EasyFiji: Fiji'de Kullanıcı Dostu Floresan Görüntü İşleme İçin Grafiksel Arayüz

Summary

EasyFiji, Fiji (ImageJ) için tasarlanmış bir grafiksel kullanıcı arayüzü eklentisidir ve yaşam bilimcileri tarafından sıkça kullanılan floresan görüntü görselleştirme ve işleme araçları paketini sunar.

Abstract

Fiji (Fiji Is Just ImageJ), biyogörüntü analiz topluluğu tarafından yaygın olarak kullanılan kapsamlı ve genişletilebilir açık kaynaklı bir görüntü işleme paketidir. Ancak, hesaplamalı olmayan yaşam bilimcileri için, Fiji'nin birçok yeteneğiyle manuel etkileşimde bulunmak, derin katmanlı bir menü sistemini öğrenmek ve gezinmeyi gerektirir. Ayrıca, bazı komutların varsayılan davranışları floresans görüntü görüntüleme ve işleme için ideal değildir. Floresan mikroskopik görüntülerle çalışan yaşam bilimcileri için verimliliği artırmak amacıyla, Fiji için özenli bir grafik kullanıcı arayüzü (GUI) eklentisi olan EasyFiji'yi geliştirdik. Her EasyFiji komutu, araç ucu ile geliştirilmiş düğmeler ve kaydırımlar aracılığıyla çalıştırılır ve floresans görüntüleri için gerektiği gibi kanala özgü bir uygulama gösterir. Piksel yoğunluklarını değiştiren komutlar ayrıca tek tıklamayla yapılamaz hale gelir ve daha etkileşimli işlem mümkün olur ve otomatik olarak kaydedilip metin olarak kaydedilebilir. Bir görüntü bilgi paneli, görüntü yorumlama için kritik ayarları gösterir. Yeni görüntü işleme ve ağartıcı düzeltme fonksiyonları da sağlanır. Eklenti GitHub'da ve Fiji Güncelleme Sitesi olarak ücretsiz olarak erişilebilir. Bu protokol, floresan mikroskopi görüntülerinin görselleştirilmesi ve işlenmesi için EasyFiji arayüzünün kullanılma adımlarını özetler.

Introduction

Fiji (Fiji Is Just ImageJ), biyogörüntü analiz topluluğu ^1,2 tarafından yaygın olarak kullanılan kapsamlı ve genişletilebilir açık kaynaklı bir görüntü işleme paketidir. Fiji'nin geniş genel amaçlı algoritma kod tabanı, makro dili ve eklenti arayüzüyle birlikte, hesaplama analistleri tarafından neredeyse her görüntü işleme veya analiz sorunu için çözüm sunmak üzere kolayca kullanılabilir. Ancak, az hesaplama deneyimi olan yaşam bilimleri kullanıcıları için, FIJI'nin derin katmanlı açılır menü sistemine yayılmış >1.100 komutu etkili şekilde gezinmek ve kullanmak göz korkutucu derecede karmaşık olabilir. Fiji'nin manuel kullanımını basitleştirmek için çeşitli yaklaşımlar benimsenmiştir. Fiji'nin arama çubuğu, menü navigasyonuna alternatif olarak mükemmel yardım dokümantasyonuna erişim sağlar, ancak kullanıcı ihtiyaç duyduğu algoritmanın adını bilirse bunu sağlar. Fiji'nin araç çubuğu düğmeleri, kullanıcı tanımlı komutlara hızlı erişim sağlamak için özelleştirilebilir, ancak bu prosedür makro kod yazmayı ve hangi komutların en faydalı olacağını öngörmeyi gerektirir. ActionBar eklentisi, özelleştirilebilir ve organize edilebilir düğme dizileriyle bağımsız grafik kullanıcı arayüzü (GUI) penceresi sunar, ancak yine de düğmeleri etkili şekilde doldurmak için kodlama ve deneyim gereklidir³. Bu çözümlerin hiçbiri, görüntü işleme deneyimi az olan yaşam bilimcilerinin ihtiyaçlarını karşılamaz.

