Otomatik hücre segmentasyonu kullanılarak birincil insan hava yolu epitelyal kültürlerinde floresans tabanlı kalsiyum görüntüleme

Özet

Kalsiyum sinyalinin canlı hücre görüntülemesi, monokatmanlarda yetiştirilen stabil hücre hatlarında kalsiyum mobilizasyonunu incelemek için yoğun şekilde kullanılır. Bu protokol, karmaşık ve birincil dokuda canlı hücre boyaları kullanılarak kalsiyum sinyalinin canlı hücre floresans görüntülemesini tanımlar ve binlerce bireysel hücrenin floresan yoğunluğunu aynı anda nicelikten ölçmek için makine öğrenimi yazılımını kullanarak analizleri kolaylaştırır.

Özet

Kalsiyum sinyalizasyonu, birçok biyolojik süreçte kritik öneme sahiptir ve birincil dokuda kalsiyum akışını incelemek için yöntemler geliştirme ihtiyacını pekiştirmektedir. Karmaşık primer epitel kültürlerinde tek hücre çözünürlükte kalsiyum sinyalinin incelenmesi zordur ve bu nedenle hâlâ az incelenmiştir. Bu çalışma, birincil hava yolu epitel kültürlerinde canlı kalsiyum sinyalinin izlenmesi için uyarlanmış yöntemleri ve makine öğrenimi tabanlı analizler için yeni yaklaşımları sunmaktadır. Hastadan türetilen birincil hava yolu epitel kültürleri ALI'de (hava-sıvı arayüzü) farklılaşmış ve dışsal floresan bir gösterge boyası ile yüklenerek, kalsiyum mobilizasyonu epifloresan mikroskop kullanılarak tek hücre çözünürlükte ölçüldü. Makine öğrenimi tabanlı hücre segmentasyonunu kullanarak zaman içinde farklı hücrelere floresan yoğunlukları atayan yeni bir yazılım geliştirdik. Genel olarak, uyarlanmış görüntüleme sistemi ve yazılımı, birincil epitel kültürlerindeki tek hücrelerin hızlı ve tarafsız analizini mümkün kılar. Burada sunulan adım adım protokol, birincil epitel kültürlerini oluşturan bireysel hücreler ve hücre tiplerinde kalsiyumun gelecekte incelenmesini mümkün kılacaktır.

Giriş

Hücre içi kalsiyum mobilizasyonundaki değişiklikler, gen ifadesindeki değişiklikler ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarının modülasyonu dahil olmak üzere çok çeşitli hücresel^{süreçleri yönlendirir 1,2}. Hücre içi kalsiyum seviyeleri, endoplazmik retikulum ve mitokondri ^1,2,3 gibi hücre içi kalsiyum depolarından salınım yoluyla değiştirilebilir. Hücre içi boşluğa ekstraselüyar kalsiyum akışı da sitozolik kalsiyumu hem pasif hem de aktif taşıma^{yoluyla değiştirebilir.} Kalsiyum mobilizasyonunun canlı hücre görüntülemesi, esas olarak hücre içi boyalar veya genetik olarak kodlanmış boyalar, GCaMP (Yeşil Kalsiyum-aktive Multimer/Protein) ile analiz edilir^. Literatürde yaygın olanlar arasında (asetoksimetil) konjuge boyalar bulunur; bu boyalar boya plazma ^membranına 5,6,7,8 nüfuz etmesini sağlar. Hücreye girdiğinde, kısmı endogen hücre içi esterazlar tarafından bölünür ve boya negatif yük kazanır, bu da onu sitozolik^{boşlukta hapseder 9}. Bu kazanılan yük sayesinde, boya plazma zarında yerleşik organik anion kanalları aracılığıyla pompalanabilir. Bu nedenle, organik anyon efflux taşıyıcılarının inhibitörü olan probenecid, boya hücresel akışını önlemek ve optimal sitozolik^sinyal 10,11'i korumak için eklenir. Çalışmalar, genellikle bir oran metrik boya olan Fura-2 ve intensitometrik bir boya olan Fluo-4AM'yi kullanarak tek katmanlı olarak kültürlenen stabil hücre hatlarında kalsiyum sinyalini analiz eder. Bu çalışma, hava-sıvı arayüzünde yetiştirilen çok katmanlı kültürlerin epifloresan görüntülemesi için uyarlanmış bir protokol kullanmaktadır; bu boya, Fluo-4'e kıyasla daha hassas olan yoğun yoğun kalsiyum boyası Cal-520 kullanılmıştır. Bu nedenle, karmaşık primer epitel kültürlerinden tek hücre çözünürlükte ince sinyalleri sağlam şekilde görselleştirmek için uygundur. Güncel literatür, stabil hücre hatlarından toplu yanıtların canlı kalsiyum görüntülemesi açısından zengindir. Ancak, in vivo dokuların doku homeostazını korumada farklı hücre tipine özgü rolleri destekleyen çeşitli hücresel bir peyzaj oluşturduğu yaygın olarak^{bilinmektedir 12,13,14,15}. Bu yaygın bilgiye rağmen, farklı hücre tiplerinin kalsiyum sinyallerini koordine etme ve kalsiyum iyonu homeostazını düzenleme mekanizmaları bilinmemektedir. Bu nedenle, burada sunulan yöntemler, kalsiyum sinyalinin tek hücreli algılanmasını mümkün kılacak ve birincil hava yolu dokularında aşağı akış analizlerinin verimliliğini artıracaktır.

