Method Article

Domuz bağırsak dokusundan kriptler ve mezenkimal stromal hücrelerin optimize edilmiş ardışık izolasyonu

DOI:

10.3791/69429

⸱

December 19th, 2025

 , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, domuz jejunal dokusundan bağırsak kriptleri ve bağırsak mezenkimal stromal hücrelerinin (iMSC) ardışık izolasyonu için adım adım bir protokol sunmaktadır. Yöntem, bağırsak homeostazı ve rejenerasyon sırasında hücresel çapraz konuşmayı incelemek için tekrarlanabilir, fizyolojik olarak önemli epitelyal-stromal ko-kültür modelleri geliştirmek için uygun 2D enteroid monotabakalar ve iMSC'ler üretir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak epitel, alttaki bağırsak mezenkimal stromal hücreleriyle (iMSC) yakın etkileşime girerek gelişimi, homeostazı ve yenilenmesi düzenler. Ancak, domuz dokusundan epitel ve stromal fraksiyonların ardışık izole edilmesi için standartlaştırılmış yöntemler sınırlıdır. Bu protokol, aynı jejunal domuz yavrusu segmentinden kriptleri ve iMSC'leri izole etmek için optimize edilmiş adımlı bir süreci tanımlar. Yöntem, kriptleri serbest bırakmak için etilenediaminetetraasetik asit/ditiothreitol (EDTA/DTT) tabanlı bir dissosiyasyon tamponu kullanır, ardından iMSC'leri izole etmek için ekstrasellüler matriksin kollagenaz/dispaz sindirimi yapılır. Bu yaklaşım, izole hücrelerdeki mekansal değişimleri en aza indirir. İzole kriptler başarılı bir şekilde kültürlenerek tipik genişleyen iki boyutlu (2D) enteroid monokatmanlar oluşturdu; bunlar kollajen hidrojel kaplı plakalar üzerinde gerçekleşti. Kültürlenen iMSC'ler, kültür şişelerine yapışmış ve trombositten türetilen büyüme faktörü reseptörü alfa (PDGFRα) ve farklılaşma kümesi 81 (CD81) gibi stromal belirteçleri ifade etmiştir; bu belirteçler immünboyama ile belirlenmiştir. Genel olarak, bu optimize edilmiş izolasyon protokolü, aynı domuz yavrusu jejunal segmentinden hem epitel hem stromal hücreler elde eder ve domuzlarda epitelal-stromal etkileşimleri kontrol eden mekanizmaları aydınlatmak için bağırsak organoidleri ve iMSC ortak kültür sistemleri ile gelecekteki araştırmalar için tekrarlanabilir bir temel sağlar; bu model, insan fizyolojisini çoğaltmak ve hayvan bilimlerini ilerletmek için translasyonal olarak ilgili bir modeldir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak epitel, bağırsak homeostazını korumak ve mukoza yaralanmalarından sonra yenilenmeyi kolaylaştırmak için sürekli kendini yenileyen ve farklılaşan dinamik birdokudur 1,2. Bağırsak epitel hücreleri bağırsak kök hücrelerinden (ISC) kaynaklanır ve çeşitli mikroçevrefaktörleri 3,4,5,6,7,8 ile etkileşime girerler. Subepitel bölmeleri, özellikle lamina propria ve muscularis mukoza, farklı soylardan çeşitli hücre popülasyonlarındanoluşur 9. Bu hücre popülasyonları arasında, fibroblastlar ve miyofibroblastlar dahil olmak üzere bağırsak mezenkimal stromal hücreleri (iMSC'ler), epitel homeostazı ve rejenerasyonu düzenlemek için ISC köklülüğünü, proliferasyonunu ve farklılaşmasını modüle edentrofik ve büyüme faktörleri üretir 6,7,10,11.

