Yöntem makalesi

Dijital Damla PCR (ddPCR) kullanılarak toprakta Mikrobiyal Biyokütlenin Belirlenmesi

DOI:

10.3791/69467

⸱

24 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Geography, Faculty of Environment, Science and Economy, University of Exeter

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, toprak mikrobiyal biyokütlesi ve mantar-bakteriyel oranlarının nicelendirilmesi için hızlı bir ddPCR yöntemi sunmaktadır. ddPCR kaynaklı mikrobiyal biyokütle karbonu, kloroform fumigasyon tahminleriyle yalnızca zayıf korelasyon gösterse de, yöntem ek toprak örnekleme veya sert yöntem kullanmadan mikrobiyal bolluğu değerlendirmek için hassas ve ölçeklenebilir bir moleküler yaklaşım sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toprak, organik karbonun en büyük karasal havuzunu temsil eder, ancak son iki yüzyılda topraklardan 133 Gt'den fazla karbon kaybolmuştur. Toprak mikrobiyal biyokütlesinin, özellikle karbon ve besin döngüsünü yönlendiren birincil ayrıştırıcıların doğru nicelendirilmesi, toprak ekolojik işleyişini ve sağlığını anlamak için gereklidir. Kloroform fumigasyon ekstraksiyonu ve PLFA analizi gibi geleneksel yaklaşımlar, yüksek örnek gereksinimleri ve biyokimyasal belirteçlerin mikrobiyal biyokütle tahminlerine dönüştürülmesiyle ilgili belirsizliklerle sınırlıdır. Burada, 16S ve 18S rRNA genlerini hedef alan dijital damla PCR (ddPCR) kullanarak toprakta bakteriyel ve mantar bolluğunu nicelendirmek için optimize edilmiş bir iş akışı sunuyoruz. Yöntem, mikrobiyal gen kopyalarının mutlak nicelendirilmesini, gen kopyası sayı düzeltme faktörleriyle hücre sayılarına dönüşümü ve ardından mikrobiyal biyokütle karbonunun tahminini sağlar. Bu protokolü, toprak dokusu, arazi kullanımı ve organik madde içeriği açısından farklı beş küresel dağınık tarım sisteminden topraklara uyguladık. ddPCR teşkılı tahminler, mikrobiyal biyokütle karbonunun geleneksel kloroform fumigasyon tahminleriyle karşılaştırıldı. ddPCR, mikrobiyal bolluğun yüksek çözünürlüklü nicel ölçüsünü sağladı ve toprak tipleri arasında F:B oranlarının tüm genom dizilemesinden daha geniş ve hassas tahminleri üretti. ddPCR kaynaklı MBC, kloroform fumigasyon değerleriyle yalnızca zayıf bir korelasyon gösterse de, bu yöntem mikrobiyal biyokütlenin ve F:B oranı gibi ekolojik göstergelerin değerlendirilmesi için etkili bir moleküler yaklaşım sunar. Bu protokol, toprak sağlığı değerlendirmesini ilerletmek için mikrobiyal bolluk ölçümlerini bileşimsel analizlerle entegre etmek için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir strateji sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toprak, bitki örtüsü ve atmosfer karbon toplamından daha fazla karbon barındıran en büyük karasal organik karbonhavuzudur 1. Son 200 yılda topraklardan 133 gigaton (Gt) üzerinde karbon kaybolmuş ve toprak karbon stoklarının yeniden kazanılması ve korunması için devam eden çabalar küresel toprak sağlığı için hayatiöneme sahiptir 2. Toprağın muazzam karbon depolama kapasitesi göz önüne alındığında, bu karbon stoklarına başlıca katkıda bulunanların doğru şekilde belirlenmesi temelöneme sahiptir 3. Mikroplar, toprak içindeki besin döngüsünde temel bir rol oynar ve mikrobiyal biyokütle toprak organik karbonunun (SOC)3 önemli bir bileşenini oluşturur. Mantarlar ve bakteriler, toprak ortamlarında başlıca ayrıştırıcılardır ve bu ekosistemlerin biyojeokimyasal döngülerinde hayati önemesahiptir 4,5. Bakteriyel ağırlıklı topraklarda, organik madde ayrışması ve besin mineralizasyonu, mantar ağırlıklı topraklara göre çok dahahızlıdır 5. Mantar-bakteriyel (F:B) oranı, toprak sağlığıgöstergesi olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır 6,7; bu nedenle, hem mantar hem de bakterilerin doğru değerlendirilmesi kritik öneme sahiptir.

Topraklarda mikrobiyal biyokütle tahminleri genellikle kloroform fumigasyonu gibi bozucu kimyasal işlemleredayanır 8. Diğer yaklaşımlar, substrat kaynaklı solunum veya fosfolipid yağ asidi (PLFA) analizi gibi tekniklerle aktif mikrobiyal topluluğu seçici olarakhedeflemektedir 9. PLFA analizi, mikrobiyal topluluk bileşimini değerlendirmek ve F:B oranını tahmin etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, farklı mantar ve bakteriyel türler arasında hücre boyutundaki önemli değişkenlik, PLFA konsantrasyonlarını biyokütle veya popülasyon tabanlı F:B oranlarına dönüştürürken belirsizlik yaratır ve bu tahminler potansiyel olarak güvenilmezhale gelir 10. Akış sitometrisi gibi diğer yöntemler, topraklarda bakteriyel bolluğu belirlemek için örnek verimliliğini artırmak için kullanılabilir; Ancak, mikrobiyal olmayan parçacıkların mikroplara benzer boyut, şekil ve otofloresans özelliklerine sahip olması nedeniyle doğruluklarıazalabilir. Kloroform fumigasyonu, mikrobiyal biyokütleyi tahmin etmek için nispeten büyük miktarda toprak (>10 g) gerektirirken, ticari kitlerle ekstraksiyon yapılırken DNA tabanlı yöntemler için 500 mg toprak örnekleme yeterlidir. DNA tabanlı yöntemler ile kloroform fumigasyonu arasındaki önceki karşılaştırma, her iki yaklaşımın da mikrobiyal biyokütkütle tahmin edebilmesine rağmen, bunları birlikte kullanmanın toprak mikrobiyal biyokütlesinin daha sağlam bir değerlendirmesinisağladığını göstermiştir 12.