Daha önce yayımlanmış ve titizlikle doğrulanmış insan burun epitelinin birincil epitel kültür modellerini, canlı hücre, sitozolik kalsiyumu daha biyolojik olarak ilgili bir^{modelde görüntülemek için kullanıyoruz} 16,17,18. Kısaca, epitel hücreleri hasta burun fırçalarından izole edilir ve yarı geçirgen bir zar üzerinde kültür kuyusu'nda askıya alınarak hava-sıvı arayüzünü (ALI) korumak için bir transwell üzerinde kültür kuyusu üzerinde kültürlenir. Bu arayüz, özel ortamlarla birleşerek, farklı hücre tiplerinin varlığı için ortogonal tekniklerle titizlikle test^edilmiştir 16,17,18. Ayrıca, mevcut yöntemlerin, birincil burun kültürlerimize benzer şekilde kültürlenen primer bronşiyal kültürlere de çevrilebileceği^{gösterilmiştir 19}.

Bu makale, bu birincil hava yolu epitel kültürlerinde tek hücre çözünürlükte canlı kalsiyum sinyalini ölçmek ve analiz etmek için uyarlanmış bir yöntem tanıtmaktadır. Bu çok katmanlı kültürleri mikroskopi ile görselleştirmek zordur; Ancak mevcut düzen, çok katmanlı kültürler içindeki tek katmanlara güvenilir şekilde odaklanmamızı sağlıyor ve bu özel katmanlardan kalsiyum mobilizasyonunu tespit edebiliyoruz. Bu düzenin birkaç avantajı vardır; çünkü perfüzyon sistemi gerektirmez; bu sistem genellikle maliyetlidir ve özel mikroskoplar kullanılmadıkça uyarlanması zordur. Epifloresans mikroskopisi kullanılmıştır; bu yöntem, konfokal görüntülemeye kıyasla daha iyi zamansal çözünürlük sağlar. Işık yayan diyotların (LED) kullanımı, lazer bazlı konfokal sistemlere göre fototoksisiteyi en aza indirir. Burada sunulan protokolde dışsal intensiyometrik boyalar kullanılır; çünkü tüm hücre popülasyonunda kalsiyumda hızlı ve göreceli değişiklikler yapılmasını sağlar ve çoğu floresan mikroskopi kurulumuyla uyumludur. Bu, birçok mikroskopta bulunmayan derin ultraviyole (UV) uyarılmaya ihtiyaç duyan yaygın orantımetrik boyalara göre faydalıdır. Ayrıca, GCaMP transfeksiyon veya transdüksiyon gerektirir; bu da belirli hücre tiplerinde daha hedefli kalsiyum görüntüleme tekniğini güçlendirir. Primer epitel kültürlerindeki düşük transdüksiyon ve transfeksiyon verimliliği nedeniyle, bu teknik tüm hücre popülasyonunu izlemek için uygun değildir.

