Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fetal ve Neonatal Fare Yumurtalıklarının Tam Mount İmmmünbonize Edilmesi

302 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69455

⸱

28 Nisan 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, gelişmekte olan fare yumurtalıklarının tüm montaj immünoetiketleme yöntemini ve diğer küçük dokulara uygulanmasını tanımlar.

Özet

Yumurtalık rezervi, dişinin üremesi için erişebildiği oositlerden oluşur ve her bir yumurta içerir; her biri birkaç granüloza hücresiyle çevrili bir oosit içerir. Oositler, gonadın dışında oluşan ilkel germ hücreler olarak başlar ve embriyonik gelişim sırasında gelişen yumurtalığa göç eder. Yumurtalığa ulaştıklarında oogonya oluşur ve mitoz ile bölünürler; sitokinez eksik, germ hücre kistleri adı verilen birbirine bağlı hücre kümeleri oluştururlar. Kistlerde ise hücreler meyoz geçirir ve oositlere dönüşür. Farede, doğumdan iki gün önce, kistler parçalanmaya başlar ve her oosit ilkel bir foliküle paketlenir. Bu süreçte sadece bazı oositler hayatta kalır, geri kalanlar apoptoz geçirir. Kist parçalanmasının ve ilkel folikül oluşumunun düzenlenmesi yalnızca kısmen anlaşılır ve ilgili moleküllerin tanımlanması bu süreci anlamak için çok önemlidir. Gelişmekte olan fare yumurtalıklarının tam montaj immünboyaması, potansiyel düzenleyici moleküllerin lokalizasyonunu belirlemek ve mutasyon veya diğer moleküler değişiklikler nedeniyle ilkel folikül oluşumu üzerindeki etkileri oosit ve somatik hücre belirteçleri kullanılarak değerlendirmek için kullanılabilir. Yumurtalıklar fetal veya yenidoğan farelerden alınır, formaldehit ile sabitlenir ve bloklanır. Yumurtalıklar daha sonra ilgi çeken bir proteine karşı antikorlara maruz bırakılır, ardından birincil antikorları tespit eden floresan etikete konjuge edilen ikincil antikorlar uygulanır. Son olarak, yumurtalıklar kontur ve konfokal mikroskopi ile incelenir. Bu prosedür, ilgi çekici birden fazla proteini tespit edebilir ve fetal fare testisleri gibi diğer küçük dokulara uygulanabilir.

Giriş

Tüm montaj immünboyama, konfokal görüntüleme ile birleştiğinde, küçük dokularda protein ifadesi ve hücre morfolojisini kesitlemeden analiz etmek için güçlü biryöntemdir. Bu yöntemde, dokular önce hasat edilir, sabitlenir ve bloklanır, ardından ilgi çeken proteinlere karşı antikorlara maruz bırakılır. Antikorlar ya doğrudan floroforlara bağlanır ya da birincil antikorları tanıyan floroforlara konjuge olan ikincil antikorlarla etiketlenir. Daha sonra doku, hücre çekirdeklerini görselleştirmek için floresan boya olan 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile kuluçka edilir. Bu adım, dokunun görüntülemesi sırasında mekânsal yönelim sağlamak için önemlidir. Son olarak, doku konfokal mikroskopi ile monte edilir ve görselleştirilir. Doku morfolojisini incelemek için kullanılan bir diğer teknik ise dokunun parafine gömülmesi, kesitlenmesi ve hematoksilin ve eozin gibi boyalarla ya da antikorlarla etiketlenmesidir. Alternatif olarak, donmuş kesitler hazırlanıp immün boyama yapılabilir. Ne yazık ki, bu iki teknik de bölümleme içerir ve bu da üç boyutlu bilginin kaybına yol açar. Seri bölümler yardımcı olabilir, ancak analiz zahmetlidir ve çok sayıda bölümü izlemeyi içerir. Bu nedenle, tüm montaj yöntemi avantajlıdır çünkü optik kesitleme ile görselleştirilebilen dokunun üç boyutlu yapısını korur.