Mikrobiyal topluluk değerlendirmeleri, toprak sağlığının az kullanılan bir ölçütüdür ve toprakları ölçme ve anlama biçimimizi değiştirme potansiyelinesahiptir 13. Metabarkodlama yaklaşımları geleneksel olarak toprak mikrobiyal topluluğunu belirlemek için kullanılır; göreceli bakteriyel bolluklar 16S rRNA geninin bölgelerinin amplifikasyonu ile değerlendirilirken, mantar taksonları 18S rRNA geni veya iç transkribe edilmiş aralayıcı (ITS) bölgesi14 kullanılarak hedef alınır. Mantar için metabarkodlama yaklaşımları, farklı genomik hedef bölgelere dayanabilir ve tanımlanan mantar türlerinin çeşitliliğini ve bolluğunu etkileyebilir. Mantar türleri arasındaki eşit olmayan ITS uzunluğu, tercihli amplifikasyon ve dizileme ile ilgili yanlış tahmin edilmesini teşvik edebilir ve mantar topluluklarının yanlışdeğerlendirilmesine yol açabilir 15. Fungiquant primerleri, 18S rRNA genindeki ve diğer ökaryotlara kıyasla çeşitli mantarların kapsamlı kapsamını ve özgüllüğünü gösteren belirli değişken bölgeleri hedeflemeküzere geliştirilmiştir 16.

Çoğu bakteri ve mantarda hedeflenen genin birden fazla kopyası bulunur, bu da hücre sayısı tahminlerinin yanlışlığına yol açar. Ayrıca, mantarlar genellikle hücre başına değişken sayıda çekirdek olan çok çekirdeklihücrelere sahiptir 6. Taksonomik gruplar içinde ve arasında önemli rRNA gen kopyası sayısı varyasyonu vardır; genellikle prokaryotlarda toplamda 15 kopyadan az olur ve mantar17 için 28 ile 511 arasında tahmin edilir. Bu varyasyon nedeniyle, mikrobiyal topluluk yapılarını analiz etmek için kullanılan moleküler teknikler yarı nicel olarak kabul edilir; çünkü bu teknikler bir toplulukta türlerin göreceli bolluğunun tahminini çarpıtabilir. 18. Ölçülen gen kopya sayıları (GCN), ilgilenilen taksonomik grup 18,19,20'deki tahmini ortalama GCN kullanılarak rutin olarak hücre bolluğuna dönüştürülür.

Bazı çalışmalar, metagenomik yaklaşımlar kullanmıştır; çünkü metabarkodlamaya göre çeşitli avantajlar sunar; bunlar amplifikasyon yanlılığının ortadan kalkması ve tüm mikrobiyal topluluğun kapsamlı şekilde incelenmesi gibi birçok avantajsunar 21. Ayrıca, mantar ve bakteriyel bileşimlerin eşzamanlı karşılaştırılmasını ve birbirleriyle ilişkilerininkarşılaştırılmasını mümkün kılar 22. Genel olarak, RT qPCR genellikle mikrobiyal içeriği ve işlevini tespit etmek içinkullanılır 23. qPCR, inhibitörlere karşı hassasiyeti nedeniyle mutlak niceliklendirme için dijital damla PCR (ddPCR) ile karşılaştırıldığında sınırlamalara sahiptir; çünkü harici bir standartgerektirir 24.

ddPCR, bireysel amplifikasyon reaksiyonlarını ayrı damlacıklara ayırmaya dayanan çığır amacı taşıyan bir teknolojidir. Şablon, her damlada ayrı bir reaksiyon olarak PCR ile güçlendirilir. ddPCR, enzimatik inhibitörlere karşı düşük hassasiyete, bakteriyel ve mantar niceliklerindeqPCR 25'e göre daha iyi hassasiyet, tekrarlanabilirlik, hassasiyet ve kararlılığa sahiptir. Ayrıca, topraktaki bakteri ve mantarların mutlak nicelendirilmesi içinkullanılabilen bir yöntemdir 5. ddPCR, mikrobiyal bileşimsel değişimleri değerlendirmek için kullanılan aynı çıkarılmış DNA'ya dayandığından, ddPCR'den elde edilen bolluk verileri doğrudan topluluk bileşimiverileriyle 26 ilişkilendirilebilir ve toprak mikrobiyal biyokütlesinin nicelendirilmesinde kullanılabilir.

Bu çalışma, dijital damla PCR (ddPCR) kullanılarak topraktaki mantar ve bakterilerin nicelendirilmesi için bir metodoloji sunmaktadır. Bu optimize edilmiş yöntem, beş farklı küresel konum ve arazi kullanımından topraklara uygulanmıştır. Örnek konumları, toprak özellikleri, çevresel koşullar ve yönetim uygulamalarının geniş bir yelpazesini kapsayacak şekilde seçilmiştir; böylece yaklaşımımızın çeşitli ortamlarda sağlamlığı ve genelliği değerlendirilmiştir. Bu veriler, toprak ekolojik kalitesinin moleküler biyoindikasyonu olarak F:B oranının belirlenmesini sağlamıştır. Son olarak, mikrobiyal ddPCR verileri ile geleneksel kloroform fumigasyon yöntemleri arasında tahmini mikrobiyal biyokütlenin karşılaştırılması yapılmıştır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokollerin genel şeması, Şekil 1'de gösterilmiştir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Toprak Örnekleme

  1. Beş küresel konumdan (0–20 cm) bileşik üst toprak örnekleri toplayın; her konumdan 25 m alan içinde rastgele seçilmiş noktalardan üç örnek alın.
    NOT: Tüm örnekler, bulundukları bölgesel arazi kullanımını temsil eden tarımsal sistemlerden toplanmıştır. Toprak dokusu, lazer kırınma parçacık boyutu analizörü ile ölçülen lazer difraksiyon kullanılarak karakterize edilmiştir (Tablo 1). Örnekler ortam sıcaklığında taşınır ve daha fazla analiz yapılana kadar 4 °C'de saklanmıştır.

2. DNA çıkarımı

NOT: DNA çıkarımı üreticinin talimatlarına uygun olarak toprak DNA çıkarma kiti ile gerçekleştirin. Tüm adımlar için oda sıcaklığı 20 °C idi.

  1. 2 mL boncuk vurma tüpünü kısa bir süre döndürerek boncukların dibine yerleştiğinden emin olun. 100 mg toprak ve 800 μL çözelti CD1 ekleyin. Karıştırmak için kısa bir girdap ekleyin.
  2. Örnekleri boncuk değirmenli homojenizatör ile iyice homojenize edin; örnekler 40 saniye boyunca 6 m s−1 hassasiyetinde lizize edilsin.
  3. Oda sıcaklığında 15.000 x g hassasiyetinde mekanik hücre lizisi için boncuk vurma tüpünü santrifüj yapın.
  4. Süpernatantı temiz bir 2 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Süpernatant hâlâ toprak parçacıkları içerebilir.
  5. 200 μL çözelti CD2 ekleyin ve 5 saniye vortex ekleyin.
  6. Oda sıcaklığında 15.000 x g ile 1 dakika boyunca santrifüj yapın.
  7. 700 μL'ye kadar süpernatantı temiz bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın, böylece pelletten kaçının. Pelet görünür olmalıdır.
  8. 600 μL çözelti CD3 ve vortex ekleyin, 5 saniye.
  9. 650 μL lizat bir spin kolonuna yüklenin ve oda sıcaklığında 15.000 x g sıcaklıkta 1 dakika boyunca santrifüj yapın.
  10. Akışı atıp 2.9. adımı tekrarlayarak tüm lizatın spin sütunundan geçtiğinden emin olun.
  11. Spin kolonunu temiz bir 2 mL'lik toplama tüpüne yerleştirin.
  12. Spin kolonuna 500 μL Solution EA ekleyin. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 15.000 x g üzerinde santrifüj yapın.
  13. Akış filtresini atıp spin kolonunu aynı 2 mL toplama tüpüne geri yerleştirin.
  14. Spin kolonuna 500 μL çözelti C5 ekleyin. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 15.000 x g santrifüj yapın.
  15. Akış filtresini atın ve spin kolonunu yeni bir 2 mL'lik toplama tüpüne yerleştirin.
  16. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 16.000 x g'ye kadar santrifüj yapın.
  17. Dönme kolonunu yeni bir 1.5 mL elusyon tüpüne yerleştirin.
  18. Beyaz filtre membranının ortasına 50–100 μL çözelti C6 ekleyin.
  19. Oda sıcaklığında 15.000 x g sıcaklıkta 1 dakika boyunca santrifüj yapın. Dönme kolonunu atın ve elyutu -20 °C'de saklayın.

