Yöntem makalesi

Diopatra claparedii'de Ön Rejenerasyonun Morfoloji Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/69421

⸱

13 Mart 2026

 ,  ,  , 
1Faculty of Science and Marine Environment, Universiti Malaysia Terengganu, 2STEM Foundation Centre, Universiti Malaysia Terengganu

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Diopatra claparedii'de ön rejenerasyon sürecini karakterize etmek için odaklı bir çerçeve sağlar ve gelecekteki rejeneratif çalışmalar için kritik bir adım olarak hizmet eder.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polihetler, yaralanma veya kendi kendine amputasyon sonrası ön ve arka segmentleri yenileme yeteneğine sahiptir; bu da yara onarımı ve doku desenini incelemek için kolayca yönetilebilir bir sistem sunar. Annelid rejenerasyonunda karşılaştırmalı ve mekanistik çalışmaları desteklemek için, bu çalışma Diopatra claparedii (D. claparedii) cinslerinde ön rejenerasyonun indüklenmesi ve karakterizasyonu için bir protokol sunmaktadır. Protokol, örnek yönetimi, immobilizasyon ve hassas amputasyon adımlarını belirtir; ardından rejenerasyon boyunca morfolojik ilerlemeyi belgelemek için planlanmış gözlem zaman noktaları gelir. D. claparedii, tüplerinden kör uçlu bir çubukla nazikçe çıkarıldı ve gevşeme indüklemek için %4 magnezyum klorür içinde immobilize edildi. Ön amputasyon 4. chaetiger'de stereomikroskop altında yapıldı ve yenilenme süreci amputasyon sonrası 1, 6, 15, 30 ve 60. günlerde izlendi. Bu işlem, anterior rejenerasyonun tutarlı bir şekilde indüklenmesini sağlar ve erken yara kapanışı, blastema oluşumu ve segment yeniden oluşması gibi temel morfolojik özellikleri yakalar. D. claparedii için tekrarlanabilir bir iş akışı ve morfolojik referans sağlayarak, bu protokol, annelid yenilenmesindeki hücresel veya moleküler süreçlerle morfolojik gözlemleri ilişkilendirmeyi amaçlayan gelecekteki araştırmaları destekleyecek pratik bir temel sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polihetler, tanımlanan tüm annelid türlerinin neredeyse %65'ini oluşturur ve bu da onları deniz omurgasızlarının en çeşitli gruplarındanbiri yapar 1. Yakın zamanda güncellenmiş bir polihet türleri (Annelida) kontrol listesi, Malezya kıyı sularından 30 ailede 47 cinse ait toplam 57 tür kaydetmiş olup, türlerin çoğunluğu (53 tür) MalezyaYarımadası'ndan rapor edilmiştir 2. Bunlar arasında, Diopatra claparedii (D. claparedii) Grube, 1878, yerel olarak ruat sarung olarak bilinen, Malezya'da ticari olarak işletilen polihet türlerinden biridir. Ağırlıklı olarak Malezya Yarımadası'nın batı kıyısındaki çamur düzlüklerinde, Jeram Plajı, Selangor 2,3 gibi alanlarda bulunur.

D. claparedii, Onuphidae familyasına dahildir ve hem ön hem de arka vücut segmentlerini yenileme yeteneğiyle tanınan, yerleşik ve tüpte yaşayan bir polihettir. Bu, merkezi ve periferik sinir sistemlerinin bileşenleriniiçerir 4. İyi tanımlanmış segmental vücut planı ve belirgin rejeneratif kapasitesi, D. claparedii'yi nispeten karmaşık biyolojik sistemlerde doku yenilenmesini araştırmak için umut vadeden ve yönetilebilir bir omurgasız model yapmaktadır. D. claparedii'nin yenilenme çalışmaları için model organizma olarak seçilmesi, ekolojik önemi, bölgesel önemi ve yenilenebilir kapasitesiyle ilgili bilimsel bilgi boşluklarından kaynaklanmaktadır. Bu tür ticari olarak toplanır ve Malezya'da balık yemi olarak yaygın olarak kullanılır; bu da yerel topluluklar tarafından iyi bilindiğini ve nadir sayılmadığınıgösterir 2,3. Bu nedenle, D. claparedii'de yenilenmenin araştırılması pratik ve ekonomik değere sahiptir; çünkü bulgular, bilimsel bilgiyi yerel paydaşlara yaymaya yardımcı olabilir ve rejeneratif mekanizmaların daha iyi anlaşılmasıyla popülasyon sürdürülebilirliğini desteklemek için stratejiler geliştirmeye yardımcı olabilir.

