirilmesine olanak tanıyan bir fiksasyon prosedürü geliştirdik (Şekil 2C,D).

figure-results-1
Şekil 1: Peroksisomların canlı hücre görüntülemesi. (A) Boyama şeması. (B) GFP-SKL'yi aşırı eksprese eden ve kırmızı peroksisom probuyla boyanmış WT ve PEX19 KO hücrelerinin konfokal mikroskopisi HEK293T (1 μM, 10 dakika). Ölçek çubukları - 1 μm ve 10 μm. Temsil eden yoğunluk profili gösterilmiştir. (C) GFP-SKL'yi aşırı eksprese eden ve PeroxiSPY ile boyanmış insan fibroblastlarının konfokal mikroskopisi (10 dakika boyunca 1 μM). Ölçek çubukları - 1 μm ve 10 μm. Temsil eden yoğunluk profili gösterilmiştir. (D) SW13 (Adrenal Korteks), SH-SY5Y (Nöroblastlar), CCL-136 (Miyositler), HaCat (Keratinositler), U2OS (Osteoblastlar) ve HEK293T (İnsan Embriyonik Böbrek) hücrelerinin konfokal mikroskopisi kırmızı peroksisom probuyla boyanmış (1 μM, 10 dakika). Ölçek çubukları - 2 μm ve 10 μm. Nicel hesaplama, daha önceaçıklandığı gibi Fiji kullanılarak yapılmıştır 9 ve mikron kare başına peroksizom sayısını, ortalama ± SEM, N = 100 hücrenin 3 biyolojik tekrardan toplandığını, *** - p < 0.001, **** - p < 0.0001, Kruskal-Wallis Testi'ni gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Sabit hücrelerin peroksizom görüntüleme optimizasyonu ve boyaması. (A) COS-7 (Afrika yeşil maymun böbreği) hücrelerinin konfokal mikroskopisi, protokole göre kırmızı peroksisom probuyla boyanmış (1 μM; optimizasyondan önce 10 dakika) ve optimize edilmiş koşullarda (20 dakika 250 nM; optimizasyondan sonra). Ölçek çubuğu - 10 μm. Peroksizom ve sitozolun ortalama piksel yoğunluğu Fiji kullanılarak nicelendirildi ve oran olarak ifade edildi. N = 7 hücre (optimizasyondan önce) ve 21 hücre (optimizasyondan sonra). Ortalama ± SEM, *** - p < 0.001, **** - p < 0.0001, Shapiro-Wilks testi. (B) Kırmızı peroksisom probu (1 μM) ile boyanmış HEK293T hücrelerin konfokal mikroskopisi, 15 dakika ve 24 saat boyunca. Nicel hesaplama, peroksizomların ve sitoplazmanın floresans yoğunluğunu ve peroksizomun sitoplazmaya oranını, ortalama SEM ± ortalamasını gösterir, 3 biyolojik tekrardan toplanan N = 680 peroksizom, **** - p < 0.0001, Shapiro-Wilks testi. (C) Fiksasyon protokolü kullanılarak peroksizom problarıyla boyanmış Huh7 hücrelerinin konfokal mikroskopisi. Peroksizomlar, anti-PEX14 birincil antikor (bloke çözeltisinde 1:100, RT'de 1 saat kuluçka) ve ikincil antikor (bloklama çözeltisinde 1:1000, keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488, RT'de 1 saat kuluçka) ile birlikte boyandı. Temsilci konfokal görüntüler gösterilir. Ölçek çubukları - 10 μm. (D) Nicel belirleme, protokolle göre fiksasyon ve permeabilizasyon sırasında yapılan peroksisom floresans yoğunluğundaki HEK293T değişiklikleri gösterir; protokole göre ortalama ± SEM, N = 100 hücre üç biyolojik tekrardan toplanmış, **** - p < 0.0001, Shapiro-Wilks testi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu basit peroksizom tespiti hayvan hücrelerinde 10 dakikadan kısa sürede gerçekleştirilebilir. PeroxiSPY boyama, canlı hücrelerde peroksizomların görselleştirilmesi, nicelenmesi ve izlenmesine olanak tanır ve kırmızı (Materyal Tablosu) ile uzak kırmızıprob 5 (Materyal Tablosu) olarak mevcuttur. Boyama, aşırı ifade gerektirmeden klasik peroksisom hedefleme sinyali (PTS1)l tabanlıboyama 10'a (Şekil 1B) benzer bir peroksizom görselleştirmesi sağlar. Floroforlar fotostabildir ve farklı deneysel koşullarda süper çözünürlüklü görüntüleme ve peroksisom dinamiklerinin uzun vadeli edinimi içinkullanılabilir 5,9,11. Ayrıca, problar peroksisom işlevine karşı hassastır; Bu nedenle, araştırma ve tanı uygulamaları için peroksisompatolojisi 5'i tespit etmek ve nicelendirmek için kullanılabilirler. Peroksisom boyama, peroksisom metabolizmasına ve peroksizomların yağ asitlerini ithal edip oksitleme kapasitesine bağlıdır. Bu nedenle, kullanılan hücre hatlarının konsantrasyonunu ve zamanlamasını optimize etmek önemlidir. Burada, test ettiğimiz hücre hatları için işe yarayan standart bir prosedür sunuyoruz; ancak boyama zamanlaması, peroksizom-sitoplazma floresan yoğunluk oranı kaybı olmadan 24 saate kadar uzatılabilir (Şekil 2B).

