Yöntem makalesi

Farklı Memeli Beyinlerinde Nicel Hücre Sayımı Çalışmaları İçin Karşılaştırmalı Yaklaşım

DOI:

10.3791/69446

⸱

16 Ocak 2026

 ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, 2Department of Veterinary Sciences, University of Turin, 3Department of Anthropology and Center for the Advanced Study of Human Paleobiology, The George Washington University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modern sinirbilimler, laboratuvar kemirgenleri ve insanlar dahil olmak üzere birçok tür arasındaki farkları keşfetmelidir. Ancak büyük beyinli memeliler söz konusu olduğunda teknik zorluklar ortaya çıkar. Bu yaklaşım, çok farklı memelilerde nöronal popülasyonların türler arası varyasyonlarını ele alır ve evrimsel kalıpların ortaya çıkarılması için haritalanacak benzer sonuçlar sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoğu nörobiyolojik çalışma laboratuvar kemirgenleri üzerinde yürütülür. Memeli beyinleri arasında birçok benzerliğe rağmen, çeviri açısından yanıltıcı olabilecek önemli farklılıklar da mevcuttur. Beyin plastisitesinde, özellikle nörogenezde, belirgin türler arası farklılıklar bulunmuştur. Evrimsel değişimler nedeniyle farklı nörojenik süreçler yaygın olabilir; beyin yapıları ve memeliler arasında varyasyon gösterebilir ve fare ve insanlar gibi farklı türlerde plastisite potansiyelini değiştirir. Çok farklı türleri karşılaştırmak birçok sorunu gündeme getirir: karşılaştırmalı çalışmalar, büyük boyutlu beyinler söz konusu olduğunda teknik zorluklarla karşılaşır; Farklı laboratuvarlar tarafından heterojen deneysel yaklaşımların kullanılması, sonuçların karşılaştırılmasını sınırlayabilir; Heterojenlik, memeliler arasında nörogelişimsel süreçlerin farklı zaman süreçleriyle ilişkili olabilir ve bu da karşılaştırmaya değişkenler ekleyebilir.

Bu sınırlamaları aşmak için, memelilerde beyin boyutu, gyrensefali, sosyoekolojik niş ve yaş açısından büyük farklılıklara sahip seviye II kortikal olgunlaşmamış nöron popülasyonunun türler arası varyasyonunu incelemek için bir yaklaşım oluşturuldu. Tam olarak standartlaştırılamayan bazı değişkenlere rağmen, beyin toplamada azaltılmış heterojenliği ve ilgili beyin seviyelerinde hücre sayımı için referans noktası olarak ortak anatomik yapıların kurulmasını birleştiren bir yöntem önerilmektedir. Elde edilen veriler (örneğin, hücre yoğunlukları) filogenetik ağaçlara eşlenebilir, evrimsel desenler ortaya çıkarılır ve nöroanatomik özelliklerle (örneğin beyin boyutu, kortikal yüzey alanı) kovaryans açısından analiz edilir. Bu yaklaşım, filogenetik gruplar ve beyin boyutuyla ortaya çıkarılan kovaryasyon arasında kortikal olgunlaşmamış nöron sayısında dikkat çekici bir farklılık göstermiştir. Yöntem aynı türde farklı gelişim evrelerinde farklılıkları niceliklendirmek için de kullanılabilir ve yetişkin beyinlerdeki farklı hücre popülasyonlarının daha doğru niceliklerini sağlamak için karşılaştırılabilir sonuçları haritalamak için diğer çeşitli memeliler ve biyolojik süreçlere genişletilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinirbilim araştırmaları, sonuçları insanlara aktarmak için büyük ölçüde akraba evliliği yapmış fareler ve fareler kullanır. Moleküler, hücresel ve hatta anatomik benzerliklere rağmen, önemli türler arası farklılıklar da mevcuttur ve bu da preklinik verilerin yorumlanması içinyanıltıcı olabilir 1,2. Karşılaştırmalı çalışmalar gerekse de, büyük beyinler söz konusu olduğunda teknik ve pratik zorluklar nedeniyle engellenirler (örneğin, farelerde ortalama 0,5 g'den insanlarda 1300 g'a kadar; Şekil 1A). Ayrıca, farklı laboratuvarların heterojen deneysel yaklaşımları, özellikle nicel analizler gibi sonuçların karşılaştırmasını sınırlayabilir ve bazen tartışmalara yol açabilir. Bu, beyin yapısal plastisitesi örneğidir; özellikle nörojenik süreçler 3,4,5 ile ilgili, gelişimsel nöroplastisite ve beyinonarımını anlamak için ilgi çekici bir konu olan 6,4,5.

Beyin plastisitesi alanındaki son keşifler, evrim sırasında farklı nörojenik süreçlerin meydana gelmesi, hızı ve anatomik konumunda önemli farklılıklar ortaya çıktığını güçlü bir şekildegöstermektedir 8. Buna örnek olarak, kök hücre kaynaklı nörogenezin laboratuvar kemirgenlerine kıyasla büyük beyinli yetişkinmemelilerde görülen belirgin azalması verilebilir 5,9,10; bu durum, muhtemelen beyin bölgelerinin farklı genişlemesiyle ve ekolojik baskılara uyum işlevi ile bağlantılıdır 7,8 ve farklı nörogelişimsel zamansüreçleriyle 11,12. Nörogenezin hızı fareler ve insanlar arasında dikkat çekici şekilde farklılık gösteriyor ve bu da çeviri13 sorununu gündeme getiriyor.

