Method Article

Düşük Yoğunluklu Nötrofillerin Verimli Saflaştırılması için Hızlı Manyetik-mikro Boncuk Yöntemi

DOI:

10.3791/69407

⸱

November 11th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN) birçok hastalıkta önemli ölçüde artar. LDN genellikle hücre sıralaması yoluyla izole edilir. Saf ve canlı LDN elde etmek için pratik bir yöntem sunuyoruz. Periferik kanın yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesinden sonra, hücreler manyetik mikro boncuklarla inkübe edilir ve daha sonra LDN, manyetik kolonlar aracılığıyla ayrılır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğuştan gelen bağışıklığın önemli lökositleri olan nötrofiller, geleneksel olarak homojen bir hücre popülasyonu olarak kabul edilmiştir. Bununla birlikte, son kanıtlar nötrofillerin birkaç alt popülasyonda var olduğunu göstermiştir. Böyle bir alt popülasyon, düşük yoğunluklu nötrofillerdir (LDN). LDN, sağlıklı bireylerin kanında az sayıda bulunur, ancak sistemik lupus eritematozus, otoimmün bozukluklar, kanser ve enfeksiyonlar gibi hastalıklarda sayıları önemli ölçüde artar. Bu durumlarda, LDN hastalığın patogenezine katılabilir. LDN'yi izole etmenin tek yolu, periferik kanın yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesidir. Bununla birlikte, santrifüjlemeden sonra LDN, mononükleer hücrelerle birlikte saflaştırılır. Bu nedenle, bu nötrofil alt popülasyonunu incelemek zordur. LDN'yi mononükleer hücrelerden ayırmak için standart bir metodoloji yoktur. Tipik olarak, LDN, bir akış sitometresinde hücre sıralaması ile ayrılır. Bununla birlikte, bu yöntem, daha ileri fonksiyonel çalışmalar için yeterli saf hücre elde etmek için uzun sıralama süreleri (saatler) gerektirir. Bu, hücrelerin canlılığını ve işlevini ciddi şekilde etkiler. Burada, kısa sürede çok sayıda saf ve canlı LDN elde etmek için pratik bir yöntem öneriyoruz. Yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeden sonra, mononükleer hücre fraksiyonu anti-CD66b manyetik mikro boncuklarla inkübe edilir ve daha sonra LDN, < 30 dakika içinde manyetik kolonlardan ayrılır. Saflaştırılmış LDN (CD66b+ hücreleri), CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b ve CD98'e karşı monoklonal antikorlarla etiketlenir ve doğrulama için akış sitometrisi ile analiz edilir. Saflaştırılmış LDN, reaktif oksijen türleri üretme ve nötrofil hücre dışı tuzaklar oluşturma kapasitelerinin gösterdiği gibi tamamen işlevseldir. Bu yeni saflaştırma yöntemi, kısa sürede yüksek saflıkta (%90'dan fazla) ve canlılıkta (%96'dan fazla) LDN ile sonuçlanır. Bu yöntem, biyokimyasal veya diğer omik analizler yoluyla farklı hastalıklarda LDN fonksiyonlarını değerlendirmek için çok sayıda saf LDN elde etmek üzere kolayca ölçeklendirilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan kanında1 baskın lökositler olan nötrofiller, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin kilit katılımcılarıdır. İltihaplı veya enfeksiyonlu dokulara çok sayıda ulaşırlar2. Burada nötrofiller, fagositoz 3,4, degranülasyon 5,6 ve nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) oluşumu gibi çeşitli efektör fonksiyonları aktive eder7. Ek olarak, nötrofiller de adaptif bağışıklık tepkisine katılır8. Nötrofillerin klasik görüşü, onları kemik iliğinde önceden belirlenmiş yanıtlarla üretilen homojen hücreler olarak kabul eder 9,10. Bununla birlikte, son çalışmalar, nötrofillerin hem sağlıklı hem de hastalık durumları altında çoklu fenotipik ve fonksiyonel durumlara sahip heterojen hücreler olduğunu ortaya koymaktadır 11,12,13,14,15.