Problar, birçok memeli hücre hattında (Şekil 1 ve Şekil 2) ve Zebrafish Danio rerio hücreleri ileembriyolar 5'te test edildi; peroksizomlara özgüllük ve kullanım kolaylığı gösterdi. Bu problar diğer hayvan hücre hatlarında test edilmedi ve koşullar ile prob konsantrasyonları bunlar için optimize edilmelidir. Problar, bitki Arabidopsis thaliana hücrelerindeki peroksizomları boyamaz.

Bazı sorunlar ve bunların sorun giderme çözümleri burada tartışılır. Peroksizom-sitoplazma oranı çok düşükse (düşük peroksizom boyama), hücrelerin taze bölündüğünden emin olun ve boyama için tekrar bölünün. Boyama için %30-70 birleşme kullanın. Probun konsantrasyonunu optimize edin (çok yüksek konsantrasyon, probları alma peroksizomun kapasitesinin aşılmasına yol açar) ve zamanlamayı optimize edin (örneğin, Şekil 2A'ya bakınız). 35 mm cam tabanlı bir çanak kullanın (96 kuyu tabaklarda boyanlamak, az hacimli karışım nedeniyle daha zordur). Probların mikrosantrifüj tüpüne eklendiğinden ve hücrelere eklenmeden önce medyayla iyice karıştırıldığından emin olun. Farklı hücre hatları ve farklı koşullar boyama üzerinde etkili olur. Son olarak, probu yıkamak arka planı azaltır; ancak sinyal yavaş yavaş kaybolur ve görüntülemenin etkili şekilde yapılabileceği süreyi azaltır.