Kullanıcı arayüzü sorunlarının ötesinde, floresan mikroskopi görüntülerle çalışan birçok yaşam bilimcisi kanala özgü görüntüleme ve işleme prosedürlerine ihtiyaç duyar. Ancak, yaygın olarak kullanılan bazı Fiji komutları varsayılan olarak kanal farkında değildir. Örneğin, kullanıcılar sahte renkli kanalları eşit derecede belirgin şekilde birlikte render etmek, kanallar arasında benzer yoğunluktaki bölgeleri özellikle vurgulamak veya morfolojik sinyalin gri tonlu kontrastını korumak ve aynı zamanda floresansı göstermek isteyebilirler. Bu kullanım alanlarının her birinde, Fiji'nin RGB bileşik render tekniği, istenen bilgiyi algısal düzeyde gizler. Çok kanallı görüntüler işlenirken yerel Fiji görüntü filtreleri (yani, Process | Filtreler), ya sadece aktif 2B bit düzlemini işler ya da görüntü penceresindeki tüm bit düzlemlerini (yani ImageStack sınıfı tarafından tanımlanan 'yığın'). İlk davranış, belirli bir kanal için z- veya t- boyutları boyunca işlemezken, ikinci davranış neredeyse her zaman uygunsuzdur; çünkü her kanal benzersiz bir boyama deseni ve sinyal-gürültü oranına sahiptir ve kanala özgü işlem parametrelerinin kullanılmasını gerektirir. Native Fiji'nin çamaşır suyu düzeltme komutları (Görsel | Ayarlan | Ağartıcı Düzeltme) çok kanallı floresans görüntülerine uygulandığında yanlış davranır, çünkü yine tüm ImageStack'te düzeltilirler; burada kanal verileri aralı olur, her kanal içindeki z veya t-boyutunda ayrı ayrı düz değil.

Floresan mikroskopik görüntülerle çalışan yaşam bilimcileri için bu sorunları ele almak amacıyla, Fiji için özenli ve rehberli grafiksel kullanıcı arayüzü eklentisi EasyFiji'yi geliştirdik. EasyFiji, kanal farkında render ve işleme imkanı sağlayan, tematik olarak düzenlenmiş bir komutlar setidir. Dört tablolu panel, Display, Process, Save ve Image Info olmak üzere her biri, komut çalıştırmak için araç ucu ile geliştirilmiş düğmeler ve kaydırıcılardan oluşan topikal bağlantılı koleksiyonlar içerir. Diğer kolaylıklar arasında etkileşimli işlem için geri alma işlevi, piksel değiştirme işlemlerini görüntüyle birlikte otomatik olarak kaydedebilen basit ve düz metin işlem kaydedicisi ve görüntü yorumlama için önemli olan edinim ayarlarının biçimlendirilmiş görüntülenmesi yer alır. EasyFiji ayrıca yeni görüntü işleme ve ağartıcı düzeltme araçları da sunuyor. EasyFiji, nicel görüntü analizi veya toplu işleme fonksiyonlarını desteklemez; çünkü bu işlemler yalnızca uzman bir biyogörüntü analistinin yardımıyla yapılmalıdır. EasyFiji tasarımı açısından kısa olsa da, tüm yerel Fiji komutları her zaman yerel Fiji menü sistemi üzerinden erişilebilirdir. EasyFiji'nin hedef kitleye yönelik^{tasarımının,} yaşam bilimcileri arasında Fiji'nin kullanımını artıracağına inanıyoruz. Burada EasyFiji'nin floresan mikroskopik görüntülere tasarımı, uygulaması ve uygulamasını sunuyoruz. Eklenti, Fiji güncelleme sitesi (https://imagej.github.io/list-of-update-sites/ ve https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin) üzerinden kolayca kurulabilirken, açık kaynak kod GitHub üzerinden indirilebilir; eklenti ve kaynak kodu ücretsiz olarak erişilebilir (https://github.com/stjude/EasyFiji).

Protocol

Bu protokol, EasyFiji'nin nasıl kurulacağını ve kullanılacağını açıklar.

1. EasyFiji'yi kurmak için...

1. İşletim sistemine uygun en son Fiji sürümünü (>1.54g) indirin ve kullanıcının okuma/yazma erişimine sahip olduğu bir klasöre yükleyin (Fiji indirme sitesine bağlantı için Materyaller Tablosu'na bakınız).
2. Fiji'yi başlatın ve Help | sayfasına geçin. Güncelleme... menü çubuğunda.
3. Güncelleme penceresinde Site Güncelleme Rejimi seçeneğine tıklayın. Listeden EasyFiji'yi seçin ve Uygula ve Kapat'a tıklayın. EasyFiji otomatik olarak kurulacak ve Fiji, EasyFiji'nin gelecekteki sürümleriyle otomatik olarak güncellenecek.
4. Fiji'yi yeniden başlatın. Fiji Eklentileri menüsünden EasyFiji'yi seçin.
   NOT: EasyFiji, Fiji'nin birçok eski versiyonuyla tamamen uyumludur ve esas olarak ImageJ ile uyumludur. Detaylı uyumluluk ve bağımlılık bilgileri EasyFiji GitHub wiki sayfasında (https://github.com/stjude/EasyFiji) ve EasyFiji ImageJ.net wiki sayfasında (https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start) bulunabilir. Geri bildirim GitHub sayfası veya Image.sc forumundaki EasyFiji başlığı üzerinden (https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617) sağlanabilir (bu kaynaklara bağlantılar için Materyaller Tablosu'na bakınız).