İlkel germ hücrelerin (PGC) oositlere gelişimi ve oositlerin ilkel foliküllere birleşmesi kadın doğurganlığı için gereklidir. PGC'ler embriyon dışı olarak oluşur ve embriyonik gelişim sırasında yumurtalığa göç etmek zorundadır. PGC'ler yumurtalığa ulaştıklarında, farede yaklaşık embriyonik gün (E) 10.5'te başlarken,oogonia 2 olarak sınıflandırılırlar. Oogonyalar mitoz geçirir ancak eksik sitokinez ile birlikte, germ hücre kistleri adı verilen birbirine bağlı hücrekümeleri oluşturur 3. Oogonia, E 13.5'ten itibaren mayoza girer, oositlere dönüşür ve profaz I'den diploten evresine ilerler. Oositler geliştikçe kistler parçalanır ve her oosit, granüloza hücrelerinden oluşan bir tabaka ile çevriliyle, her biri diploten tutuklanmış biroosit 4 içeren ilkel foliküller oluşturur. Kist parçalanmasıyla eşzamanlı olarak çok sayıda oosit kaybı yaşanır ve bunun primordial folikül oluşumu sırasında kalite kontrolü için önemli olduğuna inanılmaktadır. İlksel foliküllerdeki diploten tutuklanmış oositlerin sayısı, üremek için mevcut yumurta rezervini oluşturur ve doğrudan doğurganlıkla ilişkilidir. Folikül oluşumu bozulursa, bu daha küçük bir yumurtalık rezervine yol açabilir ve dişi üreme yaşam süresini kısıtlayabilir.

Embrionik, fetal ve yenidoğan oosit gelişimi sırasında proteinlerin ekspresyonunu tanımlamak ve analiz etmek için tam mount immünboyama yöntemi kullanıldı. İncelen moleküller arasında MSY2, SYCP3, ESR1, ESR2, CYP19A1, 3βHSD, KIT ve STAT3 5,6,7,8,9 bulunmaktadır. Bu teknik, ilkel folikül oluşumunun nasıl düzenlendiğini ortaya çıkarmak için de kapsamlı şekilde kullanılmıştır. Fetal veya yenidoğan yumurtalıkları kültürlenip sinyal moleküllerine veya inhibitörlere maruz bırakıldı. Kültürlenmiş yumurtalıklardaki oositler, in vivo10'a benzer ilkel folikül oluşumuna yol açar. Yumurtalık kültürü, bu yumurtalık gelişim aşamasında steroidhormonu 6,10,11, KIT8 ve PI3Ksinyalizasyonu 12'yi başarıyla incelemiştir. Kültür sonrasında, oositlerin sitoplazmasında eksprese edilen DEAD box helicase 4 (DDX4, aynı zamanda Fare vasa homologu (MVH) olarak da bilinir) karşısında antikorlar kullanılarak tüm montaj immünboyama uygulanır. Yumurtalıklar daha sonra konfokal mikroskopiyle incelenerek ilkel folikül oluşumu değerlendirilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Fare kullanılarak yapılan tüm prosedürler Syracuse Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenip onaylanmıştır. Aşağıdaki protokol, doğum sonrası 1–5 doğumlu günlerde yeni doğan fare yumurtalıklarının etiketlenmesi için hazırlanmıştır (şematik için Şekil 1'e bakınız). Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Yumurtalıkların hasadı ve sabitlenmesi