Öte yandan, durgun olgunlaşmada tıkanmış nöronlarla temsil edilen yeni bir "bölünmesiz nörogenez" türü (olgunlaşmamış veya uykuda olan nöronlar 14,15,16,17,18,19) küçük beyinlilerden büyük beyinli türlere doğru arttığı varsayılmıştır 20,21. İlginç bir şekilde, kök hücreden bağımsız olgun olmayan nöron popülasyonu, beyin korteksinde (gyrensefalik türlerde yüksek dereceli bilişin bir alanı22,23) ve çoğunlukla koku alma ve mekânsal navigasyonla bağlantılı olan kanonik nörojenik sitelerden uzakta yer alır ve lissensefaliktürlerde büyük öneme sahiptir 7,8. Beyin yapıları ve memeli türleri arasındaki bu farklılıklar, sadece karşılaştırmalı ilginin ötesine geçer; çünkü fare ve insanlarda plastisitenin potansiyelini değiştirerek çeviri açısından önemli olabilirler. Bu nedenlerle, farklılıkların çok farklı memeliler arasında ne ölçüde filogenetik bir varyasyon temsil ettiğini "karşılaştırılabilir şekilde" değerlendirmek, özellikle laboratuvar kemirgenleri ve primatlara atıfta bulunmak önemlidir.

Beyin boyutu, girensefali ve sosyoekolojik niş 22,24,25 bakımından oldukça farklılık gösteren memelilerde katman II kortikal olgunlaşmamış nöron (cIN) popülasyonunun türler arası varyasyonunu incelemek için yakın zamanda kurulan bir yaklaşım tanımlanmıştır. Bu yöntem üç ilkeye dayanır: i) aynı prosedürlerle paralel olarak işlenecek birkaç (çeşitli) memeli türünü düşünmek; ii) çok farklı beyinlerde tam olarak standartlaştırılamayan değişkenleri en aza indirmeyi (fiksasyon prosedürü, ölüm sonrası aralık, yaş) ve immünositokimya için antikorların tür-özgüllüğünü, incelenen hücre popülasyonunun yaygın ortak özelliklerini iç pozitif kontroller olarak kullanarak ele almak; ve iii) farklı türlerin karşılık gelen beyin seviyelerinde hücre sayımı yapmak için referans noktası olarak karşılık gelen anatomik yapıları oluşturmak (Şekil 1B ve Şekil 2). İyi bilinen işaretleyici çift kortin (DCX15,17,26) ile tanımlanan hücrelerin sayılması yoluyla elde edilen veriler (örneğin, hücre yoğunlukları), filogenetik ağaçlara eşlenebilir ve evrimsel desenler ortaya çıkarılabilir ve beyin boyutu, gyrensefali ve kortikal yüzey alanı gibi farklı parametrelerle kovaryans açısından analiz edilir.

Şekil 1
Şekil 1: Kortikal mantoda cIN dağılımı ve miktarının değerlendirilmesi için çok farklı memeli beyinlerinin işlenmesi. (A) Farklı türlere ve takımlara ait memeliler, beyin boyutları ve girenekefaliyi ile kortikal genişleme dereceleriyle karakterize edilir. BioRender lisansıyla yeniden üretilen beyin ikonları. (B) Beyinlerden çok farklı boyutlarda ve kortikal manto uzantısında kesilmiş temsil Toluidin mavisi boyalı koronal kesitler. Histolojik olarak boyanmış seri kesitler (kriyost kesimi, koronal, 40 μm kalınlığında) her hayvan türünün ana nöroanatomik yapılarını tanımlamak için kullanılır ( bkz. Şekil 3); Beyin boyutu ve kortikal çevresindeki dikkat çekici farklılıklara dikkat edin. Panel A'daki hayvan ikonları, La Rosa ve ark.22'nin izniyle çoğaltıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Son olarak, tüm plastik süreçler genellikle27,28 yaş arttıkça kademeli bir azalma geçirdiğinden, karşılaştırmalı nöroplastislikte bir diğer konu da bu indirgenin farklı zaman süreçlerini değerlendirmektir; bu durum, memeliler arasında nörogelişimsel süreçlerin farklı zaman süreçleriyle ilişkiliolabilir 12,29,30 . Aslında, hızlı olgunlaşan (fare) ile yavaş olgunlaşan türlerin (primatlar) varlığı, biyomedikal bilimlerdeki zorlukları çözmede en yaygın model sistemi olan laboratuvar faresinin sınırlı olmasının bir diğer nedenidir. Burada açıklanan yöntem, her türün yaşam süresi boyunca farklı yaşlardaki hücre popülasyonlarını değerlendirmek ve ardından türler arasındaki eğilimleri karşılaştırmak için de faydalı olabilir. cIN yoğunluğundaki filogenetik varyasyon ve yaşlar boyunca kalıcılıklarındaki farklılıklar, küçük beyinli ve büyük beyinli memelilerarasında tespit edilmiştir 22,28.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri ilgili ulusal ve kurumsal düzenlemelere uygundu. Fare dokuları, İtalya Sağlık Bakanlığı'nın (RRID: MGI:3696370) izniyle, Serena Bovetti ve Charles River Laboratuvarları'nın izniyle, İtalya'nın Orbassano kentindeki Cavalieri Ottolenghi Sinirbilim Enstitüsü'nden (NICO) temin edilmiştir. Çıplak köstebek sıçan dokuları, ötenazi sonrası hemen Londra Queen Mary Üniversitesi'nde (Birleşik Krallık) Hayvanlar (Bilimsel İşlemler) Yasası'nın 1986 Ekvivalent 1'ine göre toplanmıştır. Tavşan deneyleri, Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi 86/609/EU ve İtalyan yasaları (DL.vo 116/92) uyarındaydı, İtalya Sağlık Bakanlığı'nın onayıyla (yetki 66/99-A). Koyun ve at beyinleri, 86/609/EEC Direktifi kapsamında ticari bir mezbahadan ve sürekli veteriner gözetimiyle otopsa sonrası elde edildi. Köpek beyinleri, gerekli yetinlerle MarshallBio Laboratuvarları (Lyon, Fransa) tarafından ölüm sonrası temin edildi; Kedi beyinleri, Padova Üniversitesi'nde rutin tanısal nekropsiler sırasında sahiplerinin onayı ile toplandı. Tüm prosedürler AB ve İtalyan mevzuatına uygun şekilde uygulandı. Şempanze örnekleri, Uluslararası Tıp Bilimleri Konseyi (CIOMS) uluslararası rehber ilkelerine ve Ulusal Sağlık Enstitüleri-Laboratuvar Hayvan Refahı Ofisi (NIH-OLAW) izni A5761-01 kapsamında işlenmiştir (her hayvan türü ve deney hakkında detaylar için Ek Tablo 1 ve Ref.22,25'e bakınız).