2. EasyFiji ekran panelinin kullanımı

NOT: Şekil 1A'da gösterildiği gibi, Ekran paneli renk örnek düğmeleri kullanılarak floresans kanalı sahte boyamayı, sezgisel kontrast ayarlama kontrollerini ve algısal olarak kalibre edilmiş çok kanallı görüntü render seçeneklerini destekler. 3D/4D görüntü projeksiyonu ve yeniden dilimleme için yerel Fiji komutları da dahildir. Tablo 1, EasyFiji komutları ile yerel Fiji komutları arasındaki uyumları belgeler.

1. Bir kanalın rengini veya görünürlüğünü ayarlayın (Ekran Paneli, Kanal Rengi bölümü).
   1. İstediğiniz kanalı görüntü penceresinin kanal kaydırıcısını kullanarak seçin.
   2. Yeni bir renk arama tablosu (LUT) atamak için bir renk örnek düğmesine basın.
   3. Bir kanalın ekranını kapatmak için siyah örnek düğmesine basın.
   4. Tüm kanalları bir anda göstermek için AllChs düğmesine basın.
   5. Her kanalı ardışık olarak görüntülemek için EachCh butonuna basın, görüntü penceresinde kanal kaydırıcısını kaydırarak .
2. Görüntüler içinde veya arasında kanal kontrastını ayarlayın (Ekran Paneli, Kanal Kontrastı bölümü).
   1. Bir kanalın görüntü aralığını (kontrastı) değiştirmek için, görüntünün görüntü penceresinin altındaki kanal kaydırıcısını kullanarak kanalı seçin.
   2. Ekran kazanç kaydırıcısını hareket ettirerek görüntü piksel yoğunluğunu (sağda gösterilen değer) ekranda en parlak değer olarak gösterin.
      NOT: Bu eylemi tanımlamak için display gain terimini kullanıyoruz çünkü kanalın doğrusal olarak daha parlak hale gelmesine neden olur; bu, görüntü alımı sırasında dedektördeki kazançın değişmesine benzer bir etkiye benzer.
   3. Ekran kazancı sıfırlama düğmesine basarak kanalın maksimum piksel yoğunluğunu (bit derinliğine göre belirlenen) ekrandaki en parlak değer olarak gösterin.
   4. Ekranın en karanlık değeri olarak gösterilecek görüntü piksel yoğunluğunu (sağda gösterilen değer) belirtmek için ekran ofset sürgüsünü hareket ettirin.
      NOT: Bu eylemi tanımlamak için görüntü ofseti terimini kullandık çünkü görüntünün siyah seviyesini belirler; bu, görüntü alımı sırasında dedektörde ofsetin ayarlanmasının etkisine benzer.
   5. Görüntü piksel yoğunluğunu sıfırlamak için ekranın ofset sıfırlama düğmesine basın, görüntü piksel yoğunluğunu sıfır olarak ekrandaki en koyu değere ayarlayın.
   6. AutoCh düğmesine basarak ekran kazancı ve offsetini otomatik olarak ayarlayın.
   7. Tüm kanallar için ekran kazancı ve ofsetini otomatik olarak ayarlamak için AutoAll düğmesine basın.
   8. Aktif görüntüden aynı sayıda kanal içeren diğer açık görüntülere ekran kazancı ve ofset ayarlarını aktarmak için Propagate düğmesine basın.
3. Çok kanallı bir ekran oluşturun (Ekran Paneli, Kanal Görünümleri bölümü).
   1. İki floresans kanalını renkli bir görüntü olarak birlikte render etmek için FF ön ekli düğmeleri (floresans ile floresans) kullanın. Floresans kanal(lar)ı ve morfolojik gri tonlu kanalı renkli bir görüntü olarak birlikte render etmek için FG ön ekli düğmesini (gri tonlu floresans) kullanın. Renderlemeler yeni bir görüntü penceresinde oluşturulur.
      NOT: Herhangi bir Kanal Görünümü oluşturmadan önce, ilgi çekici sinyalin ekranın dinamik aralığını aşacak şekilde her kanal için ekran kazancı ve ofsetini ayarlayın (bölüm 2.2) ve ardından bu kazançları ve ofsetleri İşleme sekmesindeki Kazanç Uygula ve Ofset butonları ile uygulayın (bölüm 3.2.3). Kazançlar ve kaymalar ayarlanmaz ve uygulanmazsa renderlemeler optimal olmaz.
   2. FFColoc düğmesine basarak iki floresan kanalından renk renderı elde edin ve her iki kanalda da yoğunluk benzer (%25 içinde) sarı piksel olarak aydınlanıyor.
