Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tümörle İlgili Makrofajların In Vitro Modellemesi: Salgılanan Faktörlerin Tümör Mikro Ortam Dinamiklerinde Rolü

446 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69406

⸱

30 Aralık 2025

 ,  ,  , 
1Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET, Academia Nacional de Medicina

Bu makalede

Özet

Bu makale, insan monositlerini tümör hücre hatlarından koşullu ortama maruz bırakarak tümörle ilişkili makrofaj benzeri hücreler üretmek için in vitro bir protokol sunmaktadır.

Özet

Makrofajlar dikkat çekici bir plastisite sergiler; bu da çeşitli çevresel ipuçlarına yanıt olarak belirgin fonksiyonel durumlar kazanmalarını sağlar. Katı tümörlerde, genellikle tümör mikroçevresinde en bol bulunan bağışıklık hücresi popülasyonunu oluştururlar ve burada tümörle ilişkili makrofajlar (TAM) olarak adlandırılırlar. TAM'lar kötü hutlu hücrelerle yakın etkileşime girerek tümör ilerlemesini, anjiyogenezi ve bağışıklık kaçışını aktif olarak teşvik eder. Tümör hücreleri, makrofajları doğrudan hücre-hücre teması ve çok çeşitli salgılanan faktörler aracılığıyla yeniden programlayabilir, bu da onların polarizasyonunu pro-tümör fenotiplerine doğru şekillendirir. Bu TAM polarizasyon mekanizmalarını in vitro incelemek için, insan monositlerini tümör hücre hattı ile koşullandırılmış ortamda bulunan çözünür faktörlere maruz bırakan bir yöntem öneriyoruz. Bu protokol, kontrollü koşullar altında TAM benzeri makrofajların üretilmesini sağlar ve tümörden türetilen sinyaller tarafından indüklenen fenotipik ve fonksiyonel değişikliklerin analizini kolaylaştırır. Yaklaşımımız, tümör-makrofaj etkileşimlerini araştırmak için tekrarlanabilir ve fizyolojik olarak ilgili bir model sunar, makrofaj yeniden programlama anlayışımızı derinleştirir ve kanser immünolojisi ile immünoterapide yeni terapötik stratejiler üzerine araştırmaları destekler.

Giriş

Makrofajlar, çevresel ipuçlarına yanıt olarak çeşitli fenotipler benimsemelerini sağlayan olağanüstü plastikliklere sahip çok fonksiyonlu doğuştan bağışıklıkhücreleridir 1. Katı tümörlerde makrofajlar genellikle en bol bulunan bağışıklık hücresi popülasyonu olur ve tümörle ilişkili makrofajlara (TAM) ayrılır. Bu hücreler, tümör mikroçevresi tarafından tümör büyümesini desteklemek, anjiyogenezi teşvik etmek, metastazı kolaylaştırmak ve etkili antitümör bağışıklık yanıtlarını bastırmak için aktif olarak yeniden programlanır. Tümör hücreleri, bu polarizasyonu hem doğrudan hücre-hücre etkileşimleri hem de makrofajların transkripsiyon ve fonksiyonel programlarını yeniden şekillendiren sitokinler, kemokinler ve büyüme faktörleri dahil olmak üzere salgılanan faktörlerin karmaşık repertuarı yoluylayönlendirir 3. Bu dinamik etkileşim, TAM'ların kanser biyolojisindeki merkezi rolünü destekler ve makrofaj plastisitesini hem terapötik müdahale için bir zorluk hem de bir fırsat olarakvurgular. 2.

TAM'ların klinik önemi giderek daha fazla kabul edilmektedir: tümörlerdeki bollukları genellikle kötü prognoz ve tedavilere dirençle ilişkilidir 4,5. Sonuç olarak,TAMs 6 cazip terapötik hedefler olarak ortaya çıkmıştır. Onların işe alınmasını engellemeye, hayatta kalmalarını engellemeye veya onları inflamatuar ve tümöröldürsel fenotiplere yeniden programlamaya yönelik stratejiler şu andaaraştırılmaktadır 6. Tümörden kaynaklanan faktörlerin makrofajları TAM'lara nasıl polarize ettiğini anlamak, etkili immünoterapilerin geliştirilmesi için gereklidir. Bağışıklık kontrol noktası blokajı birçok kanserde büyük başarı göstermiş olsa da, diğerlerinde etkinliğisınırlıdır 7. Anti-Programlanmış Hücre Ölümü Proteini 1 (PD-1) veya Anti-Programlanmış Hücre Ölümü Ligand 1 (PDL-1) antikorları gibi T hücre hedefli tedavilerin makrofaj yeniden programlama stratejileriyle birleştirilmesi, genel antitümör bağışıklık yanıtını güçlendirebilir.

TAM biyolojisini incelemek için geleneksel deneysel modeller, karmaşık ve fizyolojik olarak ilgili bir ortam sunan in vivo fare kanseri modelleriniiçermiştir 8. Bu modeller, TAM işe alımı ve işlevi hakkında temel içgörüler sağlamıştır. Ancak, bağışıklık sinyalleri, tümör biyolojisi ve makrofaj ontogenezisindeki önemli türler arası farklılıklar, doğrudan insan hastalığına geçişisınırlayabilir 9,10. Ayrıca, in vivo sistemlerin karmaşıklığı, makrofaj polarizasyonunu tetikleyen belirli sinyal yollarını veya moleküler olayları izole etmeyi ve incelemeyi zorlaştırır.

