Yöntem makalesi

Kemik Yenilenmesi ve İskelet Performansını Değerlendirmek İçin Multimodal Yaklaşım

330 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69483

⸱

13 Şubat 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Condensed Matter, Applied Physics and Nanoscience, Brazilian Center for Research in Physics, 3Alberto Luiz Coimbra Institute for Graduate Studies and Research in Engineering (COPPE), Federal University of Rio de Janeiro, 4Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM)

Bu makalede

Özet

Kemik yenilenmesini çeşitli hiyerarşik seviyelerde değerlendirmek için bir protokol öneriyoruz. Bu çok modlu yaklaşım, farklı uzunluk ölçeklerinde yapısal analizlere olanak tanır ve örnek hazırlığındaki zorlukları etkili bir şekilde ele alır. Ayrıca, biyomalzemelerin kemik yenilenmesini teşvik etmedeki etkinliğini değerlendirmek için güvenilir bir iş akışı sağlar.

Özet

Bir implantın klinik başarısı büyük ölçüde kemik onarımını teşvik etme ve osteoentegrasyonu kolaylaştırma yeteneğine bağlıdır. Yeni iskelelerin tasarımında önemli ilerlemeler kaydedilmiş olsa da, çeşitli kemik uzunluğu ölçeklerinde implant başarısının kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi yeterince araştırılmamıştır. Kemik, hiyerarşik olarak organize edilmiş bir dokudur ve karmaşık yapısına sahiptir; bu yapı kollajen fibrillerinin organizasyonu ve nanometre ile mikrometre ölçeklerinde mineralizasyonundan, kompakt ve soluklu kemiklerin makroskobik düzenine kadar uzanır. Bu hiyerarşik organizasyon, kemik fonksiyonu ve mekanik performansı sağlamak için kritik öneme sahiptir. Bu bağlamda, implante edilmiş malzemelerin etkinliği ve güvenliğini değerlendirmek için biyomalzemelerin kemik onarımına etkilerinin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi, birden fazla uzunluk ölçeğinde gereklidir. Ancak, entegre multimodal analizler için örneklerin hazırlanması teknik bir zorluk teşkil eder. Bu çalışmada, çeşitli hiyerarşik seviyelerde kemik yenilenmesini değerlendirmek ve yeni oluşan kemik ile implante edilen iskelet arasındaki arayüzü analiz etmek için tasarlanmış bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, kemik onarımını tetiklemedeki iskelelerin etkinliğini değerlendirmek için sağlam bir yöntem sunar. Seçilmiş 3D ve 2D görüntüleme tekniklerinin birleşimi, kemik iyileşme sürecinde oluşan karmaşık mineralize dokunun doğru değerlendirilmesi için çok önemlidir

Giriş

Kemik, karmaşık, hiyerarşik olarak organize edilmiş birdokudur 1,2. Yapısal organizasyonunu anlamak, hücrelerin doku mimarisine nasıl katkıda bulunduğu ve yapısal değişikliklerin mekanik fonksiyonu nasıl etkilediğiyle ilgili temel soruları ele almak için gereklidir3. Bu bağlamda, yaralanma sonrası kemik remodelasyonu araştırmanın merkezi bir konusu olmaya devam etmektedir. Kırık iyileşmesi, karmaşık çok aşamalı bir süreçtir; başlangıçta iltihap yanıtıyla başlar, ardından anjiyogenez ve öncül hücrelerin kondrositler ve osteoblastlaraayrılması gelir 4,5. Biyomalzemelerin osteoentegrasyonu teşvik etme rolüyle ilgili çok fazla tartışma yapılmıştır; özellikle biyouyumluluk ve lifli kapsülasyonu önleme yetenekleri6.

Biyomateryalle uyarılan osteoentegrasyonu değerlendirmek için yaygın olarak benimsenen bir yöntem, hem nicel hem de niteliksel histolojik analizleri mümkün kılan optik mikroskopidir. Bu yaklaşımın, kemik implantlarının başarısını değerlendirmek için güvenilir ve etkili bir yololduğu gösterilmiştir 7,8. Bununla birlikte, kemik hiyerarşik organizasyonuyla ilgili birçok konu, özellikle histolojik yaklaşım tek bir görüntülemeyaklaşımı kullanılarak incelenemez; çünkü histolojik yaklaşım yöntemin büyütme kısıtlaması nedeniyle en azından kısmen sınırlıdır.