Ayrıca, D. claparedii Güneydoğu Asya genelinde özel bir coğrafi dağılıma sahiptir ve özellikle Malezya kıyı ekosistemlerinde yüksek temsilgörülür 2,3. Ancak, polihetler ve diğer annelidler üzerindeki çoğu rejenerasyon çalışması Amerika kıtası veya diğer Asya dışı bölgelerden gelen türlereodaklanmıştır 5,6. Örneğin, sıkça rejeneratif biyobelirteç türü olarak kullanılan iyi incelenmiş Diopatra neapolitana (D. neapolitana) Kızıldeniz, Hint Okyanusu, Akdeniz ve Atlantik Okyanusu'nu kapsayan geniş bir yayılıma sahiptir. Sonuç olarak, Güneydoğu Asya'ya özgü D. claparedii dahil annelidler üzerinde yapılan yenilenme araştırmaları sınırlı kalmaktadır.

Polihetler üzerinde yapılan önceki çalışmalar, yara kapanışı, blastema oluşumu ve segmental doku farklılaşması gibi belirgin ve tekrarlanabilir rejenerasyon evrelerigöstermiştir 7,8. D. claparedii üzerinde moleküler düzeyde çalışmalar daha önce bildirilmiş olsa da, özellikle rejenerasyona odaklanan araştırmalar nadirdir. Ayrıca, mevcut çalışmalar büyük ölçüde deneysel rejenerasyon protokollerinden ziyade moleküler karakterizasyona vurgu yapmıştır. Ayrıca, D. claparedii hem dedifferentiasyon hem de yeniden farklılaşma süreçleri gösterir; bu da daha yüksek organizmalardakilere daha benzer mekanizmalarıyansıtır 9. Rejeneratif yanıttaki bu karmaşıklık, polihetlerin değerli ara modeller olarak giderek daha fazla tanınmasını ortaya koymakta ve rejenerasyon çalışmalarında basit omurgasızlar ile karmaşık omurgalılar arasındaki boşluğu etkili bir şekilde kapatmaktadır.

Mevcut çalışma, D. claparedii için bir rejenerasyon protokolü oluşturup optimize ederek bu açığı gidermekte, bölgesel olarak önemli polihet türde gelecekteki fonksiyonel, gelişimsel ve moleküler araştırmalar için sağlam bir çerçeve sağlamaktadır. Özellikle, bu protokol polihetlerde rejenerasyonun ardışık aşamalarını ve altta yatan mekanizmalarını incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunar. Bu, yara iyileşmesi, blastema oluşumu ve segmentasyon gibi temel rejeneratif süreçlerin sistematik olarak gözlemlenmesini ve karakterizasyonunu mümkün kılar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik Bildirimi

Bu çalışma, Universiti Malaysia Terengganu Araştırma Etik Komitesi tarafından UMT/JKEPH/2026/173 onay numarasıyla onaylanmıştır