Buna karşılık, in vitro modeller bu mekanizmaları disseksiye etmek için daha basit ve kontrollü koşullar sunar. En yaygın kullanılan yaklaşım, insan monositlerinden türetilen makrofajları tanımlanmış uyaranlar ile polarize etmektir: İnferon gamma (IFN) ve bakteriyel lipopolisakkarit (LPS) pro-inflamatuar makrofajlar (M1), veya Interleukin 4 (IL-4) ve interlökin 10 (IL-10) veya deksametazon ile çeşitli anti-inflamatuar makrofaj (M2) alttipleri 11,12,13,14 elde etmek için . Bu modeller, kanonik makrofaj polarizasyon durumlarıyla ilişkili moleküler belirteçleri ve transkripsiyon programlarını tanımlamaya yardımcı olmuştur. Buna rağmen, makrofajların tümörlerde karşılaştığı karmaşık, çok faktörlü ortamı taklit edemezler; burada polarizasyon, çok sayıda çözünür aracının, metabolik sinyallerin ve hücre-hücre etkileşimlerinin eşzamanlı etkisiyle sonuçlanır15,16. Klasik M1/M2 sınıflandırması makrofaj fonksiyonel durumlarını tanımlamak için faydalı olsa da, artık daha önce düşünülenden çok daha fazla makrofaj popülasyonunun mevcut olduğu açıktır. Dr. Ginhoux'un grubu ve diğerlerinin tek hücreli transkriptomik yaklaşımları kullandığı çalışmalar, hem fizyolojik koşullarda hem de hastalık 17,18'de bulunan makrofaj alt kümelerinin geniş çeşitliliğini göstermiştir. Bu durum, TAM'ların genellikle M2 benzeri profillere benzediği tanımlansa da, yalnızca kanonik sitokinlerle ayırt edilen makrofajlarla tam olarak eşdeğer olmadığını vurgular; aksine, belirli özellikleri paylaşırlar ancak aynı zamanda belirgin ve bağlama bağlı farklılıklar da gösterirler.

Bu boşluğu kapatmak için, insan monositlerinden türetilen makrofajları tümör hücre hatlarından toplanan koşullu ortama maruz bırakarak TAM benzeri polarizasyonu modelleyen in vitro bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, kanser hücreleri tarafından salgılanan sitokinler, kemokinler ve büyüme faktörlerinin zengin bir karışımı olan tümör sekretomunun etkisini yakalar. Böylece, makrofajların tümör kaynaklı çözünür faktörlere yanıt olarak fenotipik ve transkripsiyonel yeniden programlanmasını araştırmak için ilgili ve deneysel olarak erişilebilir bir sistem sunar. Monositlerin doğrudan tümör ile koşullandırılmış ortama maruz kaldığı önceki yaklaşımların aksine, bu protokol özellikle makrofajların yeniden programlanmasına odaklanır ve böylece tümör mikroçevresinde yerleşik makrofaj davranışını daha iyiyansıtır 19,20. Ayrıca, makrofaj polarizasyonunu akış sitometrisiyle değerlendirmek için optimize edilmiş ve basit bir yüzey işaretleyici paneli içerir; bu uygulama kolayca uygulanabilir ve araştırmacının ihtiyaçlarına göre genişletilebilir14,21. Son olarak, M-CSF'nin monositleri M2 benzerifenotip 10,15,22,23,24'e doğru hazırlaydığı gösterildiğinden, gözlemlenen makrofaj polarizasyonunun özellikle tümör hücre hattı kaynaklı koşullu ortama maruz kalmasından kaynaklanmasını sağlamak için kasıtlı olarak çıkarıldı.

Bu yaklaşımın birkaç güçlü yönü vardır: in vitro sistemlerin tekrarlanabilirliğini ve sadeliğini korur, birincil insan hücrelerini daha fazla translasyonel önem için kullanır ve tümör mikroçevresinin heterojen, çok faktörlü doğasını tek sitokin modellerinden daha iyiyansıtır 25,26,27,28. Ayrıca, farklı tümör tiplerinden veya genetik olarak değiştirilmiş kanser hücrelerinden koşullu ortamlara makrofaj yanıtlarının karşılaştırmalı çalışmalarını kolaylaştırır ve TAM polarizasyonunu değiştirebilecek farmakolojik ajanları test etmek için bir platform görevi görür. Genel uygulanabilirliğinin ötesinde, bu yöntem uygun hücre hatları seçilerek veya koşullu ortamların oranını ayarlayarak farklı tümör modellerine uyarlanabilir. Buna rağmen, kullanıcılar sağlıklı bağışçılar ve tümör hücre hatları arasındaki değişkenliğin tekrarlanabilirliği etkileyebileceğinin farkında olmalıdır; bu da dikkatli deneysel tasarım ve standartlaştırmanın önemini vurgulamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak sağlıklı bağışçılardan çevresel kan örnekleri alındı. Bu protokol, Buenos Aires Üniversitesi Kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve reaktiflerle ilgili detaylar için Materyaller Tablosu'na bakınız.

