Yöntem makalesi

Farelerde Servikal Lenfatik Damarların Kasılması ve Lenf Akışının In vivo İki Foton Görüntülemesi için Tekrarlanabilir Kurulum

DOI:

10.3791/69482

⸱

10 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Saratov State University, 2Institute of Physics, Department of Optics and Biophotonics, Saratov State University, 3Department of Computer Science and Information Technology, Saratov State University, 4, Res Inst Intelligent Complex Syst, Fudan University, 5Potsdam Institute for Climate Impact Research

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El yazması, servikal lenfatik damarların (cLV) çeşitli fizyolojik fonksiyonlarını ve beyin drenajı ile klirens mekanizmalarının modülasyonuna yönelik terapötik stratejileri test etmek için farelerde servikal lenfatik damarların ve lenf akışının in vivo çalışması için yenilikçi bir yöntem sunmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cLV'lerin kasılması, lenf akışının itici gücü ve beyin toksin temizliğinin temel mekanizmasıdır. Burada, cLV'lerin kasılmalarının in vivo iki foton görüntülemesi ve farelerde cLV'lerde limfa akışıyla kırmızı kan hücrelerinin çıkarılmasının uzun vadeli gözlemi için yenilikçi bir yöntem sunuyoruz. Kurulumun bileşenleri arasında, fare boynuna uyarlanmış mini ısıtma pedi bulunur; bu da görüntüleme süresini 5 saate kadar uzatmanıza olanak tanırken, cLV kasılmasını ve lenf akışını korur; nem kontrolü; koruyucu bir kılıf; ve cLV'lerin kararlı optik görselleştirmesini sağlayan bir konumlandırma sistemi. Bu yöntem, diğer iki foton mikroskop türleri ile geniş bir hedef yelpazesiyle tekrarlanabilirlik ve uyumluluk sağlar; yüksek kaliteli görüntüleri 500 μm'e kadar derinliğe kadar tutar. Protokol, fizyolojik ortamın korunması için cLV'lerin cerrahi hazırlıklarının ayrıntılı aşamalarını içerir ve normal cLV kasılmasını sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Servikal lenfatik damarların (cLV) kasılması, beyin drenajında ve dokularının metabolitler ve toksinlerden lenfatik temizlenmesindeönemli bir rol oynar 1,2,3. CLV'lerin bu ana fonksiyonunun azalması, Alzheimer hastalığı, travmatik beyin hasarı ve beyin kanseri gibi birçok beyin hastalığıyla birlikte gelen beyin toksini arınmasının baskılanmasınayol açar 4,5,6,7,8,9. Bu nedenle, cLV kasılmalarının incelenmesi, beyin drenajı ve kalınlansının lenfatik düzenleyici mekanizmalarının modülasyonu için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesindeönemli bir yaklaşımdır 10,11,12.

Bu çalışma, farklı yaş içindeki farelerde cLV kasılması ve lenf akışının gerçek zamanlı iki fotonlu görüntülemesi için yenilikçi bir yöntem sunmaktadır. Kurulumun önemli bileşenleri arasında, hayvanın boynuna takıldığında, koleksiyoncu lenfatik damarların kasılma aktivitesini ve lenf akışının stabilitesini korurken 5 saate kadar uzun görüntüleme süresi sağlayan mikro ısıtma pedi bulunur.

Kan dolaşım sisteminin farklı olarak, belirli bir hızda (arteriollarda 10 mm/s'den insanlarda sagital sinüste 13 cm/s) hareket eden kanla dolu olmasının farklı olarak, lenfatik damarların lenf ile doldurulması, boş lenfatik damarlar arasındaki artan basınç gradyanı ile metabolizma sırasında oluşan interstisiel sıvı hacmine bağlıdır13, 14,15,16,17,18,19. Aynı zamanda, lenf damarlarındaki lenf akışı aralıklıdır ve 0 ile 1 mm/sarasında değişir 20,21,22. İnsanlarda yapılan son MRI çalışmaları, meningeal lenfatik damarlarda (MLV'ler) lenf akışının 1-3 mm23 olduğunu göstermiştir. Ancak, tek bir kişide bile MLV'lerde lenf akışının günün farklı saatlerinde değiştiği ve 0'a düşebileceği belirtilmelidir. Bu nedenle, lenfatik damarlarda lenf akışı tutarsızdır çünkü metabolik süreçlerin hızına bağlıdır ve bu dasıcaklık 24'e bağlıdır. Gerçekten de, biyokimyasal reaksiyonun hızı derin ve doğrudan sıcaklıktan etkilenir; bu nedenle lenfatik damar spontan kasılmaları üzerinde de önemli bir etki yaratabilir ve böylece lenf drenajını ve taşınımınıdeğiştirebilir 24,25,26.

Bu nedenle, vücut sıcaklığının korunması, lenfatik damarların fizyolojik ortamının normal kasılma ve lenf akışını desteklemesi için önemli bir koşuldur. Ancak, ticari olarak bulunan ısıtma plakalarının kullanımı, cLV'lerin bulunduğu boyun bölgelerinde gerekli sıcaklığın korunmasını sağlamaz. Bu özellikle, cLV kasılmaları ve lenf akışının iki fotonlu görüntülemesi için önemlidir; çünkü bu yöntem, 19 °C ortam sıcaklığında soğuk deney odalarında yapılır ve bu optikteknik için gereklidir 27.