Ayrıca, bu çalışma, canlı nükleer boyamaya dayalı tek hücreli segmentasyonu sağlayan yeni, özel makine öğrenimi tabanlı yazılımlar geliştirmiştir. Yazılım daha sonra her hücre için zaman içinde floresans yoğunluk değerlerini kaydedebilir. Yöntem optimizasyonu için başlangıçta stabil bir epitel hücre hattı (Calu-3) kullanıldı. Daha sonra bu yöntemler, primer epitel kültürlerinde tek hücreli kalsiyum mobilizasyonunu incelemek üzere çevrildi. Kalsiyum boyası ve probeneksidin konsantrasyonu, kuluçka adımlarının zamanlaması ve görüntüleme düzeni gibi değişkenler optimize edildi. Burada, kalsiyum sinyalizasyonu 0.2 fps (frame/s) kare hızında kaydedilir ve bu da kalsiyum sinyalini izlemek için uygundur. Daha hızlı kalsiyum geçişlerini ölçmek için kare^{hızı artırılabilir 20}. Optimal değişkenler daha sonra uygulandı ve daha karmaşık birincil burun kültürlerinde daha da optimize edildi.

Protokol

Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Calu-3 hücre bakımı ve kültürlenmesi

1. Calu-3 hücrelerini EMEM kültür ortamında %20 FBS ve %1 penisilin/streptomisin takviyeli EMEM kültürlü ortamlarında saklamaktır. Medyayı önceden ısıtın ve dönüşümlü günlerde değiştirin (5 mL/şişe).
2. Hücreler termosa %70 birleştiğinde, ortamı şişedeki aspirasyonla çekilir.
3. Matayı 5 mL 1x fosfatla tamponlanmış tuzlu su (PBS) ile yıkayın.
4. 1 mL TrypLE doğrudan hücrelere 10-15 dakika boyunca 37 °C, %5_CO2 ile ekleyin. Tüm hücrelerin mataşa altından ayrılıp tek hücreli bir süspansiyona ayrıldığından emin olun.
5. Reaksiyonu 4 mL taze kültür ortamıyla nötralize edin (adım 1.1), ardından hücreleri serolojik pipetle iyice karıştırarak eşit tohumlama sağlanır.
6. Hücreleri, %90-100 birleşimde (yaklaşık 40.000 hücre/kuyyu) 96 kuyu ölçüsünde bir plakaya plakalayın.
   1. Kuyular için 200 μL/well iyi karışık hücre süspansiyonu ekleyin.
   2. Hücrelerin gece boyunca 96 kuyu plakasına yapışmasına izin verin.
7. Her gün (200 μL/well) deneylere hazır olana kadar ortamı değiştirin.
8. Kuyular içinde birleşmeden sonra deneylere başlamak için 2-5 gün beklen, böylece deneyler yapılmadan önce farklılaşmayı mümkün kılarak deneylere başlayın.

2. Calu-3 hücrelerinin Cal 520 veya Fluo-4 ile yüklenmesi protokolü

DIKKAT: Fluo-4 ve Cal-520 DMSO'da çözünür ve bu tehlikeli kabul edilir. Probenecid akut tehlike olarak listelenmiştir. Kimyasallarla çalışırken ciltle temas etmemek için lütfen eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Tüm kimyasalları belirlenmiş kimyasal atık kutularına at.

1. Deney günü, pipetle ile kuyulardan ortam çıkarın ve hücreleri önceden ısıtılmış kalsiyum tamponunda iki kez (200 μL/kuyyu) yıkayarak ölü hücreleri temizleyin (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM_{MgCl 2, 2} mM CaCl₂ ve pH 7.38 (NaOH) 291 mOsm'a ayarlanmış 10 mM Hepes).
2. Hücreleri, 3 μM Cal-520, 2.5 mM probenekid ve 1:5000 Hoechst nükleer boyama kokteylinden oluşan kalsiyum tamponu içinde (adım 2.1) içeren 200 μL/well kokteyliyle 37°C ve %5 CO₂ olarak ayarlanmış bir kuluçka makinesinde, 1 saat boyunca kuluçka hücrelerini kullanın.
   1. Fluo-4 deneyleri için, hücreleri 3 μM Fluo-4, 2.5 mM probenecid ve 1:5000 Hoechst nükleer boyama kokteylinden oluşan kalsiyum tamponunda (step 2.1) 200 μL kokteyl ile 1 saat boyunca 37 °C ve %5_{CO 2} ile kuluçka altına alın.
      NOT: Boya tüplerini alüminyum folyo ile kaplayarak karanlıkta tutun.
3. Kuluçka sırasında kalsiyum tamponunda hapsigargin hazırlanır (adım 2.1). Kuyu içindeki doğru nihai konsantrasyonları sağlamak için ara stok konsantrasyonlarını ayarlayın.
   NOT: Burada, mevcut kalsiyum tamponunun 100 μL'sine 50 μL ilaç eklenir. Bu nedenle, 6 μM'lik 3x ara stok hazırlandı.
4. 1 saat sonra, boya pipetle aspirasyon alın ve hücre dışı boya kalsiyum tamponu ile (step 2.1) iki kez (200 μL/kuyruk) yıkayarak silinin.
5. Yıkamaların ardından, boya sitoplazmik alanda kalsiyum tamponunda seyreltilmiş 2,5 mM probenecid (step 2.1) ile 100 μL / well ekleyin.
6. Plakayı ışığa karşı korumak için alüminyum folyoya sar. Hücreler artık görüntülemeye hazır.