Üç boyutlu görüntülemedeki gelişmeler, kemik hiyerarşik organizasyonunu anlamak için hayati öneme sahiptir. Mikrobilgisayarlı tomografi (mikroCT; ya sinkrotron radyasyonu veya geleneksel laboratuvar tabanlı X-ışını kaynakları)9,10,11, çift ışınlı taramalı elektron mikroskopisi (FIB-SEM) gibi teknikler, dilim-görüntü tomografisi 12,13,14 ile ilişkili transmisyon elektrontomografisi 15,16 gibi teknikler, birden fazla ölçekte kemik mimarisi hakkında yeni içgörüler sağlamıştır.

Farklı 3D görüntüleme yaklaşımlarına dayanarak, kemik hiyerarşik organizasyonu modeli önerilmiştir ve başlangıçta dokuz farklı kemik yapısal organizasyon seviyesitanımlanmıştır 1. Bu şema yakın zamanda revize edilmiş ve yaklaşık 12 hiyerarşik düzeyi kapsayacak şekilde genişletilmiş olup, kemik dokusunda yapı ile fonksiyon arasındaki ilişkiyiincelemek için değerli bir referans olarak hizmet vermektedir 2,17. Önemli olarak, önerilen bu hiyerarşik model, yaralanma sonrası kemik onarımının başarısını değerlendirmek için bir temel sağlar. Yenilenmiş kemik dokusunun doğal hiyerarşik yapıyı yeniden üretip üretmediğini değerlendirmek, özellikle hasar alan bölgede biyomalzemeler kullanıldığında, kemik iyileşme kalitesini değerlendirmede önemli bir standarttır.

Kemik organizasyonunu araştırmak için birden fazla görüntüleme tekniğinin kullanımıtartışılsa da, kemik mineral organizasyonunu çoklu mekansal ölçeklerde değerlendirmek için farklı görüntüleme yöntemlerini entegre eden bir iş akışı hakkında çok az şey araştırılmıştır. Daha önce belirtildiği gibi, kemik karmaşık bir bileşik dokudur; organik bir faza (hücreler, kollajen ve makromoleküller) ve mineralize bir matristen oluşur. Örnek hazırlama açısından bu karmaşıklık, numune boyunca çözücü geçirimliliği, sert bir örnekin kesitlenmesi ve aynı örnek üzerinde farklı görüntüleme stratejilerinin entegrasyonu gibi teknik zorluklar yaratır.

Bu çalışmadaki temel yenilik, üç boyutlu görüntüleme ve tamamlayıcı teknikler kullanarak tekrarlanabilir, korelasyon ve çok ölçekli görüntüleme iş akışının oluşturulmasıdır. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, iş akışı aynı örneklemin farklı görüntüleme yöntemleriyle sıralı olarak incelenebileceği şekilde tasarlanmıştır. Bu tekniklerin bazıları yıkıcı veya kesitleme gerektirdiğinden, iş akışı yıkıcı olmayan yöntemlerle başlayan ve kesme veya malzeme çıkarımı içeren yaklaşımlara ilerleyen bir sırayı takip eder.

Bu örnek hazırlama ve analiz iş akışı, kortikal ve trabeküler kemik, implantasyon öncesi iskeleler ve implantasyon sonrası kemik/biyomateryal arayüzünün değerlendirilmesi gibi sert veya mineralize örnekler için geniş çapta uygulanabilir. Farklı görüş alanlarını ve çözünürlük aralıklarını kapsayan görüntüleme modalitelerini birleştirerek (Şekil 1B), iş akışı örneklerin santimetre ölçeğinden mikrometre ve nanometre ölçeklerine kadar analizini mümkün kılar. Dizi, tek bir örnek için korelasyon analizini desteklemek için optimize edilmiş olsa da, her teknik deneysel hedefe göre bağımsız olarak da uygulanabilir. Bu yaklaşım, biyomalzemelerin osteoentegrasyonunun ayrıntılı bir şekilde değerlendirilmesini ve iyileşme alanındaki yenilenmiş kemik büyümesinin değerlendirilmesini sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolde sunulan sonuçlar, önceki bir çalışmada yapılan deneyselbir prosedürden elde edilmiştir 21. Tüm prosedürler, Brezilya'daki Fluminense Federal Üniversitesi'nde Deneysel Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Etik Komitesi'nin etik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir (CEUA/UFF: 779). Kısaca, 300 ile 400 g arasında ağırlığında 20 erkek Wistar sıçan rastgele iki gruba ayrıldı: Sham ve cHA-mikrosfer implantasyonu. Tüm hayvanlar, tibial diafizde 2 mm bir kusur oluşan ameliyat oldu. Sham grubu, kritik olmayan bir kusurda kemik yenilenmesini değerlendirmek için pıhtı kontrolü görevi görürken, deneysel grup defekt bölgesine CHA37 mikroküreleri yerleştirildi. 7 ve 21 gün sonra, hayvanlar aşırı dozda genel anestezi ile ötenazi edildi ve her grup ile zaman noktasından (7 ve 21 gün) tibial kemik blokları toplandı. Kemik kalitesi ve yeni oluşan kemiğin kapsamı optik mikroskopi ve mikroBT ile değerlendirildi.