Bu bağlamda, in vivo çalışmaların ezici çoğunluğunda, ticari ısıtma plakaları kullanılarak lenfatik toplama damarlarının kasılması 3-5 dakika ile sınırlıdır (maksimum etki genellikle birkaç saniye içindegözlemlenir: 3,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37),38, bundan sonra lenfatik dolgu ve kontraktilitesi azalır. Bu yaklaşım, lenfatik damar fizyolojisinin gözlem süresini önemli ölçüde sınırlandırır ve onların kasılma ve lenf akışı üzerindeki uzun vadeli etkileri değerlendirmeyi imkansız kılar; bu da fare boynuna uyarlanmış mini bir ısıtma pedi geliştirmemizi teşvik etti; böylece cLV kasılma ve stabil lenf akışını koruyarak görüntüleme süresini 5 saate kadar uzatmayı hedefledik.

Kurulumun bir diğer bileşeni, cLV'lerin suya batırılmadan sabit görselleştirmesini ve uzun çalışma mesafesi hava daldırma lensleri 0,17 mm kapak camı için düzeltilmiş yüksek çözünürlüklü görüntüler MRD70270 MRD70170 in korunmasını sağlayan nem kontrolü ve konumlandırma sistemine sahip koruyucu kılıftır.

Önerilen yöntem, çevresel özellikleri (sıcaklık/nem kontrolü ve lensle çalışma mesafesi) dikkate alınarak diğer iki foton mikroskop türleri ile tekrarlanabilirlik ve uyumluluk sağlar; aynı zamanda 500 μm'ye kadar derinlik ve zaman aralığında (5 saate kadar) yüksek kaliteli görüntüler elde eder; bu da farelerde cLV'lerin daralma ve lenf akışının uzun vadeli analizini yüksek kalitede mümkün kılmaktadır.

Baroreseptörlerin bulunduğu karotis arterinin bifurkasyonuna yakın anatomik konumunun dikkate alınması önemlidir. Baroreseptörler üzerindeki mekanik etki, kan basıncının ve kalp atış hızının dengesizleşmesine yol açar. Bu, hidrostatik basınçta önemli değişikliklere ve bunun sonucunda lenfakışının 39 bozulmasına neden olabilir. Bu nedenle, önerilen yöntem, yakındaki karotis arterinin bifurkasyonuna mekanik etki ve kan basıncındaki değişiklikleri önlemek için derin boyun bölgesinde cLV'lerin nazikçe izole edilmesi için cerrahi protokolün ayrıntılı bir açıklamasını içerir; bu değişiklikler beyinde lenf akışının bozulmasına ve dolayısıyla cLV'lerde lenf akışının ve kasılmalarının bozulmasına yol açabilir.

Sonuçlar, farelerde cLV kasılmasında yaşa bağlı azalmayı ve terapötik foto-uyarıcı etkilere duyarlılığını göstermektedir. Ayrıca, uzun süreli gözlemde (5 saatten fazla) ilk kez, cLV'lerin sağ lateral ventrikülden kırmızı kan hücrelerinin alınması için tünel görevi gördüğünü açıkça gösterdik; bu da beyin toksini temizleme 1,2,3 için önemli bir lenfatik yoldur. Genel olarak, cLV kasılması ve lenf akışının in vivo iki fotonlu görüntüleme yöntemi, cLV'lerin çeşitli fizyolojik işlevlerinin preklinik çalışmaları için tasarlanmıştır; bunlar arasında beyin drenajı ve kölüsünün düzenlenmesi, beyinden metabolit ve toksinlerin alınması ve cLV fizyolojisinin modülasyonu için yeni terapötik teknolojilerin test edilmesi de amaçlanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm prosedürler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi, Bilimsel Amaçlarla Kullanılan Hayvanların Korunması Direktifi 2010/63/EU ve Rusya Federasyonu Bilim ve Yüksek Eğitim Bakanlığı'nın (13.11.1984 tarihli 742 sayılı yönergeleri) doğrultusunda gerçekleştirilmiştir; bu kılavuzlar Saratov Devlet Üniversitesi Biyoetik Komisyonu tarafından onaylanmış (Protokol No. 7, 22.09.2022).

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm materyallerle ilgili detaylar için Materyaller Tablosu'na bakabilirsiniz.