NOT: Tüm protokol boyunca steril koşulları koruyun, bir Biosafety seviye 2 (BSL-2) dolabında çalışın ve hücre >%90 yaşatılabilirliğinden emin olun. Bertaraf için, tüm biyolojik atıklar önce en az 30 dakika boyunca %10 sodyum hipoklorit çözeltisinde bekletilerek dezinfekte edilmeli ve ardından uygun biyolojik tehlike bertaraf konteynerine konmalıdır.

1. Tümör hücre hattı kültürü ve koşullu ortam preparatı

  1. MDA-MB-231 üçlü negatif insan meme kanseri (veya diğer seçilmiş tümör) hücre hattını sıvı azot depolamasından eritiler. Hücre hatlarını içeren kriyotüpleri hemen 37 °C su banyosuna daldırın ve şişeleri nazikçe çevirerek hızlı ve eşit bir şekilde çözülmesini sağlayın. Şişeyi çoğunlukla çözüldüğünde hemen çıkarın.
  2. Çözülen hücreleri, 5 mL steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) içeren 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonunu 400 × g sıcaklığında oda sıcaklığında (RT) 5 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Hücre canlılığını korumak için eritme süreci hızlı yapılmalıdır.
  3. Süpernatantı dikkatlice atın ve hücre pelletini 1 mL taze, tam Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile hızla yeniden süzülün; bu madde yüksek glikoz (4,5 g/L), %10 fetal sığır serumu (FBS), 4 mM Glutamin ve 1 mM sodyum piruvatla yeniden süzülür. Yeniden askıya alınmış pelletteki hücreleri sayarak aşağıdaki iki aşamalı seri seyreltme uygulanır:
    1. Önce steril DMEM ortamında 1:5 hücre süspansiyon seyreltmesi hazırlanır, ardından (1:2) Trypan Blue canlılık boyamasıyla nihai 1:10 seyreltme elde edilir.
    2. Neubauer hemositometresindeki (veya sayma odasındaki canlı hücreleri) saymak için ışık mikroskobu kullanın. Canlı hücreleri sayın (sadece mavi boyayı hariç tutan hücreler) ve büyük köşe kare başına ortalama canlı hücre sayısını belirleyin.
    3. Son konsantrasyonu aşağıdaki formülle hesaplayın: Hücreler/mL = (Kare başına ortalama hücreler) x (Sulandırma Faktörü) x 10.000.
      NOT: Hücreleri istenen tam bir DMEM ortamında yeniden süzülerek nihai konsantrasyon 1x 105hücre/mL elde edin.
  4. 2.5 x 105 ila 5.0 x 105 hücre tohumu 5 mL tam DMEM ortamı içeren bir T25 kültür şişesine tohumlayın. Kültürü, hasat için gerekli hücre yoğunluğuna ulaşılana kadar %5CO2 içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C'de tutulun.
  5. Tohumlamadan sonraki gün hücre tutumunu mikroskop altında kontrol edin. Eğer hücrelerin %50'sinden fazlası yüzüyorsa (hücre ölümünü gösteriyor), eski ortamı nazikçe aspire edin ve yerine 2,5 mL taze, önceden ısıtılmış ortam ekleyin.
  6. Hücre büyümesini günlük olarak izleyin. Kültür yaklaşık %90 birleşime ulaştığında (T25 şişesinde tahmini 2,3 x 106 hücre), genellikle 5 gün içinde hücreler alt kültüre (bölünmeye) hazır olur. Hücreleri 1:8 oranında bölmek için şu adımları izleyin:
    1. Kullanılmış ortamı steril bir Pasteur pipeti ile çıkarın.
    2. Hücre monokatmanını bir kez 3 mL steril 1x PBS ile durulayın, böylece tripsin inhibe edilen kalıntı serum alın. 1x PBS aspirasyon ve at.
    3. Hücrelere 1 mL %0,25 Tripsin-1 mM Etilenediamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi eklenin ve 37 °C, %5 CO2 sıcaklığında nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 3 dakika boyunca inkübe yapın, böylece hücreler ayrılır.
      NOT: Tripsin/EDTA ile optimal kuluçka süresi, belirli hücre hattına bağlıdır ve ayarlanması gerekebilir. Hücrelerin tamamen ayrıldığından emin olmak için 3 dakika sonra mikroskop altında kontrol edilsin.
    4. Enzimatik aktiviteyi 3 mL tam DMEM ortamı ekleyerek nötralize edin. Hemen ardından hücreleri tamamen ayırmak ve asmak için nazikçe yukarı ve aşağı pipet yapın.
  7. Hücre süspansiyonunun 3,5 mL'sini 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve RT'de 400 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  8. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini 1 mL dondurucu ortamda (%90 FBS ve %10 dimetil sülfoksit (DMSO) içermelidir) tekrar askıya alın. Hücre süspansiyonunu kriyoviallere aktarın ve aliquot edin, böylece gelecekte kullanılmak üzere tüp başına 5 x 105 hücre konsantrasyonu sağlanır.
    1. Dondurma, kriyoviallerin Mr. Frosty (veya benzeri kontrollü hızlı dondurma kapçasına) yerleştirilerek kademeli olarak soğutulması gerekir. Kabı -80°C dondurucuya taşıyın ve hücreleri gece boyunca dondurmaya bırakın. Hücreler birkaç gün boyunca -80°C'de tutulabilir, ancak uzun süreli depolama için sıvı azota taşınmalıdır.
      NOT: Hücre pasajlarının ayrıntılı kayıtlarını tutun ve deneyler için erken pasajları kullanın. 20'den az pasajlı hücreler kullanılması önerilir.
  9. Yeni kültürler tekrar %90 birleşime ulaştığında, aspirasyon ve süpernatantı 15 mL'lik konik bir tüpte toplar. Kültürü sürdürmek istiyorsanız, toplanan cildi taze, tam DMEM ortamıyla değiştirin.
    1. Toplanan süpernatantı 400 × g sıcaklığında 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjlenerek pellet ile hücresel kalıntıları temizleyin. Üst yüzeyi (arıtılmış koşullu ortam) kalın, peleti ise atın.
  10. Temizlenmiş koşullu ortamı 1 mL porsiyonlara ayırın, tüpleri etiketleyin ve kullanıma kadar -20 °C sıcaklıkta saklayın.
    NOT: Kalite kontrolü için, koşullu medya toplama tarihini ve aliquotun daha önce çözülüp çözülmediğini her zaman kayda alın. Aynı aliquot'u iki kere fazla eritmekten kaçınmanız şiddetle tavsiye edilir. Ayrıca, donma tarihinden itibaren bir ay içinde kondisyonlu ürünü en iyi etkinliğini sağlamak için kullanın.

2. Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) izolasyonu

NOT: PBMC'ler, %3,8 sodyum sitrat ile antikoagüllenmiş 40 mL periferik kan izole edilir. İzolasyon, Ficoll-Hypaque yoğunluk gradyanı (1077) ve santrifüj kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokolün tamamı steril koşullarda, bir BSL2 kabininde yapılmalıdır.

  1. Aliquot, antikoagüllenmiş periferik kan örneğini yaklaşan santrifüj aşamasından önce 15 mL veya 50 mL konik bir tüpe içine alın.
  2. Kan bileşenlerini ayırmak için kan bileşenlerini ayırmak için düşük hızda, 200 × g 15 dakika RT'de santrifüj yapın. Bu süreç, üst katman olarak trombosit açısından zengin plazma (PRP) ve alt tabaka olarak hücresel fraksiyon (kırmızı ve beyaz kan hücreleri) elde eder. Santrifüj ayarını kullanarak ivmelenme: 4 ve yavaşlama: 2, maksimum 5 iken.
  3. Santrifüjden sonra üst fraksiyon, yani PRP olan üst fraksiyonu aspire edin ve yeni steril bir tüpe aktarın.
    NOT: Sonraki deneyler için gerekirse, toplanan PRP RT'de 600 × g ile tekrar santrifüjlenebilir ve trombositler çıkarılarak trombositler çıkarılabilir ve plazma trombositsiz -20 °C'de diğer testler için -20 °C'de saklanabilir.
  4. Birinci santrifüjlemeden elde edilen hücresel alt fraksiyon, steril, oda sıcaklığında 1x PBS kullanılarak nazikçe 2 ila 3 kat nihai hacme seyreltilmelidir. Ortaya çıkan süspansiyonu tersine çevirerek yumuşak bir şekilde homojenleştirin ve Ficoll-Hypaque yoğunluk gradyanı santrifüjü için kullanın.
  5. Oda sıcaklığında 15 mL Ficoll-Hypaque steril 50 mL bir tüpe dağıtın.
  6. Ficoll-Hypaque üzerine dikkatlice ve yavaş şekilde 30 mL seyreltilmiş kan katmanı yerleştirin, böylece iki fazın karışmamasını sağlar.
  7. Ficoll-kan katmanlı tüpü RT hızında 600 × g ile 25 dakika boyunca santrifüj yapın. Santrifüjü frensiz ayarlayın (ivme: 1; Yavaşlama: 0).
  8. Dökülmemek için elde edilen üst fraksiyondan en az 4 mL terk etmek için steril bir Pasteur pipeti kullanın. Daha sonra aynı pipet, üst fraksiyon ile Ficoll-Hypaque şeffaf fraksiyonu arasında oluşan PBMC'leri içeren beyaz halkayı geri kazanmak için kullanılır. PBMC yüzüğüyle Ficoll'u toplamaktan kaçının.
  9. PBMC halkası tüpten steril 15 mL santrifüj tüpüne en az 3 mL 1x PBS ile aktarılır.
  10. 15 mL'lik tüpü daha fazla 1x PBS ile doldurun ve RT'de 600 × g ( maksimum ivmelenme ve yavaşlama) santrifüj yapın.
  11. Süpernatantı ters çevirerek çıkarın, tekrar 1x PBS ile doldurun ve RT'de 600 × g ( maksimum ivmelenme ve yavaşlama) 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
  12. Süpernatantı çıkarın ve PBMC pelletini 2 ila 3 mL steril 1x PBS artı %2 ısıyla inaktive edilmiş FBS (1x PBS-%2 FBS) içinde yeniden askıya alın, ardından hacmi 10 mL'ye çıkarın. Hücreleri sayın; steril soğuk 1x PBS ile seyreltilmiş 1:5 hücre süspansiyonu hazırlanır ve ardından (1:2) %0,4 Trypan Blue ile 1:10 nihai seyreltme elde edilir. Saymak için 1.3.2 numaralı adımda açıklandığı gibi ışık mikroskobu üzerinde bir hücre odası kullanın.
  13. PBMC süspansiyonunu 300 × g'de 8-10 °C'de 5 dakika boyunca döndürün. Hücreleri istenen steril, soğuk 1x PBS-2% FBS hacminde yeniden süspansiyona getirerek nihai konsantrasyon 108 hücre/mL elde edilir. Bu hücreleri bir sonraki adıma kadar 4 °C'de bırakın.
    NOT: Bu noktada, toplanan PBMC'ler bir kriyojenik şişede 108 hücre/mL ile dondurulma ortamında (%90 FBS-%10 DMSO) dondurulabilir. Hücrelerin yavaşça donmasını sağlamak için Mr. Frosty kapında -80 °C'de gece boyunca saklanın. Ertesi gün, hücreleri bir depolama kutusuna aktarın ve birkaç gün boyunca -80 °C'de bırakın ya da uzun bir depolama süresi için sıvı azot tankına aktarın ya da protokole devam edin.

