Bu protokol, pediatrik kanser hücrelerinin yenidoğan farelere damar içi iletini göstererek, erken yaşamda kansere karşı bağışıklık yanıtlarının kesin ve tekrarlanabilir modellenmesini mümkün kılar. Bu yöntem, yenidoğan döneminde uygulandığında immünomodülasyon veya terapi gibi müdahalelerin etkisinin değerlendirilmesini sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kanser Hücrelerine Karşı Erken Yaşamda Bağışıklık Aktivitelerinin Değerlendirilmesi İçin Yenidoğan Damar Nakli Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Tüm pediatrik kanserlerin yarısından fazlası rahimde başlar ve açık hastalık ilerlemesi yenidoğan dönemi boyunca devam eder. İmmünoterapiler artık kanserli birçok çocuk için yeni tedavi seçenekleri sunsa da, erken yaşamdaki bağışıklığın kanser ilerlemesini ve tedavi yanıtını nasıl etkilediği hâlâ tam olarak anlaşılmamaktadır. Bu boşluğu kapatmak, bağışıklık yanıtlarının geç çocukluk ve yetişkinlikten temel ölçüde farklı olduğu yenidoğan döneminde terapötik müdahalelerin değerlendirilmesini gerektirir.
Burada, erken yaşam bağışıklık modülasyonunun pediatrik kanserler üzerindeki etkisini araştırmak için biyolüminesans in vivo görüntüleme ile entegre edilen bir yenidoğan nakli modelini tanımlıyoruz.
İki rahim başlatılan kanserden türetilen lusiferaz etiketli hücrelerin temporal damar enjeksiyonu, 1–2 günlük singeneik alıcılarda tekrarlanabilir tümör nakleti sağladı; prosedürle ilgili ölüm olmadı ve biyolüminesans görüntüleme ile doğrulanan yüksek prosedür başarısı oldu. Enfeksiyon kaynaklı bağışıklık modülasyonunu deneysel bir değişken olarak kullanarak, nakildən beş gün sonra mare sitomegalovirüsü ile intraperitoneal enfeksiyonun akut lenfoblastik lösemi (ALL) yükünde belirgin bir azalma sağladığını, ancak nöroblastoma (NB) olmadığını gösteriyoruz. Bu platform, erken yaşamda bağışıklık modülasyonuna verilen yanıttaki kansere özgü farklılıkların incelenmesini sağlar ve erken yaşamda bağışıklık ve kanser etkileşimlerini modellerken tümör bağlamının önemini vurgular.
Bu metodoloji, kanser immünogözetim, enfeksiyon kaynaklı bağışıklık modülasyonu ve terapötik müdahaleyle ilgili yenidoğan bağışıklık mekanizmalarını sorgulamak için çok yönlü ve yüksek tekrarlanabilir bir platform sağlar. ALL ve NB'nin ötesinde, bu yaklaşım ek pediatrik maligniteler ve immünomodülatör stratejilere uyarlanabilir; mekanistik çalışmaları ve erken yaşam kanser müdahalelerinin preklinik değerlendirmesini destekler.
Giriş
İmmünoterapideki son gelişmeler, bazı kanser hastalarının sonuçlarını belirgin şekilde artırdı, ancak küçük çocuklarda en iyi uygulamaları, gelişmekte olan bağışıklık sisteminin kanser hücrelerini nasıl tanımlayıp yok ettiğinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını gerektiriyor. Çocukluk içi kanserlerin yaklaşık %50'si rahimden kaynaklanırken, bunlar arasında B-hücreli akut lenfoblastik lösemi (B-ALL) ve NB de var, ancak artan kanıtlar doğum sonrası olayların hastalık evrimini ve klinik sonuçlarını kritik şekilde etkilediğinigöstermektedir 1,2.
Yenidoğan bağışıklık yanıtları, yetişkinlerinkinden niceliksel ve niteliksel olarakfarklılık gösterir 3. Tam gelişmiş adaptif bağışıklık yoksa, yenidoğanların korunması büyük ölçüde anne antikorlarına ve doğuştan gelen bağışıklık hücrelerine dayanır. Ancak bu doğuştan gelen efektörler, hücre içsel hipo-tepkisi ve immünosupresif yolların artan aktivasyonu nedeniyle yetişkin muadillerine göre işlevsel olarak daha az verimlidir ve yenidoğanlarıenfeksiyona karşı özellikle hassas kılar 4,5,6. Ancak, bu özelliklerin, olgunlaşmamış bağışıklık sisteminin etkili anti-kanser yanıtları oluşturma yeteneği üzerindeki etkisi hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır.