1. Beyin toplamak

  1. Beyinleri doğrudan veya diğer kurumlardan ve doku bankalarından toplayın, ancak sadece tüm yarımküreleri düşünün. Kurumlarla birlikte, hayvan türlerinden beyin çıkarma için en iyi prosedürü kurmak, yarımküredeki hasarı azaltmak ve minimum ölüm sonrası intervalı (PMI, aşağıdaki NOT'a bakınız) ve ekstraksiyondan sonra fiksatif çözeltiye hızlı daldırmayı sağlamak amacıyla oluşturulur.
    NOT: İlgilenen antikorun hassasiyetine bağlı olarak, PMI'ya dikkat edin. Çift kortinin (DCX) bozulmaya karşı yüksek hassasiyeti göz önüne alındığında, PMI aralığı 0-1 saat aralığında örnekler alın (şempanze hariç, 14 saate kadar PMI süresi var, ancak bu da boyama kalitesinde herhangi bir değişikliğe yol açmamıştır, Ek Tablo 1).
  2. Hayvanın yaşam süresinin yüksek değişkenliği göz önüne alındığında, karşılaştırılabilir veriler elde etmek için çalışmaya katılan farklı memeliler arasında toplanacak yaş gruplarını önceden belirleyin.
    1. Bu çalışma tasarımı ve karşılaştırılabilir yaş grupları belirlemek için, hayvan tarihi ve çeşitliliği üzerine iki veri tabanından veri analizi alın: AnAge, hayvanlarda yaşlanma ve yaşam öyküsüne dair küratör bir veritabanı ve hayvan doğal tarihi, dağılımı, sınıflandırması ve koruma biyolojisi için çevrimiçi bir veritabanı Hayvan Çeşitliliği Web.
    2. Hayvan ömrünü dört aşamaya ayırın (bir ergenlik öncesi ve üç ergenlik sonrası dönem, yani "yetişkin"), Amerikan Veterinerler Tıp Birliği'nin (AVMA) köpeklerdeki yaşam evrelerisınıflandırmasından başlayarak 31 yaşam süresi altı aşamaya ayrılmıştır: yavru köpek, genç, yetişkin, olgun, yaşlı ve geriatri.
    3. Yaşlı ve geriatrik evreleri ile yetişkin ve olgun evreleri sıkıştırarak bu terimi uygulayın: ergenlik öncesi, genç-yetişkin, orta yaş ve yaşlı/yaşlı/22 yaş.

2. Beyin dokusu fiksasyonu ve işleme

NOT: Fiksasyon prosedürleri, beyin boyutuna ve bazı hayvan türlerine ilişkin etik kaygılara bağlı olarak farklı olabilir (çoğu büyük beyinli primat veya at perfüzyon edilemez ve ekstraksiyondan sonra fiksatif çözeltiye daldırarak düzeltilmelidir).

  1. Beynleri tamamen fiksatif çözeltiye (%4 paraformaldehit veya %10 formalin önerilen) içine kaptırın.
    NOT: Fiksasyon süresi beyin büyüklüğüne göre değişir (örneğin, köpek beyni için 3 hafta; at beyni için 3 ay, Ek Tablo 1). İlgilenen antijenin bütünlüğünü korumak için fiksatif çözeltide düşük veya fazla zaman geçirmekten kaçının.
  2. Tercih edilen beyin yarımküresini eşit dilimlere (1-1,5 cm kalınlığında) bir cetvel (düz kesim yapmak için) ve bıçak bıçağı ile kesin.
  3. Beyin dilimlerini 0,1 M fosfat tamponu (PB) (28,49 g sodyum fosfat dibazi ve 7,8 g sodyum fosfat monobaz, distile suda çözünmüş, pH 7,4) içine batırın ve 24 saat boyunca bir çalkalayıcıda hafif çalkalama altında tutulun. Gerekirse (aşağıdaki NOT'a bakınız), çözeltiyi atın ve ertesi gün PB 0,1 M, pH 7,4 taze bir çözeltiyle değiştirin.
    NOT: PB 0.1 M'deki yıkama hacmi ve sayısı beyin büyüklüğüne göre değişir (örneğin, fare beyni için 30 dakika, at beyni için 3 gün). Beyinlerin tamamen PB 0.1 M içinde olduğundan ve formalin, kan ve doku atıklarının artık olmadığından emin olun, böylece yıkamayı durdurun.
  4. Dilimleri, PB 0,1 M, pH 7,4 içinde kademeli olarak artan konsantrasyona (%10, %20, %30'a kadar) sukroz çözeltilerine batırarak kriyokoruma yapın ve bir çalkalayıcıda hafif çalkalama altında tutun.
    NOT: Sakroz çözeltilerinin hacmi beyin büyüklüğüne göre değişir. Beyinlerin tamamen sakaroz çözeltilerine daldırıldığından ve onları daha yüksek sakaroz konsantrasyonuna taşımadan önce tamamen battığından emin olun.

