Düşük Yoğunluklu Nötrofillerin Verimli Saflaştırılması için Hızlı Manyetik-mikro Boncuk Yöntemi

Summary

Düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN) birçok hastalıkta önemli ölçüde artar. LDN genellikle hücre sıralaması yoluyla izole edilir. Saf ve canlı LDN elde etmek için pratik bir yöntem sunuyoruz. Periferik kanın yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesinden sonra, hücreler manyetik mikro boncuklarla inkübe edilir ve daha sonra LDN, manyetik kolonlar aracılığıyla ayrılır.

Abstract

Doğuştan gelen bağışıklığın önemli lökositleri olan nötrofiller, geleneksel olarak homojen bir hücre popülasyonu olarak kabul edilmiştir. Bununla birlikte, son kanıtlar nötrofillerin birkaç alt popülasyonda var olduğunu göstermiştir. Böyle bir alt popülasyon, düşük yoğunluklu nötrofillerdir (LDN). LDN, sağlıklı bireylerin kanında az sayıda bulunur, ancak sistemik lupus eritematozus, otoimmün bozukluklar, kanser ve enfeksiyonlar gibi hastalıklarda sayıları önemli ölçüde artar. Bu durumlarda, LDN hastalığın patogenezine katılabilir. LDN'yi izole etmenin tek yolu, periferik kanın yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesidir. Bununla birlikte, santrifüjlemeden sonra LDN, mononükleer hücrelerle birlikte saflaştırılır. Bu nedenle, bu nötrofil alt popülasyonunu incelemek zordur. LDN'yi mononükleer hücrelerden ayırmak için standart bir metodoloji yoktur. Tipik olarak, LDN, bir akış sitometresinde hücre sıralaması ile ayrılır. Bununla birlikte, bu yöntem, daha ileri fonksiyonel çalışmalar için yeterli saf hücre elde etmek için uzun sıralama süreleri (saatler) gerektirir. Bu, hücrelerin canlılığını ve işlevini ciddi şekilde etkiler. Burada, kısa sürede çok sayıda saf ve canlı LDN elde etmek için pratik bir yöntem öneriyoruz. Yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeden sonra, mononükleer hücre fraksiyonu anti-CD66b manyetik mikro boncuklarla inkübe edilir ve daha sonra LDN, < 30 dakika içinde manyetik kolonlardan ayrılır. Saflaştırılmış LDN (CD66b⁺ hücreleri), CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b ve CD98'e karşı monoklonal antikorlarla etiketlenir ve doğrulama için akış sitometrisi ile analiz edilir. Saflaştırılmış LDN, reaktif oksijen türleri üretme ve nötrofil hücre dışı tuzaklar oluşturma kapasitelerinin gösterdiği gibi tamamen işlevseldir. Bu yeni saflaştırma yöntemi, kısa sürede yüksek saflıkta (%90'dan fazla) ve canlılıkta (%96'dan fazla) LDN ile sonuçlanır. Bu yöntem, biyokimyasal veya diğer omik analizler yoluyla farklı hastalıklarda LDN fonksiyonlarını değerlendirmek için çok sayıda saf LDN elde etmek üzere kolayca ölçeklendirilebilir.

Introduction

İnsan kanında¹ baskın lökositler olan nötrofiller, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin kilit katılımcılarıdır. İltihaplı veya enfeksiyonlu dokulara çok sayıda ulaşırlar². Burada nötrofiller, fagositoz ^3,4, degranülasyon ^5,6 ve nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) oluşumu gibi çeşitli efektör fonksiyonları aktive ^eder7. Ek olarak, nötrofiller de adaptif bağışıklık tepkisine katılır⁸. Nötrofillerin klasik görüşü, onları k....

Protocol

Bu protokoldeki tüm prosedürler, Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México'daki (UNAM) İnsan Araştırmaları Biyoetik Komitesi'nin yönergelerini takip eder. Tüm katılımcılar bilgilendirilmiş onam verdi.

1. Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) ve nötrofillerin insan kanından izolasyonu

1. Damar delinmesi yoluyla sağlıklı bir yetişkin gönüllüden yaklaşık 10 mL kan alın. Antikoagülan olarak 10 U/mL heparin ekleyin.
   DİKKAT: İğneyi biyolojik tehlike içeren bir iğne imha kabına atın. Şırıngalar ve kanla temas eden diğer malzemeler atılmadan önce bir torba....