Bu hücresel etkileşimleri incelemek için, son çalışmalar bağırsak epitel hücresi ve iMSC çapraz konuşmasını tetikleyen olası etki mekanizmalarını çözmek için yeni yaklaşımlar geliştirmiştir. Organoidleri stromal veya bağışıklık hücreleriyle birleştiren ortak kültür sistemleri, epitelal-subepitel hücresel etkileşimleri gelişim, yenilenme, ilaç taraması ve hastalık modellemesi sırasındaanlamamızı ilerletmiştir 12,13,14,15,16,17. Ancak, çoğu organoid ortak kültür çalışması, insan fizyolojisini ve hastalık fenotiplerini etkili şekilde taklit edemeyen fare dokuları kullanmıştır ve bu da klinik translasyonel önemlerinisınırlamaktadır 18.

Çoğu fare bağırsak izolasyon protokolünde, epitel ve stromal hücreler ayrı doku segmentlerinden elde edilir; bu hücreler, biraz farklı özellikler yansıtan örnekler verebilir ve deneyler arasında tekrarlanabilirliği etkileyebilir19,20. Şu anda, aynı doku örneğinden domuz bağırsak kriptleri ve iMSC'lerini izole etmek için standartlaştırılmış optimize edilmiş protokoller bulunmamaktadır. Ayrıca, uygun insan bağırsak örnekleri elde etmedeki pratik sınırlamalar, birçok araştırmacının epitelyal-mezenkimal hücresel çapraz iletişimi değerlendirmek için farklı organlardan (örneğin deri fibroblastlı insan enteroidleri) uyumsuz hücre tiplerine güvenmesine yol açmıştır ve bu da veri yorumunukarıştırabilir. 21,22,23.

Yakın zamanda yayımlanan bir insan bağırsak biyopsisi protokolü, kripteleri izole etmiş ve epitelden kalan dokudan çıkan büyüme yoluyla fibroblastlar elde etmiş olsa da, domuzlarda benzer standartlaştırılmış yaklaşımlareksiktir 24. Domuzlar, insanlara anatomik ve fizyolojik benzerlikleri nedeniyle translasyonel araştırmalar için uygun hayvan modeliolarak kullanılır 2,18,25,26,27,28,29. Bu nedenle, bu yöntem, bağırsak fizyolojik, anatomik ve morfolojik yapısına dayanarak aynı domuz jejunal segmentinden bağırsak kriptleri ve iMSC'leri geri getiren ardışık bir izolasyonprotokolü sunar 4,30. Bu prosedür, gelecekteki domuz bağırsağı ortak kültür çalışmaları için uygun olan hem kriptleri hem de iMSC'leri izole etmek için tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maryland Üniversitesi College Park'taki domuz tesisinde tutulan 21 günlük domuz yavrularının kesilmiş proksimal jejunumundan 5 cm uzunluğunda bir segment ayrıldı. Domuz yavrusunun kurban edilmesinde kullanılan prosedür (R-JUN-22-30), üniversitenin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan hayvan bakım ve kullanım politikaları yönergelerine uydu. İzolasyon adımlarına geçmeden önce, protokol taslağı Şekil 1'de sunulmakta ve domuz bağırsağı kriptleri ile iMSC'lerin ardışık izolasyonu için kullanılan reaktif ve ekipmanların listesi Materyaller Tablosu'nda sunulmaktadır.

1. İzolasyon öncesi hazırlık aşaması

  1. 50 mL konik tüplerde 5 cm doku segmenti başına 30 mL yıkama tamponu hazırlayın.
  2. Toplanan doku örneklerinin sayısına göre hacmi ayarlayın.
    NOT: Yıkama tamponu bileşimi için Tablo 1'i kontrol edin. Tüm doku hazırlığı ve hücre izolasyonu adımları bir tezgah üzerinde yapılır.