Görünür peroksisom yoksa, probun medya ile karıştığından emin olun. Probun konsantrasyonunu artırın (örneğin, 2 μM'e). Peroksizomların görselleştirilebilmesini sağlamak için ek bir peroksizomal işaretleyici ekleyin. Eğer boyamada hücreden hücreye farklılık varsa, tüm ortamı çıkarıp aliquot ile iyice karıştırmak önemlidir ve sonra hücrelere tekrar eklenir. Bu, tekiz bir boyalanma sağlar. Eğer hala varyasyon varsa, hücre popülasyonunun peroksisom substrat ithalat kapasitesi açısından heterojen olması mümkündür. Hücrelerin düzenli bölünmesiyle senkronize edilmesi, eşit boyamaya yardımcı olur. Sinyal tespit edilmezse, mikroskoplardaki lazer ayarlarının prob uyarılma/emisyon parametreleriyle uyumlu olup olmadığını kontrol edin. Hücrenin dışındaki arka plan çok parlaksa, probları yıkayarak bu arka planı çıkarabilirsiniz; ancak sinyal kademeli olarak kaybolur ve görüntülemenin etkili şekilde yapılabileceği zaman penceresi kısaldır. Ayrıca, arka planı azaltmak için fiksasyon kullanılabilir. Sinyal sabitleme sonrası çok zayıfsa, Triton-X 100 eklemesinden sonra sinyalin kaybolup olmadığını kontrol edin. Bu adım, sonraki uygulamaya bağlı olarak değiştirilebilir veya kaldırılabilir. Yıkama adımlarını azaltın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LR, Spirochrome AG'nin hisselerine sahiptir. Diğer tüm yazarların açıklamak için hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojik Bilimler Okulu Görüntüleme ve Mikroskopi Merkezi'ne (IMC) temel ekipmanlara erişim sağladığı için teşekkür ederiz. TA, HFSP Uzun Vadeli Bursu (LT000559/2021-L), Southampton Üniversitesi, Wessex Tıbbi Araştırma İnovasyon Büresi ve Avrupa Lökodistrofi Derneği (ELA) tarafından finanse edilmiştir. Yüksek Lisans, EPFL Yaşam Bilimleri Okulu'nun ELISIR programı, Foundation Bryn Turner-Samuels ve Fondation Bios pour la recherche tarafından desteklenmektedir. CH, Royal Microscopical Society yaz öğrencisi tarafından finanse edilmiştir. REC, Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi Keşif Bursu (BB/Z514767/1) tarafından desteklenmektedir. MSvA, Biyokimya Derneği Yaz Tatili Öğrenci Okulu tarafından desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
anti-PEX14 antikorProteintech10594-1-AP
Konfokal MikroskopNikonA1rYüksek NA hedefli herhangi bir konfokal mikroskop, örneğin 60x yağ NA1.4
DMEMPan Biotech  P04-03590Hücre kültürü ortamı
Cam tabanlı görüntüleme plakalarıCellvisD35C4-20-1.5-N
Keçi karşıtı Tavşan Alexa Fluor 488 ABCAMAB150081
HEK293TATCCCRL-3216 
PeroxiSPY555Spirokromhttps://spirochrome.com/product/peroxi_spy555/  https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2
PeroxisPY650Spirokromhttps://spirochrome.com/product/peroxi_spy650/  https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kassmann, C. M. Myelin peroxisomes - essential organelles for the maintenance of white matter in the nervous system. Biochimie. 98, 111-118 (2014).
  2. van den Bosch, H., Schutgens, R. B., Wanders, R. J., Tager, J. M. Biochemistry of peroxisomes. Annu Rev Biochem. 61, 157-197 (1992).
  3. Aubourg, P., Wanders, R. Peroxisomal disorders. Handb Clin Neurol. 113, 1593-1609 (2013).
  4. Honsho, M., Okumoto, K., Tamura, S., Fujiki, Y. Peroxisome biogenesis disorders. Adv Exp Med Biol. 1299, 45-54 (2020).
  5. Korotkova, D., et al. Fluorescent fatty acid conjugates for live cell imaging of peroxisomes. Nat Commun. 15, 4314(2024).
  6. Bezman, L., Moser, H. W. Incidence of X-linked adrenoleukodystrophy and the relative frequency of its phenotypes. Am J Med Genet. 76 (5), 415-419 (1998).
  7. Visser, W. F., van Roermund, C. W., Ijlst, L., Waterham, H. R., Wanders, R. J. Metabolite transport across the peroxisomal membrane. Biochem J. 401 (2), 365-375 (2007).
  8. Matsuzono, Y., et al. Human PEX19: cDNA cloning by functional complementation, mutation analysis in a patient with Zellweger syndrome, and potential role in peroxisomal membrane assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2116-2121 (1999).
  9. Borisyuk, A., Howman, C., Pattabiraman, S., Kaganovich, D., Amen, T. Protein Kinase C promotes peroxisome biogenesis and peroxisome-endoplasmic reticulum interaction. J Cell Biol. 224 (9), e202505040(2025).
  10. Gould, S. G., Keller, G. A., Subramani, S. Identification of a peroxisomal targeting signal at the carboxy terminus of firefly luciferase. J Cell Biol. 105 (6 Pt 2), 2923-2931 (1987).
  11. Lukinavicius, G., et al. A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins. Nat Chem. 5 (2), 132-139 (2013).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Perokzisom ProblarCanl H cre G r nt lemePerokzisom Dinami iFloresan ProblarPerokzisom Disfonksiyonumm nofloresan BoyamaPerokzisom KantifikasyonuFikslenmi H cre Boyama

İlgili makaleler