3. Tüm yarımküre kriyostat kesimi

  1. Kesim sırasında sorun yaşanmamak için beyin dilimlerinden meningleri kavisli cımbızla çıkarın.
  2. Dilimleri, optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğiyle doldurulmuş gömülü kalıplara yerleştirin. Eğer dilim gömülü kalıbı doldurmazsa, beyin diliminden biraz daha büyük bir kare Parafilm parçası kesin ve parçanın ortasına OCT ortamı ekleyin, ardından dilimi OCT'nin üstüne koyun.
  3. Dilimi, 300 mL sıvı azotla soğutulmuş izopentana batırarak -50 °C'de dondurun, OCT ortamı tamamen beyaza dönene kadar. Beyin dilimleri, kesitlenmeye kadar uzun süreli depolama için -80 °C sıcaklıkta tutulabilir.
  4. Kesitten önce, dokunun kriyostatla aynı sıcaklığa yavaş ve homojen bir şekilde ulaşmasını sağlamak için beyin dilimini en az 5 saat boyunca -20 °C'de tutun.
  5. Dilimi, kriostat kullanarak 40 μm kalınlığında seri koronal kesitlere kesin, iç odada -20 °C ile -25 °C arasında sıcaklık aralığı korun.
  6. Serbest yüzen kesitleri 12 kuyu plakalarında toplayıp kriyoprotektan çözeltisinde (150 mL gliserol, 150 mL etilen glikol, 150 mL damıtılmış su ve 50 mL F tampon [1.682 g sodyum fosfat monobazik dihidrat ve 0.385 g sodyum hidroksit damıtılmış suda çözünmüş, pH 7.4]) (büyük beyinlerde kesitleri tamamen kaplamak için 1 mL veya daha fazla) içinde -20 °C'de boyalana kadar saklanır.
    NOT: Tüm yarımküre dilimleri beyin büyüklüğüne göre değişir. Daha büyük beyinler (örneğin, şempanzeler, atlar) kriostatta işlenmek için iki eşit bloka (dorsal ve ventral) bölünmelidir. Bu durumda, serbest yüzen bölümler iki 6 kuyruklu plakada toplanabilir. Alternatif olarak, büyük beyinli türlerden yarımküreleri kaydıran bir mikrotomla kesmek ve böylece daha büyük boyutlu bloklar oluşturulmasına olanak tanır.

Şekil 2
Şekil 2: Aynı prosedürü takip ederek çok farklı beyinleri işlemek ve standartlaştırılamayan değişkenlerle ilgilenmek. Yukarıda açıklanan yöntemde, standartlaştırılabilen tüm işlemler aynı şekilde yapılır (genel fiksasyon, tüm yarımkürede aynı kalınlıkta seri koronal kesitlerin kesilmesi, genel immünositokimyasal işlemler, hücre sayılması). BioRender ile oluşturulan figür (https://app.biorender.com/). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Histolojik boyama

  1. Seri koronal kesimleri seçin (12 bölümden 1). Bu aralığı elde etmek için, 12 kuyuluklu plakadan bir kuyunun tüm bölümlerini seçin. Tüm yarımkürenin tam temsilini elde etmek ve incelenen farklı türler arasında farklı karşılaştırılabilir beyin seviyelerinde koronal kesitleri seçmek için referans olarak kullanın (bkz. bölüm 5). Onları %1 jelatinize slaytlara monte edin. Birkaç saat kurumasına izin verin.
  2. Aşağıdaki çözeltileri hazırlayın (150 mL/çözelti): etanol %50, %70, %96, %100, Ksirol ve Toluidin Mavisi.
  3. Boyama protokolü: Slaytları artan etanol konsantrasyonlarına (%50-100), her biri 1 dakika %50-70, 2 dakika %96%-100 oranında yerleştirin ve ardından 1 dakika boyunca ksilol çözeltisine aktarın.
  4. Slaytları ters sırayla yerleştirin: 1 dakika boyunca ksilol çözeltisi, ardından azalan etanol çözelti konsantrasyonları (%100-50), %100-96 aralığında 2 dakika, %70-%50 oranında 1 dakika koyun.
  5. Slaytları 150 mL damıtılmış H2O (2 dakika) içine yerleştirin.
  6. Slaytları Toluidin Blue leke çözeltisine yerleştirin (5-10 dakika). Bu adımdan sonra, lekelenmiş bölümler koyu mavi görünür.
    NOT: Histolojik boyama çözeltilerinde tutulan zaman bölümleri türe göre değişebilir. İlgilendiğiniz türün beyin bölümlerini test ederek optimal boyama protokolünü belirleyin.
  7. Slaytları 150 mL damıtılmışH 2O ile 1 dakika durulayın.
  8. Slaytları artan etanol konsantrasyonlarında (%70-%100) 1 dakika boyunca %70, %2 dakika %96%-100 oranında yerleştirerek ve ardından 1 dakika 30 saniye boyunca ksilolü çözeltiye aktararak farklılaştırma adımına devam edin. Bu adımlarda, bölümler koyu maviden gökyüzü mavisine geçer.
  9. Kaplamayı montaj ortamıyla kaymadan önce son ksilolü aşamadan sonra bölümlerin hâlâ ıslak olduğundan emin olun (kuruyorlarsa 5 saniye ksilol çözeltisinde durulayın). Sonra slaytları birkaç gün kurut.