3. Calu-3 kararlı hücre hattı için mikroskopi kurulumu

1. SuperFluor Objektif ile donatılmış epifloresans mikroskobu, stabil, katı hal ışık kaynağı ve CMOS floresans kamerası (6,5 μm piksel boyutu) kullanıldı. Aydınlatma yoğunluğu 500 mW olarak ayarlanmıştır.
2. Hücre plakasını sahneye 96 kuyruklu plaka adaptörü ile yerleştirin. Brightfield kullanarak, hücre katmanına düşük büyütmede odaklanarak hücrelerin tek katmanını bulun (5-10x hava nesnesi kullanın).
   NOT: Bu adım isteğe bağlıdır, ancak hücre katmanına ilk odak noktasını verimli bir şekilde kazanmak için faydalıdır.
3. Hücre tabakası belirlendikten sonra Brightfield kullanın ve daha yüksek büyütme (20x hava hedefi) ile tekrar hücre tabakasına odaklanın.
   NOT: Brightfield ile tek katmana doğru odaklanmayı unutmayın; Hücre sınırları net olmalı.
4. GFP (475 nm LED) kullanarak kalsiyum boya sinyalini tanımlayın. LED gücünün %5-10 arasında olduğundan emin olun ki foto ağartmayı önler ve pozlama süresi, sinyali aşırı doygunlaştırmadan temel yeşil sinyalin görselleştirilmesi için uygun olsun, genellikle 300-500 ms arasında.
   NOT: Tekrarlanabilirliği ve boya yükünü sağlamak için hücre tabakasını niteliksel olarak analiz edin; Çoğu hücre aynı parlaklığı göstermelidir. Sınırlı ölü hücrelerin olduğu görüş alanlarına odaklanın; bu hücreler herhangi bir uyarıcı eklenmeden önce yoğun şekilde floreslenir. Göreli başlangıç floresans yoğunluğu Fiji kullanılarak ölçülebilir (adım 7.9). Eğer boya eşit şekilde yüklenmişse, hücreler arasındaki temel floresans varyasyonu %10-15 civarında olmalıdır (adım 7.9).
5. Hoechst nükleer lekesini, DAPI (405 nm) LED ile tanımlayın. LED gücü %2-5 arasında olmalı, pozlama süresi ise 50-100 ms arasında olmalı.
   NOT: Hücreler odaktaysa, çekirdekler keskin konturlarla görünmelidir. Çekirdeklerin yeşil kanala müdahale edebileceği için nükleer sinyalin doygunluğa ulaşmadığından emin olun.

4. Canlı kalsiyum videosu elde etmek

1. Canlı videoyu her 5 saniyede bir (0.2 fps) aralık kullanarak 10 dakika boyunca başlatın.
   NOT: Her karede her floresan kanalı (DAPI 405 nm ve GFP 475 nm) yakalayın.
2. Video başladıktan sonra, agonistler eklemeden önce 5 dakikalık bir temel ölçüme izin verin.
3. Bir P200 pipeti kullanılarak, kalsiyum tamponunda 100 μL 2.5 mM probenecid içeren kuyuya 3x ara stokta 50 μL hapsigargin ekleyin (adım 2.1). İlacın eşit şekilde dağıldığından emin olmak için kuyu içinde 1-2 kez nazikçe tekrar süsle alın. Thapsigargin eklendikten sonra 5 dakika okumaya devam edin.
   NOT: İlaç ekleme adımı kritiktir; Pipet ucu plakaya temas etmemeli, odak düzlemini kaydırmak için. Bunun yerine, pipet ucunu sadece kuyu içindeki tampona temas edecek şekilde havada kaldırın. İlaçlar çok şiddetli karıştırılırsa, hücreler plakadan ayrılabilir ve sinyali etkileyebilir.
   NOT: İlacın eklendiği çerçeveyi takip analizi için not edin.
4. Videoyu ve deneyden önce çekilen fotoğrafı kaydedin. Veri analizine geçin.