1. Fare tamiri için teknik cihaz

  1. Çelik optik ray kullanın (SOR, uzunluğu 270 mm, genişliği 43 mm; Şekil 1A) kurulumun temeli olarak kullanıldı.
  2. SOR'un üzerine birbirinden 175 mm mesafede iki direk tutucu (3PH-25) takın (Şekil 1B). Montaj direklerini (3MP, çapı 12 mm) 3PH-25'in içine yerleştirin ve ardından M6 vidasını sıkıca sabitleyin (Şekil 1C).
  3. Direk tasmasını (3 kişi) her iki montaj direğine (3MP; Şekil 1D). Servikal lenfatik damarın optik izlemesi sırasında kateterin sabit salin solüsiyle sabit bir şekilde fiksasyonu için bir post-yaka gereklidir.
    NOT: Bu, cerrahi işlemler sonrası biriken kanı almak için çalışma alanının periyodik olarak temizlenmesi için gereklidir; bu da optik izlemeyi zorlaştırabilir.
  4. Dik açılı sabit direk kelepçesini (3RPC-12) 3MP montaj direklerinden birine takın ve M6 vidasını sıkıca sabitleyin (Şekil 1H).
    1. Montaj direğini (çapı 12 mm) 3RPC-12'nin yan deliğine yerleştirin (Şekil 2B).
      NOT: Montaj direği, suya batırılmayan iki fotonlu lens için koruyucu kapağın sonrasında sabitlenmesi için gereklidir.
    2. 3D yazıcıda bastırılmış tutacağı yan montaj direğine takın ve iki çift M3 vida ile sıkıca sabitleyin (Şekil 2C).
    3. UV ile kürlenebilen yapıştırıcı kullanılarak, 3D yazıcıda basılan koruyucu kasanın alt kısmına 12 mm çapında bir kapak camı takın (Şekil 2D,F). Bundan sonra, koruyucu kapağı tutucuya takmak için M4 vidalı somun çiftini kullanın (Şekil 2).
  5. Dikey hareket için hassas pantograf tablosunu SOR tabanına iki masa klipsi (3TC5) ve M6 vida, somun ve albay setleri kullanarak takın (Şekil 1F).
  6. Masanın üzerine 3D baskılı bir kutu (155 mm uzunluğunda, 110 mm genişliğinde) yerleştirin; bu kutu tuzlu çözeltinin birikmesi için bir rezervuar olarak kullanılır (Şekil 1G).

2. Isıtma elementi

  1. Çevresel cihazların montajı.
    1. Isıtma elemanı 1'e olan kabloların bağlantı noktasını ince bir silikon tabakası ile kaplayın (Şekil 3). Sıcaklık sensörü 1'i matın yerine sabitleyin ve silikonla kapatın (Şekil 3B).
    2. Isıtma elemanının ve sıcaklık sensörlerinin tellerini çok telli bir kabloya lehimleyin, bağlantı noktasını silikon ile doldurun ve daraltma sargısı ile kapatın (Şekil 3).
    3. Isıtma elemanı 2 ve sıcaklık sensörü 2'yi köpük ruloya yerleştirin (Şekil 4).
  2. Kontrol ünitesinin montajı
    NOT: Kontrol https://disk.yandex.ru/d/06BURfMlQpl0Jg kutusunu yazdırmak için dosyaları indirmek için bağlantı.
    1. Kontrol ünitesinin kutusunu bir 3D yazıcıya yazdırın (Şekil 5B).
    2. Güç kablosunu ve güç düğmesini kasanın duvarlarına bağlamak için konnektörleri Şekil 5C,D'de gösterildiği gibi tamir edin.
  3. Kutu içine 24 V DC güç kaynağı, bir DC step-down dönüştürücü ve 2 MOSFET modülü takın (Şekil 5A,G,H,I).
  4. Devreyi monte etmek için şu adımları takip edin (Şekil 6).
    1. Step-down dönüştürücüyü kaynağa bağlayın ve voltajı 9 V'a ayarlayın (Şekil 6).
    2. Arduino UNO'nun VIN pinini dönüşümün OUT+ konnektörüne, GND'yi ise OUT konnektörüne bağlayın (Şekil 6).
    3. Güç kaynağındaki V+ pinini sırasıyla MOSFET modüllerindeki VIN+ pinlerine, V pinini ise VIN pinlerine bağlayın (Şekil 6).
    4. Isıtma elemanı 1'deki V pin+'ı sırasıyla modül MOSFET 1'deki VOUT+ ile ve V- ile VOUT'a bağlayın (Şekil 6).
    5. Isıtma elemanı 2 ve MOSFET 2 için bu adımları tekrarlayın (Şekil 6).
    6. MOSFET 1 ve 2 modülündeki GND pinini Arduino UNO'daki GND'ye, PWM MOSFET 1'i Arduino UNO'daki D11 konnektörüne ve PWM MOSFET 2'yi sırasıyla D10 konnektörüne bağlayın (Şekil 6).
    7. Sıcaklık sensörü 1'in VIN pinini Arduino UNO'daki GND konnektörüne, VIN+ cihazını Arduino UNO'daki 5V konnektöre ve SIG D3'e bağayın (Şekil 6).
    8. Arduino UNO'da sıcaklık sensörü 2'nin SIG konmasını A1'e bağlayın, GND sensörünü Arduino UNO'daki GND'ye ve ayrıca 100 kΩ çekme direncini de bağlayın (Şekil 6).
  5. Arduino UNO'yu ve kapak gövdesindeki klavye ekranını düzeltin (Şekil 7I).