Results

Sağlıklı bireylerde düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN), PBMC'nin yaklaşık% 5'ini temsil eder (Şekil 2A). Burada açıklanan protokol tipik olarak saf (%90'>) LDN sağlar. Hücreler ayrıca yüksek canlılık (%98) ile verimli bir şekilde geri kazanılır (%> %95 verim); Şekil 2B). Karşılaştırma için, LDN ayrıca daha önce tarif edildiği gibi floresanla aktive olan hücre sıralaması ile saflaştırıldı

Discussion

Genel olarak, nötrofiller homojen hücreler olarak düşünüldü. Bununla birlikte, son kanıtlar, nötrofillerin farklı aktivasyon durumlarına ve/veya çoklu fenotiplere sahip hücreler olarak var olabileceğini göstermiştir. Bu nedenle, çeşitli nötrofil alt popülasyonları mevcut olabilir 13,14,15. Bir nötrofil alt popülasyonu olan düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN), belirli içsel özellikleri ve ayrıca ç.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Sitrullin tavşan poliklonal antikor	AbCam	AB100932	1/50 seyreltme
96 kuyuklu doku kültürü plakası	Yardımcı oyuncu; Corning, Inc.	3596
Alexa Fluor 488 insan karşıtı CD11b fare IgG1 antikoru	BioLegend	301317	0.25 μ g/mL
Alexa Fluor 647 insan karşıtı CD66b fare IgM antikoru	BioLegend	305109	0.05 μ g/mL
Fare Karşıtı IgG (H+L) keçi antikoru, Alexa Fluor 488	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-11001	1/50 seyreltme
Anti-Nötrofil Elastaz fare monoklonal IgG1 antikoru	Santa Cruz Biyoteknolojisi	SC-55549	10 µ g/mL
Anti-Tavşan IgG (H+L) eşek antikoru, Alexa Fluor 555	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-31572	1/50 seyreltme
APC anti-insan CD62L fare IgG1 antikoru	BioLegend	304809	0.03 μ g/mL
APC/Siyanin7 insan karşıtı CD14 fare IgG1 antikoru	BioLegend	367107	0.25 μ g/mL
Attune NxT akış sitometresi	Thermo Fisher Scientific, Inc.	(mavi/kırmızı lazerler)
Sığır serum albümini (BSA) Fraction V	MP Biyomedikal	810025
Brilliant Violet 510 insan karşıtı CD33 fare IgG1 antikoru	BioLegend	366609	0.30 μ g/mL
DAPI	Calbiochem/EMD Millipore	268298
Dextran T500	Farmakosmolar Klima	5.51005E+11
Dihidrorodamin-123	Anaspec, Inc.	AS-85711
FACS hücre sorucu	Becton Dickinson	Model FACSAria
Fetal sığır serumu (FBS)	Gibco	16000-044
Ficoll-Paque	Merck KG	GE 17-1440-03
FITC anti-insan CD98 fare IgG1 antikoru	BioLegend	315603	0.30 μ g/mL
FlowJo Software	Becton Dickinson	Sürüm 10, 2019
Flüoresans ters mikroskop	Olympus	Model IX-70
Heparin	Inhepar - PiSA Farmaceutica	3660149	5000 UI/mL
Hepes	Sigma Aldrich	H7006
MACSprep Chimerism CD66b Mikroboncuklar	Miltenyi Biotec	130-111-552
Mıknatıs	Miltenyi Biotec	130-042-102
Manyetik ayırma kolonu	Miltenyi Biotec	130-042-201
Mikrosantrifüj	Eppendorf	Model 5415C
Microplate okuyucu	BioTek Instruments	Model Sinerjisi HT
Paraformaldehit	Sigma Aldrich	158127
PE anti-insan CD10 fare IgG1 antikoru	BioLegend	312203	0.05 μ g/mL
PE anti-insan CD16b fare IgG2a antikoru	BD Pharmingen	550868	1/40 seyrelme
PE/Siyanin5 anti-insan CD15 fare IgG1 antikoru	BioLegend	323013	0.25 μ g/mL
Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)	Sigma Aldrich	P8139
Poli-L-Lisin	Sigma Aldrich	P2658
Soğutmalı santrifüj	Eppendorf	Model 5702R
RPMI-1640 doku kültürü ortamı	Gibco	23400-021
SYTOX Yeşil	Molecular Probes, Inc.	S-7020
Tween-20	Sigma Aldrich	P2287
Vectashield	Vektör Laboratuvarları	H-1000