1. Örnek fiksasyonu ve reçine gömülmesi

  1. Ötenazi sonrası hemen implante edilen biyomateryali içeren tibia'yı çıkarın ve Karnovsky fiksasyon çözeltisi içeren bir şişeye (%2,5 glutaraldehit, %4 formaldehit 0,1 M kakodilat tamponunda) aktarın. Örneği en az 1 gün boyunca -4 °C'de sakla.
    NOT: Sabit malzemeyi buharlı maddelere maruz kalmayı önlemek için bir duman davlumbonu altında hazırlayın ve kullanın. Tüm kimyasal işlemler uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanılarak yapılmalı ve gerektiğinde ek teknik güvenlik önlemleri uygulanmalıdır.
  2. Numuneyi fiksatiften 0.1 M kakodilat tampon içeren bir şişeye aktarın. Örneği nazik bir dönüş altında tutun, tamponu 10 dakikalık aralıklarla 2 kez değiştirin. Bu aşamada, reçine sızmasını kolaylaştırmak için küçük bir testere ile örnek kenarlarını kesin. Numuneyi keser sırasında, kurumasını önlemek için 0.1 M kakodilat tamponunda ıslak tutun.
    NOT: Örneği her zaman örnek hacmünin en az 2 katı olan bir tampon hacminde tutun. Bu protokolde kullanılan tüm çözeltiler ve reçine için bu uygulanmalıdır. Yukarıda bahsedilen kimyasal bileşenleri kullanırken, bir buhar kaputu içinde çalışın ve uygun PPE'leri kullanın. Fiksatif çözeltiyi toplayın ve kakodilat tampon atıklarını açıkça etiketlenmiş, kimyasal olarak uyumlu kaplarda, uygun şekilde takılmış kapaklarda toplayın. Tehlikeli kimyasal atıkların güvenli depolanması ve bertarafı için kurumsal Standart İşletme Prosedürlerini (SOP) takip edin.
  3. Susuz bırakma sürecine artan aseton konsantrasyonları (%10, %30, %50, %70, %90 ve %100) ile başlayın. Örneği her konsantrasyonda 30 dakika boyunca döndürerek tutun. %100 susuz aseton adımını 3 kez tekrarlayın.
    NOT: Aseton ile çalışırken, bir duman kapasonu içinde çalışın ve uygun PPE giyin. Kullandıktan sonra, kalan çözücüleri, düzgün takılmış kapaklı açıkça etiketlenmiş, kimyasal olarak uyumlu atık konteynerlerinde toplayın. Tehlikeli kimyasal atıkların güvenli depolanması ve bertaraf edilmesi için kurumsal SOP'leri takip edin.
  4. Numuneyi bir dizi derecelendirilmiş aseton-reçine oranlarından geçirerek spur reçine ile sızdırın: 2:1, 1:1, 1:2 ve nihayetinde saf reçine. Her adım 12 saat sürmeli ve oda sıcaklığında rotasyon altında yapılmalıdır. Aseton-reçine infiltrasyonundan sonra saf reçineyi 2 kez değiştirin. Son olarak, örneği saf reçine içeren bir kalıba aktarın ve örneği 70 °C'de 24 saat boyunca polimerize edin.
    NOT: Reçine, orta sertlik elde etmek için veri sayfasına göre hazırlanmıştır. Spur reçinesini kullanırken, bir duman kaputu içinde çalışın ve uygun PPE kullanın. Kullanımdan sonra, kalıntıları açıkça etiketlenmiş, kimyasal olarak uyumlu atık konteynerlerinde ve uygun şekilde takılmış kapaklara toplayın. Tehlikeli kimyasal atıkların güvenli depolanması ve bertaraf edilmesi için kurumsal SOP'leri takip edin.

2. Mikrobilgisayarlı X-ışını tomografisi (microCT) kullanılarak örnek görselleştirme

NOT: mikroBT, implant pozisyonunu ve kemik yenilenmesini değerlendirmek için kullanılır. Ayrıca, daha ileri analiz için potansiyel ilgi alanlarını belirlemeye yardımcı olur. Bu adım, örnek reçineye gömülü olarak yapılmalıdır.