Birkaç nötrofil alt popülasyonu arasında, düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN), içsel özellikleri ve çeşitli hastalıklarda sayılarının artması nedeniyle çok ilgi görmüştür 16,17,18. LDN, 1986 yılında sistemik lupus eritematozus (SLE) hastalarının kanında bulunmuştur19. Lökositleri20,21 yoğunluk gradyanında ayırma işleminin ardından tespit edildiler. Kanın veya lökositten zengin plazmanın bir yoğunluk ortamında (örneğin, Ficoll-Paque) santrifüjlenmesinden sonra, monositler ve lenfositler (periferik kan mononükleer hücreleri [PBMC] olarak bilinir) tüpün üst (düşük yoğunluklu) kısmında bir bant oluşturur. Nötrofiller tüpün dibinde çökelir. PBMC arasında birkaç nötrofil de bulundu; bunlar LDN'dir (Şekil 1). Sağlıklı bireylerin kanında az sayıda LDN bulunur22. Bununla birlikte, SLE23,24, sepsis25, sedef hastalığı26, astım27, jüvenil idiyopatik artrit28, anti-nötrofil sitoplazmik antikor (ANCA) ile ilişkili vaskülit29, HIV enfeksiyonu30, sıtma31 ve tüberküloz32 dahil olmak üzere çoklu immünosupresyon ve kronik inflamasyon durumlarında LDN sayıları önemli ölçüde artar. Bahsedilen tüm patolojilerde LDN sayıları artmasına rağmen, LDN çoğunlukla SLE17 bağlamında incelenmiştir. SLE hastalarının kanından alınan LDN, NET'leri33 oluşturma, büyük miktarlarda proinflamatuar mediatörleri34 salgılama ve T hücrelerini24 aktive etme konusunda daha büyük bir kapasiteye sahip gibi görünmektedir. Bununla birlikte, kanser gibi diğer durumlarda, LDN'nin, T hücresi baskılayıcı özelliklere sahip olgun ve olgunlaşmamış nötrofillerden35 oluştuğubildirilmektedir 36,37,38. Benzer şekilde, COVID-19 hastalarında LDN'nin de T hücresi proliferasyonunu39 baskıladığı bildirilmektedir, ancak SLE'nin aksine, LDN'nin daha az NET ürettiği görülmektedir39. Bu nedenle, LDN'nin kökeni, bileşimi ve fonksiyonel özellikleri hala tartışmalıdır.

LDN, PBMC ile birlikte bulunduğundan, bunları incelemek teknik olarak karmaşıktır. Farklı patolojilerde LDN özelliklerini tam olarak keşfetmek için onları saflaştırmak gerekir. LDN ayırmanın yaygın bir prosedürü, floresan hücre sıralama 22,40,41,42,43,44,45'tir. Ancak hücre ayrıştırma, hücre ayrımı için uzun bir zaman gerektirir. Bu, sıralama süresi yeterli değilse hücre kaybına veya düşük iyileşmeye yol açabilir. Ayrıca hücreler aşırı strese maruz kalır ve bu hücrelerin işlevi incelenirken değişken sonuçlara neden olur. Uzun ayıklama süresi aynı zamanda deneysel prosedürlerin maliyetini de artırır ve uzman personel gerektirir.

Burada, çok kısa sürede çok sayıda saf ve canlı insan LDN'si elde etmek için hızlı ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeden sonra LDN, manyetik hücre sıralama (MACS; Şekil 1). Bu saflaştırma yönteminin temel avantajı, LDN'nin yüksek saflık (%90'dan fazla) ve canlılık (%96'dan fazla) ile ayrılmasıdır. Ayrıca, saflaştırılmış LDN, reaktif oksijen türleri (ROS) üretme ve NET'leri serbest bırakma kapasitelerinin gösterdiği gibi tamamen işlevseldir. Bu protokol, bu hücreleri daha fazla incelemek için LDN'yi birden fazla hastalığı olan kişilerin kanından hızlı bir şekilde ayırmak için nötrofil biyolojisi ile ilgilenen herhangi bir laboratuvarda kolayca uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokoldeki tüm prosedürler, Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México'daki (UNAM) İnsan Araştırmaları Biyoetik Komitesi'nin yönergelerini takip eder. Tüm katılımcılar bilgilendirilmiş onam verdi.

1. Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) ve nötrofillerin insan kanından izolasyonu