  1. Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi" ve IACUC onaylı hayvan protokollerine uygun olarak neonatal C57BL/6 farelerini ötenazi edin. 1x fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) yumurtalıkları disseksiya yapın.
    NOT: Bu işlem için, IACUC hayvan protokolümüzde onaylanan yeni doğumlu fareler kafasının kesilmesiyle ötenazi edildi. C57BL/6 fare sürünün erkek ve dişileri, yenidoğanlarda anogenital açıklıklar arasında küçük koyu bir nokta bulunmasıyla ayırt edilebilir. Yumurtalıkları disseksiye etmek için önce mideyi kesin ve bağırsakları alarak çıkarın. Sonra, kuyruğun orta hatında bir kesi ile karın bölgesini açın ve ardından iki yatay kesik yapın. Her böbreğin altındaki yumurtalıkları bulun, her yumurtalığı izole edin ve fazla dokuyu temizleyin.
  2. Yumurtalıkları doğrudan 600 μL 5,3% paraformaldehit (PFA; 1x PBS ile seyreltilmiş %16 EM sınıfı PFA) (sabit) içine oda sıcaklığında (RT) mikrofuge tüpte yerleştirin. Yumurtalıkları bir nutatorda sabit şekilde gece boyunca (O/N) 4 °C'de kuluçka edin.
    DIKKAT: Paraformaldehit zehirlidir. Buharlı bir davlumbozda veya iyi havalandırılan alanda kullanın. Cilt ve göz teması önlemek için eldiven, göz koruma ve koruyucu giysiler giyin. Tehlikeli atık olarak bertaraf edin.
  3. Yumurtalıkları çıkarıp 1 mL 0.1% Triton X-100 ile 1x PBS (PT) içinde hızlıca iki kez, ardından 1 mL PT içinde en az 30 dakika RT'de 1 mL PT ile en az 30 dakika RT'de inkübe yapın veya 4 °C'de en fazla 2 haftaya kadar saklayın.

2. Birincil ve ikincil antikorlarla kuluçka

  1. Primer antikorla 500 μl PT + %5 BSA O/N ile 4 °C sıcaklıkta inkübe yapın. 1 mL PT + %1 BSA, nutator ile RT 30 dakika içinde üç kez yıkayın.
    NOT: Sulandırma antikora bağlıdır. Burada gösterilen temsil veriler, DDX4 ile 1:200 seyreltilmiş olarak etiketlenmiştir. İki farklı proteine karşı antikorlar, birincil antikorlar iki farklı türde üretildiği ve ikincil bir antikorun diğer ikincil türde üretilmediği sürece aynı anda kullanılabilir (keçi anti-fare-Alexa 488 ve eşek anti-keçi Alexa 568 kullanmayın).
  2. Yumurtalıkları birincil antikorla kuluçkalarken, inceltilmiş ikincil antikoru bir tutam embriyo tozu ile 500 μL PT + %5 BSA O/N ile 4 °C'de nutator (folyo ile kaplı) inkübe ederek ikincil antikorun spesifik olmayan bağlanmasını azaltın. İkincil antikoru 6000 x g ile 30 saniye boyunca santrifüjlenerek alttaki kalıntı tozunu toplayın. İkincil tüpü aktarırken bu kalıntıyı çekmemeye dikkat edin.
    NOT: Sulandırma antikora bağlıdır. Burada gösterilen temsili veriler, keçi anti-tavşan Alexa 488 ile 1:200 seyreltilmiştir.
  3. Nutator üzerinde RT'de 2–4 saat boyunca önceden emilmiş floresan ikincil antikor (step 2.2 olarak üretilmiştir) inkübe yapın. Bundan sonra folyoyla örtün. 1 mL PT + %1 BSA ile üç kez yıka, RT rejiminde nutator ile 30 dakika boyunca.

3. Çekirdeklerin DAPI ile etiketlenmesi ve yumurtalıkların bir slayta monte edilmesi

  1. DAPI 1:1000 PBS'de RT'de 90 dakika kuluçka yapın. 1 mL 1x PBS ile bir kez yıkayın.
  2. Yumurtalıkları, geniş 200 μL mikropipet ucu kullanılarak mikroskop slaytına aktarın. Fazla PBS'yi iğne/şırıngala ile çıkarın. Yumurtalıklara 3 damla montaj malzemesi ekleyin.
  3. Yumurtalıkların üstüne nazikçe bir örtü yapıştırın, böylece montaj malzemesinin örtü damlasının kenarlarına yayılmasını sağlayın. Örtü kenarlarını oje ile kapatın ve kurumasına izin verin, ardından -20 °C'de sakla.