Erken yaşamda anti-kanser bağışıklığının modellemesi, bağışıklık fonksiyonunun sınırlı olduğu kısa doğum döneminde kanser hücrelerinin ve bağışıklık modülatörlerinin veya patojenlerin hassas ve tekrarlanabilir teslimatını gerektirir. Temporal ven enjeksiyonu, bu gereksinimleri en iyi karşılayan ve yüksek prosedürel başarı, düşük ölüm oranı, minimum işlem stresi ve enfeksiyon mücadelesi veya terapötik uygulama gibi ardışık müdahalelerle uyumluluk sağlayan neonatal intravenöz (IV) bir uygulamayöntemidir 7,8,9,10.
Bu çalışmada, daha önce doğrulanmış yenidoğan damardamar doğum tekniklerini ve biolüminesans in vivo görüntülemenin çok yönlülüğünü kullanarak erken yaşam enfeksiyonunun pediatrik kanser hücrelerinin ilerlemesi üzerindeki etkisini incelemek için bir nakil modelini tanımladık. Bu yaklaşım, lusiferaz etiketli B-ALL veya NB hücrelerinin 1–2 günlük yavrulara damar içi iletini ve ardından 7. doğum sonrası günde (P7) mCMV'nin intraperitoneal (ip) fare sitomegalovirüsü (mCMV) ile immün modülasyonu uygulanmasını sağlar. Kanser ilerlemesi enfeksiyondan 10 gün sonra değerlendirildi (P17).
Temporal damara erişim sınırlı bir doğum sonrası pencereyle (P0–P3) sınırlı olsa da, bu yöntem tekrarlanabilirliği ve deneysel kontrolü artırır ve erken yaşamdaki bağışıklık mekanizmalarının kanser immünogözetim, enfeksiyon-kanser etkileşimleri ve immünoterapiye yanıtlar üzerindeki etkisini incelemek için çok yönlü bir platform sunar. Ayrıca, bu yaklaşım nakil edilen hücrelerin verimli şekilde yönlendirilmesini destekler ve böylece mekanik araştırmalar için hastalık modellerinin tekrarlanabilir oluşturulmasını sağlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm prosedürler (Şekil 1), Kanada Hayvan Bakımı Konseyi yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve British Columbia Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi (protokol A23-0169) tarafından onaylandı.
1. Lusiferaz etiketli lökemik hücrelerin oluşumu
- Lökemik Eμ-Ret farelerden Lökemik Hücrelerin İzolasyonu
- Fareleri, %5 izofluran ve 1 L·min-1 oksijen içeren 1 L indüksiyon odasında anestezi edilerek derin bir cerrahi düzlem elde edilene kadar (düz refleks kaybı ve yavaş, düzenli solunum).
- Derin anestezi doğrulandıktan sonra, izoflüranı bırakın ve yüksek akış hızında (standart kademeli yer değiştirme hızının 3–4 katı; örneğin, 10 L odada 6-8 L·min) karbondioksit (CO₂) uygulanır ve hayvan odalar arasında aktarılır. Solunum kesildikten sonra en az 5 dakika CO₂ maruziyetini koruyarak ölümü garanti altına alın.
- Boşaltma ve atık gazları temizlemeden önce odayı açın.
- Kalp atışı ve solunum eksikliği nedeniyle ölümü doğrulayın, ardından kurumsal prosedürlere uygun olarak ikincil fiziksel yöntem olarak servikal dislokasyon uygulanır.
- Karkası biyogüvenlik dolabına aktarın, ölümü yeniden doğrulayın, cinsiyet ve vücut ağırlığını kaydedin ve dış yüzeye %70 etanol püskürtün.
- Orta hat karın kesisi yapın, deri ve periton duvarını yansıtın ve dalağı 5 mL steril PBS'ye kesin.
- Her iki bacaktan tibiae ve femora kesin, fazla dokuyu çıkarın ve dalağı steril koşullarda çıkarın. Dalağı hemen 5 mL steril, buz gibi soğuk Fosfat Tamponlu Tuzlu (PBS) çözeltiye aktararak hücre canlılığını koruyun.
- Dalağı işle.
- Dalak dokusunu 1 mL 1× kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponunda homojenize edin (dalak için 2 mL > 200 mg kullanın). Oda sıcaklığında 2–3 dakika kuluçka yapın.
- Lizizi, 10 mL PBS + %2 fetal sığır serumu (FBS) (FACS tampon) eklenerek söndürün, 40 μm süzgeçten geçirin ve 350 × g'de 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
- Dalak pelletini 5 mL FACS tamponunda yeniden askıya alın.
- Kemik iliği işlenmesi.
- Her iki epifizi de çıkarın ve her kemiği 1 mL FACS tamponu ile 1 mL FACS tamponu ile 15 mL'lik bir tüpe takılan 1 mL iğne ile yüzün.