  1. Damar delinmesi yoluyla sağlıklı bir yetişkin gönüllüden yaklaşık 10 mL kan alın. Antikoagülan olarak 10 U/mL heparin ekleyin.
    DİKKAT: İğneyi biyolojik tehlike içeren bir iğne imha kabına atın. Şırıngalar ve kanla temas eden diğer malzemeler atılmadan önce bir torbaya konulmalı ve otoklavlanmalıdır.
  2. 15 mL'lik konik bir santrifüj tüpüne, PBS'ye 2 mL %6 dekstran T500 ekleyin. Daha sonra tüpün kenarından aşağı doğru boşaltarak 10 mL kan ekleyin. Kan ve dekfanı karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.
  3. Eritrositler çökelirken tüpü 45 dakika dinlendirin. Lökositten zengin plazma, eritrosit tabakasının üzerinde görünür.
  4. Başka bir 15 mL santrifüj tüpüne, 5 mL yoğunluk gradyan ortamı ekleyin. Plazmayı eritrositlere dokunmadan dikkatlice pipetleyin ve ortamın üzerine yerleştirin. İki ayrı aşama oluşturulmalıdır.
  5. Tüpü 4 °C'de 20 dakika boyunca 516 x g'da santrifüjleyin. Mononükleer hücreler (PBMC), plazma ve orta katmanlar arasında bir bant oluşturur. Nötrofiller altta bir pelet oluşturur (Şekil 1).
  6. PBMC'nin İzolasyonu
    1. Hücrelere dokunmadan PBMC'nin üstündeki plazmayı aspire ederek ortadan kaldırın. Plazma ve ortam arasındaki banttan hücreleri toplayın. Mümkün olduğunca az ortam aspire ettiğinizden emin olun.
    2. Hücreleri 50 mL'lik konik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. 20 mL PBS ekleyin. Tüpü 400 x g'da 5 °C'de 4 dakika santrifüjleyin.
    3. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücreleri ayırmak için tüpü kazıyın. Hücreleri yeniden süspanse etmek için 10 mL soğuk PBS ekleyin. Bir Neubauer odası kullanarak PBMC'yi sayın.
      NOT: Hücreleri yeniden askıya almak için pipet kullanmayın, çünkü bu hücrelere zarar verebilir.
  7. Nötrofillerin izolasyonu
    1. Yoğunluk gradyan ortamını kaldırın. Tüpü kazıyarak hücreleri ayırın ve 10 mL soğuk PBS ekleyin.
    2. Hücreleri 50 mL'lik yeni bir santrifüj tüpüne koyun ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri adım 1.6.3'te açıklandığı gibi ayırın.
  8. Artık eritrositleri ortadan kaldırmak için 10 mL soğuk hipotonik çözelti (%0.2 NaCl, %1 BSA, 20 mM Hepes, pH = 7.4) ekleyin ve tam olarak 1 dakika hafifçe karıştırın.
  9. Çözeltiyi izotonik hale getirmek için hızla 10 mL soğuk hipertonik çözelti (%1.6 NaCl, %1 BSA, 20 mM HEPES, pH = 7.4) ekleyin.
  10. Nötrofilleri bir Neubauer odası kullanarak sayın (saflık > %95). Adım 1.6.2'deki gibi santrifüj ederek hücreleri peletleyin. ve onları soğuk PBS'de yeniden askıya alın. Tüpü buz üzerinde tutun.
    NOT: Nötrofillerin in vitro yarılanma ömrünün 8 - 12 saat 46,47,48 olduğu bildirilmektedir. Bu protokolle ilgili deneyimlerimize göre, nötrofiller işlevlerini yaklaşık 6 ila 8 saat sürdürürler.

2. Düşük yoğunluklu nötrofillerin (LDN) saflaştırılması

  1. PBMC'yi 400 x g'da 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 120 μL soğuk yıkama tamponunda (PBS'de %1 BSA) yeniden süspanse edin.
  2. 35 μL CD66b manyetik mikro boncuk ekleyin. Karışımı karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. Hücre toplanmasını önlemek için her 10 dakikada bir hafifçe karıştırın.
  3. 1 mL soğuk yıkama tamponu ekleyin. Hücreleri bir mikrosantrifüje yerleştirin ve 3 dakika boyunca 400 x g'da döndürün.
  4. Süpernatanı çıkarın, tüpü kazıyarak hücre peletini ayırın ve hücreleri 1 mL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin.
  5. Bir mıknatısın üzerine bir manyetik ayırma kolonu yerleştirin. Kolona 0,5 mL yıkama tamponu ekleyin ve kolondan geçmesine izin verin.
  6. Hücreleri (1 mL) kolona aktarın. Tamponun sütundan damla damla geçmesine izin verin.
  7. Kolona 0,5 mL yıkama tamponu ekleyin ve geçmesine izin verin. Sütuna 0,5 mL daha yıkama tamponu ekleyin.
  8. Kolonu mıknatıstan çıkarın ve bir mikrosantrifüj tüpüne koyun. Kolona 1 mL yıkama tamponu ekleyin.
  9. Pistonu kolonun üstüne yerleştirin ve hücreleri ayrıştırmak için hafifçe basınç uygulayın. Pistonu çıkarın ve kolonu yeni bir mikrosantrifüj tüpünün üzerine yerleştirin.
  10. 1 mL daha yıkama tamponu ekleyin. Pistonu kolonun üstüne yerleştirin ve hücreleri ayrıştırmak için hafifçe basınç uygulayın.
  11. Her iki tüpü de bir mikrosantrifüje yerleştirin ve 3 dakika boyunca 800 x g'da döndürün. Son olarak, hücreleri (LDN) her iki tüpten 1 mL soğuk PBS'ye yeniden süspanse edin. Buz üzerinde kalın.
    NOT: İlk 2 mL akış, PBMC'nin geri kalanını içerir. Bu hücreler başka çalışmalar için kullanılabilir.