      NOT: Kanallar arasında farklı yoğunluklara sahip pikseller gri tonlamada render edilir. Sarı pikseller, ilgi çekici sinyalin ekranın dinamik aralığını aşması durumunda korelasyona dayalı^{kololokalizasyon 5'i} ima eder.
      DIKKAT: FFColoc render yalnızca veri keşfi veya illüstrasyon amaçları için tasarlanmıştır. Bu, bir uzmanın yardımıyla kololokalizasyonun titiz nicelik tesliminin yerini tutmaz.
   3. FFMerge düğmesine basarak iki floresans kanalından renk renderı elde edin; her kanaldaki sinyal eşit derecede algılanabiliyor.
      NOT: Her pikselde, parlaklık daha yüksek yoğunluğa sahip sinyale göre ayarlanırken, ton kanallar arasındaki yoğunluk oranının bir fonksiyonudur (Taylor ve ^ark.6 tarafından açıklanan kavramlara göre). Ayrıca Tartışma bölümüne bakınız.
   4. FGMerge düğmesine basarak floresans kanal(lar)ından renk renderı elde edin ve gri tonlu kanalların rengi korunurken, gri tonlu kanalın kontrastı korunur.
      NOT: Gri tonlu kanal genellikle DIC, faz kontrastı veya elektron mikroskobu gibi morfolojik bilgileri içeren floresan olmayan bir modalitedir.
   5. Kanalları tek tek görsellere ayırmak için Montage düğmesine basın, ekranda otomatik olarak kayık ve görselleştirmelerini senkronize edin.
   6. Aynı türden birden fazla görselin görselleştirilmesini senkronize etmek için SyncWins düğmesine basın.
4. 3D z- veya t-stack'in 2D görünümlerini oluşturun (Display Panel, Stack View bölümü).
   NOT: Her render yeni bir görsel penceresinde görüntülenir.
   1. Maksimum yoğunluk projeksiyonu oluşturmak için MIP düğmesine basın.
      NOT: Ortaya çıkan 2D görüntüdeki her konumdaki yoğunluk, 3D görüntüdeki 3^. boyuttaki en yoğun pikselin yoğunluğuna karşılık gelir. Bu prosedür gürültüyü vurgulayabilir, bu yüzden MIP oluşturmadan önce yığını düzeltmek ( bkz. İşleme sekmesi) faydalı olabilir.
   2. SIP düğmesine basarak toplam yoğunluk projeksiyonu oluşturun.
      NOT: Ortaya çıkan 2D görüntüdeki her konumdaki yoğunluk, 3D görüntüdeki 3^. boyuttaki yoğunlukların toplamına karşılık gelir. Bu prosedür, toplam yoğunluğu korur ve tek bir dilimden daha az gürültülü bir görüntü elde eder.
   3. Ortogonal dilim görüntüleyici oluşturmak için Ortho düğmesine basın; bu gösterge, mevcut imleç konumunda kesişen 3D yığının üç ortogonal düzlemini (örneğin, xy, xz, yz) etkileşimli olarak render eder.
   4. Kymo düğmesine basarak bir kymograph oluşturun.
      NOT: Kymograph, dikey (y-) ekseninin bir yığının üçüncü boyutuna (genellikle t-) karşılık geldiği, yatay (x-) ekseninin ise kullanıcının giriş yığınında çizdiği bir çizgi boyunca konumuna karşılık geldiği 2D bir görüntüdür. Üçüncü^{boyut zaman} olduğunda, hareketi göstermek veya nicelendirmek için bir kymograph kullanılır.
      Bu düğme, Fiji ile gelen KymographBuilder^{eklentisi 7'ye} dayanıyor ancak ImageJ kullanıyorsanız ayrı olarak indirilmesi gerekiyor.
5. Çeşitli seçenekleri ayarlayın (Display Panel ).
   1. Fiji'deki aktif görüntü penceresini çoğaltmak için Dup düğmesine basın. Yeni bir görüntü penceresi açılacak.
      NOT: Fiji'nin Dikdörtgen ROI aracı ile görüntüye dikdörtgen ilgi alanı (ROI) çizin, Dup düğmesi ROI sınırına kırpılır. Çoğaltılan görüntünün boyutluluğunu yeniden şekillendirmek için kanal, z- ve/veya t- aralıklarını belirleyin.
   2. Ekranda mevcut şekilde gösterilen aktif görüntüyü sistem panosuna kopyalamak için ToClip düğmesine basın. Görseli başka bir uygulamaya yapıştırmak için (slayt hazırlamak veya fotoğraf düzenlemek için), diğer uygulamayı aktif hale getirin ve yapıştırmayı seçin (Windows'ta Ctrl+V veya Mac'te Cmd+V).
   3. |--um--| tuşuna basarak görüntüde bir ölçek çubuğu üst üste görünmek. |--um--| tuşunu değiştirerek ölçek çubuğunu kaldırın.