- Hücre süspansiyonunu santrifüjleyin, süpernatantı atın ve hücreleri 1 mL 1× RBC liz tamponunda yeniden süzülün, RT'de 2 dakika kuluçka yapın, 10 mL FACS tamponu eklenerek söndürülün, 40 μm süzgeçten filtreleyin ve 350 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Süpernatantı atın ve BM pelletini 1 mL FACS tamponunda yukarı ve aşağı pipet ile tekrar askıya alın.
- Girdap nazikçe ve gerekirse 40 μm süzgeçten geçirin.
- 200 μL hücre kültür ortamında (örneğin Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)) %20 FBS ve interleukin-7 (IL-7; 250 pg·mL-1) ile takviye edilmiş 0,5 × 10^6 lökemik hücreyi yeniden süspansiyona alın.
Duraklama Noktası: Hücre süspansiyonlarını boyamadan önce 2 saate kadar buzda tutun.
- Lökemik hücrelerin lentiviral transdüksiyonu:
- Tohum faresi kemik iliği kaynaklı stromal hücreler, transdüksiyondan 24 saat önce 24 kuyu bir plakada 1 × 10^5 hücre ile yapışmaya izin verilmesi ve %70–80 birleşme sağlanması sağlanır.
- Plaka lökemik hücreler (200 μL nihai hacimde 0,5 × 10^6 hücre) doku dışı kültür ile işlenmiş 24 delikli plakada.
- Kendi kendini inaktive eden (SIN) lentiviral vektör ekleyin; bu raporlayıcı, tıklama böceği kırmızısı (CBR) lusiferaz ve geliştirilmiş yeşil floresan protein (eGFP) içeren, bileşen ubiquitin promotoru tarafından yönlendirilmiş, enfeksiyon çokluğu (MOI): 10–20, viral titre≥: 1 × 10^8 TU·mL-1 (mililitre başına birim transdüksiyon) ile birlikte polibren (8 μg·mL-1; Sigma, H9268-5G).
DIKKAT: Polibren yüksek konsantrasyonlarda sitotoksiktir. 8 μg·mL-1'i aşmayın. Lentivirüsle Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) muhafazası altında işlen. - Plakayı parafilm ile mühürleyin ve 1.200 × g'de oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Spinokülasyonun ardından, transdüksiyon edilen lökemik hücreleri stromal monotabakaya aktarın ve 24 saat boyunca 37 °C'de, %5 CO₂ DMEM'de + %20 FBS + IL-7 (250 pg·mL-1) hücre hayatta kalma ve raporlayıcı ekspresyonu desteklemek için kültür yapılabilir.
NOT: Gerekirse 24 saat sonra antibiyotik eklenebilir ancak viral transdüksiyon sırasında kaçınılmalıdır. - 24 saat sonra, yapışmayan lökemik hücreleri toplayın ve steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) ile iki kez yıkayın; 350 × g 4 °C'de 20 dakika boyunca kalıntı virüs ve polibren temizlendi.
- Steril PBS'de hücreleri 1 × 10^7 hücre·mL-1 ile yeniden süspansiyona alın ve nakil için.
Duraklama Noktası: Yıkamadan sonra, hücreler gerekirse nakildən 48 saat öncesine kadar aynı kültür koşullarında tutulabilir.
- Yetişkin NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) farelerine nakil
- Alıcı olarak 4–6 haftalık NSG fareleri kullanın.
- Kuyruk damarlarını genişletmek için ısıtma pedi veya ısı lambası kullanarak 5 dakika fareyi ısıtın.
- Akrilik bir sığınaktıcı kullanarak fareyi sabitleyin.
- 29 gauge insülin şırıngası ile lateral kuyruk damarı aracılığıyla 100 μL steril PBS'ye 1 × 10^6 hücre enjekte edin. Anestezi gerekmiyor (kurumsal yönergeler gerektirmedikçe)
- Kanamayı önlemek için enjeksiyon bölgesine nazik baskı uygulayın.
DIKKAT: Ekstravaziyadan kaçının. Başarılı intravenöz enjeksiyon görünür bir şişlik yaratmaz. - Fareleri haftada iki kez hastalık gelişimi için izleyin.
- GFP+ lökemik hücrelerin sıralanması
- Hastalık başladığında, lökemik NSG farelerinden BM veya dalak alın.
- Yukarıda açıklandığı gibi tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.
- Vitability boyası (7-AAD) ile boyama hücreleri.
- GFP+ lökemik hücreleri ayırmak için Floresans-Aktiflenmiş Hücre Ayırma (FACS) kullanın.
- Sıralama için yüksek hızlı hücre sortucu kullanın ve ileri saçılma (FSC) ile yan saçılma (SSC) arasındaki kapı stratejisini takip edin → döküntü hariç tutun, FSC-A ile FSC-H → seçilmiş teklereler, canlı hücreler → canlı hücreler için canlılık boya negatif, GFP+ kapı → raporlayıcı-pozitif lökemik hücreleri izole et.