1. D. claparedii'nin Toplanması ve Alışkanlığı

  1. D. claparedii'yi, haliçin doğal yaşam alanı olan halaç intertidal bölgesinin (orta gelgit seviyesinde, orta ince kumlu) çamurlu düz bölgesinde konumlandırın.
  2. Polihet tüplerin üst kısmını, tüplerin zarar vermemesi için kürekle tortulu nazikçe kazarak kazın.
  3. Her tüpün içinde solucanın varlığını tüpü nazikçe sıkıştırarak ve hareket veya direnç olup olmadığını kontrol ederek doğrulayın.
  4. Yalnızca minimum gevşek vücut uzunluğu 5 cm olan örnekleri seçin.
    NOT: Polihetleri vücut uzunluğuna göre seçin, böylece taşıma hasarını azaltabilir ve tartı sırasında parçalanma önlenir.
  5. Laboratuvarda çevresel tutarlılığı korumak için aynı bölgelerden kürek kullanarak tortu toplayın.
  6. Toplanan örnekleri oda sıcaklığında taşınabilir soğutucu kaplarda laboratuvara taşıyor. Tüpleri deniz suyla nemlendirilmiş bir havluyla örtün, böylece nem korun ve geçiş sırasında stresi azaltın.
  7. Laboratuvarda, tortuldan kalıntıları manuel olarak ayırın, ardından malzeme doğrudan güneş ışığı altında tamamen kuruyana ve kalan nemden arınana kadar hava ile kurutulur.
  8. Diğer organizmaları (örneğin küçük yengeçler, deniz kabukları veya yabancı maddeler) çıkarır veya temizleyin, böylece tortunun kirleticilerden arınmış olduğundan emin olun.
  9. Polihet tüplerini yapay deniz suyu (ASW) ile durulayın, böylece yüzeye bağlı olan enkazları ve canlı organizmaları temizleyin.
    NOT: ASW yapmak için, 1,9 L deklorlu arıtılmış suya 1/4 bardak Instant Ocean Sea Tuzu karıştırın.
  10. Akvaryumları plastik akvaryum ile hazırlayın; orijinal alandan alınan tortuyla ve 23-25 ppt tuzluluğa ayarlanmış yapay ASW ile doldurun (Şekil 1). Alışkanlık süresi boyunca su sıcaklığını tutarlı olarak 28 °C olarak tutun.
    NOT: Kullanılan ASW hacmi 58 L idi ve akvaryumun boyutlarına göre belirlendi: 61,5 cm (L) x 32 cm (W) x 33,5 cm (H).
  11. D. claparedii'yi silindirik plastik kaplara (7 cm çap, 15 cm yükseklikte) aktarın; yarı doldurulmuş tortularla doldurulmuş, her kap başına bir poliket yoğunluğunda.
  12. Konteynerleri tamamen havalı ASW ile bir akvaryuma batırın. Polihetlerin kendilerini yeniden tesis edip kazmalarına izin verin.
  13. Polihetleri haftada 2-3 kez batma tipi balık yemiyle besleyin, böylece alışkanlık süresi boyunca sürekli beslenme sağlanır. Fazla yiyeceği düzenli olarak çıkararak birikim, mantar oluşumu ve kontaminasyonu önleyin.
  14. Alışkanlık, davranışsal gözlemlerle değerlendirildi; aktif keşif (vücut hareketi) ve yiyecek arama davranışı (uyaranlara yanıt) normal fizyolojik duruma dönüşü gösterdi.
    NOT: Herhangi bir deneysel prosedüre başlamadan önce iki haftalık bir alışkanlık süresi tanıyarak solucanların toplama sırasında oluşan stres veya kazara kesilmeden iyileşmesini sağlar.