3. Arındırılmış DNA'nın nicelendirilmesi

NOT: Arıtılmış DNA, üreticinin talimatlarına uygun olarak florometre ve çift zincirli (dsDNA) geniş aralıklı (BR) test kiti kullanılarak nicelendirilmiştir.

  1. 199:1 tampon ve reaktif oranı kullanarak çalışan bir çözüm hazırlayın.
  2. Her DNA standardından 10 μL ekleyerek 190 μL çalışma çözeltisine eklenin.
  3. 180–199 μL çalışma çözeltisine 1–20 μL saflaştırılmış DNA ekleyin. Son hacim 200 μL olmalıdır. Vortex ve standart ile DNA örneklerini ortam sıcaklığında 2 dakika kuluçka edin.
  4. Ekrandaki talimatları kullanarak florometredeki DNA örneklerinden önce standartları analiz edin.

4. Primer seçimi

  1. Toprak mikroorganizmalarının analizi için, ilgili referanslara dayanarak özel primerler seçilir. Bakteriler için 16S rRNAprimerleri 25,27, mantarlar için ise 18S rRNAprimerleri 16 kullanılmıştır.
  2. DNA bağlayıcı boya bazlı gerçek zamanlı PCR (qPCR) ana karışımı ve termal döngücü kullanılarak amplifikasyon gerçekleştirilin. Astar dizileri Tablo 2'de verilmiştir.

5. ddPCR ile mikrobiyal niceliklendirme

  1. Buz üzerindeki erime ve vortex, hepsi reaktifler.
  2. ddPCR reaksiyonunu şu şekilde kurun: 0,1 μL (10 μM) ileri ve 0,1 μL (10 μM) ters 16S veya 18S primer, 10 μL ddPCR Evagreen Supermix, 0,5 ng şablon DNA X μL, nukleazsız su (NFW) kullanarak nihai reaksiyon hacmini 22 μL'ye ayarlayın. Her sütun için şablon yerine NFW ekleyerek negatif kontrol oluşturun.
  3. DG8'i kartuş tutucusuna yerleştirin.
  4. Toplam 20 μL reaksiyon karışımını kartuştaki örnek yuvalarına yerleştirin.
  5. Evagreen için 70 μL Damla Üretim Yağı kartuşa 'yağ' etiketi ile eklenir.
  6. Kartuşu damla jeneratörüne yerleştirin ve kartuşu bir conta ile kapatın.
  7. Üretilen damlaların 40 μL'sini PCR amplifikasyonu için 96 kuyruklu (yarı etekli) bir plakaya aktarın.
  8. 96 kuyu plakayı plaka sızdırmazlayıcı ile sızdırmaz (Sıcaklık, 5 saniye 180 °C).
  9. Aşağıdaki döngü koşullarını, 105 °C'ye ayarlanmış ısıtmalı kapakla kullanın.
    NOT: (a) Bakteriler: 5 dakika 98 °C, 40 döngü; 30 saniye 94 °C, 60 saniye 61 dakika, 4 °C'de 5 dakika, 98 °C'de 10 dakika. (b) Mantarlar: 5 dakika 95 °C, 40 döngü; 30 saniye 95 °C, 1 dakika 55 °C, 30 saniye 72 °C, 4 °C'de 5 dakika ve 90 °C'de 5 dakika.
  10. 96 kuyruklu plakayı plaka okuyucuya aktarın.
  11. Her kuyunun kopya konsantrasyonunu QuantaSoft sürüm 1.2 kullanarak değerlendirin. Genlik eşiğini negatif ve pozitif damlacıkları ayıracak şekilde ayarlayın.
  12. Reaksiyonda DNA'nın her ng başına gen kopyası sayısını, kopyaları/μL'yi son reaksiyon hacmi (20 μL) ile çarparak ve reaksiyona toplam şablon DNA girdisine aşağıdaki şekilde bölerek hesaplayın: (μL-1 x reaksiyon hacmini kopyalar) / Reaksiyona toplam DNA girisi.
  13. Alınan DNA'nın ng başına toplam gen kopyalarını, gen kopyalarını çıkarılan toplam DNA (ng) ile çarparak aşağıdaki şekilde hesaplayın: (gen kopyaları per ng x toplam DNA çıkarılmış).
  14. Ekstraksiyon sırasında işlenen toprak miktarına (g) bölerek gram başına toplam gen kopyalarını hesaplayın:
    gram başına gen kopyaları = (ekstraksiyonda işlenen toprak gramı / gram kuru toprak ağırlığı (GDW) başına toplam gen kopyaları).
  15. Gen kopyalarını ortalama gen kopya numarası (GCN) kullanarak gdw başına hücre sayısını şu denklemde dönüştürerek hesaplayın:
    Hücre sayısı = gram başına gen kopyaları / Ortalama gen kopyaları hücre-1).
  16. Hücre numaralarını aşağıdaki denklemi kullanarak Mikrobiyal biyokütle karbonuna (MBC) dönüştürün:
    MBC için 16S (mg C g-1 toprak) = hücreler gdw-1 × (100 fg hücre-1) × 10−15 (g fg-1) × 103(mg g-1)28
    MBC için 18S (mg C g-1 toprak) = hücreler gdw-1 × (6 fg hücre-1) x 10−12 (g fg-1) × 103 (mg g-1)29
    Tüm süreç Şekil 2'de açıklanmıştır.
    NOT: 46 bakteriyelfil 20 için ortalama 16S rRNA gen kopyası (ortalama ± SD) hesaplanmış ve bakteriler için düzeltme faktörü olarak kullanılmıştır; nihai değer 2.48 olmuştur. Mantarlar için ise gen kopya sayısı Lofgren ve ark.17'ye göre 113 düzeltme faktörü ile hesaplanmıştır. Mikrobiyal biyokütle karbonu (MBC), ddPCR kaynaklı hücre sayımlarından tahmin edilmiştir; bakteriyelhücre 28 başına 100 fg ve mantarhücresi 29 başına 6 pg olarak varsayılan hücre karbon içeriği kullanılmıştır.