2. Bağırsak dokusu hazırlama aşaması

  1. Kesilen bağırsak dokusunu 50 mL konik tüplerde 30 mL yıkama tamponuna yerleştirin.
    NOT: Çıkarılan dokular kullanımdan önce bir saat soğuk yıkama tamponuna konabilir.
  2. Dokuyu 3× soğutma tamponu ile 21 G'lik bir şırınga ile alıp luminal içeriği çıkar.
  3. Dokuyu sterilize edilmiş polistiren köpük yüzeyine yerleştirin ve serosadan mezenterik ve yağ dokusunu dikkatlice çıkarın.
  4. Dokuyu cerrahi bir bıçakla uzunlamasına olarak keserek lümenin açılması (Şekil 2A).
  5. Kısmen temizlenmiş diseksiyon dokusunu taze yıkama tamponuna aktarın ve iki kez, ya da tampon berrak olana kadar yıkayın.
  6. Mendiliyi 100 mm'lik bir Petri kabında yıkama tamponuna yerleştirin ve yeni bir cerrahi bıçakla 10-15 mm parçalara kesin (Şekil 2B,C). Bu adım, sindirim tamponuna maruz kalan yüzey alanını artırır.
  7. Kıyma dokusunu yeni 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
  8. Yıkama tamponu ile nazikçe yıkayın ve kıyma dokunun yerçekimiyle yaklaşık 30 saniye çökmesine izin verin (Şekil 2D).
  9. Süpernatantı nazikçe aspire edin, sadece konik tüpteki doku parçalarını kapatacak kadar tampon bırakın.
  10. Epitelyal dissosiyasyon evresi
    1. 30 mL önceden ısıtılmış epitel dissosiyasyon tamponu ekleyin (Tablo 2) ve yaklaşık 9 × g ağırlığında statik boncuk banyosu veya sallanma su banyosu ile 37 °C'de 20-30 dakika kuluçka yapın.
    2. Tüpü her 15 dakikada bir nazikçe sallayarak epitel zarından kriptlerin salınmasını artırın.
    3. Dokunun yerleşmesine izin verin ve serolojik pipetle süpernatantı nazikçe aspire edin, konik tüpteki yerleşik dokunun kaplanması için yeterli tampon bırakın.
    4. Yerleşmiş dokuya 30 mL taze yıkama tamponu ekleyin ve villis, kriptler ve kalıntıları serbest bırakmak için sertçe sallayın (Şekil 3A). Doku kalıntılarının yerleşmesine izin verin, ardından askıda duran kript segmentlerini içeren yıkama tamponu süpernatantını 100 μm hücre süzgecinden yeni 50 mL'lik konik bir tüpe içine nazikçe boşaltın.
      1. Kalan dokuya taze yıkama tamponu ekleyip dekantasyon işlemini üç kez (3×) tekrarlayın. Kriptleri içeren 10 μL yıkama tamponunu 100 mm'lik bir Petri kabına pipet yapın ve kript yoğunluğunu stereo mikroskop altında inceleyin.
        NOT: Her yıkama tamponu her yıkamadan sonra kriptler içeriyor.
    5. Üçüncü yıkamadan sonra, kriptleri içeren yıkama tamponu minimum kalıntı ile temiz olmalı (Şekil 3B).
      NOT: Ekstrasellüler matriksiyle birlikte doku kalıntılarını konik tüpte iMSC izolasyon işlemi için tutun.
    6. Kript askısını oda sıcaklığında 150 × g boyunca 2 dakika boyunca santrifüjle ederek kripta parçalarını pellet et.
    7. Kript pelletini epitel kültür ortamında aspire edin ve yeniden süzülün.
    8. Yeniden askılanan kriptleri 150 × g ile 2 dakika boyunca santrifüjle ederek kript parça pelletini topla.
    9. Kriptleri yeniden süspansiyona almak için epitel kültür ortamı ekleyin ve 1.000 μL pipet ucu kullanarak 5× pipet yapın.
    10. Yaklaşık 100 yeniden askılanmış kript, önceden hazırlanmış kolajen tip 1 hidrojel kaplı 6 kuyu plakalarına tohumlanarak kriptleri iki boyutlu (2D) enteroid monotabakalara dönüştürür ve genişletir.