2. Yenilenme

  1. Düzenli ve başarılı rejenerasyon sonuçlarını sağlamak için standart amputasyon alanı olarak chaetiger 4'üseçin 7,9.
    NOT: 4. Km'deki amputasyon noktasının seçimi ön bulgulara dayanmaktadır. Segment 10'u sadece gerekirse kullanın, çünkü daha yavaş yenilenir.
  2. ASW içinde %4 (ağırlık/hacim) magnezyum klorür heksahidrat (MgCl₂·6H₂O) içeren bir anestezi çözeltisi hazırlayın (1 L ASW'de 4 g MgCl₂·6H₂O).
  3. Poliheti ön açıklığa yerleştirilen kör uçlu bir çubukla tüpünden nazikçe itin.
    NOT: Çıkarma sırasında vücuda zarar vermekten kaçının.
  4. Sonra poliheti anestezi solüsyonuna batırın, tamamen gevşemiş ve hareketsiz hale gelene kadar (yaklaşık 15 dakika).
  5. Stereomikroskop altında sterilize edilmiş bir sbört kullanarak chaetiger 4'te amputasyon yapın; böylece hassasiyet ve minimum doku hasarı sağlanır (Şekil 1).
    NOT: Her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve bistüriyle ele geçirirken kesiklerden kaçınmak için özen gösterin.
  6. Solucanın arka kısmını forseps kullanarak orijinal tüpüne geri döndürün, ön ucu önce yerleştirerek doğal yeniden kazmayı kolaylaştırın.
  7. Bu prosedürden sonra, solucanları enfeksiyon, doku çürümesi veya ölüm belirtileri dahil olmak üzere davranış değişiklikleri ve fiziksel durum açısından günlük olarak izleyin.
    NOT: Anormal davranış, görünür nekroz veya ilerleyici bozulma gösteren bireyler iyileşmede başarısız sayılıyor ve daha fazla analizden dışlanıyordu.
  8. Bu aşamada yenilenme ilerleyene kadar yemeği tutmak, çünkü ağız bölgesi ön amputasyon nedeniyle yok. Ağzı geliştikten sonra, amputasyondan yaklaşık 60 gün sonra normal beslenme davranışına devam edin (p.a).
    NOT: Rejenerasyon süreci boyunca aynı çevresel koşulları (su tuzluluğu aralığı 23-25 ppt ve su sıcaklığı sürekli olarak 28 °C) koruyun.
  9. Belirli günlerde (1, 6, 15, 30 ve 60) başarılı şekilde yenilenmiş polihetlerin görüntülerini stereomikroskop ile yakalayın.
  10. 60 yıldan sonra tam rejenerasyon izlemesi

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D. claparedii'deki rejenerasyon süreci, tam baş rejenerasyonuna kadar sürekli izlenmiştir. Genel rejenerasyon modeli, D. neapolitana için bildirilen ile karşılaştırılabilirdi (Şekil 2). Amputasyon bölgesinde yara kapatılması, amputasyondan sonraki 1 gün içinde tamamlandı (p.a.). 6. güne gelindiğinde, hayatta kalan bireylerde net tanımlanmış bir blastema gözlemlendi ve bu aktif doku yenilenmesini gösteriyordu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deniz, tatlı su ve kara ortamlarında yaşayan segmentli solucanlardan oluşan annelidler, biyolojik organizasyonun birçok düzeyinde olağanüstü yenileyici yeteneklere sahiptir. Bunlar hücresel onarım ve germ hücre yenilenmesinden yapısal yeniden büyümeye ve bazı durumlarda küçük vücut parçalarından tam vücutyenilenmesine kadar uzanır. 8,10. Mevcut protokol, D. claparedii'nin ön rejenerasyonuna odaklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Araştırma çalışmaları, SZA'ya verilen TAPE Yetenek ve Yayın Geliştirme Araştırma Hibesi (55269) ile desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Yapay Deniz SuyuAnında Okyanus
Dijital Elde Taşınan Tuzlu HidrometreScionix
MgCl2· 6H2OSigmaM2670
Scapel
StereomikroskopLeica Microsystem
TeraBits Tam Balık YemiTetra
cımbız