6. Tüm genom dizilemesinden toprak moleküler analizi

  1. Oxford Nanopore Technologies SQK-NBD114 protokolüne uygun olarak, Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) kullanılarak dizileme kütüphanesini hazırlayın ( bkz. Materyal Tablosu). Her örnek için kitte sağlanan bir barkod kullandığınızdan emin olun.
  2. Hazırlanan kütüphaneyi Oxford Nanopore Technologies R10.4.1 akış hücresi kullanarak sıralayın.
  3. Dizileme çalışması sırasında MinKnow'ta süper doğruluk (SUP) modelini seçerek ve barkod kesme "ON" seçeneğini seçerek basecalling gerçekleştirin. Dorado sürümü: 0.7.2+9ac85c6.
  4. DNA dizisi okumalarının taksonomik sınıflandırmasını, taksonomik sınıflandırıcı Kraken2 (v2.1.3)30 ile NCBI yedeksiz protein (nr) veritabanına karşı karşılaştırın, güven 0.05 ile gerçekleştirilir.
  5. Kraken2 rapor dosyalarını toplam bakteri ve mantar okuma sınıflandırmaları için inceleyin.
  6. Her örnek için göreceli bakteri ve mantar bolluğunu hesaplayın.

7. Kloroform fümigasyonu ile toprak mikrobiyal biyokütle karbon tahmini

  1. Taze toprak örneklerini önceden tartılmış tavalara tartın ve 105 °C'de fırında 24 saat kurutun.
  2. Kuru toprak ağırlığını taze toprak ağırlığından çıkararak ve farkı taze toprak ağırlığına bölerek toprak nem içeriğini hesaplayın.
    Nem içeriği (%) = ((B ıslak – Kkuru)/ Bkuru) × 100
  3. Nem içeriğini toprağın kuru maddesini hesaplamak için kullanın.
    Kuru madde (%) = 100 – Nem içeriği (%)
  4. İki ayrı 50 mL'lik santrifüj tüpüne 5 g toprak ekleyin; bu tüpler fumigasyon edilmemiş ve fumigasyon edilmiş olarak etiketlenmiştir.
  5. Etiketlenmemiş tüpe toplam 25 mL 0.5 MK 2SO4 ekleyin.
  6. Fumigasyon edilmemiş örnekleri oda sıcaklığında yörünge sallayıcısında 1 saat boyunca sallayın.
  7. 2 mL etanolsuz kloroformu doğrudan toprağa ekleyin, bu tüplerde fumigasyon yapılmış. Kapakları kapatıp parafilm ile sabitleyin ve oda sıcaklığında 24 saat karanlıkta kuluçka yapın.
  8. Fumigasyon edilmemiş örneği oda sıcaklığında 2.500 x g ile 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  9. Fumigasyon edilmemiş numuneden süpernatantı dedikt edin, 0,45 μm selüloz filtresinden süzülüp -20 °C'de depolayın.
  10. Fumigasyon edilen örneklerin kapaklarını çıkarın ve 2 saat boyunca buhar kapalısında havalandırma yapın, ardından K2SO4 ekstraksiyonunu (5-9. adımları tekrarlayın) ve -20 °C'de saklayın.
  11. Hem 'fumigasyonlu' hem de 'fumigasyon' örnekler için ekstraktın karbon konsantrasyonunu Total Organic Carbon analizörü kullanarak ölçün.
  12. Aşağıdaki denklekle mikrobiyal biyokütle karbonu (MBC) hesaplayın: MBC = (Fumigasyon edilmiş C içeriği-Fumigasyon Edilmemiş C içeriği)/0.45. Gram başına kuru ağırlıklı toprak için normalize edin.

8. Toprak organik madde içeriği tahmini

  1. Porselen potayı konveksiyon fırında 105 °C'de 30 dakika boyunca kurutun, ardından soğuduktan sonra 20 °C'ye (WC) kadar tartın.
  2. Kurutulmuş potaya 2 grama kadar toprak koyup tekrar tart.
  3. Toprak örneklerini doldurulmuş potada 105 °C'de konveksiyon fırınında 24 saat kurutun.
  4. Soğuması için kapalı bir kurutucuya koyup tekrar tartın (WS).
  5. Bir muffle fırınını 550 °C'ye kadar önceden ısıtın, ardından toprağı içeren potayı 4 saat boyunca fırına yerleştirin.
  6. Fırından topraklı pota çıkarın ve soğuması için bir kurutucuya koyun.
  7. Potayı toprakla (WA) tartın.
  8. SOM yüzdesini, 550 °C'de kuluçka öncesi ve sonrası toprak kuru ağırlığındaki farkı hesaplayarak ölçün.
    SOMLOI = [(WS –W A)/(WS –WC)] × 100

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beş noktadan toprak örnekleri toplandı ve toprak organik madde içeriği alevlenme kaybı ile belirlendi. Çalışmada kullanılan her toprak için toprak organik madde içeriği %3,38 ile %10,34 arasında değişmiştir (Tablo 1). Her toprak örneğinde üçlü DNA çıkarımları yapılmış, sonuç olarak DNA verimleri gram kuru toprak başına 32 ng ile 4.590 ng arasında değişmiştir (Şekil 3A).

Organik madde içeriği değişken olan topraklar arasında DNA konsantrasyonu belirgin şekilde farklıydı (tek yönlü ANOVA p < 0.0001, R2=0.97). En düşük organik madde içeriğine sahip toprak olan toprak A, en düşük DNA konsantrasyonunu göstermedi. Ancak, en yüksek organik madde içeriğine sahip toprak E, diğer tüm topraklardan (A–D, p < 0.0001) anlamlı şekilde daha yüksek DNA konsantrasyonuna sahipken, toprak B en düşüktü ve A ile D'den anlamlı şekilde farklıydı (p < 0.05). ddPCR protokolü, her toprak örneğinden arındırılmış DNA üzerinde 16S ve 18S rRNA gen primerleri kullanılarak gerçekleştirildi. 16S (Şekil 3B) ve 18S rRNA (Şekil 3C) genleri için toprak gram kuru ağırlığı başına gen kopyası sayısı ddPCR kullanılarak belirlendi. Tüm toprak örneklerinde, 18S rRNA geninin 16S rRNA geninden daha az kopyası bulundu. Tukey'nin sonradan yaptığı testler, toprak B'nin en az 16S ve 18S rRNA gen kopyasına sahip olduğunu, ortalama olarak her gram kuru toprak başına sırasıyla 8,8 x 107 ve 4,6 x 106 gen kopyasına sahip olduğunu ortaya koydu. Toprak E, diğer tüm topraklardan anlamlı şekilde farklıydı ve kuru toprak başına sırasıyla 4,4 x 109 ve 2,5 x 109 gen kopyalarıyla en fazla 16S ve 18S rRNA gen kopyasını gösterdi. A–D topraklarındaki mantar kopyaları birbirinden anlamlı şekilde farklıydı, D topraklarındaki bakteriyel kopyalar ise toprak B ve E'den anlamlı şekilde farklıydı.