- Sıralanmış hücreleri DMEM + %20 FBS içeren tüplere toplayın. Hedef sıralama sonrası saflık: ≥ %95 GFP+ hücre.
Duraklama Noktası: Sıralanmış hücreler, kriyo-korumadan önce 2 saat buzda tutulabilir.
- Sıralanmış hücrelerin kriyokonservası
- Sıralanmış hücreleri %90 FBS ve %10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren dondurma ortamında 5 × 10^6 hücre/mL olarak yeniden askıya alın.
- Her kriyovial başına 1 mL aliquot yapın ve şişeleri izopropanol bazlı dondurma kabına koyun, gece boyunca −80 °C'de (12–18 saat) depolayın.
- Şişeleri uzun süreli depolama için sıvı azot (LN₂) ile aktarın.
DIKKAT: DMSO toksiktir ve cilt yoluyla kolayca emilebilir. Eldivenle tutun ve hızlı çalışın.
Duraklama Noktası: Hücreler, yenidoğan nakil deneylerinde kullanılana kadar sıvı azotta uzun süre depolanabilir.
2. Lusiferaz etiketli NB hücrelerinin üretimi
NOT: TH-MYCN transgenik farelerde spontan NB tümörleri gelişir ve onaylı kurumsal hayvan bakım protokolleri altında tutulmuştur. Kullanılan lentiviral vektör, Bölüm 1.2'de tanımlananla aynıdır.
- Tümör Hasatı' ve Doku Dissosiyasyonu
- Tümör taşıyan TH-MYCN farelerini onaylanmış hayvan bakım yönergelerine göre ötenazi yapın.
- Steril koşullarda deri altı veya karın NB tümörleri alın.
- Tümör dokusunu tartın ve steril makasla ~1–2 mm boyutunda parçalara doğran.
- Doku, DMEM, Deoksiribonukleaz I (DNaz I; 50–100 U·mL-1) ve kollagenaz bazlı enzim karışımından (10 μg·mL-1 nihai konsantrasyon) oluşan 15 mL konik bir tüpte 0,5 g tümör dokusu başına yaklaşık 5 mL sindirim tamponuna aktarın.
- 37 °C'de, 150 rpm'de sallanan kuluçka makinesinde, 30 dakika boyunca kuluçka yapın.
DIKKAT: Enzimatik sindirim reaktifleri cilt ve göz tahrişine neden olabilir. Eldiven ve göz koruyucu takın. - Sindirimden sonra dokunun daha fazla ayrışması için nazikçe yukarı aşağı pipetleyin. 70 μm'lik hücre süzgecinden süspansiyonu yeni bir tüpe filtreleyin.
- Oda sıcaklığında (20–22 °C) 300 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Süpernatantı atıp DMEM'deki 10% FBS takviyesi olan tekrar süzülme pelletini kullanın.
- Daha önce Bölüm 1.1'de açıklandığı gibi RBS lizin tamponu kullanılarak RBC lizisi yapılacaktır.
- 300 × g 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve 10 mL yüksek glukozlu DMEM'de pelleti %10 FBS ve 50 μM 2-merkaptoetanol takviyesi ile yeniden süzüldürün.
DIKKAT: 2-merkaptoetanol toksik ve uçucudur. Kimyasal bir buhar kapanağında işlem yapın.
Duraklama Noktası: Hücreler transdüksiyondan önce 1 saate kadar buzda tutulabilir.
- Lentiviral Transdüksiyon
- Pellet 2 × 10^6 NB hücresi 300 × g 5 dakika boyunca ve süpernatantı tamamen çıkarın.
- Hücre peletini doğrudan 14 μL konsantre lentiviral vektörde (Bölüm 1.2'de tanımlanan aynı vektör; viral ≥titre 1 × 1 10^8 TU·mL-1, yaklaşık MOI: 10–20) içine yeniden süspansiyona alın.
- Hücre-virüs karışımını nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde (% CO₂) 37 °C'de 5 dakika kuluçka edin.
- 200 μL yüksek glikozlu DMEM + %10 FBS ekleyin ve 37 °C, %5 CO₂ sıcaklıkta 2 saat kuluçkaya devam edin.
DIKKAT: Lentiviral vektörler BSL 2 koşulları altında ele alınmalıdır. - Transdüksiyon edilen hücreleri yüksek glikozlu DMEM ile dört kez yıkayarak kalıntı virüs çıkarın.
- Trypan mavisi dışlanmasıyla canlı hücreleri say.
ÖNEMLİ: Erken jelleşmeyi önlemek için matris hazırlığını her zaman buz üzerinde tutun.
- NSG farelerine deri altı implantasyonu
- Hücreleri 100 μL'de 5 × 10^6 hücre ile soğuk bazal membran matris hazırlığında (büyüme faktörü ile ekstraselüler matriks) yeniden süzülür.