3. EasyFiji Süreç panelinin kullanımı

NOT: Şekil 1B'de gösterildiği gibi, Süreç paneli Kanal Özellikleri bölümü, görüntü gösterimini geliştirmek için kullanılabilecek araç ipuçlarıyla kaydırıcı tabanlı görüntü işleme komutları sunar. Last'ı geri al butonu etkileşimli işlem imkanı sağlar. Görüntü boyutları, Boyutları Değiştir butonları kullanılarak değiştirilebilir. Eylem Tablosu, görüntü piksel yoğunluk değerlerini değiştiren düz metin olarak İşleme komutlarını kaydetmek için kullanılır. Günlük, aynı başlıkla otomatik olarak görüntüyle kaydedilebilir (bkz. Kaydetme paneli).

1. Bir görüntünün mekansal özelliklerini değiştirin (Süreç Paneli , Kanal Özelliklerini Değiştir bölümü).
   NOT: Tüm komutlar yalnızca aktif kanala uygulanır ve sonuçlar otomatik olarak orijinal görüntü penceresinde gösterilir. Yeni bir görüntü penceresi oluşturulmaz.
   1. Smooth kaydırıcıyı hareket ettirerek Gauss bulanıklığı uygulayın; böylece normal dağılımlı piksel-piksel varyasyonunu (~shot gürültüsü ve okuma gürültüsü) azaltın.
      1. ~Nyquist örneklenmiş görüntüler (70-150 nm xy piksel boyutu) için, 1.0 ile 2.0 arasında kaydırıcı değerlerle başlayın.
      2. Belirli bir piksel boyutu için, görüntünün sinyal-gürültü oranı (SNR) azaldıkça kaydırıcı değeri artırılır.
      3. Bir SNR verildiğinde, piksel boyutu azaldıkça kaydırıcı değerini artırın.
      4. Görüntü yığınları için, Nyquist örneklemeli veriler için uygun olduğu şekilde, z-yarıçapı otomatik olarak xy yarıçapının üçte birine ayarlandığı 3D bir yumuşatma uygulanır.
         NOT: Kaydırıcı değer, bir Gauss çekirdeğinin piksel cinsinden ölçülen standart sapmasına karşılık gelir.
   2. Gürültü Azaltma kaydırıcısını hareket ettirerek medyan filtre uygulayın, böylece aşırı istisnaları (kamera sıcak pikselleri veya PMT termiyonik emisyonları) ortadan kaldırın.
      NOT: Kaydırıcı değeri, kutu çekirdeğinin piksel cinsinden yarıçapına karşılık gelir. 0.5 ile 1.0 arasındaki değerler iyi bir başlangıç noktasıdır.
   3. Sharpen kaydırıcısını hareket ettirerek 2D unsharp maske uygulayın; böylece odak dışı ışıktan kaynaklanabilecek bulanıklık veya bulanıklığı azaltır. Keskinleştirme ayrıca gürültüyü de vurgular.
      NOT: Kaydırıcı değeri, bulanıklığın ölçeğini tanımlamak için kullanılan bir Gauss çekirdeğinin standart sapmasına (piksel biriminde) karşılık gelir. ~Nyquist örneklemeli görüntüler (70-150 nm xy piksel boyutu) için, 2.0 ile 4.0 arasındaki kaydırma değerleri iyi bir başlangıç noktasıdır. Ağırlık parametresi 0.6 olarak sabittir.
2. Görüntü piksel yoğunluklarını değiştirin (Süreç Panel, Kanal Yoğunluklarını Değiştir bölüm).
   NOT: Tüm komutlar yalnızca aktif kanala uygulanır ve sonuçlar otomatik olarak görüntü penceresinde gösterilir. Yeni bir görüntü penceresi oluşturulmaz.