3. CD14+ monositlerin manyetik boncuklarla sıralanması

NOT: Saflaştırılmış CD14+ monositler, insan CD14+ pozitif seçim manyetik ayırma kiti11 kullanılarak PBMC'den elde edilir. PBMC'de CD14+ hücre yüzdesi donöre bağlıdır ancak %10 olarak tahmin edilebilir (%5-20 arasında aralık arasında). Deneyiniz için gereken monosit sayısına göre başlangıç PBMC ve son reaksiyon hacimlerini uyarlayın. Önerilen minimum reaksiyon hacmi, 1 × 107 PBMC'den az işlenildiğinde bile 100 μL'dir.

  1. Her 100 μL PBMC için 10 μL pozitif seçim kokteyli ekleyin, pipet yapın ve 15 dakika buzda tutun.
  2. Boncukları kullanmadan önce 30 saniye girdabla sokuyorum. Sonra her 100 μL PBMC süspansiyonu için 10 μL boncuk ekleyin. İyi karıştırın ve 15 dakika boyunca buzun üzerinde kuluçka yapın.
  3. Son hacmi 2.5 mL'ye 1x PBS-% 2 FBS -1 mM EDTA ekleyin, süspansiyonu nazikçe karıştırın ve tüpü mıknatısa yerleştirin ve 5 dakika kuluçka yapın.
  4. Mıknatıstasi (tüpü çıkarmadan) atma alıcı tüpünün üzerinde 2-3 saniye ters çevirin, titreme hareketini önleyin. Pozitif hücreler tüpte kalır.
  5. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve tüp duvarlarına 1x PBS-%2 FBS -1 mM EDTA ekleyin, nihai hacmi 2.5 mL olana kadar.
  6. Tüpü tekrar mıknatısa yerleştirin ve 5 dakika kuluçka yapın.
  7. Mıknatıstasi (tüpü çıkarmadan) atma alıcı tüpünün üzerinde 2-3 saniye ters çevirin, titreme hareketini önleyin. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve tüp duvarlarına 3 mL 1x PBS-2% FBS ekleyin, böylece tüm hücreler geri alın.
  8. Bir Neubauer odasındaki CD14+ hücre sayısını ışık mikroskobu ile saymak için 10 μL alın. Trypan Blue ile 1:2 seyreltir.
    NOT: Bu denklem üzerinden hücre sayısını hesaplayın: CD14+ hücre sayısı = dörtrede canlı hücre sayısı x seyreltme faktörü x 10.000.
  9. CD14+ hücre süspansiyonunu yeni steril 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve hücreleri 600 × g (maksimum ivmelenme ve yavaşlama) sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj ile yıkayabilirsiniz.
  10. CD14+ hücrelerini, %10 FBS ve %1 penisillin-streptomisin (P/S) ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı ile uygun bir hacimde yeniden süspansiyona geçirin; böylece elde edilen hücre sayısı göz önüne alındığında bir sonraki adım için 2,5 x 106 hücre/mL elde edilir.
    NOT: CD14+ monositlerini bir sonraki adıma kadar buzda tutun, böylece bu hücrelerin plastik tüp duvarına bağlanmasını önleyin.

4. Makrofajların farklılaşması

  1. CD14+ monositleri 2,5 x 105 hücre ölçüsünde 250 μL tam RPMI ortamında (%10 FBS-%1 PS) askıya alınmış, 48 kuyuyla arındırılmış bir plakada yapılmıştır.
    NOT: Ayrıca 96 iyi işlenmiş bir plakadaki hücre sayısının yarısı ile de yapılabilir.
  2. Levha kuluçka sırasında buharlaşmayı azaltmak için çevredeki boş kuyulara steril su ekleyin.
  3. Hücreleri 37 °C'de, %5 CO₂ ile nemlendirilmiş bir kuluçka içinde, rahatsız etmeden, morfoloji, farklılaşma ve canlılık açısından günlük izleyerek kuluçka yapın.
    NOT: M-CSF (25 ng/mL) farklılaştırma için eklenebilirken, protokolümüzün beş gün kültür sonrası M0 makrofajlarını elde etmek için sadece %10 yüksek kaliteli FBS kullandığını doğruluyoruz. Özellikle M-CSF'den kaçınmasını öneriyoruz; çünkü monositleri M2 benzerifenotip 10,22'ye doğru hazırlaya bilmektedir.