- 6–8 haftalık NSG farelerini (bkz. Bölüm 1.1) inhalasyon izofluran (%2–3 oksijen) kullanarak anestezi edin.
- Yük hücresi-matris karışımını, 27 kalibre iğneyle donatılmış önceden soğutulmuş 1 mL bir şırıngaya dönüştürür.
- 100 μL toplam hacimde 5 × 10^6 hücreyi yan bölgeye deri altı olarak enjekte edin.
- Anesteziden tam iyileşmeye kadar fareleri izleyin.
NOT: Matriks ile karıştırdıktan hemen sonra enjekte edin, böylece şırınganın içinde katılaşmayı önleyin. - Tümörlerin ~1 cm çapında büyümesine izin verin.
- Hücre sıralaması
- Tümörleri toplayarak Bölüm 2.1–2.2'de açıklandığı gibi tek hücreli süspansiyonlar üretin.
- Lüsiferaz etiketli hücreleri, GFP ekspresyonu temelinde FACS ile zenginleştirin, Bölüm 1.4'te tanımlanan kapı stratejisini izlemek.
- %95 GFP pozitif saflık elde etmek için iki ardışık sıralama ≥turu yapın.
- Kriyokonserasyon
- Kriyopreserve sıralanmış hücreleri Bölüm 1.5'te tarif edildiği şekilde kullanır.
Duraklama Noktası: Hücreler, gelecekteki nakil deneyleri için sıvı azotta uzun süre depolanabilir.
- Kriyopreserve sıralanmış hücreleri Bölüm 1.5'te tarif edildiği şekilde kullanır.
3. Hücre süspansiyonunu temporal ven enjeksiyonu için hazırlayın
- Kriyokonseriflenen lusiferaz etiketli lökemik hücreleri veya NB hücrelerini 37 °C'lik su banyosunda küçük bir buz kristali kalana kadar hızla çözebilirsiniz.
- Hemen şişenin dışını %70 etanol ile dezenfekte edin, ardından içeriği 15 mL konik bir tüpte 9 mL önceden ısıtılmış DMEM + %10 FBS ortamına aktarın.
- 300 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın, süpernatantı aspirasyon edin ve pelleti steril, buz gibi soğuk PBS ile yeniden askıya alın.
- Tripan mavisi dışlama ve hemositometre (veya otomatik hücre sayacı) kullanarak kullanılabilirliği belirleyin. Sadece %80 kullanılabilirliğe sahip süspansiyonlar ≥.
- Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek kümeleri çıkarın.
DIKKAT: Hücre kümeleri başarısız enjeksiyonları ve doku hasarını artırır. - Konsantrasyonu ayarlayarak her yenidoğan için 1 × 10^4 lökemik hücre içeren 20 μL (lökemik nakil için) veya 5 × 10^4 NB hücresi (NB nakli için) hazırlanın.
- Hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun ve şırıngayı yüklemeden hemen önce nazikçe karıştırarak homojenliği koruyun.
Duraklama Noktası: Hücreleri enjeksiyondan önce 2 saate kadar buzda tutun, eğer canlılık %80 ≥ kalıyorsa.
4. Temporal ven enjeksiyonu (P1–P2 yavrular)
NOT: Neonatal temporal ven enjeksiyonu anestezi olmadan yapılabilir. Ancak, kısa süreli hipotermik immobilizasyon genellikle hareketi azaltmak ve enjeksiyon doğruluğunu artırmak için kullanılır. Hipotermik immobilizasyon kullanımı bazı kurumsal hayvan bakım komiteleri tarafından izin verilmez - araştırmacılar bu işlemi uygulamadan önce ilgili kurum komiteleriyle görüşmelidir. Kurumunuz tarafından onaylanırsa, aşağıdaki adımlar hipotermik immobilizasyon için geçerlidir.
- Steril bir peçeteyle kaplı küçük bir kap hazırlayın ve buzun üzerine koyarak önceden soğutun.
- Yerleştirme yavruları (doğum sonrası 1–2. gün; P1–P2) kap içindeki peçetede hipotermik immobilizasyon için 2–3 dakika boyunca kalın, ardından spontan hareket belirgin şekilde azalır.
ÖNEMLİ: Yavru köpeklerin doğrudan buzla temas etmesine izin vermeyin (her zaman kap ve peçete bariyerini kullanın). - Hücre süspansiyonundan 60 μL 100 μL cam şırıngaya yükleyin ve 30 gauge bir iğne takın. Süspansiyonu tekrar tüpün içine atarak şırınganın ve iğnenin ölü hacmini doldurun. Ölü hacim açıktıktan sonra, enjeksiyon için 20 μL hücre süspansiyonu aspire edilir ve hava kabarcıklarının olmadığından emin olur. Lökemik ve NB hücrelerinin alıcıları olarak BALB/c ve TH-MYCN fareleri kullanılır.