4. Embriyo tozu hazırlama

  1. ~ E 12.5–E 14.5 fare embriyolarını minimum buz gibi 1x PBS hacminde homojenleştirin. 4 hacim buz gibi aseton ekleyin, karıştırın ve 30 dakika boyunca buzda kuluçka yapın.
    DIKKAT: Aseton yanıcıdır ve göz ile cilt tahriş edicidir. Buharlı bir davlumbozda veya iyi havalandırılan alanda kullanın. Cilt ve göz teması önlemek için eldiven, göz koruma ve koruyucu giysiler giyin. Tehlikeli atık olarak bertaraf edin.
  2. 10.000 x g ile 10 dakika boyunca santrifüj yapın, üst kısmı çıkarın, ardından peleti buz gibi asetonla yıkayın ve tekrar çevirin.
  3. Pelleti bir filtre kağıdına yayın, plastik bir tepsiye yerleştirin ve O/N'nin kimyasal bir başlıkta kurutulmasına izin verin. İnce bir toz haline getirin, tamamen hava kurumasına izin verin ve -20 °C'de saklayın.

5. Konfokal mikroskopi ile protein ifadesinin analizi

  1. İlgilendiğiniz proteini etiketledikten sonra, konfokal mikroskopiyle görselleştirin. Protein ifadesini incelemek için genellikle 3–4 hayvan (6–8 yumurtalık) kullanır ve her yumurtalıktan birkaç fotoğraf alırız.
    NOT: Temsil eden sonuçlar bölümünde tanımlanan görüntüler, dönen disk konfokal mikroskopu veya konfokal lazer tarama mikroskobu ile alınmıştır. Kullanılan parametreler temsil sonuçlar bölümünde açıklanır ve kullanılan mikroskopa bağlı olarak değişir.

6. Konfokal mikroskopi ile ilkel folikül oluşumu ve gelişiminin analizi

  1. DDX4 gibi sitoplazmik bir oosit belirtemesi için yumurtalıklar etiketlendikten sonra, her yumurtalık için görselleştirme için rastgele iki alan veya "çekirdek" atanır.
    NOT: Bir çekirdek, 212 × 212 μm boyutlarında 4 ana optik bölümden oluşur ve her biri 15–20 μm derinlikle ayrılır. 4 optik bölüm, hem korteks hem de medullayı kapsayarak yumurtalığın tüm bölgelerinin değerlendirilmesini sağlar. Her yumurtalık için, toplam 8 bölüm için 2 çekirdek ve 4 optik bölüm olacaktır (bkz. Şekil 2).
  2. Ana optik bölüm analiz için görüntülendikten sonra, ana bölümün üstünde 5 ve alt 5 görüntüden oluşan bir Z-yığını alın, her biri 1 μm aralıkta olsun. Her ana bölüm için, bölümdeki toplam oosit sayısını sayın
  3. Daha sonra, ana bölümdeki her yumurta için, ana bölümü ve ayrıca bölüm yığınını inceleyerek ana bölümdeki oositlerin odak düzleminin üstünde veya altında yaşayan oositlerle ilişkili olup olmadığını belirleyerek başka bir oositle ilişkili olup olmadığını belirleyin. Son olarak, her bir oosit için hangi folikül gelişim aşamasında (primordal, birincil veya ikincil) olduğunu belirleyin.
    NOT: İstatistiksel olarak anlamlı veriler elde etmek için en az 4 hayvanın (8 yumurtalık) analiz edilmesi önerilir.