5. Makrofajların koşullu ortama maruz kalması ve analizi

  1. Farklılaşmanın 5. gününde, her kuyiden %50 (125 μL) maddeyi nazikçe çıkarın ve yerine şu seçeneklerden birini ekleyin:
    1. 125 μL taze RPMI tam ortam (kontrol),
    2. 125 μL tümör hücre hattıyla koşullandırılmış ortam (örneğin, MDA-MB-231'den), veya
    3. 125 μL DMEM tam ortamı (koşullu ortam için kontrol).
      NOT: Yeni tümör hücre hatlarıyla ilk optimizasyon için, koşullu ortam konsantrasyonlarının bir aralığını test edin (örneğin, %10, %25 ve %50). Bu aralık, makrofajların yaşamlılığını ve farklılaşma değişikliklerini sağlamak için önerilmektedir. Yüksek makrofaj yaşamabilirliği gösteren daha yüksek konsantrasyonlu koşullu ortamı seçin.
  2. 7. güne kadar kuluçkaya devam edin.
    NOT: 5. günde M0 makrofajları elde edilir, ardından koşullu ortamın varlığında 2 gün daha kültür yüzey polarizasyon belirteçlerinin ifadesini tetiklemek için yeterlidir. Polarizasyon yüzeyi belirteçleri, M1 veya M2 makrofajları oluşturmak için standartlaştırılmış sitokinler kullanılarak da akış sitometrisiylebelirlenir 11,14.
  3. Makrofajların yaşamlılığını ve morfolojisini her gün mikroskop altında değerlendirin.
    NOT: 7 günlük kültür dönemi boyunca makrofaj farklılaşmasını günlük olarak izleyin. Hücre yapışması, sağlıklı ve canlı bir kültürün göstergesi olarak kullanılır. Daha yüksek bir füsiform hücre oranı, koşullu ortam (CM) tedavi grubunda artan farklılaşma ve polarizasyonun göstergesidir; bu durum Şekil 2'de gösterilmiştir.

6. Akış sitometrisiyle polarizasyon belirteçlerinin değerlendirilmesi için makrofajların hasadı

NOT: Tümörle ilişkili makrofajların fenotip karakterizasyonunu daha da genişletmek için, grup 11'in bildirdiği gibi, kanonik sitokin üretimini ölçmek için RNA'yı (örneğin TGM2, IRF-4 ve CXCL10) nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile ölçmek için izole edin veya grup11'in bildirdiği gibi, kanonik sitokin üretiminin ölçülmesi için kültür süpernatantlarını (örneğin, TNFα, IL-6 ve IL-10) enzimle bağlı immünosorbent testi (ELISA) toplayın. 14.

  1. Her kuyunun toplam kültür ortamı hacmini steril bir Pasteur pipeti veya ucuyla nazikçe aspirasyon ile atın ve hücre hasadı için 200 μL soğuk 1x PBS-%2 FBS-1 mM EDTA tamponu ekleyin.
  2. Buzda 10-15 dakika kuluçka yapın ve ardından EDTA tamponunu seyreltmek için 200 μL 1x PBS-2% FBS ekleyin. Makrofajları yukarı aşağı pipetle (hâlâ buz üzerinde) 5 dakika daha toplayın, ta ki tüm hücreler ayrılana kadar.
    NOT: Bu adım, iyi sayıda geçerli makrofaj elde etmek için çok önemlidir. Hücre canlılığını korumak için EDTA sergisi süresini önerilenden fazla uzatmamak önemlidir. İşlemi tamamladıktan sonra hücreleri mikroskop altında kontrol ederek tamamen ayrılmış olduklarından emin olun.
  3. 1.5 mL mikrotüpte makrofajları toplayıp 1 mL 1x PBS-2% FBS ile 400 × g sıcaklığında 5 dakika boyunca 8-10 °C'de santrifüj yaparak yıkayın.
  4. Makrofaj pelletini 200 μL 1x PBS-5% FBS ile yeniden askıya alın ve RT'de 15 dakika boyunca spesifik olmayan bloklama için 96 kuyruklu yuvarlak tabanlı mikroplakaya aktarın. Hücreleri 400 x g ile 5 dakika boyunca 8-10 °C sıcaklıkta santrifüj yapın.
  5. Plakayı hızlıca ters çevirerek üst yüzeyi at.
  6. Her antikor için 1:50 seyreltme faktörü kullanarak doğrudan konjuge edilmiş antikorlardan oluşan uygun kokteyl 1x PBS-2% FBS ile hazırlanır. Her örneği 50 μL antikor kokteyli ile boyanıp 30 dakika boyunca karanlıkta buzda kuluçka yapın.
    NOT: Antikor kokteyli: CD11b-PE/Cy7 (200 μg/mL), CD64-AlexaFluor 647 (150 μg/mL), CD163-PerCP/Cy5.5 (200 μg/mL), HLADR-PE (40 μg/mL) ve CD206-AlexaFluor 488 (400 μg/mL). Önceden tittered edilmiş antikor konsantrasyonu Tablo 1'de listelenmiştir; Katalog numaraları Materyaller Tablosu'nda bulunabilir.
  7. Lekeli makrofajları 150 μL 1x PBS ekleyerek yıkayın ve 400 × g sıcaklığında 8-10 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  8. Plakayı hızlıca ters çevirerek üst yüzeyi at.
  9. Hücre canlılığını ölçmek için, 100 μL düzeltilebilir canlılık boyası Zombie Violet (1x PBS'de 1:1.000) ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika karanlıkta kuluçka yapın.
  10. Boyalı hücreleri 100 μL 1x PBS ekleyerek yıkayın ve 400 x g sıcaklığında 8-10 °C'de 5 dakika santrifüj yapın. Yıkama işlemini 200 μL 1x PBS kullanarak tekrarlayın.
  11. Hücre pelletini 20 μL taze hazırlanmış %1 paraformaldehit ile yeniden süzüldürüp 20 dakika boyunca buzda ve karanlıkta inkübe geçirerek düzeltin.
    NOT: Fiksasyon için %1 paraformaldehit kullanılmış, permeabilizasyon olmadan. İsteğe bağlı: Ticari fiksatif bileşen (BD fiksator/permeabilizasyon kitinden) bu11. adım için de kullanılabilir.
  12. Hücreleri 180 μL 1x PBS-2% FBS ekleyerek yıkayın ve 400 x g sıcaklığında 8-10 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Yıkama prosedürünü 200 μL 1x PBS-2% FBS kullanarak tekrarlayın.
  13. Üst örtü plaka inversiyonuyla atılır ve peleti 200 μL 1x PBS ile yeniden süspansiyona bırakarak ölçüm için akış sitometri ekipmanına götürülür.
    NOT: Eğer boyalı ve sabit örnekler aynı gün akış sitometrisiyle çalıştırılamıyorsa, onları 4 °C'de saklayıp ışıktan koruyun. Sonraki günlerde örnekleri mümkün olan en kısa sürede analiz edin.
  14. FlowJo yazılımı kullanarak akış sitometrisi sonuçlarını analiz edin. Kapı stratejisi, ileri ve yan saçılma (FSC/SSC) kullanarak enkazı dışlayarak başlar. Daha sonra, canlı makrofajları CD11b⁺ Zombi Mor hücreleri olarak seçin.
    NOT: Makrofajlarda otofloresans donöre bağlı olduğundan, her deney için aynı donörden türetilen kontrollerin kullanılması şarttır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