- Bir pleksiglas platformun altına soğuk bir ışık kaynağı yerleştirerek transaydınlatmalı bir sahne hazırlayın.
- Enjeksiyon bölgesini görselleştirmek için büyütücü gözlük takın (veya stereomikroskop kullanın).
- Sahneye ortasında delik bulunan steril bir peçete yerleştirin ve yavruyu temporal damarın görünür şekilde konumlandırın.
- İğne sırasında iğneyi stabilize etmek için yavrunun başının yanına küçük bir model parçası (oyun hamuru) yerleştirin.
- İğne kenarını görünür temporal ven içine yerleştirin ve hücre süspansiyonunu yavaşça enjekte edin, damar dolgusu gözlemlenerek başarılı intravenöz doğumu doğrulayın.
- Enjeksiyondan sonra, steril pamuklu çubukla enjeksiyon bölgesine hafifçe baskı uygulayın. Yavruyu, normal hareket ve pembe renk geri dönene kadar yaklaşık 37 °C sıcaklıkta, örneğin düşük sıcaklıkta havlu bariyeriyle ısıtılmış bir iyileşme yüzeyine yerleştirin.
- Yavruyu iyileşmeden sonra 5–10 dakika boyunca izleyin, ardından barajın yanına geri gönderin.
DIKKAT: İyileşme sırasında aşırı ısınmaktan kaçının. Bir bariyer katmanı kullanın ve sürekli izleyin. - Şırıngayı hemen PBS ile durulayın, ardından bir şırınga temizleme solüsyonuyla duru ve %70 etanol ile bitirin.
5. Virüs hazırlığı ve enfeksiyon
- BSL-2 muhafazası altında fare sitomegalovirüsü (mCMV) içeren tüm prosedürleri kurumsal biyogüvenlik ve hayvan bakım onaylarına uygun olarak gerçekleştirmek.
- Virüs stoklarını sertifikalı Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde tutmak ve hayvan enfeksiyonlarını belirlenmiş BSL-2 prosedür alanlarında gerçekleştirmek.
- Virüs hazırlama ve işleme işlemini sertifikalı Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirin ve hayvan enfeksiyonlarını belirlenmiş BSL-2 prosedür alanlarında gerçekleştirin.
- Uygun PPE'leri giyin; laboratuvar önlüğü veya tek kullanımlık önlük, eldiven ve göz koruması dahil. Virüs içeren tüm malzemeleri (şırıngalar, yatak takımları, kafesler ve yüzeyler) potansiyel olarak bulaşıcı olarak değerlendirin.
- Keskin maddelerin kullanımını en aza indirin ve iğneleri hemen onaylı biyolojik tehlike keskin kaplara atın. Kullanım sonrası çalışma yüzeylerini ve ekipmanlarını dezinfekte edin. Tüm katı ve sıvı atıkları kurumsal prosedürlere uygun olarak biyolojik tehlikeli atık olarak bertaraf etmelidir.
- P7 seviyesinde (lökemik hücre naklinden 5–6 gün sonra) fareleri enfekte edin.
- Bir virüs alikotunu buz üzerinde erit, nazikçe ters çevirerek karıştır ve hazırlık sırasında buzda kalın. Tekrarlayan donma–erime döngülerinden kaçının (tek kullanımlık aliquotlar kullanın).
- 2 × 10^5 plak oluşum birimi (PFU)/mL içinde mCMV hazırlanır ve 30 gauge iğne ile 50 μL PBS'de 1 × 10^4 PFU ile intraperitoneal (i.p.) yavrular enjekte edilir. Karın organlarını önlemek için karın alt sağ kvadrantına sığ bir açıyla enjeksiyon yapın.
DIKKAT: mCMV bulaşıcıdır (BSL-2). Uygun muhafaza ve dekontaminasyon kullanın. - Hayvan kimliği, yaşı, deney grubu, virüs dozu, hacim ve enjeksiyon detaylarını kaydedin.
6. Biyolüminesans görüntüleme (BLI)
NOT: Aşağıda açıklandığı gibi P7 (hücre enjeksiyonundan 5–6 gün sonra ve enfeksiyondan önce) ve P17 (enfeksiyondan 10 gün sonra) seviyesinde BLI uygulanır.
- D-Luciferin'i PBS'de 10 μg·μL-1'de çöz. 0.22 μm filtre (aliquot) ile filtre sterilizasyonu yapın ve ışıktan korunarak −20 °C'de saklayın.
DIKKAT: D-luciferin ışığa duyarlıdır. Hazırlık ve kullanım sırasında ışığa en az maruz kalmayı unutmayın. - 30 gauge iğne ile her yavru başına 50 μL D-luciferin i.p. enjekte edin.
- Yavrular oksijende izofluran (indüksiyon %1,5–2 %1,5–2) ile anestezi yapın. Isıtılmış görüntüleme aşamasında vücut sıcaklığını korumak (yaklaşık 37 °C).