  1. Üretici tarafından sağlanan örnek tutucuyu temel olarak kullanın; böylece tarama sırasında hareketi önlemek için numunenin güvenli şekilde konumlandırıldığından emin olun. Destek için polistirol, gazlı bez veya mikrosantrifüj tüpleri gibi düşük yoğunluklu malzemeler kullanılır.
  2. Aşağıdaki optimal tarama parametreleriyle görselleştirin: tüp voltajı/akım = 60 kV/133 mA; açısal adım = 0.33°; ortalama kare = 5; voxel boyutu = 5 μm; dönme modu = 180°. Metalik implant içeren örnekler için 360° dönme ve 0,5 mm alüminyum filtre kullanın.
    NOT: Kemik yenilenmesinde, trabeküler benzeri dokuma kemiğin kalınlığı genellikle geleneksel mikroCT görüntülemenin çözünürlük sınırları içindedir. Trabeküler kemiğin geleneksel morfometrik parametrelerini, örneğin trabeküler kalınlık, ayrım ve sayı gibi doğru şekilde nicelemek için, en küçük voxel boyutu (belirtildiği gibi 5 μm) kullanılması önerilir. İlgi Alanı (ROI) bu nominal çözünürlükte Görüş Alanını (FOV) aşarsa, önce çoklu tarama özelliğini kullanarak ROI'yi kareleyebilir. Eğer yatırım getirisi multiscan ile yakalanmazsa, voxel boyutunu ancak son çare olarak artırmayı düşünün.
  3. Taramadan sonra, ham alım verileri bir dizi numaralı görüntü dosyasından oluşur. Üretici tarafından sağlanan yazılımı kullanarak yeniden yapılandırma işlemini gerçekleştirin; örneğin ilgi alanındaki eserleri en aza indirmeye odaklanın.
    NOT: Görüntülerin sınırları boyunca, özellikle analiz edilmeyen alanlarda görüntü artefaktlarıyla karşılaşmak yaygındır. Son hacim, üreticinin yazılımı kullanılarak bu bölgeleri ortadan kaldırmak için kırpılabilir.
  4. Yeniden oluşturulan hacmi Avizo, VGStudio Max, CTVox ve Dragonfly22 gibi çeşitli 3D görselleştirme yazılım seçenekleriyle analiz edin. Dijital görüntü filtreleri uygulayarak artefaktları kaldırın. Bu durumda, bu amaçla Yerel Olmayan Araç Dengesizleştirmeyöntemini kullanın 19.
    NOT: Yerel olmayan Means Denoising filtre yumuşatma değerleri mümkün olduğunca düşük tutulmalı, arayüzün önemli detaylarını engellememek için.