MDA-MB-231 hücre hattından %50 koşullu ortam (CM) ile monositten türetilen makrofajları tedavi ederek üçlü negatif meme kanseri tümörü ilişkili makrofajlar (TAM) benzeri hücreler ürettik. Monositler, altı bağımsız sağlıklı donörün periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC) ayrıldı ve protokolümüze uygun olarak farklılaştırıldı. CM preparatında MDA-MB-231 hücreleri %90 birleşimde kullanılmıştır (Şekil 1). CM 5. günde makrofaj kültürüne ekl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan protokol, insan monositlerinden türetilen makrofajların tümör hücre hattı ile koşullandırılmış ortama maruz kalması yoluyla tümör ilişkili makrofaj benzeri polarizasyonu incelemek için tekrarlanabilir ve pratik bir yaklaşım sunar. Bu sistem, tümör hücreleri tarafından salgılanan çözünür faktörlerin etkisini yakalar; bu faktörler, tümör mikroçevresinde makrofajların yeniden programlanmasında kritik rol oynadığıbilinir 7,9,10,15,19,20.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bilim ve Teknolojiyi Teşvik Ulusal Ajansı (ANPCyT-FONCYT) tarafından PICT 2021 I-INVI-00034 (DR'ye), PICT 2021-I-A-00807 (E.A.C.S.'a) ve PICT 2021-I-A-00716 (A.E.E.'ye) hibeleri aracılığıyla sağlanan mali desteği takdir ediyoruz. Ayrıca, PIP 2022-0763 için Ulusal Bilimsel ve Teknik Araştırma Konseyi'ne (CONICET) ve A.E.E.'ye verilen PIDAE 2022 için Buenos Aires Üniversitesi'ne teşekkür ediyoruz.

M.C.L., Buenos Aires Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Legado Peruilh bursu aldı ve ANPCyT-FONCYT doktora bursu aldı. D.R., E.A.C.S. ve A.E.E. CONICET'TE KARIYER ARAŞTıRMACıLARıDıR.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Fluor 488 fare anti-insan  CD206 Antikor klonu 15-2BioLegend, San Diego, CA, ABD.Cat# 321113; RRID:AB_571874
Alexa Fluor 647 fare anti-insan CD64 Antikor klonu 10.1BioLegend, San Diego, CA, ABD.Cat# 305012; RRID:AB_528867
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences, San Jose, CA, ABDCat# 554714Fiksasyon/Permeabilizasyon Kiti
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), yüksek glikozGibco  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA Cat# 11965092
EasySep İnsan CD14 Pozitif Seçim Kiti; EasySep Pozitif Seçim Kokteyli; EasySep manyetik nanopartiküller; Easy Sep MagnetSTEMCELL Teknolojileri, Vancouver, KanadaCat# 18058
FACS Canto sitometresi Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, ABD.
Fetal Sığır Serumu, Yeni Zelanda  sertifikalı;Gibco™   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - Yaşam Bilimleri, ABDCat# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
GraphPad Prism   GraphPad Software Inc.RRID:SCR_002798
Partec CyFlow uzay sitometresi Sysmex Partec, Almanya
PE anti-insan HLA-DR Antikor klonu L243BioLegend, San Diego, CA, ABD.Cat# 307605; RRID:AB_314683
PE/Cy7 sıçan anti-fare/insan CD11b Antikor klonu M1/70BioLegend, San Diego, CA, ABD.Cat# 101216; RRID:AB_312799
PerCP/Cy5.5 fare anti-insan CD163 Antikor klonu GHI/61BioLegend, San Diego, CA, ABD.Cat# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 OrtaGibco  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA Cat# 11875119
Sodyum piruvat çözeltisiSigma-Aldrich Merck, San Luis, MO, ABD. Cat#  S8636
Tripsin-EDTA (%0,25), fenol kırmızıGibco  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA Cat# 25200056
Zombie Violet Düzeltilebilir Kullanılabilirlik KitiBioLegend, San Diego, CA, ABD.Cat# 423113