3. Çok renkli akış sitometrisi

  1. Saflaştırılmış hücreleri etiketleme tamponunda 1 x 106 hücre/mL'de (PBS'de %1 FBS) yeniden süspanse edin. 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 250 μL hücre ekleyin.
  2. Nötrofil membran moleküllerine karşı karşılık gelen antikorları ekleyin (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın). Hücreleri ışıktan koruyarak 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  3. 1 mL PBS ekleyin. Tüpleri bir mikrosantrifüje yerleştirin ve 3 dakika boyunca 800 x g'da döndürün.
  4. Süpernatanı aspire edin, tüpe dokunarak hücre peletini kırın ve hücreleri 0,5 mL %1 paraformaldehit içinde yeniden süspanse edin.
  5. Akış sitometrisi ile analiz edilene kadar hücreleri ışıktan koruyarak 4 °C'de tutun. Hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin ve numune başına 10.000 olay yakalayın. Hücre sıralamasını daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirin22.
    DİKKAT: Paraformaldehit cildi ve solunum yollarını tahriş eder. Buharları solumadığınızdan emin olun.

4. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) tespiti

  1. 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 2,5 x 105 hücre ekleyin. Tüpleri bir mikrosantrifüje yerleştirin ve 3 dakika boyunca 800 x g'da döndürün.
  2. Süpernatanı aspire edin, hücreleri ayırmak için tüpü kazıyın ve hücreleri PBS'de 100 μL 15 μM dihidrorodamin 123 içinde yeniden süspanse edin.
  3. Işıktan korunan hücreleri 37 °C'de 20 dakika inkübe edin. 1 mL PBS ekleyin.
  4. Tüpleri bir mikrosantrifüje yerleştirin ve 3 dakika boyunca 800 x g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin, hücreleri ayırmak için tüpü kazıyın ve PBS'de 100 μL 50 nM forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) içinde yeniden süspanse edin.
  5. Işıktan korunan hücreleri 37 °C'de 45 dakika inkübe edin. 1 mL PBS ekleyin.
  6. Tüpleri bir mikrosantrifüje yerleştirin ve 3 dakika boyunca 800 x g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin, hücreleri ayırmak için tüpü kazıyın ve PBS'de 0.5 mL %1 paraformaldehit içinde yeniden süspanse edin.
  7. Akış sitometrisi ile analiz edilene kadar hücreleri ışıktan koruyarak 4 °C'de tutun. Hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin ve numune başına 10.000 olay yakalayın.

5. Nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) görselleştirilmesi

  1. Lamelleri 12 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin ve üzerlerini 10 μg/mL poli-L-Lizin ile kaplayın. Plakayı gece boyunca 4 °C'de hafif çalkalayarak inkübe edin.
  2. Poli-L-Lizin'i çıkarın ve lamellerin PBS ile yıkanması, plakanın oda sıcaklığında 5 dakika boyunca hafifçe çalkalanması ile inkübe edilmesi. Lamelleri PBS ile iki kez daha yıkayın.
  3. PBS'yi çıkarın ve plakayı 2 saat boyunca laminer akışlı bir başlığın içine yerleştirerek lamellerin kurumasını bekleyin.
  4. LDN'yi %5 FBS ile RPMI-1640 ortamında 1 x10 6 hücre/mL'de yeniden askıya alın. 350 μL (3.5 x 105 hücre) hücre süspansiyonu alın ve bunları lamellerin bulunduğu 12 oyuklu plakanın bir kuyusuna koyun.
  5. Plakayı 37 °C'de% 5CO2 inkübatörde 30 dakika tutun. Her bir oyuğa PBS içinde seyreltilmiş 3.5 μL 5 μM PMA ekleyin (PMA'nın nihai konsantrasyonu 50 nM'dir).
  6. Plakayı 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörde 4 saat tutun. PBS'ye 350 μL %8 paraformaldehit ekleyin ve plakayı gece boyunca %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de tutun.
  7. Daha önce tarif edildiği gibi bir test tüpü standının üzerine şeffaf bir film yerleştirin49, böylece tüp deliklerinde kuyular oluşur.
  8. Lamelleri yıkamak veya lekelemek için her bir kuyucuğu çeşitli solüsyonlarla doldurun ve büyük bir damla oluşturun. Lamelleri çıkarın ve 5 dakika boyunca bir damla su üzerinde baş aşağı koyun. Aynı şekilde lamelleri üç kez daha suyla yıkayın.
  9. Lamelleri bir damla blokaj tamponu (PBS'de% 5 BSA) üzerine baş aşağı yerleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
  10. Lamelleri, bloke edici tamponda karşılık gelen birincil antikorun (örneğin, anti-elastaz veya anti-sitrülin) bir damlasına aktarın ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.
  11. Lamellerin 2 kez PBS'de %0.01 Tween-20'de yıkanması. Lamelleri, 150 nM DAPI içeren bloke edici tamponda karşılık gelen ikincil antikorun bir damlasına aktarın ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.
  12. Lamellerin 2 kez PBS'de %0.01 Tween-20'de yıkanması. Bir cam slayt üzerine bir damla antifade montaj ortamı yerleştirin ve lameller baş aşağı koyun.
  13. Çevre etrafındaki lamellerin oje ile kapatılmasını sağlayın. Monte edilmiş slaytları ışıktan koruyarak 4 °C'de saklayın. Bir floresan mikroskobu kullanarak NET'leri görselleştirin.

6. Nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) tespiti

  1. Hücreleri 500 nM Sytox Green içinde 5 x 105 hücre /mL'de yeniden süspanse edin, RPMI-1640 ortamında %5 FBS ile seyreltilir.
  2. 100 μL (5 x 104 hücre) hücre süspansiyonu alın ve bunları 96 oyuklu bir doku kültürü plakasının kuyucuğuna koyun.
  3. Plakayı 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörde 20 dakika tutun. Her bir oyuğa RPMI-1640 ortamında seyreltilmiş 20 μL 300 nM PMA ekleyin (PMA'nın nihai konsantrasyonu 50 nM'dir).
  4. Plakayı önceden ısıtılmış bir mikroplaka okuyucuya aktarın. Plakayı 35 °C'de 4 saat inkübe edin, her 5 dakikada bir plakanın altından floresan ölçümleri alın (485 nm uyarma ve 528 nm emisyon filtrelerini kullanarak).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlıklı bireylerde düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN), PBMC'nin yaklaşık% 5'ini temsil eder (Şekil 2A). Burada açıklanan protokol tipik olarak saf (%90'>) LDN sağlar. Hücreler ayrıca yüksek canlılık (%98) ile verimli bir şekilde geri kazanılır (%> %95 verim); Şekil 2B). Karşılaştırma için, LDN ayrıca daha önce tarif edildiği gibi floresanla aktive olan hücre sıralaması ile saflaştırıldı22. Kısaca, P...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genel olarak, nötrofiller homojen hücreler olarak düşünüldü. Bununla birlikte, son kanıtlar, nötrofillerin farklı aktivasyon durumlarına ve/veya çoklu fenotiplere sahip hücreler olarak var olabileceğini göstermiştir. Bu nedenle, çeşitli nötrofil alt popülasyonları mevcut olabilir 13,14,15. Bir nötrofil alt popülasyonu olan düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN), belirli içsel özellikleri ve ayrıca ç...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak algılanabilecek herhangi bir ticari veya finansal bağ olmaksızın gerçekleştirildiğini belirtmektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, NET'leri görselleştirmek için floresan mikroskobu konusundaki yardımlarından dolayı César Díaz-Godínez'e (Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM) teşekkür eder. Bu araştırma, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Meksika'dan PAPIIT IN205523 hibesi ve Secretaría de Ciencias, Humanidades, Tecnología e Inovación (Secihti), Meksika'dan CF-2023-I-610 hibesi ile desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  Anti-Sitrullin tavşan poliklonal antikorAbCamAB1009321/50 seyreltme
96 kuyuklu doku kültürü plakasıYardımcı oyuncu; Corning, Inc.3596
Alexa Fluor 488 insan karşıtı CD11b fare IgG1 antikoruBioLegend3013170.25 μ g/mL
Alexa Fluor 647 insan karşıtı CD66b fare IgM antikoruBioLegend3051090.05 μ g/mL
Fare Karşıtı IgG (H+L) keçi antikoru, Alexa Fluor 488Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-110011/50 seyreltme
Anti-Nötrofil Elastaz fare monoklonal IgG1 antikoruSanta Cruz BiyoteknolojisiSC-5554910 µ g/mL
Anti-Tavşan IgG (H+L) eşek antikoru, Alexa Fluor 555Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-315721/50 seyreltme
APC anti-insan CD62L fare IgG1 antikoruBioLegend3048090.03 μ g/mL
APC/Siyanin7 insan karşıtı CD14 fare IgG1 antikoruBioLegend3671070.25 μ g/mL
Attune NxT akış sitometresi Thermo Fisher Scientific, Inc.(mavi/kırmızı lazerler)
Sığır serum albümini (BSA) Fraction VMP Biyomedikal810025
Brilliant Violet 510 insan karşıtı CD33 fare IgG1 antikoruBioLegend3666090.30 μ g/mL
DAPICalbiochem/EMD Millipore268298
Dextran T500Farmakosmolar Klima5.51005E+11
Dihidrorodamin-123Anaspec, Inc.AS-85711
FACS hücre sorucuBecton Dickinson Model FACSAria
Fetal sığır serumu (FBS)Gibco16000-044
Ficoll-PaqueMerck KGGE 17-1440-03
FITC anti-insan CD98 fare IgG1 antikoruBioLegend3156030.30 μ g/mL
FlowJo SoftwareBecton DickinsonSürüm 10, 2019
Flüoresans ters mikroskopOlympusModel IX-70
HeparinInhepar - PiSA Farmaceutica36601495000 UI/mL
HepesSigma AldrichH7006
MACSprep Chimerism CD66b MikroboncuklarMiltenyi Biotec130-111-552
MıknatısMiltenyi Biotec130-042-102
Manyetik ayırma kolonuMiltenyi Biotec130-042-201
MikrosantrifüjEppendorfModel 5415C
Microplate okuyucuBioTek InstrumentsModel Sinerjisi HT
ParaformaldehitSigma Aldrich158127