5. Beyin seviyeleri seçimi ve immünohistokimyasal boyama

  1. 4. bölümde elde edilen histolojik olarak boyalı kesitler referans olarak kullanılarak, belirli nöroanatomik özelliklere bağlı olarak beyin seviyelerini belirleyin: Seviye 1 (L1) - lateral ventrikülün ön açılışından L2'ye; Seviye 2 (L2) - iç kapsülün ön başlangıcından L3'e kadar; Seviye 3 (L3) - amigdalanın ön başlangıcından L4'e kadar; Seviye 4 (L4) - lateral ventrikülün arka kapanışından L2'ye eşdeğer bir uzantıya (aynı sayıda 40 μm kalınlığında seri kesit; Şekil 3).
    NOT: Yukarıda listelenen nöroanatomik referanslar, beyinlere ait beyin korteklerinin karşılaştırılmasına olanak sağlamayı amaçlamaktadır. İlgilendiği beyin bölgesine bağlı olarak, referans olarak kullanılan anatomik özellikler değişebilir.
  2. Her beyin seviyesinden eşit aralıklı üç koronal kesit seçin.
    NOT: Sonraki adımlarda kullanılan her tamponun hacmi beyin boyutuna göre değişir (örneğin, fare kesitleri için 0,5 mL/kuyruk, at kesitleri için 1,5 mL/kuyu). Serbest yüzen bölümlerin her tampon tarafından tamamen kaplı olduğundan emin olun.
  3. Bölümleri PBS 0.01 M, pH 7.4 ile üç kez, her biri 5 dakika boyunca yıka.
  4. Bölümleri endogen peroksidaz bloklama çözeltisinde (%0,6 H2O2, %1 Triton X-100 0,01 M PBS, pH 7,4; 20 dakika) kuluçka yapın veya limon asit (%0,05 Tween 20 ile takviye edilmiş damıtılmış suda 10 mM limrik asit, pH 6,0) kullanarak antijen toplama işlemi yapılın, 90 °C'de 5 dakika uygulanın.
    NOT: Fiksasyon prosedürü/süresi ve ilgi duyulan antijene bağlı olarak, optimal boyama elde etmek için antijen geri alımı gerekebilir (tampon, sıcaklık, pH ve kuluçka süresi, ilgi gören antijene göre değişebilir).
  5. Bölümleri tekrar PBS 0.01 M, pH 7.4 (3 x 5 dakika yıkama) ile yıkayın.
  6. Bloklayıcı çözeltide (%1-5 sığır serum albümini (BSA), normal serum, %1-1,5 Triton X-100, 0,01 M PBS, pH 7,4; RT'de 90 dakika) inkübe yapın.
  7. Birincil antikor çözeltisi ile inkübe bölümleri yapın (%1-5 BSA, %2-3 normal serum, %1-1,5 Triton X-100, primer antikor 0,01 M PBS, pH 7,4; 48 saat 4 °C'de hafif karıştırma).
    NOT: İlgilenen antijene karşı antikorlar, farklı beyin bölgelerinde ve farklı türlerde kullanıldığında boyama kalitesi açısından farklı sonuçlar verebilir26. Çalışmada değerlendirilen farklı türlerde kullanılacak en uygun aracı seçmek için farklı üreticilerden gelen antikorlar arasında karşılaştırma gereklidir (örnekler arasındaki değişkenliği azaltmak için).
  8. 5.3. adımda tarif edilen yıkama adımını tekrarlayın.
  9. İkincil biyotinillenmiş antikor çözeltisi ile inkübe bölümleri yapın (%1-5 BSA, %2-3 normal serum, %1-1,5 Triton X-100, ikincil biyotinillenmiş antikor 0,01 M PBS, pH 7,4; RT'de 2 saat).
    NOT: Avidin-biotin peroksidaz kompleksi yöntemi, Neurolucida'da hücre sayımı için kullanılır (bkz. bölüm 6), çünkü yoğun ve uzun süreli bir çökelti sağlar ve sayma sırasında kesit kalınlığına odaklanma sağlanır. İmmünofluoresans ve konfokal analiz, hücreleri daha da karakterize etmek için çift/üçlü immünboyama yapmak için kullanılabilir (protokoller için bkz. Ref.22,25,32).
  10. Mevcut kit kullanarak avidin-biotin-peroksidaz kompleksi hazırlayın.
    NOT: Avidin-biotin peroksidaz kompleks çözeltisini Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (kompleks oluşumu için stabil pH sağlar) içinde en az 1 saat önce hazırlayın; böylece kompleks oluşumu mümkün olsun.
  11. Bölümleri PBS 0.01 M, pH 7.4 (2 x 5 dakika yıkama) ile iki kez ve Tris-HCL 0.05 M, pH 7.5 (5 dakika) ile iki kez yıkayın.
    NOT: Avidin-biotin-peroksidaz kompleksi Tris-HCl 0.05M ile çözelti halinde olduğundan, Tris-HCl 0.05 M ile durulama dokunun çözeltiye alışmasını sağlar.
  12. Avidin-biotin-peroksidaz kompleksinde (RT 1 saat) kuluçka bölümleri ile inkübe yapın.
  13. Bölümleri Tris-HCL 0.05 M, pH 7.5 (3 x 5 dakika yıkama) ile yıkay.
  14. Bir duman başlığı altında, optimal boyama elde edilene kadar 3,3'-diaminobenzidin (DAB) boyama çözeltisinde (H2O2, DAB Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5) inkübe yapın. Bu aşamada, bölümler şeffaf renkten kahverengi/bordo kırmızına geçer.
    NOT: Optimal boyama süresi, analiz edilen türe göre değişir (örneğin DCX için fare kesitleri için 2-5 dakika, at kesitleri için 20-30 dakika). Aşırı leke oluşmaması için her 2 dakikada bir boyama bölümlerini kontrol edin.
  15. Bölümleri PBS 0.01 M, pH 7.4 (3 x 5 dakika yıkama) ile yıkay.
  16. Bölümleri bir kaydıra monte edin, kuruduktan sonra kaplama malzemesi kullanarak örtü ile örtün ve kayakların birkaç gün kurumasına izin verin.

Şekil 3
Şekil 3: Beyin korteksindeki DCX+ olgunlaşmamış nöron dağılımı ve miktarının incelenmesi için nöroanatomik beyin seviyelerinin belirlenmesi. Dört ilgili nöroanatomik yapı (lateral ventrikülün ön başlangıcı [seviye 1, L1]; iç kapsülün ön başlangıcı [L2]; amigdalanın ön başlangıcı [L3]); lateral ventrikülün arka kapanması [L4]; kırmızı dairelerle belirtilen) göz önünde bulundurulan tüm memelilerde dört karşılık gelen ön-arka "beyin seviyesi" belirlemek ve beyin korteksindeki cIN sayısını "karşılaştırılabilir" bir şekilde incelemek amacıyla değerlendirildi. (A) Laboratuvar kemirgenleri (fare, solda) ve primatlar (şempanze, sağda) için bir örnek verilmiştir. Her beyin seviyesinden üç koronal kesit (toplam 12 kesit; kırmızı ok uçları) her koronal kesitin tüm katman II çevresinde hücre sayımı için dikkate alınır (NOT: tüm bölümlerde neokorteks bulunur, ancak sadece bazıları paleokorteks de içerir). Bu yaklaşım, boyutları oldukça değişken beyinlerde karşılık gelen nöroanatomik seviyelerde analizlerin yapılmasına olanak sağlamayı amaçlamaktadır. (B) Farklı memeli türlerinin histolojik olarak boyalı kesitlerinde birinci seviye (L1) tanımlanması için bir örnek verilmiştir. BioRender ile oluşturulan beyin ve hayvan simgeleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. Hücre sayımı