5. Birincil hava yolu hücrelerinin Cal 520 veya Fluo-4 ile yüklenmesi protokolü

1. Deney günü, trans kuyunun bazolateral ortamını çıkarır ve insertin apikal ve bazolateral taraflarını 750 μL bazolateral ve 300 μL kalsiyum tamponunun apikal apikalları ile iki kez yıkayın (adım 2.1).
2. Hücreleri, 600 μL bazolateral ve 200 μL apikal Cal-520 veya Fluo-4 boyalarıyla 1 saat boyunca 37 °C ve %5_CO2 ile kuluçka yapın. Boyayı Calu-3 hücrelerinde olduğu gibi hazırlayın; Cal-520, 3 μM Cal-520, 2.5 mM probenecid ve 1:5000 Hoechst kalsiyum tamponunda (adım 2.1). Fluo-4 için 3 μM Fluo-4, 2.5 mM probenecid ve aynı kalsiyum tamponunda 1:5000 Hoechst bulunur.
3. Kuluçka döneminde, 3× ara stokta hapsigargin hazırlanarak nihai konsantrasyon 2 μM (6 μM ara stok) elde edilir.
4. Bunun ardından, boya aspirasyonu alın ve hücreleri 300 μL apikal ve 750 μL bazolateral tampon kalsiyum içeren tampon ile iki kez yıkayın (adım 2.1).
5. Yıkamaların ardından, kalsiyum tamponunda 100 μL apikal ve 500 μL bazolateral 2.5 mM probenecid eklenin (adım 2.1).
6. Transmanı plakanın içinde iyi tutarak, plakayı folyoya sar. Hücreler artık görüntülemeye hazır.

6. Birincil burun girişleri için mikroskopi kurulumu

1. Görüntüleme, cımbız ve ince maskeleme bandı için uygun cam tabanlı bir Petri kabı edinin. Petri kabının temiz olduğundan emin olun, hızlıca %70 etanol ile silin ve tamamen kurumasına izin verin.
2. Cam tabanlı Petri kabını, epifloresans mikroskobu için küçük dairesel adaptörün içine yerleştirin.
3. Cimset kullanarak, iç kısmı dikkatlice cam tabanlı kabın ortasına yerleştirin.
   NOT: Tamponu dökmemeye dikkat edin; tampon insertin apikal bölmesine yerleştirilir.
4. İlaç eklemeleri sırasında insert hareket etmemesini sağlamak için, plastiğin üst kısmını cam taban kabinin yanlarına sabitlemek için maskeleme bandı kullanın.
5. Inserti bağlı olan adaptörü mikroskobin sahnesine yerleştirin ve 10x hava parlak alanı hedefiyle hücrelere odaklanarak başlayın.
6. GFP (475nm LED) kullanarak kalsiyum boya sinyalini belirleyin. LED gücünün %5-10 arasında olduğundan emin olun ki foto ağartmayı önler ve pozlama süresi, temel yeşil sinyalin aşırı doygunluk olmadan görselleştirilmesi için uygun olur, genellikle 300-500 ms arasındadır.
   NOT: Doğru kalsiyum boyası yüklemesini sağlamak için lütfen 3.4. adım altındaki NOT'a bakınız.
7. Hoechst nükleer lekesini, DAPI (405 nm) LED ile tanımlayın. LED gücü %2-5 arasında olmalı, pozlama süresi ise 50-100 ms arasında olmalı.
   NOT: Hücreler odaktaysa, çekirdekler net ve belirgin konturlarla görünmelidir. En apikal hücre tabakasına odaklanın. Mikroskobun z eksenini ayarlayarak hücrelerin keskin odak halinde kaldığı en yüksek odak düzlemini belirleyin. Çekirdeklerin sinyal doygunluğuna ulaşmadığından emin olun, çünkü nükleer sinyal yeşil kanala müdahale edebilir.
8. Canlı kalsiyum videosunu elde etmek için 5.1-5.4 numaralı adımları izleyin. İlaç ekleme aşamasında, insertin ortasına ekleyin ve P200 pipeti kullanarak yavaşça tekrar süzülün.
   NOT: İlacın eklendiği çerçeveyi takip analizi için not edin.