      NOT: Tablo 3'teki kolajen hidrojel kaplı plaka hazırlanmasını kontrol edin. Son kolajen tip 1 konsantrasyonu 1.0 mg/mL olmalıdır. Maya veya mantar kontaminasyonunu önlemek için aşırı yoğun kriptaları veya kalıntı parçalarını kaplamadan kaçının. Yıkama tamponu ve kültür ortamındaki antibiyotik-antimikotik (anti-anti) koruma sağlamalıdır.
    11. Hücreleri 37 °C'de nemlendirilmiş %5CO2 kuluçka makinesinde inkubasyon yapmadan önce ters faz kontrast mikroskobu altında inceleyin.
    12. Tohumlamadan sonra 12 saat içinde kültür ortamını değiştirerek yüzen kalıntıları temizleyin ve bakteriyel kontaminasyonu azaltın.
    13. Enteroidleri epitel kültür ortamı ile yetiştirin (Tablo 4) ve ortamı yaklaşık 8. güne kadar her iki günde bir değiştirin; genişletilmiş 2D monokatmanlar alt kültür için %≥85 birleşime ulaşır.
  11. Ekstraselüler matriks ayrışma evresi
    NOT: Konik tüpteki ekstrasellüler matrisi içeren artan doku parçalarıyla izolasyon sürecine devam edin (Şekil 3C ve Şekil 4A).
    NOT: Epitel dissosiyasyon tamponundaki EDTA kollajenaz aktivitesini engelleyebilse de, önceki üç yıkama adımı tüm EDTA ve DTT'yi ortadan kaldırır. Bu nedenle, sonraki süreçte kollagenaz aktivitesi etkilenmemelidir.
    1. Kalan dokuyu tekrar küçük parçalara ayırın ve ardından lamina propria'daki iMSC'leri izole etmeye devam edin.
    2. Dokuya 25 mL ekstrahücre sindirim tamponu (Tablo 5) ekleyin ve 37 °C'de 15-20 dakika boyunca statik boncuk banyosunda kuluçka yapın (Şekil 4B).
    3. İnkubasyondan sonra şiddetle salla.
      NOT: Süpernatant daha az yüzen doku parçalarıyla bulanıklaşır. Süpernatantın 10 μL pipetini ters mikroskop altında inceleyerek süpernatanttaki iMSC'lerin yoğunluğunu inceleyin. Gözlemlenen iMSC yoğunluğu düşükse, boncuk banyosunda dokuyu fazladan 15 dakika kuluçka altına sürmeye devam edin.
    4. Üst süzücüyü, 2.2.3. adımda şiddetli bir sallamadan hemen sonra 100 μm hücre süzgeciyle yeni konik bir tüpten nazikçe boşaltarak kalıntıyı en aza indirin.
    5. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 280 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüjlenerek iMSC'leri pellet et.
    6. Süpernatantı aspire edin ve iMSC'leri mezenkimal kültür ortamında yeniden süzülün (bkz. iMSC kültür ortamı, Tablo 6).
    7. Yeniden askıya alınmış iMSC'leri 280 × g ile tekrar 5 dakika boyunca santrifüj yapın, böylece dissosiyasyon tamponunu yıkayın.
    8. iMSC'leri mezenkimal kültür ortamında aspire edin ve yeniden süzülün.
    9. iMSC'leri bir T75 kültür şişesinde yaklaşık 5 ×10-5 hücre olarak kaplayın.
      NOT: Mezenkimal hücrelerin optimal büyüme için orta ila yüksek tohumlama yoğunluğu gerektirdiği için, kaplamalı hücrelerin şişe yüzey alanının yaklaşık %60'ını kapladığından emin olun.
    10. Fazla kalıntıyı çıkarmak ve bakteriyel kontaminasyonu önlemek için kaplamadan sonra 12 saat içinde kültür ortamını değiştirin.
    11. Tohumlamadan sonraki 2. günde ters faz kontrast mikroskopu altında fibroblast benzeri hücreleri inceleyin.
      NOT: Mesenkimal kültür ortamını her iki günde bir değiştirin. iMSC'ler yaklaşık %85 birleşime ulaşmalı ve 4. güne kadar alt kültüre hazır olmalı.