3. Sıcaklık kontrol yazılımı rehberi

  1. Arduino taslağını (.ino dosyası) indirin ve Arduino geliştirme ortamında (IDE sürümü: 2.3.5-nightly-20241212) açın.
  2. Doğru COM portunu seçin ve firmware'i indirin. Arayüzde iki düğme bulunur. Aralarında hareket etmek için sol ve sağ tuşları kullanın (Şekil 7B,D). Seçim göstergesi sütunun solunda yer alır (Şekil 7F).
  3. Sıcaklık seçim alanı ekranın sol sütununda yer alır (Şekil 7H). Ayarlamak için Yukarı ve Aşağı düğmelerini kullanın (Şekil 7C).
  4. START/kapatma alanı ekranın sağ sütununda yer alır (Şekil 7G). Bu sütunu seçmek için klavyede Sağ tuşuna basın, ardından Seç tuşuna basın (Şekil 7A). Süreç çalışırken, etkinlik göstergesi yanıp sönür ve RUN butonundaki etiket KAPALI olur.

4. Teknik cihazda hayvanın sabitlenmesi

NOT: Deneyler erkek BALB/c fareleri üzerinde (25-28 g, 2, 18 ve 24 aylık) gerçekleştirildi; Her grupta 7 hayvan vardı.

  1. Ketamin ve ksilazin karışımı (sırasıyla 100 mg/kg; 10-156 mg/kg) hazırlanır ve farenin ağırlığına göre intraperitoneal enjeksiyonla enjekte edilir.
  2. Ameliyat sırasında göz küreklerinin kurumasını önlemek için göz kapuklarına göz merhemi uygulayın. Gerekirse bu işlemi tekrarlayın.
  3. Arka bacakları çekme ve kuyruğu çekme refleksleri durduğunda, fareyi sırttaki ısıtma elementine yerleştirin ki karın bölgesine erişim sağlansın.
  4. Kontrol ünitesini bir prize takın (giriş voltaj aralığı 175-240 V AC, frekans aralığı 50-60 Hz, AC akım 1.8A/230 V AC). Cihazın çalışma sıcaklığını 37-38 °C olarak ayarlayın.
  5. Tıbbi bant kullanarak, hayvanı bedeni masanın yüzeyine paralel olacak şekilde sabitleyin ve başı, vücudun sagital eksenine göre açı olarak konumlandırın, böylece boynun sağ veya sol tarafı rulonun üzerinde durur (Şekil 8A).
    NOT: Fare başının bu sabitlenmesi, boynun sağ veya sol tarafının (deneysel koşullara bağlı olarak) mikroskop lensine yaklaşık 5 mm yüksekliğe yükseltilmesi için gereklidir. Böylece, dcLN ve cLV alanı neredeyse trakea ile aynı seviyede olacaktır.
  6. Ligatürü üst kesici dişlerin etrafına sarıp cihazın arkasına takarak hayvanın vücut sıcaklığını tıbbi bant ile koruyun.
  7. Tıraş makinesi kullanarak, saç çizgisinin boyun bölgesindeki kısmını tıraş edin. Tıraş edildikten sonra kalan tüyleri çıkarın, ardından steril alanı korumak için hayvanı kapatın. Cerrahi işlemler ve ardından gelen optik kontrol için, kesik bölgesine deri altına 0,5 - 1 mL lidokain/bupivakain (sırasıyla 1 mg/mL ve 0,25 mg/mL) enjekte edilir.
    1. Birincil dezenfeksiyon için, cildi alkol sürüntüsüyle yağdan arındırın ve kısmen dezenfekte edin, ardından antiseptik tedavi için cilde %0,5 klorheksidin veya %2 iyot solüsyesi uygulanın. Tüm sterilizasyon adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
  8. Düz diseksiyon makası kullanarak, alt çeneden köprücük kemiğine yaklaşık 2 cm uzunluğunda boylamasına kesi yapılarak boyun derisine dermatotomi yapılabilir (Şekil 8B).
  9. Mikrocerrahi kavisli makasla fastsioomi, kıvrımlı cımbız kullanılarak tükürük bezlerini ve boynun yüzeysel kaslarını ayırarak sternocleidomastoid kası açığa çıkarır. Kanamayı önlemek için görünür kan damarlarına zarar vermekten kaçının. Ameliyat bölgesini sürekli olarak tuzlu su solüsyonuyla nemlendirerek aşırı doku hasarını önleyin.
  10. Mikrocerrahi makas kullanarak, sternokleidomastoid kas miyotomisi yapılarak hayvanın trakea ile karotis arteri arasındaki bölgeye erişim sağlanır.
  11. Kaslar ve fasya yayılmaya devam ederek, miyo- ve fasciotomi uygulanarak, derin servikal lenf düğümü ile afferent ve efferent lenf damarlarını 5-7 mm derinlikte konumlandırır (Şekil 8C).