Her toprak örneğinden arındırılan DNA'da tam genom pompalı tüfek (WGS) dizileme uygulandı ve taksonomik sınıflandırmalar Kraken2 kullanılarak NCBI nr veritabanına karşı yapıldı. Bakteri ve mantarlara karşı sınıflandırılan toplam DNA dizisi sayısı, her toprak için mantar:bakteri oranı (F:B) hesaplanarak ve ddPCR ile tahmin edilen gen kopya sayılarından hesaplanan mantar:bakteri oranlarıyla karşılaştırıldı (Ek Şekil 1). ddPCR ile elde edilen F:B oranı tüm toprak örneklerinde 0,022 ile 0,66 arasında değişmekte olup, tüm genom dizileme ile elde edilenlerden daha yüksekti. En yüksek ortalama F:B toprak E'de gözlemlendi; ddPCR için F:B 0,56, WGS yöntemleri için ise 0,038 idi. Ayrıca, ddPCR kullanılarak yapılan toprak örneklerinde WGS yerine daha geniş bir F:B değer aralığı tespit edilmiştir. Ayrıca, ddPCR yöntemiyle belirlenen F:B oranı ile WGS verileri arasında (r = 0,59, R2 = 0,35, p = 0,019) pozitif bir korelasyon gözlemlenmiştir; bu, Ek Şekil 1'de gösterilmiştir.

Bakteri ve mantarlar için ortalama bir gen kopya numarası, hesaplanan gen kopyalarını orijinal örneklerdeki bakteri ve mantar hücrelerinin sayısına dönüştürmek için kullanıldı (Ek Şekil 2). Bu veriler, topraktaki toplam mikrobiyal hücre sayısını tahmin etmek için birleştirildi (Şekil 3D) ve topraklar arasında anlamlı şekilde farklılık gösterdi (tek yönlü ANOVA p < 0.0001). Tukey'nin çiftli karşılaştırma analizi, en yüksek mikrobiyal içeriğin toprak E'de gözlemlendiğini, en düşük mikrobiyal içeriğin ise toprak B'den toplanan örneklerde bulunduğunu ve A, D ve E'den önemli ölçüde farklı olduğunu gösterdi.

Her toprak örneğinde üç kat kloroform fumigasyonu yapıldı ve her numunedeki toplam mikrobiyal biyokütle karbonu (MBC) tahmin edildi (Şekil 4A). Kullanılan topraklar arasında kuru toprak başına 3,6 ile 9,6 mg arasında karbon tespit edildi ve her örnek arasında belirgin fark gözlemlenmedi (tek yönlü ANOVA p = 0,266). Bakteriyel ve mantar hücreleri için ortalama karbon içeriği, ddPCR ile tahmin edilen mikrobiyal hücre sayısını tahmini toplam mikrobiyal biyokütle karbonuna dönüştürmek için kullanıldı. Bu ddPCR kaynaklı tahminler, kloroform fumigasyon yöntemiyle karşılaştırıldı (Şekil 4B). Kloroform fumigasyonu ile ölçülen MBC ile ddPCR yöntemi arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için Pearson korelasyonu yapıldı (n = 15). İki yöntem arasında pozitif bir korelasyon bulundu (r = 0.43, R2 = 0.18, p-değeri = 0.05). Toprak E'den elde edilen istisnalar, en yüksek organik madde içeriğiyle karakterize edilen, muhtemelen bu marjinal anlamlı sonuca orantısız katkı sağlamıştır (Şekil 4B).

figure-results-1
Şekil 1: Toprak örnek işleme genel bakışı. Şekil, toprak DNA'sının mikrobiyal nicelik için kullandığı moleküler yöntemleri ve mikrobiyal biyokütle, karbon ve toprak organik maddesi ölçülmesi için geleneksel yöntemleri göstermektedir. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Hem 16S hem de 18S için ddPCR kopyalarından hücre sayma sürecinin akış şeması, protokolün 5.11–5.16 adımlarını gösteren nihai mikrobiyal biyokütle karbon tahminine kadar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Toprağın mikrobiyal nicelenmesi. (A) Her toprak örneğinden arıtılan ortalama DNA konsantrasyonu. (B) ddPCR kullanılarak toprak kuru ağırlığı başına ortalama toplam toplam 16S rRNA gen kopyası. (C) ddPCR kullanılarak toprak kuru ağırlığında gram başına ortalama toplam 18S rRNA gen kopyası. (D) Toprak örnekleri boyunca gram kuru ağırlık başına ortalama toplam mikrobiyal hücre sayısı. Tüm hata çubukları ortalamanın standart hatasını gösterir. Tek yönlü bir ANOVA ve ardından Tukey'nin çift karşılaştırma sonrası testi yapıldı ve önemli farklar kompakt harf gösterimiyle gösterildi (anlamlılık eşiği = 0.05). Örnekler en düşükten en yüksek OM% sırasına alınmıştır. Toprak Kökeni (OM%) A: Hollanda (3,38), B: Irak (5,14), C: Çin (6,41), D: Birleşik Krallık (8,19) ve E: Birleşik Krallık (10,34). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Kloroform fümigasyon ekstraksiyonu ve gen tabanlı hücre tahminleriyle ölçülen mikrobiyal biyokütle karbonu. (A) Kloroform fumigasyonu ile ekstra edilen MBC - düşük ve yüksek organik madde içeriğiyle düzenlenmiştir. Hata çubukları ortalamanın standart hatasını gösterir. Tek yönlü bir ANOVA ve ardından Tukey'nin çift karşılaştırmalar için sonradan yaptığı post hoc testi yapıldı ve önemli farklar kompakt harf gösterimi kullanılarak gösterildi (anlamlılık eşiği = 0.05). (B) Hücre bolluğundan (hücre gdw -1) ddPCR gen kopya numarasından türetilen ve aynı örnek için toplam organik maddeye karşı biyokütle karbonuna dönüştürülerek tahmin edilen MBC. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ÖrnekToprak KökenipHNem içeriği %Organik Madde%DokuArazi Kullanımı
ATexel, Hollanda7.1619.043.38Sandy loamBahçecilik
BNecef, Irak7.588.335.14Siltli toprakPirinç
CJiangxi, Çin4.118.456.41Siltli toprakSusam/Kolza
DCambridge, Birleşik Krallık6.8121.88.19Siltli toprakBuğday
EExeter, Birleşik Krallık5.4420.2710.34Siltli toprakÇayır Alanı

Tablo 1: Mikrobiyal biyokütle belirlenmesi için beş toprak örneğinin (A–E) fizyokimyasal özellikleri ve arazi kullanım özellikleri.