   1. Sub.Bkgd. kaydırıcısını hareket ettirerek 'yuvarlanan top' algoritmasını uygulayın, böylece arka plan (yani mekansal olarak kademeli yoğunluk değişimleri) ortadan kalkar.
      NOT: Kaydırıcı değeri, yuvarlanan topun piksel cinsinden yarıçapıdır, bu yüzden daha büyük değerler daha az toplam arka plan çıkarır. Değer görüntü içeriğine bağlıdır, ancak genellikle korunacak özelliklerin piksel cinsinden (ölçülen boyut) ≥2 kat daha büyük olmalıdır. 10 ile 20 arasındaki değerler genellikle iyi bir başlangıç noktasıdır.
   2. Gamma kaydırıcısını hareket ettirerek zayıf sinyallerin daha parlak sinyallerle karışmasını güçlendirin; örneğin, büyük yapılarla karıştırıldığında ince yapıları vurgulamak için gerekli olabilecek sinyaller.
      NOT: Normalizasyondan sonra, her pikselin değeri, kaydırıcının değeriyle verilen bir kuvvete (üstel) yükselir. Değer görsel içeriğine bağlıdır, ancak 0.6 ile 0.8 arasındaki değerler genellikle iyi bir başlangıç noktasıdır.
      DIKKAT: Gamma'nın uygulandığı görüntüler yoğunluk ölçümü için kullanılamaz.
   3. Gain ve Offset: ToCh veya ToAll butonlarına basarak, görüntü gösterme aralığını (Display panelindeki ekran kazanç ve ofset kaydırmaları tarafından belirtildiği gibi) görüntünün bit derinliğinin sağladığı tüm yoğunluk aralığına eşleyin.
      NOT: Bu süreç aynı zamanda uygulama tablosu (LUT) olarak da bilinir. Ekran Kazancı ve Ofset, Ekran panelinde Kanal Görünümleri oluşturulmadan önce bu şekilde uygulanmalıdır.
   4. Yoğunluk Düzeltme düğmelerini, 3D görüntülerin z- veya t- boyutlarında fotobeyazlama, aberrasyonlar veya ışık saçılmasından kaynaklanabilecek yapay yoğunluk değişikliklerini düzeltmek için kullanın.
      NOT: Bu işlem yalnızca aktif kanala uygulanır. Yerel ve küresel düzeltmeler aynı veri setine sıralı olarak uygulanabilir. Temel yöntemlerin daha fazla açıklaması için Sonuçlar bölümüne bakınız.
   5. Çoğu biyolojik kaynaklı yoğunluk değişimini korurken, tüm z veya t boyutunda kademeli sinyal yoğunluk kayıplarını düzeltmek için Global düğmelerine basın. İki seçenek vardır:
      1. GlobalL düğmesine basarak z-stack'leri düzeltebilirsiniz; ilk dilimler koyu veya siyah olabilir ve ilk kareden son kareye kadar toplam yoğunluk kaybı hafif (%<%50) olur. Algoritma, yoğunluk kaybını doğrusal bir trend olarak modeller ve ardından her dilime bir düzeltme faktörü uygular, böylece uyum çizgisinin eğimi sıfıra düşürülür.
      2. İlk karelerin en parlak olduğu zaman serisini düzeltmek için GlobalP düğmesine basarak ve ilk kareden son kareye kadar toplam yoğunluk kaybının önemli olduğu (%50-%95) düzeltin. Algoritma, yoğunluk kaybını 2^. dereceden polinom eğilimi olarak modeller ve ardından her dilime bir düzeltme faktörü uygular; böylece uyum eğrisi sıfır eğimli bir çizgiye dönüştürülür.
   6. Yerel düğmeye basarak yerel, ani sinyal yoğunluğu değişikliklerini düzeltin, ancak kademeli değişiklikleri koruyun.