5. Fareyi mikroskop altında sabitlemek

  1. Sabit hayvanla birlikte cihazı mikroskobun hareketli masasına yerleştirin ve M6 vidasını kullanarak sıkıca bağlayın. Bu, hareketli masada kalıcı bir montaj pozisyonu sağlamak için gereklidir.
  2. Kontrol ünitesini bir prize takın (giriş voltaj aralığı 175-240 V AC, frekans aralığı 50-60 Hz, AC akım 1.8A/230 V AC). Cihazın çalışma sıcaklığını 36-37 °C olarak ayarlayın.
  3. Tuzlu su çözeltisiyle doldurulmuş kateteri montaj direğine tıbbi bant ile takın.
  4. Hayvanın başının yan tarafındaki ısıtma elemanının altına 1 cm çapında bir rulo yerleştirerek hareketli mikroskop masasına göre 45° eğim açısı sağlanır. Bu, servikal lenf damarının yatay konuma getirilmesi ve trakea üzerindeki sonraki baskıyı azaltmak için gereklidir.
  5. Sabit kateteri cerrahi işlemlerden sonra boyun bölgesine açık şekilde yerleştirin; böylece hayvanın köprücük kemiklerinin yanına yerleştirilir.
    1. Tuzlu çözelti kaynağını açın, açık boyun bölgesi tamamen tuzlu çözeltiyle dolana kadar bekleyin.
    2. Koruyucu kılıfı, tuzlu çözeltiyle doldurulmuş boyun bölgesinin üzerine indirin; böylece lenf damarının alanı merkezde yer alır ve hayvanın trakeası sıkışmaz (Şekil 9A).
    3. Koruyucu kılıfı takmak için, iki fotonlu mikroskopa bağlı bir dürbün kullanılması önerilir. Koruyucu kılıfı, trakea üzerine basmasın diye yerleştirin. Koruyucu kılıf aşağı indirilirken altında hava kabarcıklarının birikmediğinden emin olun. Koruyucu plakanın boynun üst kaslarında bulunduğundan ve cLV'lere bastırmadığından emin olun; böylece ısıtılan tuzlu su çözeltisi damara akabilir ve cLV'lerin mekanik deformasyonunu önler.
  6. Suya batırılmayan iki fotonlu lensi, bu lensin çalışma mesafesine uygun derinliğe indirin ve ardından servikal lenfatik damarın iki fotonlu görselleştirmesini gerçekleştirin (Şekil 9B).
    NOT: İlk tarama yapılırken, lenfatik damarın tüm uzunluğu boyunca tam bir yapıya sahip olduğundan ve fare nefes alırken hareketli olduğundan emin olmak gerekir. Bu, koruyucu bir kılıf tarafından deforme edilmediği veya sıkışmadığı anlamına gelir.

6. cLV kasılmalarının in vivo iki foton izlemesi

NOT: 2-foton görüntüleri çoklu foton mikroskopu (darbeli lazer, uyarılma dalga boyu 970 nm) kullanılarak alındı. Görüntü 20x (f/0.75) çözünürlükle elde edilmiştir. Her görüntü, 1 görüş alanından oluşuyordu (zoom x 3.0 (212.13 × 212.13 μm), 512 x 512 noktadan oluşuyordu. cLV'lerin görüntüleri, saniyede 30 kare hızında, 1 dakika süren bir video çekimiyle elde edildi. 2-foton görüntüleri, 488 nm dalga boyunda cLV'lerde floresan LYVE-1'in uyarılmasıyla ve 525 nm dalga boyunda yayımı ile bir kanalda elde edildi.

  1. cLV çapı analizi ve otomatik kasılılık değerlendirmesi
    1. İlgi alanındaki cLV'lerin çapını (ROI) 30 dakikalık filmlerle 30 kare/s hızda ve 3x büyütme ile ölçün. Özel bir Python kodu kullanarak, lenf akışı hesaplamasında kullanılan aynı segmentler için cLV çapının zaman profilini ölçün.
    2. СLV'lerin karşı duvarlarına karşılık gelen iki noktayı manuel olarak seçin. Sonraki karelerdeki konumlarını Lucas-Kanade optik akış algoritması (OpenCV'de calcOpticalFlowPyrLK fonksiyonu) kullanarak belirleyin; bu algoritma, ölçümler için alt piksel doğruluğu sağlar. Çapı, izlenen noktalar arasındaki mesafe olarak hesaplayın, pikselden mikrometreye dönüştürülür. Hareket bozukluklarını ortadan kaldırmak için kaydırmalı pencere orta filtresi kullanın. Bir yatırım getirisi için en az 20 çaplı ölçüm olmalıdır.
    3. Darbelerin iç frekansını belirlemek için, çapın düzleştirilmiş zaman serisini kullanın. Sinyalin maksimumunu ve minimumlarını, genlik eşikleri ve zirveler arasındaki minimum mesafeye göre zaman sinyalinin yerel uç noktalarını tanımlayan SciPy kütüphanesinden find_peaks fonksiyonunu otomatik olarak tespit edin.
    4. Ortalama çapın %3'ünden az genlikli ve 2 saniyeden az aralıklı cLV kasılmalarını analizden çıkarın. 30 dakikalık aralıklarla ortalama frekansı dakikadaki kasılma sıklığı olarak hesaplayın.

7. CLV'lerde lenf akışının iki foton analizi

NOT: Lenf akışı analizi, kronik kateter aracılığıyla otolog kanın sağ lateral ventriküle getirilmesinden sonraki 5 saat içinde cLV'lerde kırmızı kan hücrelerinin hareketiyle değerlendirildi.