  1. İş istasyonunda Neurolucida yazılımını açın ve slaytı mikroskobun altına yerleştirin, böylece hücre sayımı için seçilen hedef alın.
    NOT: DCX+ hücre sayımları için 20x bir objektif kullanılmıştır.
  2. Düşük büyütmede (örneğin, 4x), yazılımın İz menüsündeki Freehand kontur çizgisi aracıyla kortikal katman II'nin konturunu çizerek uzunluk çevresini (hem paleokorteks hem de neokorteks) elde edin.
  3. Ekranın sol tarafında bulunan Markers araç çubuğunda hücre sayımı için tercih edilen sembolleri seçin. Bu analiz için, ilgi duyulan her bölgede (paleokorteks, neokorteks) iki farklı hücreyi morfolojilerine göre (farklı olgunlaşma durumlarına karşılık gelir: tip 1, küçük bir soma ve bipolar bir şekle, soma çapı 3-9 μm; tip 2, daha büyük bir soma ve karmaşık dendritik arborizasyona sahip, soma çapı 9-18 μm aralığına denir.
    NOT: Bu analiz için, ilgi çekici her bölge için Markers Araç Çubuğu'nda iki farklı sembol/hücre tipi seçilmiştir. Soma çapını farklı aralıklara ayırmak, hücreleri net bir morfoloji olmadan titizlikle sınıflandırmak için çok önemlidir; bu morfoloji ara olgunlaşma aşamasında olabilir. Aşırı saymayı önlemek için, bölümün üst yüzeyinde kesilen hücreler analizden hariç tutulur.
  4. Filogenetik analiz için üç farklı bölgeden veri toplayın: paleokorteks, neokorteks ve beyin korteks (sonuncusu paleo- ve neokorteks verilerinin eklenmesiyle elde ediliyor).
  5. Yazılımdaki Kontur Ölçümleri araç çubuğunda görünen kortikal katman iki çevre (mm) bir elektronik tablo dosyasında toplayın.
  6. Aynı tabloda, her beyin bölgesi ve beyin seviyesinde (seviyede üç bölüm, toplam 12 bölüm/örnek) tip 1 ve tip 2 hücrelerinin sayısını ( Markers Toolbar'da görünür) ve toplam hücre sayısını (tip 1 ve tip 2 hücrelerin toplanmasıyla elde edilen) toplayın.
  7. Bu verileri kullanarak her bölgedeki her bölüm için doğrusal hücre yoğunluğunu (hücre sayısı/mm sayısı) ve tip 1 ile tip 2 hücrelerin %'sini (tip 1/tip 2 hücre sayısı, toplam hücre sayısına bölünüp 100 ile çarpılır) elde edinin.
  8. Dikkate alınan 12 bölümün/örnekin yoğunluk medyan değerini (tablodaki Medyan fonksiyonu kullanılarak) hesaplayın, böylece doğrusal hücre yoğunluğunu grafik olarak temsil edersiniz. Medyanı merkezi ölçü olarak kullanın çünkü grup başına verilen örneklem nispeten küçüktür (4 hayvan/grup) ve bazı gruplar asimetrik dağılımlar sergiler (medyan aşırı değerlerden daha az etkilenir).
  9. Her örnekte tip 1 ve 2 hücrenin %'sini hesaplayın (yukarıda açıklanan formülü kullanarak) ve ardından dikkate alınan dört örnek/tür arasındaki ortalama yüzdelik değeri alın (elektronik tablodaki Ortalama fonksiyonu kullanılarak). Daha sonra, filogenetik analizler yapmak için doğrusal hücre yoğunluğunu kullanın (bkz. bölüm 7) ve her koronal bölümde sayılan toplam hücreleri kullanarak olgunlaşmamış nöron/yarımkürelerin toplam sayısını tahmin edin.
  10. Neurolucida Software'deki Freehand kontur aracını kullanarak soma çapı boyunca ana eksenine dik bir çizgi çizebilirsiniz. Bu adımı uygulayarak, her türde her türde rastgele seçilmiş DCX-pozitif (DCX+) hücrenin (her beyin bölgesinde, 25 hücre/örnek) en az 100 adet rastgele seçilmiş DCX-pozitif (DCX+) hücresinin çap uzunluğunu hesaplayarak tip 1 ve tip 2 hücrelerin soma çapı aralığını elde edin.

7. Filogenetik analizler: Filogenetik ağaç üretimi

  1. Analiz edilen türlerin bilimsel isimlerini kullanarak Notepad'de bir liste oluşturun ve ardından https://timetree.org/ siteye yükleyin.
    NOT: Bilimsel isimler şu siteyi kullanarak kontrol edilebilir: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy
  2. Elde edilen ağaç dosyasını Newick dosyasına tıklayarak dışa aktarın.

8. Filogenetik analizler: Filogenetik ağacında sayma veri entegrasyonu

  1. Bir veri sayfasının ayrı sütunlarında, analiz edilen tüm türleri ve ilişkilendirilecek ilgili verileri listeleyin (bu durumda: tüm korteks DCX+ hücre yoğunluğu, neokorteks DCX+ hücre yoğunluğu ve paleokorteks DCX+ hücre yoğunluğu). Eğer bir tür başına birden fazla birey varsa, seçilen parametreler için medyan yoğunluğun ortalamasını hesaplayın.
  2. Filogenetik ağacı sayma verisiyle birleştirmek için Mesquite Projesi yazılımını (https://www.mesquiteproject.org/) indirin.
    NOT: Bu yazılım, bilgisayarda zaten Java'nın bulunmasını gerektirir.
  3. Daha önce Timetree tarafından kaydedilen Newick dosyasını Open File'e tıklayarak açın. Sonra, Simple Newick/Phylip Treefile seçeneğini seçin. Dosyayı metin olarak ele alın ve ".nex" olarak kaydedin.
  4. Açılan yeni sayfada Taxa&Trees ve ardından New Three Window'u seçin ve Kaynaktan Ağaçlarla Birlikte'yi seçin. Açılır pencerede Stored Tree'i seçin ve OK tuşuna basın. İçe Aktarılan Ağaçlar adlı yeni bir sekme gösterilecek.
  5. Ekran bölümünde filogenetik ağacı (örneğin, yazı tipi, boyut, uzunluğa orantılı dallar) grafiksel olarak değiştirin.
  6. Mesquite'de yeni bir sekme ekleyin, Ekle ve ardından Yeni Karakter Matrisi'ni seçin ve karakter sayısını seçin (bu çalışma için sayı = 3, üç DCX+ hücre yoğunluğuna karşılık gelir). Karakterleri sürekli veri olarak ele alın.
    NOT: Karakterler, filogenetik ağacla ilişkilendirilecek verileri temsil eder.
  7. Filogenetik ağacıyla ilişkilendirilecek verileri (bölüm 6.4) bu yeni oluşturulan sekmeye kopyalayın ve kaydedin.
  8. İthal ağaçlar sekmesinde Analiz:Ağaç seçeneğini seçin ve Parsimony Ancestral States analizi yapmak için Karakter Geçmişini İzleyin.
  9. Dosyayı PDF olarak kaydet.