      NOT: Bu değişiklikler, daha büyük bir z-yığındaki birkaç düzlemin ağartılması veya uyarılma güç dalgalanmaları (titreme) nedeniyle meydana gelebilir. Algoritma, biyolojik olarak ilgili yoğunluk değişimlerini dördüncü dereceden polinom olarak modeller ve ardından her kare'nin medyan yoğunluğunun uyarlanan eğriyle eşit olmasını sağlamak için bir düzeltme faktörü uygular.
   7. Her karedeki medyan sinyal yoğunluğunu eşit hale getirmek için Equalize düğmesine basın; bu, Fiji 'basit oran' ağartıcı düzeltme yöntemine benzer şekilde.
      DIKKAT: Equalize, diğer tüm yöntemler başarısız olduğunda görselleştirme amacıyla faydalı olabilir, ancak medyan yoğunluktaki biyolojik olarak ilgili değişimleri silir ve bu nedenle yoğunluk nicelendirme ile birlikte kullanılamaz.
3. Bir görselin boyutluluğunu değiştirin (Süreç Paneli , Boyutları Değiştir bölümü).
   NOT: Bu komutlar görüntü penceresindeki tüm kanallara uygulanır ve Geri Alma butonu kullanılarak geri alınamaz.
   1. Bir embriyo veya dokunun anatomik eksenlerini sayfa veya ekranla hizalamak için gerekli olabilecek görüntüyü döndürmek için Rotate butonuna basın.
   2. Kırpma butonuna basarak görüntünün xy boyutlarını küçültün. Otomatik olarak seçilen dikdörtgen ROI aracını arayın ve kırpma için kullanılacak görselde bir ROI çizme uyarısını izleyin.
   3. Alt küme düğmesine basarak giriş görüntüsünün xy olmayan boyutlarından bir alt kümeden yeni bir görüntü yığını oluşturun.
      NOT: Bu, kanalları kaldırmak ve/veya z veya t'deki dilimleri kesmek için kullanılır.
4. Bir görüntüye uygulanan işlem komutlarını kaydedin (Süreç Paneli, Kayıt Eylemleri bölümü).
   NOT: Action Recorder'ın amacı, eylemleri otomatik olarak düz metin olarak kaydetmek ve ardından görüntüyü piksel yoğunluk değerlerini değiştiren uygulanan eylemlerle birlikte kaydetmektir. Günlük, kullanıcının manuel not alması veya Fiji makro kaydedicisi kayıtlarını çözmek zorunda kalmaması için bir kolaylık sağlar. Piksel yoğunluğunu değiştirmeyen komutlar kaydedilmez.
   1. Rec düğmesine basarak komut kaydını başlatın.
      NOT: Kaydedici kayıt yaparken düğme yüzü 'AÇIK' olarak yazıyor. Çalıştırılan komutlar ve ilgili parametreler Eylem Tablosu'nda görünecektir. 'Geri alınan' komutlar tablodan kaldırılır.
   2. Eylem Tablosunu temizlemek için Clr düğmesine basın.
   3. Eylem Tablosunu metin dosyası olarak kaydetmek için Kaydet düğmesine basın. Birden fazla görse uygulanan eylemler kaydedildiyse, metin dosyası kaydedildiğinde işlemler resim başlığına göre gruplanır.
      NOT: Alternatif olarak, Kaydet panelini kullanarak bir görüntüyü kaydedin (aşağıda bölüm 4). Kayıt Eylemleri kutusunu işaretle, görse uygulanan tüm işlemler otomatik olarak görselin adı ve dosya yolu kullanılarak metin dosyası olarak kaydedilir.