7. Fiji yazılımı kullanılarak analiz

1. Fiji uygulamasını açın ve Dosya \ Aç seçeneğini seçin, video dosyasını yükleyin ve ortaya çıkan açılır pencerede tüm varsayılan ayarları koruyun.
2. İstenerse, Görüntü \ Parlaklık/Kontrast Ayarları altında, hücrelerin en optimal görüşünü sağlamak için ayrı floresan kanallarının parlaklık ve kontrastını değiştirin.
3. Hücre izlemeyi kolaylaştırmak için, Image \ Colour \ Merge Channels kullanarak nükleer boyama veya parlak alan kanallarını birleştirin ve açılır pencerede her kanal için uygun dosyaları seçin.
4. Hücre sınırları ve nükleer boyaya göre belirli hücreleri izlemek için Analyze \ Tools \ ROI Manager programını kullanın ve ortaya çıkan açılır pencerede hem hepsini göster hem de etiketleri işaretleyin.
5. Serbest el seçimi aracıyla dikkatlice hücreleri takip edin ve t'ye basarak bir hücre ekleyin.
   NOT: Videonun tüm 4 köşesinde ve ortasında hücrelerin izlendiğinden emin olun.
6. Tüm hücreler doğru şekilde izlendikten sonra, tüm ROI'ların olduğu açık sekmede, More \ Multi Measure seçeneğine tıklayın ve ortaya çıkan açılır pencerede OK tuşuna basın.
7. Ortaya çıkan açılır pencerede Sonuçlar adlı tüm sayfayı bir excel dosyasına kopyalayın.
   NOT: Ortaya çıkan sayfada, her ROI için 6 alt başlık (Area1, Mean1, Min1, Max1, IntDen1, RawIntDen1) bulunur ve her birinin ardından, takip edilen ilgili hücreye karşılık gelen sayısal bir değer bulunur. Aşağı akış analizi için önemli değer, her yatırım getirisi için ortalamadır.
8. Floresans yoğunluğu arasındaki değişimi izlemek için, her hücre için başlangıç dönemindeki ortalama floresansı hesaplayın ve yüzde varyansı hesaplayın. Deneyler genellikle %20-30 arasında varyans gösterir.
   
9. Tüm ölçümleri, izlenen her hücre için ortalama yoğunluk değerlerini, ilk ölçüme göre bığal değerlere bölerek normalleştirin.
10. Saniye cinsinden zaman için ek bir sütun oluşturun; ilk kare 0 kareye karşılık gelir ve sonraki zaman noktaları 5 artar ve bu da 0.2 fps aralığına karşılık gelir.
11. Verileri bir analiz ve grafik yazılımına kopyalayın ve zaman içinde temel çizgi üzerinde floresans değişimine dair bir eğri oluşturun.
    NOT: Tek hücreli maksimum grafikler oluşturmak için, Excel'deki =MAX() fonksiyonunu kullanarak her hücre için maksimum floresans yoğunluğuna ulaşılan çerçeveyi bulup GraphPad Prizması ile çizim yapın.

8. Kalsiyum Paketi kullanılarak analiz

1. Fiji kullanırken video dosyasını açın ve 8.1 ile 8.2 adımlarını izleyin.
2. Nükleer ve yeşil kanallar izleme için optimize edildikten sonra, Görüntü \ Kopyala' seçeneğine tıklayarak videonun tek bir karesini çoğaltın. Ortaya çıkan açılır pencerede, Duplicate Hyper stack seçimini kaldırın. Aynı açılır pencere içinde, kanallar altında, tip 1. Onu PNG görüntü dosyası olarak kaydet.
3. 9.2. adımı ve alt kanalları tekrarlayın, tip 2.
   İki görüntüyü 8.3. adımı takip ederek birleştirin. Görüntüyü Cell-Pose GUI'ye (Grafik Kullanıcı Arayüzü) yükleyerek bir hücre maskesi oluşturun.
4. Görüntüyü Hücre pozu arayüzüne yükleyin ve Cyto3 modelini seçerek nükleer boyama (Kanal 1) ve sitoplazmik boyamalar (Kanal 2) kullanarak segment yapın.
5. Görseli PNG dosyası olarak kaydedin, sonra Fiji'de PNG dosyasını açın ve TIFF dosyasına dönüştürün.
   NOT: Hücre pozu arayüzü siyah-beyaz bir PNG dosyası üretir.
6. Kalsiyum Süit'te hem maske dosyasını hem de video dosyasını sürükleyip bırakarak açın, ardından Verileri Analiz Et'e tıklayarak indirilebilir bir grafik ve yazılım tarafından sayılan tüm hücreler için normalize ve ham yoğunluk değerlerini içeren indirilebilir bir .csv dosyası oluşturulur.

