Düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN) birçok hastalıkta önemli ölçüde artar. LDN genellikle hücre sıralaması yoluyla izole edilir. Saf ve canlı LDN elde etmek için pratik bir yöntem sunuyoruz. Periferik kanın yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesinden sonra, hücreler manyetik mikro boncuklarla inkübe edilir ve daha sonra LDN, manyetik kolonlar aracılığıyla ayrılır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Düşük Yoğunluklu Nötrofillerin Verimli Saflaştırılması için Hızlı Manyetik-mikro Boncuk Yöntemi
Bu makalede
Özet
Özet
Doğuştan gelen bağışıklığın önemli lökositleri olan nötrofiller, geleneksel olarak homojen bir hücre popülasyonu olarak kabul edilmiştir. Bununla birlikte, son kanıtlar nötrofillerin birkaç alt popülasyonda var olduğunu göstermiştir. Böyle bir alt popülasyon, düşük yoğunluklu nötrofillerdir (LDN). LDN, sağlıklı bireylerin kanında az sayıda bulunur, ancak sistemik lupus eritematozus, otoimmün bozukluklar, kanser ve enfeksiyonlar gibi hastalıklarda sayıları önemli ölçüde artar. Bu durumlarda, LDN hastalığın patogenezine katılabilir. LDN'yi izole etmenin tek yolu, periferik kanın yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesidir. Bununla birlikte, santrifüjlemeden sonra LDN, mononükleer hücrelerle birlikte saflaştırılır. Bu nedenle, bu nötrofil alt popülasyonunu incelemek zordur. LDN'yi mononükleer hücrelerden ayırmak için standart bir metodoloji yoktur. Tipik olarak, LDN, bir akış sitometresinde hücre sıralaması ile ayrılır. Bununla birlikte, bu yöntem, daha ileri fonksiyonel çalışmalar için yeterli saf hücre elde etmek için uzun sıralama süreleri (saatler) gerektirir. Bu, hücrelerin canlılığını ve işlevini ciddi şekilde etkiler. Burada, kısa sürede çok sayıda saf ve canlı LDN elde etmek için pratik bir yöntem öneriyoruz. Yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeden sonra, mononükleer hücre fraksiyonu anti-CD66b manyetik mikro boncuklarla inkübe edilir ve daha sonra LDN, < 30 dakika içinde manyetik kolonlardan ayrılır. Saflaştırılmış LDN (CD66b+ hücreleri), CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b ve CD98'e karşı monoklonal antikorlarla etiketlenir ve doğrulama için akış sitometrisi ile analiz edilir. Saflaştırılmış LDN, reaktif oksijen türleri üretme ve nötrofil hücre dışı tuzaklar oluşturma kapasitelerinin gösterdiği gibi tamamen işlevseldir. Bu yeni saflaştırma yöntemi, kısa sürede yüksek saflıkta (%90'dan fazla) ve canlılıkta (%96'dan fazla) LDN ile sonuçlanır. Bu yöntem, biyokimyasal veya diğer omik analizler yoluyla farklı hastalıklarda LDN fonksiyonlarını değerlendirmek için çok sayıda saf LDN elde etmek üzere kolayca ölçeklendirilebilir.
Giriş
İnsan kanında1 baskın lökositler olan nötrofiller, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin kilit katılımcılarıdır. İltihaplı veya enfeksiyonlu dokulara çok sayıda ulaşırlar2. Burada nötrofiller, fagositoz 3,4, degranülasyon 5,6 ve nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) oluşumu gibi çeşitli efektör fonksiyonları aktive eder7. Ek olarak, nötrofiller de adaptif bağışıklık tepkisine katılır8. Nötrofillerin klasik görüşü, onları k....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokoldeki tüm prosedürler, Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México'daki (UNAM) İnsan Araştırmaları Biyoetik Komitesi'nin yönergelerini takip eder. Tüm katılımcılar bilgilendirilmiş onam verdi.
1. Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) ve nötrofillerin insan kanından izolasyonu
- Damar delinmesi yoluyla sağlıklı bir yetişkin gönüllüden yaklaşık 10 mL kan alın. Antikoagülan olarak 10 U/mL heparin ekleyin.
DİKKAT: İğneyi biyolojik tehlike içeren bir iğne imha kabına atın. Şırıngalar ve kanla temas eden diğer malzemeler atılmadan önce bir torba....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sağlıklı bireylerde düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN), PBMC'nin yaklaşık% 5'ini temsil eder (Şekil 2A). Burada açıklanan protokol tipik olarak saf (%90'>) LDN sağlar. Hücreler ayrıca yüksek canlılık (%98) ile verimli bir şekilde geri kazanılır (%> %95 verim); Şekil 2B). Karşılaştırma için, LDN ayrıca daha önce tarif edildiği gibi floresanla aktive olan hücre sıralaması ile saflaştırıldı22. Kısaca, P.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Genel olarak, nötrofiller homojen hücreler olarak düşünüldü. Bununla birlikte, son kanıtlar, nötrofillerin farklı aktivasyon durumlarına ve/veya çoklu fenotiplere sahip hücreler olarak var olabileceğini göstermiştir. Bu nedenle, çeşitli nötrofil alt popülasyonları mevcut olabilir 13,14,15. Bir nötrofil alt popülasyonu olan düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN), belirli içsel özellikleri ve ayrıca ç.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, bu çalışmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak algılanabilecek herhangi bir ticari veya finansal bağ olmaksızın gerçekleştirildiğini belirtmektedir.