  1. Fareyi %1 izofluran ile anestezi edin (40'ta yayımlanan protokole bakınız). Kateteri40'ta tanımlanan protokole göre sağ lateral ventriküle implante edin.
  2. Fareyi cLV'lerin iki fotonlu in vivo görüntülemesine hazırlamak, 7.1, 7.3-7.5 adımlarına uygun olarak hazırlanır.
  3. Kuyruk damarından kanı, kan örneği ve enjeksiyon sırasında pıhtılaşmayı önlemek için heparinle önceden yıkama işlemi yapılmış steril mikro-santrifüj tüpünde iğne delmesiyle 10 μL miktarında toplayın.
  4. Sağ lateral ventriküle kan enjekte edin (AP = −0,5 mm; ML= −1,06 mm; DV = 2,5 mm) ile 0,1 μL/dakika hızında mikroenjeksiyon pompası kullanılır.
  5. KLV'lerde kırmızı kan hücresi hareketinin iki fotonlu analizi yapılabilir. 41,22'de yayımlanan protokollerle lenf akış hızını hesaplayın.

8. cLV kasılmalarının fotobiyomodülasyonu

  1. cLV'lerin PBM'si için, daha önce yayınlanan teknoloji veprotokolleri 40'ta kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koruyucu kılıf kullanımı, cerrahi alanın dış ortamdan izole edilmesi gibi, cerrahi alanın dış ortamdan izole edilmesi gibi, in vivo olarak servikal lenfatik damarların uzun vadeli izlenmesi için en önemli avantajlar sağlar; bu da lenf damarı ve çevresindeki dokuların tuzlu çözelti içinde damızlanmasının ve vücuda bağlı bir kateter aracılığıyla sürekli tuzlu çözeltinin tedariki sağlanmasını sağlar. Ayrıca, mikroskop kaydırına bağlanması ve lenf damarını çevreleyen dokularla yakın...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lenfatik damarların fizyolojisinin incelenmesi, normal kasılma ve stabil lenf akışına olanak tanıyan özel çevresel koşulların korunması ile invaziv olmayan yöntemlerin kullanılmasını gerektirir. Lenfatik damarların işlevlerini incelemek için kullanılan yöntemlerin büyük çoğunluğu, kasılmalarının optik izlenmesine ve lenf akış hızınındeğerlendirilmesine dayanmaktadır: 3,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Rusya Bilim Vakfı'ndan (No. 23-75-30001) alınan bir hibe ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3D printerBambu Lab, ChinaP1S
5pin konnektörüConnfly electronic (Zhenqin), ChinaDS1110-01
Isıyla büzüşen tüpler setiJupiter, ChinaJP7230-01
Arduino IDEArduino LLC2.3.5-nightly-20241212
BALB/c fareleri"Andreevka" Branch FSBIS SCBT FMBA, Russia3-15-16Erkek, 6 aylık
ChlorhixedinBIOPHARMACEUTICAL PLANT, RussiaN/A
Dumont forsepsStoelting, USA52100-07
Evans Blue boyaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAN/A
İnce forsepsStoelting, USA52102-02P
HamiltonHamilton Bonaduz AG, Switzerland29 G iğne
Isıtma elemanıChinaLFH-9415sg
İnsülin iğnesiINSUPEN, Italy31G, 0.25mm*6mm
KetamineMOSCOW ENDOCRINE PLANT, FSUE, RussiaGenel anestezi
Tuş takımı Kalkanıdiymore, China1602 LCD Tuş Takımı Kalkanı
LidocainORGANICA, RussiaN/AAğrı kesici ilaç
Kilitlenebilir anahtar düğmesiChinaN/A
Metal-film dirençlerTZT, ChinaN/A
Mikro Diseksiyon Vannas Yaylı MakasStoelting, USA52130-00P
MOSFET ModülüChinaMOSFET Modülü D4184
Montaj direğiStanda, Lithuania3MP, çap 12 mm
Montaj kablosuAB retail, RussiaHB-1
Keskin olmayan cımbızStoelting, USA52108-83P
3D yazıcı için plastikBambu Lab, ChinaA00-D0-1.75-1000-SPL.
Direk boyunluğuStanda, Lithuania3PC
Direk tutucuStanda, Lithuania3PH-25
Güç konnektörüRUICHI, ChinaAC-015
Güç kaynağıSANPU, ChinaPS200-H1V24
Dikey hareket için hassas pantograf masası"Laser components", Russia02TV004
Düz açılı sabit direk kelepçesiStanda, Lithuania3RPC-12
M3 vidaStanda, LithuaniaN/A
M4 vidaStanda, LithuaniaN/A
M6 vidaStanda, LithuaniaN/A
Tıraş makinesiBraun, figure-materials-13310s serisi
Sodyum klorürKraspharma, RussiaN/A
LehimMetal toz üretimi, Russiakalay-kurşun lehim 61
Lehim akısıSolins, RussiaLTI-120 22 ml fırça ile
Lehim istasyonuAOYUE, ChinaN/A
Lehim istasyonuAOYUE, ChinaN/A
Çelik optik raylar (SOR)Standa, LithuaniaN/A
Gerilim düşürücü dönüştürücüRUICHI, ChinaEM-825
Düz diseksiyon makasıStoelting, USA52132-10P
Sıcaklık sensörüLiludin, ChinaDS1820
TetrasiklinJSC Tatkhimfarmpreparaty, RussiaGöz merhemi
KontrolörArduino, ChinaUNO R3
CımbızStoelting, USA52100-03
İki fotonlu mikroskopuNikon, JapanA1R MP
KabloPartner-Electro, RussiaP020G-0305-C050
Xilazin"Alfasan International B.V.", NetherlandsKas gevşetici
KateterScientific Commodities Inc., USAPE-10, 0,28 mm ID × 0,61 mm OD