3. Optik mikroskopi için örnek hazırlama

  1. Deneysel hedefe göre örnek kesim yönünü seçin. Tibia, kemiğin uzun ekseni boyunca enine veya boyuna kesilebilir. Tüm kusur hacmini kapsayan seri kesitler oluşturmak için enine kesitleme kullanın. Uzunlamasına kesitleme, kemik yenilenmesini uzun eksen yönünde değerlendirmek için uygundur. Ancak bu yaklaşım kusurun yalnızca tek bir kesitini sağlar.
    1. Deneysel stratejiyi takip ederek örneği 1 mm dilimlere bölmek için düşük hızlı elmas testere diski kullanın.
      NOT: 0.006 ila 0.012 inç kalınlığında elmas disk kullanılması önerilir. Daha ince bıçaklar, bıçak kalınlığından dolayı minimum malzeme kaybı ile yüksek hassasiyetli kesimler sağlar.
    2. Sıvı rezervuarını, sıvı seviyesi bıçağın alt kenarını kaplayana kadar doldurun.
      NOT: Kemik örnekleri için damıtılmış su uygundur. Ancak, aşırı ısınma bekleniyorsa, örneğin metal implant içeren örneklerde, rezervuarı doldurmak için ekipman üreticisi tarafından sağlanan yağı kullanın.
    3. Örneği numune tutucuya sabitleyin ve alet koluna takın. Numunenin diskin yüzeyine karşı stabil ve yatay olduğundan emin olun. Konumlandırma düğmelerini kullanarak numune kesim bölgesini diske ayarlayın.
    4. Örneği daha yüksek hız ayarlarıyla (210 - 250 RPM) kesmeye başlayın ve örnekte bir girinti oluşana kadar düşük basınç uygulayın. Sonra, hızı (93 - 124 RPM) düşürerek kesitleme sorunsuz tamamlanır ve aşırı titreşimi önler.
    5. Kesim tamamlandıktan hemen sonra testereyi durdurun. Numune orijinal bloktan ayrılır ayrılmaz kesmenin durmasını sağlamak için sistemi doğru şekilde ayarlayın.
  2. Örneği stereomikroskop ile inceleyin. Tüm örneği incelemek için düşük büyütmeden (örneğin 5x-10x) başlayın, ardından bilimsel soruya göre ilgi alanını seçmek için büyütmeyi (örneğin 20x-40x) artırın. Tam büyütme aralığı, kullanılan enstrümana bağlı olarak değişebilir. Bu çalışmada, yeni oluşmuş kemik ile biyomateryal arasında daha yüksek arayüz yoğunluğuna sahip bölgeler daha fazla analiz için seçildi.
  3. İnceltme için numune montajı
    1. Numuneyi, parlatma sırasında doğru tutuşmayı kolaylaştırmak için bir destek üzerine monte edin. Eğer örnek yalnızca optik mikroskopi analizi için tasarlanmışsa, önceden parlatılmış tarafına süper yapıştırıcı kullanarak doğrudan plastik bir kapak kılıfına takın.
      NOT: Plastik kaydıraklar daha iyi yapışma nedeniyle önerilir. Cam sürgüler de kullanılabilir (nötr sabunla kapsamlı yıkamadan sonra). Ancak, cam slaytlar parlatma sırasında numune ayrılma riskini artırır.
    2. Korelasyon yaklaşımıyla daha fazla analiz edilecek örnekler için, iki parçalı alüminyum tüp montajına monte edilin. Bu protokolde, iç 2,5 cm çapında katı silindir ve parlatma sırasında mekanik destek sağlayan dış içi boş silindirden oluşan ev yapımı alüminyum boru montajı geliştirildi. Numune iç katı silindire bağlanır.
    3. İç alüminyum silindiri bir sıcak plakaya yerleştirin ve mumun eritilebileceği bir sıcaklığa (genellikle kullanılan mum türüne bağlı olarak yaklaşık 60-70 °C civarında) ısıtın.
      NOT: Balmumu da uygundur. Montaj mumu kullanırken, bir duman kaputu içinde çalışın ve uygun PPE giyin. Kullanımdan sonra, kalıntıları açıkça etiketlenmiş, kimyasal olarak uyumlu atık konteynerlerinde toplayın; uygun şekilde takılmış kapaklar. Tehlikeli kimyasal atıkların güvenli depolanması ve bertaraf edilmesi için kurumsal SOP'leri takip edin.
    4. Silindirin yüzeyine az miktarda balmumu uygulayın ve tamamen erimesini sağlayın.
    5. Eridikten sonra, ilgilenilen yüzeyi balmumu kaplı yüzeye yerleştirin ve tam temas için nazikçe bastırın.
      NOT: İlgilenecek yüzey, karşı tarafta inceltme yapılması için silindir yüzeyine bakmalıdır. Aşırı mum kullanmaktan kaçının, çünkü bu düzensiz montaja yol açabilir ve parlatma kalitesini etkileyebilir.