7. Propidium iyodid'in alternatif nükleer belirteç olarak kullanılması

  1. 2.3. adımdan sonra, 0,1 mg/ml RNase A (10 μL 10 mg/ml 1 ml PT + %1 BSA) içinde 30 dakika kuluçka yapın. RNase A'yı çıkarın ve 10 μg/mL propidium iyodid (1 mL 1 mg/mL 10 μL 1 mg/mL 1 mL PT + %1 BSA) içinde RT ile nutatorda 20 dakika kuluçka edin. Bundan sonra tüpü folyo ile kapatın.
    DIKKAT: Propidium iyodid toksik ve mutajeniktir. Buharlı bir davlumbozda veya iyi havalandırılan alanda kullanın. Cilt ve göz teması önlemek için eldiven, göz koruma ve koruyucu giysiler giyin. Tehlikeli atık olarak bertaraf edin.
    NOT: Toto-3 nükleer işaretleyici olarak da kullanılabilir.
  2. Propidium iyodidi çıkarın ve 1 mL PT + %1 BSA ile 30 dakika boyunca yıkayın. 3.1. adımı (DAPI boyama) atlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada tarif edilen immünboyama yönteminin tipik sonuçları gösterilmiştir. Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6'daki görüntüler, 40x yağ objektif NA 1.3 kullanılarak dönen disk konfokal mikroskopta çekildi; pozlama süresi 100–250 ms ve lazer gücü %0,01 ile 0,1 arasındadır. Şekil 3'te, yeni doğumlu fare yumurtalıkları, fare ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu rapor, ilgi çekici proteinler için tüm yumurtalıkları floresan olarak etiketleme yöntemini tanımlar. Bu prosedür, ilkel folikül oluşumu sırasında proteinlerin ekspresyonunu belirlemek ve farklı koşullar altında folikül oluşumundaki değişikliklerikarakterize etmek için yaygın olarak kullanılmıştır (4,5,6,7,8,9,10,11).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Görüntüleme Syracuse Üniversitesi'ndeki Blatt Görüntüleme Merkezi'nde gerçekleştirildi. Şekil 7'deki görüntüler, NIH S10 OD026946-01A1 tarafından desteklenen Airyscan2 ile Zeiss LSM980'den alınmıştır. Bu çalışma, NIH'den (MEP'e) R03 HD102016 ve R21 HD112756 hibeleriyle desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti İnsan VASA (keçi üretimi)R& DAF2030
anti-DDX4/MVH (tavşan üretimi)AbcamAB13840
anti-GCNA1/TRA98 (rat üretimi)Abcamab82527
Sığır Serum Albümini (BSA)FisherBP-1600
Kapak kağıtları 22 x 22 #1.5Warner Instruments64-0721
DAPI (barıt)Sigma AldrichD-9542dH2O'da 5 mg/ml bir çözelti hazırlayın
Diseksiyon kapsamı
Eşek karşıtı Keçi Alexa 568InvitrogenA11057
Eşek Fare Karşıtı Alexa 488InvitrogenA21202
Eşek karşıtı Tavşan Alexa 568InvitrogenA10042
Eşek karşıtı Tavşan Alexa 647InvitrogenA31573
Eşek Sıçan karşıtı Alexa 488InvitrogenA21208
Etanol 200 kanıtıPharmco111000200
İnce Makas - KeskinGüzel Bilim Araçları14060-09Yumurtalığın alınması ve fazla dokunun kesilmesi için ince işler
Pensetler (Dumont cımbız, Stil 5)Elektron Mikroskopi Bilimi72705-01 (0209-5-PO)
Keçi karşıtı Tavşan Alexa 488InvitrogenA11008
Mikrosantrifüj Tüpleri 1.5 mLTermo Bilimsel3451PK
Mikroskop SlaytlarıFisherbrand12-550-123
Nutatif MikserLabNetS0500
Paraformaldehit %16Elektron Mikroskopi Bilimi15710
Petri Kabları 100 x 15 mmBiyoplast Üretimi940-10774
Fosfat tamponlu tuzlu 1X(Fisher) S271-1;                   (Sigma) P9541-500G; (Fisher) BP332-500; (Fisher) P285-500800 mL MQ H2O                            80 g NaCl                                        KCl 'nin 2.0;                                               14.4 g Na2HPO4                  2.4 g KH2PO4                  HCl ile pH'ı 7.4'e ayarlayın; son cilt 1 L Sonra kullanım için 10X'ten 1X'e seyreldin
Pim tutucuGüzel Bilim Araçları26016-12hafif bir eğri ile düz iğneyi bükülmüş tutmak
Pipet Filtre UçlarıOneTip(10uL) 1121-3810;                           (20 uL) 1120-1810;                   (200 uL) 1120-8810;         (1000 uL XL) 1122-1830
Pipet uçlarıOneTIp(10 uL) 1111-3800;                   (200 uL) 1111-1800;         (1250 uL) 1112-1820
Pipetler 0.2-2, 2-20, 20-200, 100-1000Gilson(0.1-2 uL) F144054M;       (2-20 uL) F144056M;     (20-200 uL) F144058M;       (100-1000 uL) F144059M
Propidium iyodid, dH2O içinde 1mg/mlInvitrogenP3566
RNase A tozuSigma AldrichRG513-50mg0,1 M sodyum asetat (pH 5,2) içinde 10 mg/ml bir çözelti hazırlayın. 15 dakika boyunca 100 oC'ye ısıtın. RT'ye soğutma ve pH ayarlamayı 0.1 hacim 1 M Tris-Cl (pH 7.4) ekleyerek ayarlayın
Düz İğneDüz iğne, yumurtalıktan fazla dokuyu koparmak için eğri şeklinde bükülü iğne
Triton X-100Termo BilimselX100-100ML
Tüberkülin Şırıngası 28G x 1/2Tyco/Healthcare Kendall Monoject1180128012
VectashieldVektör LabratorlarıH-1900
Wagner MakaslarıGüzel Bilim Araçları14068-12Kafa kesme ve daha büyük kesikler için
Geniş delikli pipet ucu 20 ulLabCon1026-965-008-9