9. Filogenetik analizler: Beyin boyutu ve DCX+ hücre yoğunlukları korelasyonu

  1. Daha önce oluşturulan veri sayfasında, her tür için beyin boyutunu içeren bir sütun ekleyin.
  2. DCX+ hücre yoğunluklarının ve beyin boyutunun doğal logaritmasını hesaplayın.
  3. Tercih edilen istatistiksel yazılım paketini (https://www.statskingdom.com/linear-regression-calculator.html) başlatın ve basit bir doğrusal regresyon yapın
  4. Sonuç dosyalarını indirin ve kalıntıları veri sayfasında yeni sütunlar halinde kaydedin.
    NOT: Kalıntılar, veri noktalarının regresyon çizgisinden sapmasını temsil eder.
  5. Veri sayfasında, kalıntılar sütununu ve tür isimlerini içeren sütunu seçin. Sonra, kalıntıları grafiksel olarak göstermek için histogram grafiğini ekleyin ve seçin.

10. Filogenetik analizler: Neokortikal uzantı ve neokortikal DCX+ hücre yoğunluğu korelasyonu

  1. Daha önce oluşturulan veri sayfasında, her türün neokortikal katman II yüzey alanı verilerini içeren bir sütun ekleyin ve doğal logaritmalar hesaplanın.
  2. İstatistiksel yazılımda, logaritmik neokortikal katman II yüzey alanının değerlerini X değişkeni olarak ve logaritmik neokorteks DCX+ hücre yoğunluğunu Y değişkeni olarak kullanarak basit doğrusal regresyon yapılır.
  3. Elde edilen dosyaları indirin ve kalıntıları veri sayfasında yeni bir sütunda kaydedin; burada kalıntı grafik 9.5. adımda olduğu gibi oluşturulabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İncelenen tüm türlerin beyin korteksindeki DCX+ hücreleri, iyi korunmuş bir nöronlu popülasyonun varlığını gösteren bir dizi özelliği tutarlı şekilde paylaşır (Şekil 4A). Kısacası, bunlar: (i) topografik olarak kortikal katman II boyunca bir monokatman oluşturacak şekilde düzenlenmiştir; (ii) olgunlaşmamış nöronlarda farklı olgunlaşma evreleri için tanımlanan morfolojik alt tipleri göstermek, (a) küçük, unipolar/bipolar hücrelerin büyük yaygınlığı ve piramidal nöronları andıran karmaşık dend...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan yöntem, beyin boyutları ve nöroanatomisi açısından oldukça farklı türler dikkate alındığında karşılaştırılabilir nicel veriler sağlar. Çeşitli memelilerin beynindeki hücre popülasyonlarının tutarlılığını değerlendirmek ve tek bir türde gelişimlerini doğum sonrası yaşlanmaya kadar sonraki aşamalarda takip etmek için kullanılabilir. Bu, nispeten çok sayıda beynin (tüm yarımküreler) ve türlerin dahil olacağı, aynı laboratuvar tarafından örnekleme ve fiksasyon kalite standar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kortikal olgunlaşmamış nöronlar için burada rapor edilen protokolün tanımlanmasına katkıda bulundukları için Matteo Piumatti ve Chiara La Rosa'ya teşekkür ederiz. Çalışma, Fondazione CRT - Cassa di Risparmio di Torino (grant RF=2022.0618) tarafından LB'ye desteklendi; PRIN2022 (2022LB4X3N verisi) LB'ye; Ulusal Bilim Vakfı (EF-2021785, DRL-2219759 hibeleri) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NS092988, AG067419 hibeleri) CCS'ye verilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%10 formalinSigma-AldrichHT501128
2-metilbutan Sigma-Aldrich320404İzopentan
3,3′-Diaminobenzidin tetrahidroklorür hidratSigma-AldrichD5637
%4 paraformaldehitSigma-Aldrich441244
Sığır Serum AlbüminiSigma-AldrichA9647
Limon asit SigmaC0759
Histoloji için DPX mountantSigma-Aldrich  06522
EtanolMerck1.00983
Etilen glikolSigma-Aldrich102466
GliserolSigma-AldrichG7893
Hidrojen peroksit çözeltisiSigma-AldrichH1009
Killik - O.C.T. YerleşkesiBiyo-optika  05-9801
Mesquite yazılımıMesquite ProjesiMesquite sürüm 3.81 (build 955)
Neo-mountSigma-Aldrich1.09016
Fosfat tamponlu (PB)nanaÖzel yapım
Fosfat tamponlu tuzlu (PBS)nanaÖzel yapım
Sodyum hidroksitRiedel-de Haen6213
Sodyum fosfat dibazi dihidratSigma-Aldrich71645
Sodyum fosfat monobazik dihidratSigma-Aldrich71500
SucroseSigma-AldrichS9378
Toluidin MavisiSigma-Aldrich89640
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP9416
VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit Peroksidaz (Standart)Vektör LaboratuvarlarıPK-6100
Xylol Sigma-Aldrich247642