    6. Silindiri sıcak plakadan çıkarın ve balmumunun oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.
  4. Parlatma sırasında numune kalınlığının izlenmesi
    1. Parlatma işlemi sırasında örnek kalınlığını izlemek için, düşük ve orta büyütmelerde (örneğin 10x-20x) yansıma mikroskopisi kullanın. Mikroskop kalibrasyonunu ve örnek kalınlığı ölçümünü gösteren bir diyagram Şekil 2'de gösterilmiştir.
    2. Mikroskop Z eksenini standart bir kapak kaydırmasıyla kalibre edin; bu genellikle yaklaşık 150 μm kalınlığındadır. Kapak kağızının bir tarafını kırmızı kalıcı bir işaretleyiciyle, karşı tarafta ise bitişik alanı mavi bir işaretleyiciyle işaretleyin. Kapak kayışını cam bir kaydıra monte edin.
    3. İnce odak düğmesi ve mikrometre ölçeğini kullanarak önce örtü yüzeyinin alt yüzeyine, sonra üst yüzeye odaklanın.
    4. Z-yer değiştirme değerini kaydedin. Bu değer, örtü kayma kalınlığına (yaklaşık 150 μm) karşılık gelir ve referans olarak hizmet verir.
    5. Numuneyi parlarken, örnek kalınlığını alüminyum silindirden çıkarmadan tahmin etmek için periyodik olarak bu Z-ekseni kalibrasyonunu kullanın.
      NOT: Bu teknik, parlatma sırasında hızlı ve zarar verici kalınlık tahminini sağlar. Alternatif olarak, örnek montajdan çıkarılıp dijital kaliper veya mikrometre ile ölçülebilir.
  5. İnceltme ve parlatma
    1. 1200, 2500 ve 4100 kum boyutlarına sahip kaba ve ara parlatma işlemini zımpara ile başlatın. Bu adımın amacı, örnek kalınlığını yaklaşık 0,15 mm'ye düşürürken önemli yüzey düzensizliklerini kaldırmaktır.
    2. 1200 grit zımpara ile başlayın, sonra 2500 grit zımpara ile ilerleyin. Bu süreçte hafif bir baskı uygulayın. Parlatma sırasında yansıtma mikroskopisiyle numune kalınlığını periyodik olarak izleyin.
    3. İstenilen kalınlığa ulaşıldığında, örneğin her iki tarafını 4100 grit zımpara ile parlatın. Parlatma manuel olarak veya düşük dönüş hızına ayarlanmış yarı otomatik bir parlatma makinesiyle yapılabilir. Her parlatma aşamasında numuneyi sürekli olarak damıtılmış suyla iyice temizleyin.
      NOT: Parlatma sırasında örnekleri ve zımpara kağıtlarını ıslak tutmak, ısıyı azaltmaya yardımcı olur ve daha pürüzlü zımpara kağıtlarından kaynaklanan yüzey kirliliğini önler.
    4. Son parlatma için, parlatma diskine monte edilmiş keçe parlatma bezine az miktarda elmas macunu (örneğin 6 μm veya 3 μm) uygulayın. Elmas pastası parçacık boyutunu numunenin yüzey pürüzlülüğüne göre seçin.
      NOT: 6 μm macun ön ince cilalama için uygundurken, 3 μm macun nihai ayna parlatma için önerilir. Mümkün olduğunda, her iki pastayı sıralı kullanmak en iyi sonucu verir. Buna rağmen, yalnızca 6 μm macun kullanılarak tatmin edici bir parlatma sağlanabilir.
    5. Numunenin her iki tarafını minimum basınçla nazikçe parlatın. Mikroskopi incelemelerinden önce numunenin cilalı yüzeyini kurutmak için basınçlı hava veya pamuk kullanın.
    6. Numuneyi silindirden ayırmak için, mumu sıcak bir plaka ile ısıtın ve numunedeki kalıntı mumu susuz asetonla temizleyin.
      NOT: Montaj mumu ve susuz aseton ile çalışırken, bir buhar kaputu içinde çalışın ve uygun PPE'leri kullanın. Kullanımdan sonra, kalıntıları açıkça etiketlenmiş, kimyasal olarak uyumlu atık konteynerlerinde toplayın; uygun şekilde takılmış kapaklar. Tehlikeli kimyasal atıkların güvenli depolanması ve bertaraf edilmesi için kurumsal SOP'leri takip edin.
    7. Numuneyi bir cam slayt ile örtük parçası arasında, montaj ortamı olarak daldırma yağı kullanarak monte edin ve polarize ışık mikroskopisiyle kollajen lifinin yönelimini değerlendirin. Düşük büyütme ile (örneğin, 5x-10x) başlayın ve elektron mikroskopi ile daha fazla araştırma için potansiyel bölgeleri belirlemek için orta büyütmeye (örneğin 20x-40x) yükseltin.
      NOT: Korelasyon iş akışına ve ardından taramalı elektron mikroskopiyle numune analizine devam etmek için numunenin mühürlenmemesi tavsiye edilir.