PE anti-insan CD10 fare IgG1 antikoruBioLegend3122030.05 μ g/mL
PE anti-insan CD16b fare IgG2a antikoruBD Pharmingen5508681/40 seyrelme
PE/Siyanin5 anti-insan CD15 fare IgG1 antikoruBioLegend3230130.25 μ g/mL
Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)Sigma AldrichP8139
Poli-L-LisinSigma AldrichP2658
Soğutmalı santrifüjEppendorfModel 5702R
RPMI-1640 doku kültürü ortamıGibco23400-021
SYTOX YeşilMolecular Probes, Inc.S-7020
Tween-20 Sigma AldrichP2287
VectashieldVektör LaboratuvarlarıH-1000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yvan-Charvet, L., Ng, L. G. Granulopoiesis and neutrophil homeostasis: A metabolic, daily balancing act. Trends Immunol. 40 (7), 598-612 (2019).
  2. Liew, P. X., Kubes, P. The neutrophil's role during health and disease. Physiol. Rev. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  3. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: A fundamental process in immunity. Biomed Res Int. 2017, 9042851(2017).
  4. Uribe-Querol, E., Rosales, C. Phagocytosis: Our current understanding of a universal biological process. Front Immunol. 11, 1066(2020).
  5. Faurschou, M., Borregaard, N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation. Microbes Infect. 5 (14), 1317-1327 (2003).
  6. Lacy, P., Eitzen, G. Control of granule exocytosis in neutrophils. Front Biosci. 13, 5559-5570 (2008).
  7. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  8. Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. J Leukoc Biol. 108 (1), 377-396 (2020).
  9. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  10. Lawrence, S. M., Corriden, R., Nizet, V. The ontogeny of a neutrophil: Mechanisms of granulopoiesis and homeostasis. Microbiol Mol Biol. Rev. 82 (1), e00057-e00117 (2018).
  11. Aroca-Crevillén, A., Vicanolo, T., Ovadia, S., Hidalgo, A. Neutrophils in physiology and pathology. Annu Rev Pathol. 19, 227-259 (2024).
  12. Hellebrekers, P., Vrisekoop, N., Koenderman, L. Neutrophil phenotypes in health and disease. Eur J Clin Invest. 48 (Suppl 2), e12943(2018).
  13. Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nat Rev Immunol. 19 (4), 255-265 (2019).
  14. Qu, J., Jin, J., Zhang, M., Ng, L. G. Neutrophil diversity and plasticity: Implications for organ transplantation. Cell Mol Immunol. 20 (9), 993-1001 (2023).
  15. Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Front Physiol. 9, 113(2018).
  16. Silvestre-Roig, C., Fridlender, Z. G., Glogauer, M., Scapini, P. Neutrophil diversity in health and disease. Trends Immunol. 40 (7), 565-583 (2019).
  17. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes in systemic autoimmunity and autoinflammation. Immunol Rev. 314 (1), 313-325 (2023).
  18. Ning, X., Wang, W. M., Jin, H. Z. Low-density granulocytes in immune-mediated inflammatory diseases. J Immunol. 2022, 1622160(2022).
  19. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis Rheum. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  20. Böyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  21. García-García, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J Vis Exp. (74), e50410(2013).
  22. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Front Immunol. 12, 672520(2021).
  23. Midgley, A., Beresford, M. W. Increased expression of low-density granulocytes in juvenile-onset systemic lupus erythematosus patients correlates with disease activity. Lupus. 25 (4), 407-411 (2016).
  24. Rahman, S., et al. Low-density granulocytes activate T cells and demonstrate a non-suppressive role in systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 78 (7), 957-966 (2019).
  25. Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low-density subpopulations and CD10 (calla) negative neutrophils in severely infected patients. Surg Today. 22, 322-327 (1992).
  26. Lin, A. M., et al. Mast cells and neutrophils release IL-17 through extracellular trap formation in psoriasis. J Immunol. 187 (1), 490-500 (2011).
  27. Fu, J., Tobin, M. C., Thomas, L. L. Neutrophil-like low-density granulocytes are elevated in patients with moderate to severe persistent asthma. Ann Allergy Asthma Immunol. 113 (6), 635-640 (2014).