DIKKAT: İzofluran uçucu bir anesteziktir. Onaylı bir buharlaştırıcı ve temizlik sistemi kullanın. - Anestezi altındaki yavrular küçük hayvan görüntüleme sistemine yerleştirilin (cihaz detayları Materyal Tablosu'nda verilmiştir).
- D-luciferin enjeksiyonundan 10 dakika sonra tutarlı pozlama ayarlarıyla biyolüminesans ve X-ışını görüntüleri alın (BLI ayarları: P7 görüntüleri için pozlama süresi 120 s, P17 için 30 s, P7 için B4 bin, P17 görüntüleri için B4 binelemesi, görüş alanı (FOV) 25, f-stop 1.2, nesne yüksekliği 1.5 ve X-ışını ayarları: çözünürlük yüksek, güç yüksek).
Duraklatma Noktası: Görüntü dosyalarını hemen görüntü aldıktan sonra depola; analiz daha sonra tamamlanabilir. - Uygun BLI görüntüleme yazılımı kullanarak görüntüleri analiz edin; her farenin tüm gövdesini kapsayan ilgi alanları (ROI) tanımlayın ve yayılan ışığı foton·s⁻1·cm⁻2·sr⁻1 olarak niceliklendirin.
- Aşağı yönlü istatistiksel analiz için nicelleştirilmiş yatırım getirisi değerleri ihracatı yapıldı.
7. Hücre nakliyle yapılan farelerden lökemik hücrelerin toplanması
- Lökemik hücreleri toplap Bölüm 1.1'de açıklandığı gibi tek hücreli süspansiyonlar üretin.
8. Akış sitometrisi boyama ve elde etme
- Hücreleri ve santrifüj süspansiyonlarını 300 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca sayın ve FACS tamponunda 1 × 10^7 hücre·mL-1 ile tekrar süzülün.
- 100 μL (1 × 10^6 hücre) polistiren akış sitometri tüplerine aktarın.
- Fc reseptör bloke edici antikor (anti-CD16/32; tüp başına 1 μL) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
- FACS tamponunda antikor master karışımı hazırlayın ve her tüpte CD19-FITC, BP1-PE, B220-APC ve soy negatif belirteçleri (TER119-PerCP, CD3-PerCP, CD11b-PerCP) her antikordan 100 μL FACS tamponunda 1 μL her antikoru ekleyin.
- Oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika kuluçka yapın.
- 5 mL FACS tamponu, santrifüj ile yıkayabilir ve 7-AAD (3 μL) içeren 200 μL FACS tamponunda ve sayma boncukları (6 μL; 6.000 boncuk) ile yeniden süzülür.
- Antikor yakalama boncukları veya hücreleri kullanarak tek boyalı telafi kontrolleri hazırlayın ve deneysel örneklerle birlikte kontrol edinin.
- Standart FITC/PE/APC/PerCP dedektör ayarları ve orta akış hızı kullanarak akış sitometresinde örnekler alın. 1.000 boncuk toplanana kadar etkinlikleri toplayın.
- FCS dosyalarını dışa aktarın ve akış sitometrisi analiz yazılımı ( Materyaller Tablosu'nda listelenmiş) kullanılarak yerleşik kapı stratejisini kullanarak analiz edin (Şekil 2D).
- Dalak veya kemik iliği başına mutlak hücre sayılarını, 1.000 boncukta elde edilen hedef olay sayısını 6 ölçeklendirme faktörü (6.000 boncuk eklenmiş) ile çarparak ve boyalanan hücrelerin oranına göre (1 × 10^6 hücre) toplam organ hücreliliğine normalleştirerek hesaplayın.
9. Grafiklerin çizilmesi ve istatistiksel analiz
NOT: BLI ve akış sitometrisi verileri için istatistiksel yazılım paketi (Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir) kullanarak grafikler oluşturun ve istatistiksel analizler yapın.
- Verileri ortalama ± ortalama standart hatası (SEM) olarak sunun.
NOT: Bu çalışmadan hiçbir hayvan hariç tutulmadı. - BLI için, PBS ve mCMV gruplarını P7 ve P17'de ayrı ayrı karşılaştırın, eşleştirilmemiş Mann–Whitney testleri kullanılarak, zaman noktaları arasında birden fazla karşılaştırma için Holm–Šídák düzeltmesi uygulanmıştır.
- İki kuyruklu eşleşmesiz bir Mann–Whitney testi kullanarak akış sitometrisi sonuçlarını analiz edin.