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, D. Y., et al. Photostimulation of brain lymphatics in male newborn and adult rodents for therapy of intraventricular hemorrhage. Nat Commun. 14 (1), 6104(2023).
  2. Kunert, C., Baish, J. W., Liao, S., Timothy, P. P., Lance, L. M. Mechanobiological oscillators control lymph flow. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 112 (35), 10938-10943 (2015).
  3. Du, T., et al. Restoration of cervical lymphatic vessel function in aging rescues cerebrospinal fluid drainage. Nat Aging. 4 (10), 1418-1431 (2024).
  4. Mesquita, D., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  5. Bolte, A. C., et al. Meningeal lymphatic dysfunction exacerbates traumatic brain injury pathogenesis. Nat Commun. 11, 4524(2020).
  6. Hu, X., et al. Meningeal lymphatic vessels regulate brain tumor drainage and immunity. Cell Res. 30, 229-243 (2020).
  7. Song, E., et al. VEGF-C-driven lymphatic drainage enables immunosurveillance of brain tumours. Nature. 577 (7792), 689-694 (2020).
  8. Chen, J., et al. Meningeal lymphatics clear erythrocytes that arise from subarachnoid hemorrhage. Nat. Commun. 11, 3159(2020).
  9. Liu, X., et al. Subdural haematomas drain into the extracranial lymphatic system through the meningeal lymphatic vessels. Acta Neuropathol Commun. 8, 16(2020).
  10. Li, D. Y., et al. Photostimulation of brain lymphatics in male newborn and adult rodents for therapy of intraventricular hemorrhage. Nat Commun. 14, 6104(2023).
  11. Liu, S., et al. Neuro-lymphaphotonics opens new horizons of the future technologies for the therapy of brain diseases. Theranostics. 16 (2), 776-793 (2025).
  12. Lin, H., et al. Transcranial photobiomodulation for brain diseases: review of animal and human studies including mechanisms and emerging trends. Neurophotonics. 11 (1), 010601(2024).
  13. Bollmann, S., et al. Imaging of the pial arterial vasculature of the human brain in vivo using high-resolution 7T time-of-flight angiography. Elife. 11, e71186(2022).
  14. Jordan, J. E., Pelc, N. J., Enzmann, D. R. Velocity and flow quantitation in the superior sagittal sinus with ungated and cine (gated) phase-contrast MR Imaging. J Magn Reson Imaging. 4 (1), 25-28 (1994).
  15. Negrini, D., Fabbro, M. D. Subatmospheric pressure in the rabbit pleural lymphatic network. J Physiol. 520 (Pt 3), 761-769 (1999).
  16. Negrini, D., Moriondo, A., Mukenge, S. Transmural pressure during cardiogenic oscillations in rodent diaphragmatic lymphatic vessels. Lymphat Res Biol. 2 (2), 69-81 (2004).
  17. Moriondo, A., Mukenge, S., Negrini, D. Transmural pressure in rat initial subpleural lymphatics during spontaneous or mechanical ventilation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289 (1), H263-H269 (2005).
  18. Grimaldi, A., et al. Functional arrangement of rat diaphragmatic initial lymphatic network. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291 (2), H876-H885 (2006).
  19. Gashev, A. A., Zawieja, D. C. Hydrodynamic regulation of lymphatic transport and the impact of aging. Pathophysiology. 17 (4), 277-287 (2010).
  20. Park, J. K., et al. Association of lymphatic flow velocity with surgical outcomes in patients undergoing lymphovenous anastomosis for breast cancer-related lymphedema. Breast Cancer. 29 (5), 835-843 (2022).
  21. Fischer, M., et al. Flow velocity of single lymphatic capillaries in human skin. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 270 (1), H358-H363 (1996).
  22. Dixon, J. B., et al. Lymph flow, shear stress, and lymphocyte velocity in rat mesenteric prenodal lymphatics. Microcirculation. 13 (7), 597-610 (2006).
  23. Kim, J. H., Yoo, R. E., Choi, S. H., Park, S. H. Non-invasive flow mapping of parasagittal meningeal lymphatics using 2D interslice flow saturation MRI. Fluids Barriers CNS. 20 (1), 37(2023).
  24. Solari, E., Marcozzi, C., Negrini, D., Moriondo, A. Temperature-dependent modulation of regional lymphatic contraction frequency and flow. American Journal of Physiology-Heart and Circ Physiol. 313 (5), H879-H889 (2017).
  25. Solari, E., Marcozzi, C., Negrini, D., Moriondo, A. Lymphatic Vessels and Their Surroundings: How Local Physical Factors Affect Lymph Flow. Biology (Basel). 9 (12), 463(2020).
  26. Angeli, V., Lim, H. Y. Biomechanical control of lymphatic vessel physiology and functions. Cell Mol Immunol. 20, 1051-1062 (2023).
  27. Chong, C., et al. In vivo visualization and quantification of collecting lymphatic vessel contractility using near-infrared imaging. Sci Rep. 6, 22930(2016).
  28. Weiler, M., Kassis, T., Dixon, J. B. Sensitivity analysis of near-infrared functional lymphatic imaging. J Biomed Opt. 17 (6), 066019(2012).