Teşekkürler
Yazarlar, NET'leri görselleştirmek için floresan mikroskobu konusundaki yardımlarından dolayı César Díaz-Godínez'e (Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM) teşekkür eder. Bu araştırma, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Meksika'dan PAPIIT IN205523 hibesi ve Secretaría de Ciencias, Humanidades, Tecnología e Inovación (Secihti), Meksika'dan CF-2023-I-610 hibesi ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anti-Sitrullin tavşan poliklonal antikor | AbCam | AB100932 | 1/50 seyreltme |
| 96 kuyuklu doku kültürü plakası | Yardımcı oyuncu; Corning, Inc. | 3596 | |
| Alexa Fluor 488 insan karşıtı CD11b fare IgG1 antikoru | BioLegend | 301317 | 0.25 μ g/mL |
| Alexa Fluor 647 insan karşıtı CD66b fare IgM antikoru | BioLegend | 305109 | 0.05 μ g/mL |
| Fare Karşıtı IgG (H+L) keçi antikoru, Alexa Fluor 488 | Invitrogen - Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1/50 seyreltme |
| Anti-Nötrofil Elastaz fare monoklonal IgG1 antikoru | Santa Cruz Biyoteknolojisi | SC-55549 | 10 µ g/mL |
| Anti-Tavşan IgG (H+L) eşek antikoru, Alexa Fluor 555 | Invitrogen - Thermo Fisher Scientific | A-31572 | 1/50 seyreltme |
| APC anti-insan CD62L fare IgG1 antikoru | BioLegend | 304809 | 0.03 μ g/mL |
| APC/Siyanin7 insan karşıtı CD14 fare IgG1 antikoru | BioLegend | 367107 | 0.25 μ g/mL |
| Attune NxT akış sitometresi | Thermo Fisher Scientific, Inc. | (mavi/kırmızı lazerler) | |
| Sığır serum albümini (BSA) Fraction V | MP Biyomedikal | 810025 | |
| Brilliant Violet 510 insan karşıtı CD33 fare IgG1 antikoru | BioLegend | 366609 | 0.30 μ g/mL |
| DAPI | Calbiochem/EMD Millipore | 268298 | |
| Dextran T500 | Farmakosmolar Klima | 5.51005E+11 | |
| Dihidrorodamin-123 | Anaspec, Inc. | AS-85711 | |
| FACS hücre sorucu | Becton Dickinson | Model FACSAria | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Ficoll-Paque | Merck KG | GE 17-1440-03 | |
| FITC anti-insan CD98 fare IgG1 antikoru | BioLegend | 315603 | 0.30 μ g/mL |
| FlowJo Software | Becton Dickinson | Sürüm 10, 2019 | |
| Flüoresans ters mikroskop | Olympus | Model IX-70 | |
| Heparin | Inhepar - PiSA Farmaceutica | 3660149 | 5000 UI/mL |
| Hepes | Sigma Aldrich | H7006 | |
| MACSprep Chimerism CD66b Mikroboncuklar | Miltenyi Biotec | 130-111-552 | |
| Mıknatıs | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Manyetik ayırma kolonu | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Mikrosantrifüj | Eppendorf | Model 5415C | |
| Microplate okuyucu | BioTek Instruments | Model Sinerjisi HT | |
| Paraformaldehit | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PE anti-insan CD10 fare IgG1 antikoru | BioLegend | 312203 | 0.05 μ g/mL |
| PE anti-insan CD16b fare IgG2a antikoru | BD Pharmingen | 550868 | 1/40 seyrelme |
| PE/Siyanin5 anti-insan CD15 fare IgG1 antikoru | BioLegend | 323013 | 0.25 μ g/mL |
| Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA) | Sigma Aldrich | P8139 | |
| Poli-L-Lisin | Sigma Aldrich | P2658 | |
| Soğutmalı santrifüj | Eppendorf | Model 5702R | |
| RPMI-1640 doku kültürü ortamı | Gibco | 23400-021 | |
| SYTOX Yeşil | Molecular Probes, Inc. | S-7020 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P2287 | |
| Vectashield | Vektör Laboratuvarları | H-1000 |
Kaynaklar
- Yvan-Charvet, L., Ng, L. G. Granulopoiesis and neutrophil homeostasis: A metabolic, daily balancing act. Trends Immunol. 40 (7), 598-612 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The neutrophil's role during health and disease. Physiol. Rev. 99 (2), 1223-1248 (2019).<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