Kaynaklar

  1. Wong, F. C. K. Whole-mount immunofluorescence staining of early mouse embryos. Methods Mol Biol. 2214, 143-155 (2021).
  2. Monk, M., McLaren, A. X-chromosome activity in foetal germ cells of the mouse. J Embryol Exp Morphol. 63, 75-84 (1981).
  3. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125, 3323-3328 (1998).
  4. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Dev Biol. 234 (2), 339-351 (2001).
  5. Burks, D. M., et al. Molecular analysis of the effects of steroid hormones on mouse meiotic prophase I progression. Reprod Biol Endocrinol. 17 (1), 105(2019).
  6. Chen, Y., Breen, K., Pepling, M. E. Estrogen regulates oocyte cyst breakdown and primordial follicle assembly via multiple pathways in the neonatal mouse ovary. J Endocrinol. 202 (3), 407-417 (2009).
  7. Dutta, S., Mark-Kappeler, C. J., Hoyer, P. B., Pepling, M. E. The steroid hormone environment during primordial follicle formation in perinatal mouse ovaries. Biol Reprod. 91 (3), 68(2014).
  8. Jones, R. L., Pepling, M. E. Kit signaling regulates primordial follicle formation in the neonatal mouse ovary. Dev Biol. 382 (1), 186-197 (2013).
  9. Murphy, K., Carvajal, L., Medico, L., Pepling, M. E. Expression of STAT3 in germ cells of developing and adult mouse ovaries and testes. Gene Expr Patterns. 5 (4), 475-482 (2005).
  10. Chen, Y., Jefferson, W. N., Newbold, R. R., Padilla-Banks, E., Pepling, M. E. Estradiol, progesterone, and genistein inhibit oocyte nest breakdown and primordial follicle assembly. Endocrinology. 148 (8), 3580-3590 (2007).
  11. Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  12. Burton, J. J. N., Luke, A. J., Pepling, M. E. Regulation of mouse primordial follicle formation by PI3K signaling. Biol Reprod. 106 (3), 515-525 (2022).
  13. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: An update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  14. Pina, R., et al. Ten approaches that improve immunostaining: advances in immunofluorescence optimization. Int J Mol Sci. 23 (3), 1426(2022).
  15. Yau, C. N., et al. Principles of deep immunohistochemistry for 3D histology. Cell Rep Methods. 3 (5), 100458(2023).
  16. Buchwalow, I. B., Böcker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , Springer-Verlag. (2010).
  17. Ino, H. Antigen retrieval by heating for double-label fluorescent immunohistochemistry with identical species-derived antibodies. J Histochem Cytochem. 52 (9), 1209-1217 (2004).
  18. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  19. Boateng, R., et al. Whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for 3D analysis of the ovarian reserve in mouse. J Vis Exp. (175), e62972(2021).
  20. Folts, L., et al. Oocount: A machine-learning-based approach to mouse ovarian follicle counting and classification. Biol Reprod. 113 (5), 1083-1101 (2025).
  21. Rinaldi, V. D., Bloom, J. C., Schimenti, J. C. Whole-mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries. J Vis Exp. (135), e57593(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Primordial FoliküllerGerm Hücresi KistleriOosit MarkörleriSomatik Hücre MarkörleriKonfokal MikroskopiFetal Fare OverleriFolikül Oluşumu

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.