4. EasyFiji Kayıt Panelini Kullanmak

NOT: Şekil 1C'de gösterildiği gibi, Kaydetme paneli, uzman olmayanların amaçlanan kullanım durumuna uygun doğru görüntü dosya formatını seçmelerine yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Kayıt Eylemleri işaret kutusu işaretlendiğinde, Eylem Tablosu'nda listelendiği gibi bir görse uygulanan tüm işlem işlemleri, aynı dosya adı ve yol kullanılarak otomatik olarak görüntüyle birlikte kaydedilir; ancak *.txt uzantısı kullanılır. Birden fazla görüntü açık ve paralel olarak işleniyorsa, tüm görüntülerde gerçekleştirilen tüm işlemler Eylem Tablosu'nda görüntülenir. Ancak, sadece kaydedilen görüntüye uygulanan eylemler o görüntüyle birlikte kaydedilir. Kaydedilen metin dosyası dosya sisteminde görünür ancak Fiji'de açılmaz. İstenilirse, dosya simgesini Fiji araç çubuğuna sürükleyerek metin dosyaları Fiji'de açılabilir.

1. Bir görüntüyü kaydet (Kaydetme Paneli, Kayıt Yöntemleri bölümü).
   1. Ham Veri butonuna basarak görüntüyü *.tif dosyası olarak kaydedebilirsiniz; burada tam piksel değerleri, kanal yapısı ve bazı meta veriler korunur. Amaç bir görüntüyü daha fazla niceliklendirmek veya analiz etmek olduğunda bu seçeneği kullanın.
   2. Sunum için Kaydet butonuna basarak görüntüyü şu anda görüntülendiği gibi kaydetmek için jpeg sıkıştırma ile e-posta göndermek veya slayt sunumunda kullanmak amacıyla kaydedebilirsiniz.
      DIKKAT: Bu seçenek asla rakamlar oluşturmak veya nicel analiz için kullanılmamalıdır.
   3. Kalite Seviyesi kaydırıcısını jpeg sıkıştırma seviyesini ayarlamak için hareket ettirin.
      NOT: Daha büyük değerler, piksel yoğunluklarının ve özelliklerinin (ve daha büyük dosya boyutunun) daha iyi korunmasını sağlar, ancak hiçbir zaman tüm özellikler korunmaz.
   4. Görüntüyü diğer grafik programlarıyla uyumlu olan png formatında kaydetmek için Şekil için Kaydet butonuna basın. Görüntü ekranda gösterildiği gibi kaydedilir, ancak kanallar ve meta veriler korunmaz.
      DIKKAT: Bu seçenek asla nicelik için kullanılmamalıdır.
   5. Film olarak kaydet butonuna basarak bir görüntü yığınını dilimleri ardışık olarak oynatan bir film olarak kaydedin (z veya t).
      NOT: Windows tabanlı bir işletim sisteminde mov dosyalarını oynatmak için açık kaynak VLC Media Player gereklidir.

5. EasyFiji Görsel Bilgi Panelini Kullanmak

NOT: Şekil 1D'de gösterildiği gibi, Görüntü Bilgisi paneli, resim yorumlama için kritik olan satıcıya özgü düz metin satın alma ayarlarını gösterir. Şu anda desteklenen konfokal görüntü formatlarının listesi için Tablo 2'ye bakınız.

1. Erişim ayarlarını yüklemek için Kanal Bilgisi düğmesine basın.
2. Kanala özgü alım ayarları için Kanal Bilgisi bölümüne bakınız; % lazer gücü, lazer dalga boyu, emisyon bant geçişi(ler), kazanç ve iğne deliği boyutu.
3. Sistem Yapılandırma bölümüne görüntü genelinde ayarlar için bekleyin; sistemadı, amaç, tarama modu, buruşma süresi ve voxel boyutu dahil.

Results

Çok kanallı floresan görüntülerin sahte renkli renderleri, sinyaller arasındaki mekansal veya yoğunluk ilişkilerini göstermek için kullanılabilir; ancak yerel Fiji, yalnızca algısal düzeyde renk ve parlaklığı karıştıran RGB kompozit render tekniği sunar. Bu sorunu açıklamak için Şekil 2 , N-Myc ve RNA Polimeraz II'nin (RNAPolII) iki kanallı görüntüsü kullanır. Şekil 2A'da, her kanal ayrı ayrı gri tonlu olarak gösterilir, böylece...

Discussion

Fiji, görüntü analistleri arasında yaygın olarak popüler olan açık kaynaklı bir görüntü işleme ve analiz yazılımıdır. Ancak, karmaşık menü arayüzü ve floresan görüntülerin görüntülenmesi ve işlenmesine ilişkin zaman zaman sezgisel olmayan davranışları, hesaplamalı olmayan yaşam bilimcileri için zorluklar yaratmaktadır. EasyFiji, yaşam bilimcilerine, floresans görüntülerle çalışırken gerekirse kanala özgü davranışları tutarlı şekilde sergileyen, tematik olarak düzenlenmiş ve araç ipucu il...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasyFiji GitHub Sitesi	Açık Kaynak		https://github.com/stjude/EasyFiji
EasyFiji Image.sc forumu	Açık Kaynak		https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617
EasyFiji ImageJ.net sitesi	Açık Kaynak		https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start
FIJI Yazılımı	Açık Kaynak		https://imagej.net/software/fiji/downloads
VLC Medya Oynatıcı	Açık Kaynak		https://www.videolan.org/vlc/