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, D. T. Embryology and Phylogeny in Annelids and Arthropods. International Series of Monographs in Pure and Applied Biology Zoology. 50, Elsevier. (2013).
  2. Razmi Shah, R. S. B., Ibrahim, Y. S., Villalobos-Guerrero, T. F., Sato, M. Updated Checklist of Polychaete Species (Annelida) Recorded from Malaysia, with Remarks on the Research History. Biodivers. Data J. 11, e110021(2023).
  3. Idris, I., Arshad, A. Checklist of Polychaetous Annelids in Malaysia with Redescription of Two Commercially Exploited Species. Asian J. Anim. Vet. Adv. 8, 409-436 (2013).
  4. Rouse, G., Pleijel, F. Polychaetes. , Oxford University Press. (2001).
  5. Lindsay, S. M., Jackson, J. L., Forest, D. L. Morphology of Anterior Regeneration in Two Spionid Polychaete Species: Implications for Feeding Efficiency. Invertebr. Biol. 127, 65-79 (2008).
  6. Whitford, T. A., Williams, J. D. Anterior Regeneration in the Polychaete Marenzelleria viridis (Annelida: Spionidae). Invertebr. Biol. 135, 357-369 (2016).
  7. Pires, A. Studying Annelida Body Regeneration under Environmental Stress in Diopatra neapolitana. Methods Mol. Biol. 2450, 195-206 (2022).
  8. Kozin, V. V., Filippova, N. A., Kostyuchenko, R. P. Regeneration of the Nervous and Muscular System after Caudal Amputation in the Polychaete Alitta virens (Annelida: Nereididae). Russ. J. Dev. Biol. 48 (3), 198-210 (2017).
  9. Nazri, M. U. I. A., Mahmud, M. H., Saidi, B., Mat Isa, M. N., Ehsak, Z., Ross, O., Idris, I., Ismail, W. I. W. Cellular and Molecular Profiles of Anterior Nervous System Regeneration in Diopatra claparedii Grube, 1878 (Annelida, Polychaeta). Heliyon. 7 (2), e06307(2021).
  10. Bely, A. E. Early Events in Annelid Regeneration: A Cellular Perspective. Integr. Comp. Biol. 54 (4), 688-699 (2014).
  11. Górska, B., Gromisz, S., Włodarska-Kowalczuk, M. Size Assessment in Polychaete Worms-Application of Morphometric Correlations for Common North Atlantic Taxa. Limnol. Oceanogr. Methods. 17, 254-265 (2019).
  12. Qu, F., Nunnally, C., Rowe, G. T. Polychaete Annelid Biomass Size Spectra: The Effects of Hypoxia Stress. J. Mar. Sci. 983521, (2015).
  13. Galasso, H. L., Richard, M., Lefebvre, S., Aliaume, C., Callier, M. D. Body Size and Temperature Effects on Standard Metabolic Rate for Determining Metabolic Scope for Activity of the Polychaete Hediste (Nereis) diversicolor. PeerJ. 6, e5675(2018).
  14. Kostyuchenko, R. P., Kozin, V. V. Comparative Aspects of Annelid Regeneration: Towards Understanding the Mechanisms of Regeneration. Genes. 12 (8), 1148(2021).
  15. Pugliese, C., Mazza, R., Andrews, P. L., Cerra, M. C., Fiorito, G., Gattuso, A. Effect of Different Formulations of Magnesium Chloride used as Anesthetic Agents on the Performance of the Isolated Heart of Octopus vulgaris. Front. Physiol. 26 (7), 610(2016).
  16. Vervoort, M., Gazave, E. Studying Annelida Regeneration using Platynereis dumerilii. Methods Mol. Biol. 2450, 207-226 (2022).
  17. Wibowo, E. S., Atang, A., Setiyono, E., Hana, H., Simanjuntak, S. B. I., Susilo, U., Sucharitakul, P., Apriyanti, Y., Pamungkas, J. Biological Aspects of Diopatra claparedii Grube, 1878 (Onuphidae, Polychaeta) Maintained at Different Salinity Levels. Ilmu Kelaut.: Indones. J. Mar. Sci. 30 (1), 1-6 (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Poliket RejenerasyonuAnnelid RejenerasyonuBlastema Olu umuSegmentlerin Yeniden KurulmasStereomikroskop G zlemiYara KapanmasAmputasyon Protokol

İlgili makaleler