4. Taramalı elektron mikroskopisi için örnek hazırlama

  1. Numuneyi cam slayttan dikkatlice çıkarın. Kapak kılıfı cam sürgüden pipet ucu ile nazikçe kaydırın. Fazla daldırma yağını çıkarmak için filtre kağıdı kullanın. Numuneyi nötr sabunla yıkayın. Numune kaybını önlemek için yıkamayı küçük bir kapta yapın.
    NOT: Numunede hâlâ kalıntı daldırma yağı varsa, yüzeyi %70 etanol ile hafifçe nemlendirilmiş pamuk çubukla nazikçe temizleyin.
  2. Numuneyi filtre kağıdında hava kurutmaya bırakın. Numuneyi kurutmak için basınçlı hava veya pamuk da kullanılabilir. Tamamen kuruduktan sonra örneği karbon bantla bir kıvılcıma monte edin. Görüntüleme sırasında şarj olmasını önlemek için numuneyi 10 nm bir altın tabakası ile Sputter ile kaplamak.
  3. Örnek çeşitli yöntemlerle incelenmek için çift ışınlı FIB-SEM mikroskobu kullanın.
    1. SEM (taramalı elektron mikroskopisi) modunda, ikincil elektronlar veya geri saçılan elektronlar kullanılarak, optik mikroskopi ile daha önce seçilen bölgelerde örnek morfolojisi, biyomateryal ve yeni oluşan kemik arayüzü değerlendirilir.
    2. Odaklı iyon ışını taramalı elektron mikroskopisi (FIB-SEM) modunda, dilim-görüntü tomografisi yapılabilir.
  4. İkincil elektron dedektörle SEM modunda, daha önce polarize ışık mikroskobu ve SEM ile analiz edilen alanlar seçilerek dilim-görüntü tomografisi alınmasına devam eder.
  5. Endişe edilen özelliklere göre hendek hacmi, piksel boyutu ve dilim kalınlığı parametrelerini ayarlayın. Bizim kurulumuzda, dilim-görüntü tomografisi 15 μm x 10 μm x 10 μm hendek hacmı, 20 nm piksel boyutu ve 60 nm dilim kalınlığı ile yapıldı. Üç boyutta (XYZ) görüntüleme kalitesini artırmak için mümkün olduğunca izometrik voxel boyutu kullanılması önerilir.
    NOT: Bu parametreler, belirli FIB-SEM sistemine bağlı olarak değişebilir. Analitik gereksinimlerinize ve sistemin yeteneklerine göre optimal koşulları belirlemek için ekipman operatörüne danışın.

5. FIB-SEM dilim-görüntü tomografisinin hizalanması, filtre işlemesi ve segmentasyonu

  1. Dilim-görüntü tomografisi, sırayla numaralandırılmış bir dizi görüntü üretir. Hizalama devam etmek için, seri bir MRC dosyasına dönüştürülür; bu dosya genellikle stack olarak adlandırılır.
  2. IMOD yazılımı kullanarak MRC dosya üretimi ve görüntü yığını hizalamasını gerçekleştirin.
    NOT: Avizo ve FIJI/ImageJ gibi diğer yazılımlar da stack hizalama eklentileri sunmaktadır. Detaylı rehberlik için her yazılıma özgü dokümantasyona bakabilirsiniz. Ayrıca, Peddie vediğerlerinin çalışmaları 23. Stack hizalama sırasında benimsenen yaklaşımlara genel bir bakış sunar.
  3. MRC dosyasını oluşturmak için terminal veya komut dicilini açın, görüntü dizisini içeren klasöre gidin ve şu komutu çalıştırın: tif2mrc imagerootfile*.tif stackname.mrc
    1. TIFF formatında olmayan görüntüler için raw2mrc kullanın. 24-bit RGB görüntüleri 8-bit gri tonlamaya dönüştürmek için -g (örneğin, tif2mrc -g) ekleyin. Bu, hesaplama süresini önemli ölçüde azaltacaktır.
  4. Etomo'yu terminalden başlatın ve Seri Bölümleri Hizalama seçeneğini seçin. Yığını hizalamak için diziyi takip edin: (1) Hizalanmamış yığını tek bir kareye yükleyin. (2) Algin sekmesi ile Initial Auto Alignment. (3) Make Aligned Stack ile bir Stack sekmesi oluşturun, ardından hizalanmış yığını açın.
    NOT: Bu süreç, yığın boyutuna ve sistemin performansına bağlı olarak birkaç dakika sürebilir.
  5. Tamamlandıktan sonra sonucu gözden geçirin. Hizalanmış yığın dosyası stackname_ali.mrc olarak adlandırılacaktır.
    NOT: Bu prosedür, yığın hizalama için sistem varsayılan ayarlarını kullanır. Ancak, ilk hizalama ve son yığın üretimiyle ilgili parametreler kullanıcı tercihlerine göre değiştirilebilir. Detaylı rehberlik için IMOD dokümantasyonuna bakınız: https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.
  6. Avizo yazılımı kullanarak ek görüntü filtreleme işlemi yapılabilir. Hizalanmış yığını açın ve sıralı olarak aşağıdaki filtreleri uygulayın: Hızlı Fourier dönüşümü (FFT) filtresi, Sandbox Filter eklentisinde mevcut (dikey şerit yönelimi, tolerans değeri: 2 seçeneğini seçin), Shading düzeltme sihirbazı (maske seçimini görüntünün tüm gölge alanını kapsayacak şekilde ayarlayın, normalizasyon faktörü 100 kullanın), histogram eşitleme (varsayılan yapılandırma) ve Non-local means (değerleri 5'e ayarlayın; 0.1; 10; 3).
    NOT: Eşdeğer filtreler diğer görüntü analiz yazılımlarında da mevcuttur. FIJI/ImageJ'de şu diziyi öneriyoruz: FFT filtresi, Arka Planı Çıkar, Yerel Kontrastı Artır (CLAHE) ve Yerel Olmayan Ortalama filtresi.
  7. Yazılımı kullanarak görüntü segmentasyonu ve 3D render işlemlerine geçin. Manuel segmentasyon ve eşik tabanlı segmentasyon gibi farklı segmentasyon stratejileri mevcuttur. Watershed algoritması gibi ek araçlar, süreci otomatikleştirmeye ve segmentasyon için gereken zamanı azaltmaya yardımcı olabilir.