HedefBPİleriyeTersReferans
16S rRNA1805′- ACTCCTACGGGGAGGCAGCAG5′- ATTACCGCGGCTGCTGG(Le Geay ve ark., 2024; Ovreås ve ark., 1997)
18S rRNA3515′-GGRAAACTCACCAGGTCCAG5′-GSWCTATCCCCAKCACGA(Liu ve ark., 2012)

Tablo 2: ddPCR kullanılarak 16S ve 18S rRNA genlerini hedeflemek için seçilen primer çiftleri.

Ek Şekil 1: Tüm toprak örnekleri için F:B oranı arasında ddPCR yöntemiyle belirlenen ve WGS ile WGS arasında bir korelasyon. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Farklı toprak örneklerindeki hücre sayısı, ddPCR yöntemiyle hedeflenen: (A) bakteri; ve (B) mantarlar. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toprak mikropları, karasal ekosistemlerde ana ayrıştırıcılardır ve besin döngüsünde ve toprakta karbon depolamasında önemli bir rol oynarlar. Toprak mikroplarının önemine rağmen, gen kopyalama tabanlı yöntemlerle mutlak bolluklarını doğru şekilde niceltmek zordur. Bu, farklı türlerdeki hedef gen sayısının değişkenliği gibi birçok faktörden kaynaklanmaktadır. Bu çalışma, toprak mikrobiyal biyokütlesinin, ilgili 16S ve 18S rRNA gen kodlama bölgeleriyle prokaryotlar ve ökaryotları hedef alarak ddPCR kullanılarak nasıl nicelendirilebileceğini göstermektedir. Toprak E'de en yüksek F:B oranı gözlemlenmiştir; bu örnek aynı zamanda en yüksek organik madde yüzdesine sahiptir. İkinci en yüksek F:B oranı C örneğinde görülmüştür ve bu da bu toprakların yüksek asiditesi ile korelasyonludur. Bu, C ve E örneklerinde bekleniyordu; çünkü mantar büyümesi pH31 düştüğünde artar. Tüm genom dizilemesi, ddPCR yöntemlerinde kullanılan aynı DNA özetlerinde gerçekleştirildi. WGS ile ddPCR arasındaki F:B oranı karşılaştırıldı. WGS verilerinden hesaplanan F:B oranı, analiz edilen tüm örnekler için ddPCR verilerinden hesaplanan F:B oranına kıyasla daha düşüktü. Ancak, örnekler arasındaki F:B oranının genel eğilimi, her yöntem arasında görsel olarak karşılaştırılabilirdi. Bu, toprak örneklerinde tüm genom dizileme ile karşılaştırıldığında daha yüksek F:B oranları sağladı ve farklı toprak tiplerinde daha fazla F:B oranı değişkenliği gösterdi. WGS verilerinden gözlemlenen daha düşük F:B oranı, muhtemelen mantarlar ve bakteriler arasındaki genom boyutundaki farklılıklardan kaynaklanıyor ve mantar dizileri, zenginleştirmeolmadan yeterince temsil edilmiyor 32. Ayrıca, Toprak A en düşük organik madde içeriğine sahip olmasına rağmen, en düşük mikrobiyal kopya sayısını ve mikrobiyal biyokütle karbonunu göstermemiştir; bu da organik madde içeriğinin her zaman mikrobiyal biyokütle ile doğrudan ilişkili olmadığını vurgular. Özellikle, orijinal DNA konsantrasyonu (Şekil 3A) ile toplam mikrobiyal hücreler (Şekil 3D) arasındaki eğilimler görsel olarak benzerdi ve DNA konsantrasyonunun mikrobiyal biyokütle için iyi bir gösterge olduğunu düşündürmektedir.

ddPCR, toprak örneklerindeki gen kopya sayılarının doğru nicelenmesini sağlar ve bu yöntem toplam mikrobiyal hücrelerin tahmininde kullanılabilir. Ancak, dikkate alınması gereken sınırlamalar vardır. 16S ve 18S rRNA gen kopyalarının sayısı, mikrobiyaltaksonlar arasında 23 büyük farklılıklar gösterir. Sonuç olarak, gen kopya numarası için tek bir düzeltme faktörünün kullanılması, örnekte mikrobiyal bolluğun fazla veya az değerlenmesineyol açabilir 33. Bu sınırlama, mikrobiyal topluluğun öncedenbilgisi 18, tüm genom dizileme verileri kullanılarak ve belirli toprak mikrobiyotasını temsil eden uygun gen kopya numarası düzeltmeleri uygulanarak giderilebilir. Moleküler yöntemler kesin sayıdan çok tahmin sağlarken, mikrobiyal bolluğun daha doğru tahminini sunarlar. Topluluk bileşimi verileriyle birleştiğinde, bu yaklaşım sadece göreceli bolluğun ötesine geçen yorumlara olanaktanır 19,34.

Kloroform fumigasyonu kullanılarak tahmin edilen mikrobiyal biyokütle karbonu (MBC) analiz edilen örnekler arasında anlamlı fark göstermemiştir; ancak A–D örneklerinde MBC'de yüksek varyasyon gözlemlenmiştir. Buna karşılık, ddPCR yöntemiyle ölçülen toplam mikrobiyal hücre sayısında anlamlı farklılıklar tespit edilmiştir; bu da bu moleküler yaklaşımın geleneksel tekniklerden daha yüksek çözünürlük sağlayabileceğini göstermektedir. Ancak, mikrobiyal biyokütle karbonunun mikrobiyal hücre sayılarından hesaplanmasının kendi sınırlamaları vardır. Hücre boyutundaki değişkenlik, hücre sayılarının biyokütleye dönüşümünü etkileyebilir. Gen kopyası sayısı için tek bir dönüşüm faktörü kullanmak gibi, bakteriyel ve mantar karbon içeriği için tek bir dönüşüm faktörü kullanmak mikrobiyal biyokütle karbonunun aşırı veya az değerlenmesine yol açabilir.