  28. Ramanathan, K., et al. Neutrophil activation signature in juvenile idiopathic arthritis indicates the presence of low-density granulocytes. Rheumatology (Oxford). 57 (3), 488-498 (2018).
  29. Grayson, P. C., et al. Neutrophil-related gene expression and low-density granulocytes associated with disease activity and response to treatment in antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis. Arthritis Rheumatol. 67 (7), 1922-1932 (2015).
  30. Cloke, T., Munder, M., Taylor, G., Müller, I., Kropf, P. Characterization of a novel population of low-density granulocytes associated with disease severity in HIV-1 infection. PLoS One. 7, e48939(2012).
  31. Rocha, B. C., et al. Type I interferon transcriptional signature in neutrophils and low-density granulocytes is associated with tissue damage in malaria. Cell Rep. 13 (12), 2829-2841 (2015).
  32. Deng, Y., et al. Low-density granulocytes are elevated in mycobacterial infection and associated with the severity of tuberculosis. PLoS One. 11 (4), e0153567(2016).
  33. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
  34. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  35. Sagiv, J. Y., et al. Phenotypic diversity and plasticity in circulating neutrophil subpopulations in cancer. Cell Rep. 10 (4), 562-573 (2015).
  36. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The multifaceted roles neutrophils play in the tumor microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (December), 125-158 (2015).
  37. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. J Leukoc Biol. 107 (5), 809-818 (2020).
  38. Vanhaver, C., et al. Immunosuppressive low-density neutrophils in the blood of cancer patients display a mature phenotype. Life Sci Alliance. 7 (1), e202302332(2023).
  39. Dwivedi, A., et al. Emergence of dysfunctional neutrophils with a defect in arginase-1 release in severe COVID-19. JCI Insight. 9 (17), e171659(2024).
  40. Cabrera, L. E., et al. Characterization of low-density granulocytes in COVID-19. PLoS Pathog. 17 (7), e1009721(2021).
  41. Dumont, B. L., et al. Low-density neutrophils and neutrophil extracellular traps (nets) are new inflammatory players in heart failure. Can J Cardiol. 40 (9), 1524-1535 (2024).
  42. Dumont, B. L., et al. Low-density neutrophils contribute to subclinical inflammation in patients with type 2 diabetes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1674(2024).
  43. Jones, B. E., et al. Anca autoantigen gene expression highlights neutrophil heterogeneity, where expression in normal-density neutrophils correlates with anca-induced activation. Kidney Int. 98 (3), 744-757 (2020).
  44. Li, Y., et al. The proportion, origin, and pro-inflammation roles of low-density neutrophils in SFTS disease. BMC Infect. Dis. 19 (1), 109(2019).
  45. Martin, K. R., et al. Cd98 defines a metabolically flexible, proinflammatory subset of low-density neutrophils in systemic lupus erythematosus. Clin Transl Med. 13 (1), e1150(2023).
  46. Murphy, M. P., Caraher, E. Mcl-1 is vital for neutrophil survival. Immunol Res. 62 (2), 225-233 (2015).
  47. Nauseef, W. M. Neutrophils, from cradle to grave and beyond. Immunol Rev. 273 (1), 5-10 (2016).
  48. Pérez-Figueroa, E., Álvarez-Carrasco, P., Ortega, E., Maldonado-Bernal, C. Neutrophils: Many ways to die. Front Immunol. 12, 631821(2021).
  49. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: How to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), e1724(2010).
  50. Emmendörffer, A., Hecht, M., Lohmann-Matthes, M. L., Roesler, J. A fast and easy method to determine the production of reactive oxygen intermediates by human and murine phagocytes using dihydrorhodamine 123. J Immunol Methods. 131 (2), 269-227 (1990).
  51. Pioch, J., Blomgran, R. Optimized flow cytometry protocol for dihydrorhodamine 123-based detection of reactive oxygen species in leukocyte subpopulations in whole blood. J Immunol Methods. 507, 113308(2022).
  52. Liu, X., et al. Pad4 takes charge during neutrophil activation: Impact of pad4 mediated net formation on immune-mediated disease. J Thromb Haemost. 19 (7), 1607-1617 (2021).