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience. Trends Neurosci. 38 (5), 273-278 (2015).
  2. Bolker, J. A. Animal models in translational research: rosetta stone or stumbling block. Bioessays. 39 (12), 1-8 (2017).
  3. Moreno-Jiménez, E. P., Terreros-Roncal, J., Flor-García, M., Rábano, A., Llorens-Martín, M. Evidences for adult hippocampal neurogenesis in humans. J Neurosci. 41 (12), 2541-2553 (2021).
  4. Sorrells, S. F., et al. Positive controls in adults and children support that very few, if any, new neurons are born in the adult human hippocampus. J Neurosci. 41 (12), 2554-2565 (2021).
  5. Simard, S., Matosin, N., Mechawar, N. Adult hippocampal neurogenesis in the human brain: updates, challenges, and perspectives. Neuroscientist. 31 (4), 141-158 (2024).
  6. Bao, H., Song, J. Treating brain disorders by targeting adult neural stem cells. Trends Mol Med. 24 (12), 991-1006 (2018).
  7. Ghibaudi, M., Zanone, A., Bonfanti, L. Brain structural plasticity in large-brained mammals: not only narrowing roads. Neural Regen Res. 21 (5), 1669-1680 (2026).
  8. Bonfanti, L., La Rosa, C., Ghibaudi, M., Sherwood, C. C. Adult neurogenesis and "immature" neurons in mammals: an evolutionary tradeoff in plasticity. Brain Struct Funct. 229 (8), 1775-1793 (2024).
  9. Paredes, M. F., Sorrells, S. F., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Brain size and limits to adult neurogenesis. J Comp Neurol. 524 (3), 646-664 (2016).
  10. Parolisi, R., Cozzi, B., Bonfanti, L. Humans and dolphins: decline and fall of adult neurogenesis. Front Neurosci. 12, 497(2018).
  11. Snyder, J. S. Recalibrating the relevance of adult neurogenesis. Trends Neurosci. 42 (3), 164-178 (2019).
  12. Bonfanti, L., Charvet, C. J. Brain plasticity in humans and model systems: advances, challenges, and future directions. Int J Mol Sci. 22 (17), 9358(2021).
  13. Duque, A., Arellano, J. I., Rakic, P. An assessment of the existence of adult neurogenesis in humans and value of its rodent models for neuropsychiatric diseases. Mol Psychiatry. 27, 377-382 (2022).
  14. Gómez-Climent, M. A., et al. A population of prenatally generated cells in the rat paleocortex maintains an immature neuronal phenotype into adulthood. Cereb Cortex. 18 (10), 2229-2240 (2008).
  15. Rotheneichner, P., et al. Cellular plasticity in the adult murine piriform cortex: continuous maturation of dormant precursors into excitatory neurons. Cereb Cortex. 28 (7), 2610-2621 (2018).
  16. Sorrells, S. F., et al. Immature excitatory neurons develop during adolescence in the human amygdala. Nat Commun. 10 (1), 2748(2019).
  17. La Rosa, C., Parolisi, R., Bonfanti, L. structural plasticity: from adult neurogenesis to immature neurons. Front Neurosci. 14, 75(2020).
  18. Bonfanti, L., Seki, T. The PSA-NCAM-positive "immature" neurons: an old discovery providing new vistas on brain structural plasticity. Cells. 10 (10), 2542(2021).
  19. Benedetti, B., Couillard-Després, S. Why would the brain need dormant neuronal precursors. Front Neurosci. 16, 877167(2022).
  20. Luzzati, F., Bonfanti, L., Fasolo, A., Peretto, P. DCX and PSA-NCAM expression identifies a population of neurons preferentially distributed in associative areas of different pallial derivatives and vertebrate species. Cereb Cortex. 19 (5), 1028-1041 (2009).
  21. Palazzo, O., La Rosa, C., Piumatti, M., Bonfanti, L. Do large brains of long-living mammals prefer non-newly generated, immature neurons. Neural Regen Res. 13 (4), 633-634 (2018).
  22. La Rosa, C., et al. Phylogenetic variation in cortical layer II immature neuron reservoir of mammals. Elife. 9, e55456(2020).
  23. Sherwood, C. C., Gómez-Robles, A. Brain plasticity and human evolution. Annu Rev Anthropol. 46, 399-419 (2017).
  24. Piumatti, M., et al. Non-newly generated, "immature" neurons in the sheep brain are not restricted to cerebral cortex. J Neurosci. 38 (4), 826-842 (2018).
  25. Pattaro, A., et al. Phylogenetic variation of layer II cortical immature neurons in dog and horse confirms covariance with brain size and neocortical surface. Brain Struct Funct. 230 (6), 115(2025).
  26. Ghibaudi, M., et al. Consistency and variation in doublecortin and Ki67 antigen detection in the brain tissue of different mammals, including humans. Int J Mol Sci. 24 (3), 2514(2023).
  27. Ben Abdallah, N. M., Slomianka, L., Vyssotski, A. L., Lipp, H. P. Early age-related changes in adult hippocampal neurogenesis in C57 mice. Neurobiol Aging. 31, 151-161 (2010).
  28. Ghibaudi, M., et al. Age-related changes in layer II immature neurons of the murine piriform cortex. Front Cell Neurosci. 17, 1205173(2023).
  29. Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
  30. Charvet, C. J., de Sousa, A. A., Vassilopoulos, T. Translating time: challenges, progress, and future directions. Brain Res Bull. 221, 111212(2025).
  31. Bartges, J., et al. AAHA canine life stage guidelines. J Am Anim Hosp Assoc. 48, 1-11 (2012).
  32. Ghibaudi, M., et al. Multispecies characterization of immature neurons in the mammalian amygdala reveals their expansion in primates. PLoS Biol. 23 (8), e3003322(2025).
  33. Ghibaudi, M., Boda, E., Bonfanti, L. From mice to humans: a need for comparable results in mammalian neuroplasticity. Neural Regen Res. 20 (2), 464-466 (2025).
  34. Smulders, T. V. The relevance of brain evolution for the biomedical sciences. Biol Lett. 5, 138-140 (2009).
  35. Keck, T. Bridging theory and experiment in (statistical) learning. Curr Opin Neurobiol. 94, 103106(2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Quantitative Cell CountingComparative NeurobiologyMammalian Brain VariationCortical Immature NeuronsBrain PlasticityNeurogenesis DifferencesBrain Size ComparisonPhylogenetic AnalysisNeurodevelopmental ProcessesCell Population Quantification

İlgili makaleler