Ayrıca, DNA tabanlı yöntemler, bakteriler ve mantarlar arasındaki baskın derecesinde büyük farklılıklar gösteren topraklar arasında karşılaştırmada özellikle sorunlu olabilir. Hem DNA verimi hem de GCN, DNA çıkarma yöntemi ve primer tasarımı seçimindenetkilenebilir 35,36, bu da laboratuvarlar arası karşılaştırmalarızorlaştırır 37. Ayrıca, hem GCN hem de DNA verim yöntemleri, ölü organizmalarda veya killere bağlı olan DNA'nın "kalıntı DNA" (örneğin ölü organizmalarda veya killere bağlı olması) nedeniyle aşırı tahmine açık olabilir. ddPCR yöntemleri daha iyi hassasiyet ve tekrarlanabilirlik göstermiş olsa da, bazı dezavantajları arasında karmaşık süreçler, yüksek maliyetler ve Evagreenkimyasında spesifik olmayan DNA boyası kullanımı yer alır. Bu zayıf yanlış pozitifler yaratabilir, pozitif damlacıkları negatif damlacıklardan ayırmayı zorlaştırabilir ve gen kopyalarıdüşük 14 olduğunda hafif eşik hatasının F:B oranını etkileyebileceği belirtilebilir. Bu ddPCR yöntemiyle işlenebilen örnek sayısını artırmak için, sıvı işleme robotikleriyle otomasyon DNA ekstraksiyonları ve reaksiyonkurulumu için kullanılabilir. Ayrıca, yeni ddPCR sistemi daha fazla çoklamaya olanak tanıyarak aynı anda 96 örnek için damlacık üretir.

Tüm mikrobiyal biyokütle ölçümlerinin tahmin olduğunu ve sayıları belirlemek için genel dönüşüm faktörleriniiçerdiğini belirtmek önemlidir 37. Bu nedenle, yöntemler arasında karşılaştırmalar dikkatli yapılmalıdır; hangilerinin en doğru olduğu bilinmemektedir. Buna rağmen, kloroform fumigasyon-ekstraksiyon yöntemleri son birkaç on yılda yaygın olarak kullanılmakta olup, toprağı fumigasyon için kloroform buharlarına dayanmaktadır. Bu, insanlara ve çevreye yönelik toksisitesi ve toprak mikrobiyal hücrelerini lizlemedeki etkinliği nedeniyle birçok endişeye yolaçmıştır 40. Ayrıca, kloroform fumigasyonu, bitkikalıntısı 41 gibi cansız kaynaklardan üretilen MBC'nin aşırı tahminine yol açabilir. Son olarak, bu yöntem çok düşük miktarda toprak gerektiren diğer moleküler yöntemlere kıyasla nispeten büyük miktarda toprak gerektirir (<500 mg).

Bu çalışma, çeşitli topraklarda toprak mikrobiyal biyokütlesini ölçmek için ddPCR tabanlı yöntemlerin sağlam olduğunu ve farklı toprak tipleri ve potansiyel inhibitörlerden etkilenmediğini kanıtlar sunmaktadır. Bu yöntemin başarısı, orijinal DNA örneği tarafından etkilenir ve bu nedenle örneklerden etkili DNA arındırmasının sağlanması hayati öneme sahiptir. Bu yöntem, çeşitli toprak tiplerinde ve dokularında mikrobiyal tespit ve niceliklendirme için umut vaat ediyor; mevcut mikrobiyal biyokütle tahmini yöntemlerini tamamlıyor ve bölgesel veya küresel mikrobiyom gözetimi için toprak sağlığı ve ölçeklenebilirliği izlenmesinde değerli gelecekteki uygulamalar sağlıyor.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Nina Lindstrom-Friggens, Dr. Liz Cressey, Dr. Joanna Zaragoza-Castells, Angela Elliott, Dr. Kees Jan van Groenigen ve Prof. Iain Hartley'e teşekkür ediyoruz. Ayrıca bu çalışma için toprak sağladıkları için arazi sahiplerine teşekkür etmek istiyoruz. Bu araştırma Shell Research Ltd (CW648947-PT34767) tarafından finanse edilmiştir. Mevcut çalışma sırasında oluşturulan veri setleri, NCBI Sequence Read Archive deposunda PRJNA1305539.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bettersizer S3 Plus Bettersize, ÇinBT-803
SantrifüjTermoscientif SL16 
Kloroform TermoBilimselL14759. AU 
ddPCR 96-Kuyulu PlakalarBio-Rad, Watford, Birleşik Krallık12001925
ddPCR Damla Okuyucu Yağı Bio-Rad, Watford, Birleşik Krallık1863004
Dessicator Davisil
DG8 Karuş TutucuBio-Rad, Watford, Birleşik Krallık1863051
QX200/QX100 Damla Jeneratörü için DG8 KartuşlarıBio-Rad, Watford, Birleşik Krallık1864008
QX200/QX100 Damla Jeneratörü için DG8 ContalarıBio-Rad, Watford, Birleşik KrallıkQ33265
DNeasy Power Soil pro kiti  Qiagen, Almanya47017
çift zincirli (dsDNA) Geniş Aralıklı (BR) test kitiInvitrogen, AlmanyaQ33230
FastPrep-24 5G MP Biyomedikal Şirketi, Birleşik Krallık116005500
GridION Oxford Nanopore Teknolojileri, Birleşik KrallıkGRD-MK1CAPX
K2SO4Merck, Birleşik Krallık7778-80-5
Mag-Bind Manyetik BoncuklarOmega Bio-tek, ABDM1378-01
MinION akış hücresiOxford Nanopore Teknolojileri, Birleşik KrallıkFLO-MIN114
Boğuk fırınKarbolit AAF1100
Yerel barkod kiti 24Oxford Nanopore Teknolojileri, Birleşik KrallıkSQK-NBD114.24
PCR Plaka Isı Sızdırmazlığı, folyo, delinebilir ve s.nbsp;Bio-Rad, Watford, Birleşik Krallık1814040
PX1 PCR Plaka KapatıcıBio-Rad, Watford, Birleşik Krallık1814000
Kubit florometreInvitrogen, AlmanyaQ33226
QX200 Damlacıklı Dijital PCR SistemiBio-Rad, Watford, Birleşik Krallık1864001
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-Rad, Watford, Birleşik Krallık186-4033
EvaGreen  için QX200 Damla Üretim Yağı;Bio-Rad, Watford, Birleşik Krallık1864005
QXDx Damla Jeneratörü Bio-Rad, Watford, Birleşik Krallık12001049
SENSOQUEST LABCYCLER Geneflow, Almanya1120280125