  53. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
  54. Alemán, O. R., Mora, N., Cortes-Vieyra, R., Uribe-Querol, E., Rosales, C. Transforming growth factor-β-activated kinase 1 is required for human fcγriiib-induced neutrophil extracellular trap formation. Front Immunol. 7, 277(2016).
  55. Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent net release with immune complexes. Autoimmun Rev. 15 (6), 577-584 (2016).
  56. Sanchez Gonzalez, A., Bardoel, B. W., Harbort, C. J., Zychlinsky, A. Neutrophil methods and protocols. , Humana Press - Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  57. Mishalian, I., Granot, Z., Fridlender, Z. G. The diversity of circulating neutrophils in cancer. Immunobiology. 222 (1), 82-88 (2017).
  58. Wright, H. L., Makki, F. A., Moots, R. J., Edwards, S. W. Low-density granulocytes: Functionally distinct, immature neutrophils in rheumatoid arthritis with altered properties and defective TNF signalling. J Leukoc Biol. 101 (2), 599-611 (2017).
  59. Bruger, A. M., et al. How to measure the immunosuppressive activity of mdsc: Assays, problems and potential solutions. Cancer Immunol Immunother. 68 (4), 631-644 (2019).
  60. Kimberly, R. P., Ahlstrom, J. W., Click, M. E., Edberg, J. C. The glycosyl phosphatidylinositol-linked FCγRIII PMN mediates transmembrane signaling events distinct from FCγRII. J Exp Med. 171 (4), 1239-1255 (1990).
  61. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Fc receptors: Cell activators of antibody functions. Adv Biosci Biotech. 4, 21-33 (2013).
  62. Unkeless, J. C., Shen, Z., Lin, C. W., Debeus, E. Function of human fcγriia and fcγriiib. Semin Immunol. 7 (1), 37-44 (1995).
  63. Ghaemdoust, F., Keshavarz-Fathi, M., Rezaei, N. Natural killer cells and cancer therapy, what we know and where we are going. Immunotherapy. 11 (14), 1231-1251 (2019).
  64. Lanier, L. L., Le, A. M., Civin, C. I., Loken, M. R., Phillips, J. H. The relationship of CD16 (leu-11) and leu-19 (NKH-1) antigen expression on human peripheral blood NK cells and cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 136 (12), 4480-4486 (1986).
  65. Huizinga, T. W., et al. The pi-linked receptor fcriii is released on stimulation of neutrophils. Nature. 333 (6174), 667-669 (1988).
  66. Jongstra-Bilen, J., Harrison, R., Grinstein, S. Fcγ-receptors induce mac-1 (cd11b/cd18) mobilization and accumulation in the phagocytic cup for optimal phagocytosis. J Biol Chem. 278 (46), 45720-45729 (2003).
  67. Tak, T., et al. Human CD62Ldim neutrophils identified as a separate subset by proteome profiling and in vivo pulse-chase labeling. Blood. 129 (26), 3476-3485 (2017).
  68. Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Exp Cell Res. 342 (2), 200-209 (2016).
  69. Schröder, A. K., Uciechowski, P., Fleischer, D., Rink, L. Crosslinking of CD66 b on peripheral blood neutrophils mediates the release of interleukin-8 from intracellular storage. Hum Immunol. 67 (9), 676-682 (2006).
  70. Skubitz, K. M., Campbell, K. D., Skubitz, A. P. Cd66a, cd66b, cd66c, and cd66d each independently stimulate neutrophils. J Leukoc Biol. 60 (1), 106-117 (1996).
  71. Basic principle of magnetic cell separation. , Miltenyi Biotec. https://www.miltenyibiotec.com/UN-en/products/macs-cell-separation/basic-principle-of-magnetic-cell-separation.html?query=:relevance:allCategoriesOR:10000089 (2025).
  72. Connelly, A. N., et al. Optimization of methods for the accurate characterization of whole blood neutrophils. Sci. Rep. 12 (1), 3667(2022).
  73. Hardisty, G. R., et al. High purity isolation of low density neutrophils casts doubt on their exceptionality in health and disease. Front Immunol. 12, 625922(2021).
  74. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. J Clin Invest. 126 (5), 1612-1620 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Low Density NeutrophilsMagnetic MicrobeadsNeutrophil PurificationDensity GradientPeripheral BloodFlow CytometryMononuclear CellsReactive Oxygen SpeciesNeutrophil Extracellular TrapsCD66b Marker

Related Articles