  29. Semiachkina-Glushkovskaia, A., et al. NO-ergic mechanisms of age differences in photostimulation of lymphatic drainage, filtration and clearance. Biomed Opt Exp. , In press (2025).
  30. Davis, M. J., et al. Modulation of lymphatic muscle contractility by the neuropeptide substance P. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 295 (2), H587-H597 (2008).
  31. Bell, R. D., et al. iNOS dependent and independent phases of lymph node expansion in mice with TNF-induced inflammatory-erosive arthritis. Arthritis Res Ther. 21 (1), 240(2019).
  32. Bachmann, S., Detmar, M., Proulx, S. Visualization and Measurement of Lymphatic Function In Vivo. Methods Mol Biol. 1846, 197-211 (2018).
  33. Nelson, T. S., et al. Minimally invasive method for determining the effective lymphatic pumping pressure in rats using near-infrared imaging. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (5), R281-R290 (2014).
  34. Proulx, S. T., et al. Use of a PEG-conjugated bright near-infrared dye for functional imaging of rerouting of tumor lymphatic drainage after sentinel lymph node metastasis. Biomaterials. 34 (21), 5128-5137 (2013).
  35. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat Res Biol. 5 (4), 219-231 (2007).
  36. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62 (7), 1881-1889 (2010).
  37. Schmid-Schonbein, G., Zweifach, B. Fluid pump mechanisms in initial lymphatics. News Physiol Sci. 9, 67-71 (1994).
  38. Schmid-Schonbein, G. W. Mechanisms causing initial lymphatics to expand and compress to promote lymph flow. Arch Histol Cytol. 53 (Suppl), 107-114 (1990).
  39. Hughes, G. W., Moore, J. P., Lord, R. N. Barosensory vessel mechanics and the vascular sympathetic baroreflex: Impact on blood pressure homeostasis. Exp Physiol. 108 (10), 1245-1249 (2023).
  40. Blokina, I., et al. Photobiomodulation under Electroencephalographic Controls of Sleep for Stimulation of Lymphatic Removal of Toxins from Mouse Brain. J Vis Exp. (208), e67035(2024).
  41. Dixon, J. B., Zawieja, D. C., Gashev, A. A., Cote, G. L. Measuring microlymphatic flow using fast video microscopy. J Biomed Opt. 10, 064016(2005).
  42. Terskov, A., et al. Age as a limiting factor for effectiveness of photostimulation of brain drainage and cognitive functions. Front Optoelectron. 31 (3), 6(2025).
  43. Blivet, G., Relano-Gines, A., Wachtel, M., Touchon, J. A randomized, double-blind, and sham-controlled trial of an innovative brain-gut photobiomodulation therapy: safety and patient compliance. J Alzheimers Dis. 90 (2), 811-822 (2022).
  44. Herkes, G., et al. A novel transcranial photobiomodulation device to address motor signs of Parkinson's disease: a parallel randomised feasibility study. EClinicalMedicine. 66 (1), 102338(2023).
  45. Bullock-Saxton, J., Lehn, A., Laakso, E. L. Exploring the effect of combined transcranial and intra-oral photobiomodulation therapy over a four-week period on physical and cognitive outcome measures for people with Parkinson's disease: a randomized double-blind placebo-controlled pilot study. J Alzheimers Dis. 83 (4), 1499-1512 (2021).
  46. Lee, T. L., Chan, A. S. Photobiomodulation may enhance cognitive efficiency in older adults: a functional near-infrared spectroscopy study. Front Aging Neurosci. 20 (6), 1-10 (2023).
  47. Cardoso, F. S., et al. Effects of chronic photobiomodulation with transcranial near-infrared laser on brain metabolomics of young and aged rats. Mol Neurobiol. 58 (5), 2256-2268 (2021).
  48. Hosseini, L., et al. Effect of transcranial near-infrared photobiomodulation on cognitive outcomes in D-galactose/AlCl3-induced brain aging in BALB/c mice. Lasers Med Sci. 37 (3), 1787-1798 (2022).
  49. Lutfy, R. H., Essawy, A. E., Mohammed, H. S., Shakweer, M. M., Salam, S. A. Transcranial irradiation mitigates paradoxical sleep deprivation effect in an age-dependent manner: role of BDNF and GLP-1. Neurochem Res. 49 (4), 919-934 (2024).
  50. Bohlen, H. G., Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C. Nitric oxide formation by lymphatic bulb and valves is a major regulatory component of lymphatic pumping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1897-H1906 (2011).
  51. Scallan, J. P., Zawieja, S. D., Castorena-Gonzalez, J. A., Davis, M. D. Lymphatic pumping: mechanics, mechanisms and malfunction. J Physiol. 594 (20), 5749-5768 (2016).
  52. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212 (7), 991-999 (2015).
  53. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

In Vivo G r nt lemeLenfatik KontraktiliteFare ModeliBeyin Toksin TemizlenmesiCerrahi Haz rl kOptik G rselle tirmeG r nt leme Tekrarlanabilirli i

İlgili makaleler