3. İmmünositokimya testi

  1. Hücreler yaklaşık %80 birleşime ulaşana kadar 96 kuyu uzunluğunda bir plakada mezenkimal kültür ortamında 2-3 gün boyunca yaklaşık 5.000 iMSC kültürün.
  2. Ortamı nazikçe aspire edin ve kültürlenmiş iMSC'leri odasıcaklığında 100 μL 1× PBS ile iki kez durulayın. İmmünboyama kitlerine dair tüm referanslar Materyaller Tablosu'nda yer almaktadır.
  3. Her kuyu başına %4 paraformaldehit (PFA) ekleyip kültürlenmiş iMSC'leri sabitleyin ve oda sıcaklığında statik bir tezgah üzerinde 30 dakika kuluçka yapın.
  4. Sabit kültürlenmiş iMSC'leri 100 μL %0,1 Tween-20/PBS (PBST) ile her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın ve ardından 100 μL %0,5 Triton X-100/PBS ile 30 dakika geçirimlilik yapın.
  5. Her kuyu başına %5 sığır serum albümini (BSA)/PBST eklemek için sabit hücrelere spesifik olmayan bağlanmayı engellemektir.
    NOT: Oda sıcaklığında 1 saat bekletin, ardından 100 μL PBST ile iki kez yıkamaktan sonra her biri 5 dakika boyunca yıkayın.
  6. Her kuyuya 100 μL seyreltilmiş birincil antikor (1:250; yani, 250 μL antikor sulandırıcı içinde 1 μL primer antikor) eklenin ve hücreleri gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya geçirin. Kullanılan birincil antikorlar PDGFRα ve CD81'dir.
    NOT: Negatif kontrol kuyruklarını birincil antikorlar olmadan sadece antikor sulandırıcı ekleyerek ekleyin.
  7. İkinci gün, birincil antikorları 100 μL PBST ile iki kez 5 dakika boyunca yıkayın.
  8. İkincil antikorları 1× PBS cinsinden aşağıdaki oranlarla seyreltin: Alexa Fluor Plus 555 (1 μL:100 μL), Alexa Fluor Plus 647 (1 μL:100 μL) ve DAPI (1 μL:800 μL).
  9. Hücreleri seyreltilmiş ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat boyunca karşı boyama yapın.
  10. Hücreleri 1× PBS ile iki kez, her biri 5 dakika boyunca yıkayın.
  11. Her kuyu başına 100 μL montaj ortamı ekleyin, plakayı kapatın, alüminyum folyo ile sarın ve floresan görüntülemeye kadar 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.

4. RNA izolasyonu ve qPCR testi

  1. T75 şişelerinde kültürlenen iMSC'lerden asit guanidinyum tiosiyanat-fenol-kloroform ayırma tekniği kullanılarak toplam mRNA çıkarmak.
    NOT: RNA konsantrasyonu ve saflığını bir spektrofotometre kullanarak belirleyin.
  2. Öncekiçalışmalarda bildirildiği gibi, seçilmiş Sus scrofa gen primeri GAPDH (önde: ATCCTGGGCTACACTGAGGACAC; tersi: AAGTGGTCGTGAGGGCAATG) için amplifikasyon grafiklerini doğrulamak amacıyla nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) testi için şablon olarak kullanılmak üzere toplam mRNA'yı cDNA'ya ters transkribe edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitelel ayrışma sırasında, etilenediamintetraasetik asit (EDTA) kalsiyum iyonlarını şelatlayarak kalsiyuma bağlı hücre-hücre yapışmalarını bozurken, ditiothreitol (DTT) müsin glikoproteinlerindeki disülfit bağlarını keserek mükolizi kolaylaştırır. Böylece, bir şelatlayıcı bileşik (EDTA) ve indirgeme ajanının (DTT) birleşik kullanımı, epitel membranından kriptlerin etkili şekilde serbest bırakılmasını sağlar ve ekstraselüler matriks (ECM) yapısı