- İstatistiksel anlamlılığı p < 0.05 olarak tanımlayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Temporal ven enjeksiyonu, lösemi ve nöroblastoma hücrelerinin verimli bir şekilde yenidoğan nakletini sağlar
Erken yaşam enfeksiyonunun pediatrik kanser ilerlemesi üzerindeki etkisini modellemek için, lökemik yetişkin Eμ-Ret farelerinden veya ölen Th-Mycn farelerinden türetilen NB hücrelerinden türetilen lusiferaz etiketli B-ALL hücreleri, temporal ven yoluyla 1–2 günlük senjenik yavrulara damar yoluyla iletildi. Hem lösemi (Şekil 2A, n =...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Erken yaşamda bağışıklık gelişiminin kanser ilerlemesini nasıl etkilediğini anlamak, yaşa uygun immünomodülatör stratejiler tasarlamak için gereklidir. Bu çalışmada, doğum sonrası bağışıklık olgunluğunun kritik bir döneminde kanser hücre nakletinin ve bağışıklık modülasyonunun hassas zamansal kontrolü sağlayan tekrarlanabilir bir yenidoğan nakli platformunu tanımlıyoruz. Temporal ven aracılı intravenöz teslimatı BLI ile birleştirerek, bu model, erken yaşam enfeksiyonunun farklı hastalık ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nden G.S.D.R.'ye (MOP-126122) verilen işletme hibeleriyle desteklendi. A.F., Michael Cuccione Çocukluk Kanseri Araştırma Programı (MC3RP) Doktora Sonrası Bursu aldı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 100µL, Mikrolitre Şırınga, Luer Uç | Hamilton | 80601 | - |
| 30 G İğne | BD | 305106 | - |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | - |
| Ami-X görüntüleme sistemi | Spectral Instruments Imaging | - | - |
| anti-fare B220- APC | Biolegend | 103212 | - |
| anti-fare CD19-FITC | Biolegend | 152404 | - |
| anti-fare CD3ε- PerCP | Biolegend | 100326 | - |
| anti-fare Ly-51-PE | Biolegend | 108308 | Ayrıca BP1 olarak da bilinir |
| anti-fare TER119- PerCP | Biolegend | 116226 | - |
| anti-fare/insan CD11b- PerCP | Biolegend | 101230 | - |
| Aura yazılımı | Spectral Instruments Imaging | - | sürüm 4.0.8 |
| BD Accuri C6 | BD | - | - |
| BD Fortessa X-20 | BD | - | - |
| Temizlik solüsyonu | Hamilton | 18310 | - |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 2770930 | 6 µL'de 6000 boncuk içerir |
| D-Luciferin | GoldBio | eLUCK-1G | - |
| DMEM | Gibco | 11965092 | - |
| DNase I | Sigma | 1.13E+10 | - |
| Falcon 40µm Hücre Süzgeci, Mavi, Steril, Bireysel Paketlenmiş | FALCON | 352340 | - |
| FBS | Gibco | A5256701 | - |
| FlowJo yazılımı | BD | - | v10.8 |
| GeltrexTM | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | - |
| GraphPad Prism yazılımı | Dotmatics | - | v10.4.1 |
| LE.5209 Soğuk ışık kaynağı | Euromex | - | - |
| Liberase™ TM Araştırma Sınıfı | Sigma | 5.4E+09 | - |
| NSG fareleri | Jackson Labrotary | 5557 | NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ |
| Polybrene | Sigma | H9268-5G | - |
| Saflaştırılmış anti-fare CD16/32 Antikoru | Biolegend | 101301 | - |
| RBC Lizis Tamponu (10X) | Biolegend | 420301 | - |
Kaynaklar
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat Rev Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Hwee, J., et al. A systematic review and meta-analysis of the association between childhood infections and the risk of childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 118 (1), 127(2018).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
- Tsafaras, G. P., Ntontsi, P., Xanthou, G. Advantages and Limitations of the Neonatal Immune System. Front Pediatr. 8, 5(2020).
- Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune Responses in Neonates. Expert Rev Clin Immunol. 10 (9), 1171-1184 (2014).
- Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat Rev Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous Injections in Neonatal Mice. J Vis Exp. (93), e52037(2014).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread Gene Delivery and Structure-Specific Patterns of Expression in the Brain after Intraventricular Injections of Neonatal Mice with an Adeno-Associated Virus Vector. J Virol. 75 (24), 12382-12392 (2001).
- Wasala, L. P., Hakim, C. H., Yue, Y., Yang, N. N., Duan, D. Systemic Delivery of Adeno-Associated Viral Vectors in Mice and Dogs. Methods Mol Biol. 1937, 281-294 (2019).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice. J Vis Exp. (56), e2968(2011).
- Farrokhi, A., et al. Early-life infection depletes preleukemic cells in model of hyperdiploid B-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 144 (8), 809-821 (2024).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim. 40 (5), 155-160 (2011).
- Pavathuparambil, A. M. N., et al. Facial vein injection of human cells in severe combined immunodeficiency (SCID) neonatal mice. MethodsX. 5, 1281-1286 (2018).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