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jobbágy, E. G., Jackson, R. B. The vertical distribution of soil organic carbon and its relation to climate and vegetation. Ecol Appl. 10 (2), 423-436 (2000).
  2. Sanderman, J., Hengl, T., Fiske, G. J. Soil carbon debt of 12,000 years of human land use. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (36), 9575-9580 (2017).
  3. He, Y., Li, J., Siemann, E., Li, B., Xu, Y., et al. Plant invasion increases soil microbial biomass carbon: meta-analysis and empirical tests. Glob Change Biol. 31 (3), e70109(2025).
  4. de Menezes, A. B., Richardson, A. E., Thrall, P. H. Linking fungal-bacterial co-occurrences to soil ecosystem function. Curr Opin Microbiol. 37, 135-141 (2017).
  5. Wang, D., et al. ddPCR surpasses classical qPCR technology in quantitating bacteria and fungi in the environment. Mol Ecol Resour. 22 (7), 2587-2598 (2022).
  6. Djemiel, C., et al. Biogeographical patterns of the soil fungal:bacterial ratio across France. mSphere. 8 (5), e0036523(2023).
  7. Bailey, V. L., Smith, J. L., Bolton, H. Fungal-to-bacterial ratios in soils investigated for enhanced C sequestration. Soil Biol Biochem. 34 (7), 997-1007 (2002).
  8. Vance, E. D., Brookes, P. C., Jenkinson, D. S. Microbial biomass measurements in forest soils: the use of the chloroform fumigation-incubation method in strongly acid soils. Soil Biol Biochem. 19 (6), 697-702 (1987).
  9. Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlio, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol Biochem. 25 (6), 723-730 (1993).
  10. Cao, Z., Li, D., Han, X. The fungal to bacterial ratio in soil food webs, and its measurement. Acta Ecol Sin. 31 (20), 6050-6058 (2011).
  11. Frossard, A., Hammes, F., Gessner, M. O. Flow cytometric assessment of bacterial abundance in soils, sediments and sludge. Front Microbiol. 7, 903(2016).
  12. Joergensen, R. G., et al. A hitchhiker’s guide: Estimates of microbial biomass and microbial gene abundance in soil. Biol Fertil Soils. 60 (4), 457-470 (2024).
  13. Fierer, N., Wood, S. A., Bueno de Mesquita, C. P. How microbes can, and cannot, be used to assess soil health. Soil Biol Biochem. 153, 108111(2021).
  14. Laine, M. B., Taipale, S. J., Tiirola, M. Comparison of methods for assessing fungi-to-bacteria ratio of soil. Biol Fertil Soils. 61 (5), 941-954 (2025).
  15. De Filippis, F., Laiola, M., Blaiotta, G., Ercolini, D. Different amplicon targets for sequencing-based studies of fungal diversity. Appl Environ Microbiol. 83 (17), e00905-e00917 (2017).
  16. Liu, C. M., et al. FungiQuant: A broad-coverage fungal quantitative real-time PCR assay. BMC Microbiol. 12, 255(2012).
  17. Lofgren, L. A., et al. Genome-based estimates of fungal rDNA copy number variation across phylogenetic scales and ecological lifestyles. Mol Ecol. 28 (4), 721-730 (2019).
  18. Angly, F. E., et al. W. CopyRighter: A rapid tool for improving the accuracy of microbial community profiles through lineage-specific gene copy number correction. Microbiome. 2 (1), 11(2014).
  19. Kembel, S. W., Wu, M., Eisen, J. A., Green, J. L. Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance. PLoS Comput Biol. 8 (10), e1002743(2012).
  20. Pan, P., Gu, Y., Sun, D. L., Wu, Q. L., Zhou, N. Y. Microbial diversity biased estimation caused by intragenomic heterogeneity and interspecific conservation of 16S rRNA genes. Appl Environ Microbiol. 89 (5), e0210822(2023).
  21. Chacón-Vargas, K., Torres, J., Giles-Gómez, M., Escalante, A., Gibbons, J. G. Genomic profiling of bacterial and fungal communities and their predictive functionality during pulque fermentation by whole-genome shotgun sequencing. Sci Rep. 10 (1), 15115(2020).
  22. Bahram, M., et al. Metagenomic assessment of the global diversity and distribution of bacteria and fungi. Environ Microbiol. 23 (1), 316-326 (2021).
  23. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology: Application of Q-PCR in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  24. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  25. Le Geay, M., Mayers, K., Küttim, M., Lauga, B., Jassey, V. E. J. Development of a digital droplet PCR approach for the quantification of soil micro-organisms involved in atmospheric CO2 fixation. Environ Microbiol. 26 (6), e16666(2024).
  26. Hansen, P. M., Semenova-Nelsen, T. A., Platt, W. J., Sikes, B. A. Recurrent fires do not affect the abundance of soil fungi in a frequently burned pine savanna. Fungal Ecol. 42, 100852(2019).
  27. Ovreås, L., Forney, L., Daae, F. L., Torsvik, V. Distribution of bacterioplankton in meromictic Lake Saelenvannet, as determined by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3367-3373 (1997).
  28. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (12), 6578-6583 (1998).
  29. Cheng, J. Y. W., Chan, C. K., Lee, C. T., Lau, A. P. S. Carbon content of common airborne fungal species and fungal contribution to aerosol organic carbon in a subtropical city. Atmos Environ. 43 (17), 2781-2787 (2009).
  30. Wood, D. E., Lu, J., Langmead, B. Improved metagenomic analysis with Kraken 2. Genome Biol. 20 (1), 257(2019).
  31. Rousk, J., Brookes, P. C., Bååth, E. Contrasting soil pH effects on fungal and bacterial growth suggest functional redundancy in carbon mineralization. Appl Environ Microbiol. 75 (6), 1589-1596 (2009).
  32. Xie, Z., Canalda-Baltrons, A., d’Enfert, C., Manichanh, C. Shotgun metagenomics reveals interkingdom association between intestinal bacteria and fungi involving competition for nutrients. Microbiome. 11 (1), 275(2023).
  33. Větrovský, T., Baldrian, P. The variability of the 16S rRNA gene in bacterial genomes and its consequences for bacterial community analyses. PLoS One. 8 (2), e57923(2013).
  34. Doyle, B., et al. Absolute quantification of prokaryotes in the microbiome by 16S rRNA qPCR or ddPCR. Nat Protoc. 20, 3471-3476 (2025).
  35. Frostegård, A., et al. Quantification of bias related to the extraction of DNA directly from soils. Appl Environ Microbiol. 65 (12), 5409-5420 (1999).
  36. Lee, E., Lim, H. J., Son, A. Discrepancies in qPCR-based gene quantification and their dependencies on soil properties, inhibitor presence, and DNA extraction kit types. RSC Adv. 15 (25), 19656-19664 (2025).
  37. Buell, Z. W., et al. Interrelationships among methods of estimating microbial biomass across multiple soil orders and biomes. Soil Biol Biochem. 208, 109844(2025).
  38. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nat Microbiol. 2 (3), 16242(2016).
  39. Child, H. T., et al. Automated environmental metagenomics using Oxford nanopore sequencing. BMC Genomics. 26 (1), 835(2025).
  40. Paliaga, S., Laudicina, V. A., Muscarella, S. M., Said-Pullicino, D., Badalucco, L. Comparison of different methods for estimating microbial biomass in biochar-amended soils. Soil Biol Biochem. 203, 109733(2025).
  41. Setia, R., Verma, S. L., Marschner, P. Measuring microbial biomass carbon by direct extraction: comparison with chloroform fumigation-extraction. Eur J Soil Biol. 53, 103-106 (2012).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Toprak MikroplarddPCR Kantifikasyonu16S rRNA18S rRNAMikrobiyal Biyok tle KarbonuToprak DNA EkstraksiyonuFungal Bakteriyel OranToprak Sa l De erlendirmesi

İlgili makaleler