Sonuçlar

Canlı hücrelerde kalsiyum mobilizasyonunu ölçmek için Calu-3 hücreleri veya farklılaşmış birincil burun kültürleri hücre içi bir boya ile inkubasyon edilir. Kalsiyuma bağlı sinyaldeki göreli değişim, kalsiyumun hücre içi kalsiyum depolarından veya hücre dışı boşluktan sitozole hareket eden bir artış olarak ölçülür. Sitozole kalsiyumun sürekli artışı, ER'de yerleşik SERCA (Sarco/Endoplasmic Reticulus Kalsiyum ATPaz) proteininin iyi karakterize edilmiş geri dönüşü olmayan inhibitörü olan t...

Tartışma

Bu makale, canlı birincil burun ve bronşiyal kültürlerde tek hücreli kalsiyum sinyalini analiz etmek için yöntemler ve kararlı bir epitel hücre hattı sunmuştur. Cal-520 ve Fluo-4 kalsiyum raporlayıcıları her iki kurulumda da faydalı kalsiyum göstergeleridir. Cal-520, 0.75 kuantum verimiyle Fluo-4'nin 0.16'ya kıyasla daha yüksek kuantum verimine sahip olduğu için daha hassattır (Cal-520'nin Kd'si 320 nM, Fluo-4 ise 345 nM'dir). Ayrıca, Cal-520'nin Fluo-4^22'ye kıyas...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
24-kuyulu plaka	Thermofisher	142475
24-kuyuklu transwell insertleri	Corning	CLS3470-48EA
96 kuyuyla Düz Şeffaf Taban Siyah Polistiren TC ile işlenmiş Mikroplakalar	Corning	3603
Cal-520	AAT Bioquest	21130	Aliquote ve -20° derecesinde saklanıyor; C, DMSO'da çözüldü
Kalsiyum Paketi Yazılımı	Kodu, laboratuvar ekibimizle iletişime geçerek talep edilebilir
EMEM, 1x	Wisent	320-005-CL	4° derecede depolanmıştır; C
Fetal Sığır Serumu & nbsp;	Wisent	080-450	Aliquote ve -20° derecesinde saklanıyor; C
Fluo-4	AAT Bioquest	20550	Aliquote ve -20° derecesinde saklanıyor; C, DMSO'da çözüldü
HEPES	Bioshop	HEP001.5	Oda Sıcaklığında Depolanır
Hoechst	Thermofisher	H3570	4° derecede depolanmıştır; C
İnsan Epitelyal Kolorektal Adeonkarsinom Hücre Hattı	ATCC	HTB-55
Magnezyum klorür ve nbsp;	Sigma	7786-30-3	Oda Sıcaklığında Depolanır
mikro çanak 35mm, düşük cam taban	Ibidi	80137	Oda Sıcaklığında Depolanıyor
Penisillin-Streptomisin Çözeltisi	Wisent	450-200-EL	4° derecede depolanmıştır; C
Fosfat-tamponlu tuzlu (PBS)	Wisent	3111-010-CL	Oda Sıcaklığında Depolanıyor
Potasyum Klorür	Sigma	7447-40-7	Oda Sıcaklığında Depolanıyor
Probenecid	Termobalıkçı	P36400	Aliquote ve -20° derecesinde saklanıyor; C , suda çözünebiliyor ve nbsp;
Sodyum Klorür	Bioshop	SOD004	Oda Sıcaklığında Depolanıyor
Thapsigargin	Termobalıkçı	T7458	Aliquote ve -20° derecesinde saklanıyor; C DMSO 'de çözüldü;
TripLE Express Enzimi (1X), fenol kırmızısı	Termobalıkçı	12605010	4° derecede depolanmıştır; C