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aynı domuz jejunal segmentinden bağırsak kriptleri ve iMSC'lerin izole edilmesi, doku segmentine özgü hücresel ve fonksiyonel özellikleri korumak için yeni bir yaklaşım sunar. Bu çok önemlidir çünkü bağırsak dokuları bölgesel ve mekansal özlükler sergiler; önceki domuzçalışmalarında gösterildiği gibi 2,36,37,38. Domuzlarda veya diğe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Maryland Üniversitesi, College Park, ABD'deki MAES Rekabetçi Hibe Programı'ndan maddi destek almaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.5M EDTAPromegaPR-V4231
1 M HEPES tamponuThermoFisher15630080Kolajen hidrojel plaka hazırlamak için
1000 uL pipet uçlarıAlkali Scientific FT1000104027-530
10x PBSInvitrogenAM9624Kolajen hidrojel plaka hazırlamak için
1N sodyum hidroksitTermoSS266-1Kolajen hidrojel plaka hazırlamak için
1x HBSSThermoFisher14025092
1X PBSHycloneSH30256FS
%4 paraformaldehit (PFA)ThermoFisherAAJ61899AK
50 mL konik borularThermoFisher12-565-271
6 kuyulu plakaFisherbrandFB012927
%7,5 Sodyum Bikarbonat ÇözeltisiCorningMT25035CIKolajen hidrojel plaka hazırlamak için
Advance DMEM/F12 Gibco 12634-010
Alexa fluor plus 647InvitrogenA32728İkincil antikor
Alexa plus 555 - A32732 InvitrogenA32732İkincil antikor
Alüminyum folyoReynoldshttps://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
ANTI-ANTIGibco15240096
B27ThermoFisher12587010
BSAFisherbrandBP1600-100
CD81 Proteinintech66866-1-igBirincil antikor
Hücre kültürü kalitesinde suHycloneSH30529FSKolajen hidrojel plaka hazırlamak için
Kolajen, Tip 1Corning356236Kolajen hidrojel plaka hazırlamak için
Kollagenaz IVGibco17104019
Corning 100 mm Petri kabıCorning07-202-011
Kriyostor hücresi kriyokoruma ortamıKök Hücre Teknolojileri7930
hücreler için kriyovial;Fisherbrand1050026
Dako antikor sulandırıcıDako/AgilentParça numarası: S302283-2Primer antikor seyreltici
Dako floresan montaj ortamıDako/AgilentParça numarası: S302380-2
DAPIPromocell/VWR10180-470DNA boyama
Dispase IIRoche4942078001
DMEM, yüksek glikozCorningMT10013CV
DTTSigma646563
EGFPeprotech315-09
FBS (MERHABA)Avantor1300-500H
GastrinAnaspecAS-64149
GentamicinMP BiyomedikalICN1676045
GlutaMaxThermoFisher35050061
HEPESThermoFisher15630-080
Ters floresan mikroskrapNikonECLIPSE Ti2Floresan görüntüleme
Ters faz kontrast mikroskobuNikonEclipse TS100Kültürlenmiş hücreler görüntüleme ve nbsp için;
iScript İleri cDNA Sentez KitiBio-Rad1725038RT-PCR kiti
iTaq Universal SYBR Yeşil SüpermixBio-Rad1725122qPCR kiti
LWRN koşullu ortamATCCCRL-3276LWRN medyası, ATCC prosedürüne uygun olarak kendi içinde hazırlandı
N-asetil sisteinMP Biyografisi194603
Nanodrop 2000 spektrofotometresiThermoFisherND 2000
NikotinamidSigmaN0636-100G
Barkodlu Optik 384-Yuva PlakalarıUygulamalı Biyosistemler4483285qPCR kiti
PDGFRαAbcamab230457Birincil antikor
Prostaglandin E2 (PGE2)Cayman kimyasalısı 14010
QuantStudio 5Uygulamalı BiyosistemA28570qPCR cihazı
SB202190LC LaboratuvarlarıS-1700
Stereo mikroskopNikon SMZ745
T 75 şişesiFisherbrandFB012937
Triton X100FisherbrandPI85111
Trizol reaktifi Invitrogen15596026
Tween 20, %100 Nonionik DeterjanBio-rad1706531
Y27632ApexBioA3008-200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: New insights into intestinal stem cells. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (1), 19-34 (2019).
  2. Yin, L., et al. Changes in progenitors and differentiated epithelial cells of neonatal piglets. Anim Nutr. 8 (1), 265-276 (2022).
  3. Pastula, A., Marcinkiewicz, J. Cellular interactions in the intestinal stem cell niche. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 67 (1), 19-26 (2019).
  4. Mccarthy, N., Kraiczy, J., Shivdasani, R. A. Cellular and molecular architecture of the intestinal stem cell niche. Nat Cell Biol. 22 (9), 1033-1041 (2020).
  5. Beumer, J., Clevers, H. Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (1), 39-53 (2021).