Kaynaklar

  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  2. Goswami, S., Anandhan, S., Raychaudhuri, D., Sharma, P. Myeloid cell-targeted therapies for solid tumours. Nat Rev Immunol. 23 (2), 106-120 (2023).
  3. Christofides, A., et al. The complex role of tumor-infiltrating macrophages. Nat Immunol. 23 (8), 1148-1156 (2022).
  4. Umakoshi, M., et al. Macrophage numbers in the marginal area of sarcomas predict clinical prognosis. Sci Rep. 13 (1), 1290(2023).
  5. Toor, S. M., et al. Myeloid cells in circulation and tumor microenvironment of breast cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (6), 753-764 (2017).
  6. Chen, Y., et al. Targeting tumor-associated macrophages: A potential treatment for solid tumors. J Cell Physiol. 236 (5), 3445-3465 (2021).
  7. Caverzan, M. D., et al. Exploring monocytes-macrophages in immune microenvironment of glioblastoma for the design of novel therapeutic strategies. Brain Sci. 13 (4), 542(2023).
  8. Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).
  9. Linde, N., Gutschalk, C. M., Hoffmann, C., Yilmaz, D., Mueller, M. M. Integrating macrophages into organotypic co-cultures: A 3D in vitro model to study tumor-associated macrophages. PLoS One. 7 (7), e40058(2012).
  10. Karimova, A. F., et al. In vitro functional assays to assess the reciprocal interplay between tumor cells and macrophages. FASEB J. 38 (13), e23730(2024).
  11. Carrera Silva, E. A., Errasti, A. E. Reprograming model of human monocyte-derived macrophages for in-vitro assays. J Vis Exp. (218), e67651(2025).
  12. Colado, A., et al. The kinase inhibitors R406 and GS-9973 impair T cell functions and macrophage-mediated anti-tumor activity of rituximab in chronic lymphocytic leukemia patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (4), 461-473 (2017).
  13. Colado, A., et al. Effect of the BTK inhibitor ibrutinib on macrophage- and gammadelta T cell-mediated response against Mycobacterium tuberculosis. Blood Cancer J. 8 (11), 100(2018).
  14. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  15. Gattas, M. J., et al. A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro. Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).
  16. Risnik, D., et al. Immunoregulatory effects of lurbinectedin in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Immunol Immunother. 69 (5), 813-824 (2020).
  17. Mulder, K., et al. Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease. Immunity. 54 (8), 1883-1900.e5 (2021).
  18. Silvin, A., et al. Dual ontogeny of disease-associated microglia and disease inflammatory macrophages in aging and neurodegeneration. Immunity. 55 (8), 1448-1465.e6 (2022).
  19. Maeda, A., Digifico, E., Andon, F. T., Mantovani, A., Allavena, P. Poly(I:C) stimulation is superior than imiquimod to induce the antitumoral functional profile of tumor-conditioned macrophages. Eur J Immunol. 49 (5), 801-811 (2019).
  20. Ummarino, A., Anfray, C., Maeda, A., Andon, F. T., Allavena, P. In vitro methods to evaluate macrophage polarization and function in cancer. Methods Mol Biol. 2614, 81-91 (2023).
  21. Carestia, A., et al. Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice. Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).
  22. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  23. Ferrer, M. F., et al. Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity. Front Immunol. 10, 2499(2019).
  24. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype. Front Immunol. 14, 1162671(2023).
  25. Dunsmore, G., et al. Timing and location dictate monocyte fate and their transition to tumor-associated macrophages. Sci Immunol. 9 (97), eadk3981(2024).
  26. Wang, X., Chen, J., Jia, G. From dichotomy to diversity: Deciphering the multifaceted roles of tumor-associated macrophages in cancer progression and therapy. Cancer Biol Med. 21 (2), 132-138 (2023).
  27. Hochstadt, J., Martinez Pacheco, S., Casanova-Acebes, M. Embracing diversity: Macrophage complexity in cancer. Trends Cancer. 11 (4), 351-364 (2025).
  28. Xu, J., et al. Dual roles and therapeutic targeting of tumor-associated macrophages in tumor microenvironments. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 268(2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Makrofaj PolarizasyonuIn Vitro ModellemeMonosit DiferansiyasyonuKondisyonlu MedyumTümör-Makrofaj EtkileşimleriMakrofaj Yeniden ProgramlamaKanser İmmünolojisi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.