  6. Pasztoi, M., Ohnmacht, C. Tissue niches formed by intestinal mesenchymal stromal cells in mucosal homeostasis and immunity. Int J Mol Sci. 23 (9), 5181(2022).
  7. Kraiczy, J., et al. Graded BMP signaling within intestinal crypt architecture directs self-organization of the Wnt-secreting stem cell niche. Cell Stem Cell. 30 (4), 433-449 (2023).
  8. Niec, R. E., et al. Lymphatics act as a signaling hub to regulate intestinal stem cell activity. Cell Stem Cell. 29 (7), 1067-1082 (2022).
  9. Paerregaard, S. I., et al. The small and large intestine contain related mesenchymal subsets that derive from embryonic gli1(+) precursors. Nat Commun. 14 (1), 2307(2023).
  10. Maimets, M., et al. Mesenchymal-epithelial crosstalk shapes intestinal regionalisation via Wnt and Shh signalling. Nat Commun. 13 (1), 715(2022).
  11. Ayansola, H., Mayorga, E. J., Jin, Y. Subepithelial stromal cells: Their roles and interactions with intestinal epithelial cells during gut mucosal homeostasis and regeneration. Biomedicines. 12 (3), 668(2024).
  12. Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
  13. Xia, X., et al. Mesenchymal stem cells promote healing of nonsteroidal anti-inflammatory drug-related peptic ulcer through paracrine actions in pigs. Sci Transl Med. 11 (516), eaat7455(2019).
  14. Zhang, W., et al. Dietary calcium and phosphorus amounts affect development and tissue-specific stem cell characteristics in neonatal pigs. J Nutr. 150 (5), 1086-1092 (2020).
  15. Zhou, J. Y., et al. Zinc l-aspartate enhances intestinal stem cell activity to protect the integrity of the intestinal mucosa against deoxynivalenol through activation of the Wnt/beta-catenin signaling pathway. Environ Pollut. 262, 114290(2020).
  16. Yang, S., et al. Organoids: The current status and biomedical applications. MedComm (2020). 4 (3), e274(2023).
  17. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  18. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Porcine models of digestive disease: The future of large animal translational research. Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).
  19. Nieuwenhuis, T. O., et al. Patterns of unwanted biological and technical expression variation among 49 human tissues. Lab Invest. 104 (6), 102069(2024).
  20. Pastula, A., et al. Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: A method to characterize the gastrointestinal stem cell niche. Stem Cells Int. 2016, 3710836(2016).
  21. Kraski, A., et al. Structured multicellular intestinal spheroids (SMIS) as a standardized model for infection biology. Gut Pathog. 16 (1), 47(2024).
  22. Darling, N. J., Mobbs, C. L., Gonzalez-Hau, A. L., Freer, M., Przyborski, S. Bioengineering novel in vitro co-culture models that represent the human intestinal mucosa with improved Caco-2 structure and barrier function. Front Bioeng Biotechnol. 8, 992(2020).
  23. Freer, M., Cooper, J., Goncalves, K., Przyborski, S. Bioengineering the human intestinal mucosa and the importance of stromal support for pharmacological evaluation in vitro. Cells. 13 (22), 1859(2024).
  24. Meran, L., Tullie, L., Eaton, S., De Coppi, P., Li, V. S. W. Bioengineering human intestinal mucosal grafts using patient-derived organoids, fibroblasts and scaffolds. Nat Protoc. 18 (1), 108-135 (2023).
  25. Burrin, D., et al. Translational advances in pediatric nutrition and gastroenterology: New insights from pig models. Annu Rev Anim Biosci. 8, 321-354 (2020).
  26. Lunney, J. K., et al. Importance of the pig as a human biomedical model. Sci Transl Med. 13 (621), eabd5758(2021).
  27. Barnett, A. M., et al. Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration. Am J Physiol Cell Physiol. 320 (5), C794-C805 (2021).
  28. Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), e66465(2013).
  29. Stieler Stewart, A., Freund, J. M., Blikslager, A. T., Gonzalez, L. M. Intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia. J Vis Exp. (135), e57647(2018).
  30. Meran, L., Baulies, A., Li, V. S. W. Intestinal stem cell niche: The extracellular matrix and cellular components. Stem Cells Int. 2017, 7970385(2017).
  31. Mahe, M. M., et al. Establishment of gastrointestinal epithelial organoids. Curr Protoc Mouse Biol. 3 (4), 217-240 (2013).
  32. Koliaraki, V., Kollias, G. Isolation of intestinal mesenchymal cells from adult mice. Bio-Protocol. 6 (18), 1940(2016).
  33. Chang, C. W., et al. Mesenchymal stem cell seeding of porcine small intestinal submucosal extracellular matrix for cardiovascular applications. PLoS One. 11 (4), e0153412(2016).
  34. Chen, J., et al. Human intestinal organoid-derived PDGFRα+ mesenchymal stroma enables the proliferation and maintenance of Lgr4+ epithelial stem cells. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 16(2024).
  35. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Vet Res. 52 (1), 33(2021).
  36. Wiarda, J. E., Becker, S. R., Sivasankaran, S. K., Loving, C. L. Regional epithelial cell diversity in the small intestine of pigs. J Anim Sci. 101, skac318(2023).
  37. Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. Porcine small intestinal organoids as a model to explore etec-host interactions in the gut. Vet Res. 52 (1), 94(2021).
  38. Wiarda, J. E., Trachsel, J. M., Sivasankaran, S. K., Tuggle, C. K., Loving, C. L. Intestinal single-cell atlas reveals novel lymphocytes in pigs with similarities to human cells. Life Sci Alliance. 5 (10), e202201442(2022).
  39. Uniken Venema, W. T. C., et al. Gut mucosa dissociation protocols influence cell type proportions and single-cell gene expression levels. Sci Rep. 12 (1), 9897(2022).
  40. Schaaf, C. R., et al. A lgr5 reporter pig model closely resembles human intestine for improved study of stem cells in disease. FASEB J. 37 (6), e22975(2023).
  41. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals (Basel). 12 (3), 372(2022).
  42. Gomez-Martinez, I., et al. A planar culture model of human absorptive enterocytes reveals metformin increases fatty acid oxidation and export. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 409-434 (2022).
  43. Jacob, J. M., et al. Pdgfralpha-induced stromal maturation is required to restrain postnatal intestinal epithelial stemness and promote defense mechanisms. Cell Stem Cell. 29 (5), 856-868 (2022).
  44. Modina, S. C., et al. Stages of gut development as a useful tool to prevent gut alterations in piglets. Animals (Basel). 11 (5), 1412(2021).
  45. Tang, W., et al. Ileum tissue single-cell mRNA sequencing elucidates the cellular architecture of pathophysiological changes associated with weaning in piglets. BMC Biol. 20 (1), 123(2022).
  46. Dong, X., et al. Identification of optimal reference genes for gene expression normalization in human osteosarcoma cell lines under proliferative conditions. Front Genet. 13, 989990(2022).
  47. Mccarthy, N., et al. Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient. Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).
  48. Mussard, E., et al. Culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers. J Vis Exp. (192), e64917(2023).
  49. Zhang, M., et al. Long-term expansion of porcine intestinal organoids serves as an in vitro model for swine enteric coronavirus infection. Front Microbiol. 13, 865336(2022).
  50. Benz, P., Plenge, M., Wagner, S., Mazzuoli-Weber, G. Two-dimensional porcine intestinal organoids reflecting the physiological properties of native gut. J Vis Exp. (215), e67666(2025).
  51. Lee, B. R., Ock, S. A., Park, M. R., Lee, M. G., Byun, S. J. Establishing porcine jejunum-derived intestinal organoids to study the function of intestinal epithelium as an alternative for animal testing. J Anim Reproduction Biotechnol. 39 (1), 2-11 (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

BiyolojiSay 226
Video Coming Soon

Related Articles