6. Transmisyon elektron mikroskopisi için örnek hazırlama

  1. Kemik/biyomateryal arayüzünü değerlendirmek için odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskopisi (FIB-SEM) kullanarak lameller hazırlanın.
    NOT: Eğer implante edilen biyomateryal seramik veya metalik değilse, bu çalışmada olduğu gibi, geçirimli elektron mikroskopisi (TEM) için uygun ultra ince kesitler ultramikrotom kullanılarak hazırlanabilir. Ancak, mineralize malzemelerin kesimlendirilmesinin elmas bıçağın ömrünü önemli ölçüde azaltabileceğini belirtmek önemlidir.
  2. Ultra ince bölümleri %5 uranyl asetat içeren sulu çözeltiyle 20 dakika boyandırın.
    NOT: Uranyl asetat kullanırken, bir duman kaputu içinde çalışın ve uygun PPE giyin. Kullanımdan sonra, kalıntı çözücüleri, düzgün takılmış kapaklara sahip, açıkça etiketlenmiş, kimyasal olarak uyumlu atık konteynerlerinde toplayın. Tehlikeli kimyasal atıkların güvenli depolanması ve bertaraf edilmesi için kurumsal SOP'leri takip edin.
  3. Bölümleri TEM kullanarak analiz edin. Kapsamlı bir analiz için, görüntülemeyi seçilmiş alan elektron kırınımı (SAED), enerji dağıtıcı X-ışını spektroskopisi (EDS) ve elektron tomografi ile birleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Reçine gömülü örneklerin ilk analizi mikrobilgisayarlı tomografi (microCT) kullanılarak yapılır. Bu yıkıcı olmayan teknik, tüm kusur alanının 3D görselleştirilmesini kolaylaştırır ve örneğin hem nicel hem de niteliksel analizlerini mümkün kılar. MikroBT görüntülemede kontrast çoğunlukla örnekteki malzemelerin yoğunluk farklılıklarından kaynaklanır. Şekil 1, CHA37 biyomateryaliyle implante edilen bir sıçan tibiasında kritik olmayan bir kusurun mikroBT analizi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kemik mimarisini incelemek ve biyomalzemelerinosteoentegrasyonu indükte değerlendirmek için farklı görüntüleme teknikleri kullanılmıştır 7,21,22,23,24. Bu protokolde, biyomateryal implantasyonu sonrası sıçan tibia defektinde oluşan mineralize kemik dokusunu analiz etmek için X-ışını mikrotomografisi, optik mikroskopi ve elektr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bu makalede bildirilen çalışmayı etkileyebilecek bilinen hiçbir rekabet eden finansal çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, şu Brezilya ajanslarından yazarlara verilen hibelerle desteklendi: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Brezilya) ve Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). Elektron mikroskopi olanakları için LABNANO/CBPF ve CENABIO/UFRJ'ye teşekkür ederiz. Dil iyileştirme ve dilbilgisi revizyonu ChatGPT kullanılarak gerçekleştirildi (OpenAI, GPT-5.1, 2025). Tüm düzenlemeler yazarlar tarafından incelenip doğrulandı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Aseton Merck67-64-1
Alüminyum silindirEv yapımıN/a
Avizo sürüm 2022.1ThermoFisherN/agörüntü filtreleme, segmentasyon ve 3D görselleştirme yazılımı
Kakodil Asit, Sodyum Tuzu, TrihidratTed Pella18851Cacodylate Buffer için toz. 0,2 M stok çözeltisi hazırlayın
Elmas Parlatma Bileşiği 3 & mikro; m boyutuTed Pella895-8
Elmas Parlatma Bileşiği 6 & mikro; m boyutuTed Pella895-9
Elmas Çark x.006South Bay TeknolojisiDWH 3063
Elmas Tekerlek x.012South Bay TeknolojisiDWH 4122
Keçe parlatma beziTed Pella816-20
Düz Gömülü KapsüllerEMS70021
Cam kapak kaymasıKnittelN/a
Cam kaydırağıKnittelN/a
Glutaraldehit, %25 EM kalitesindeTed Pella18426/18427
Altın sputter K550XEMITECHN/a
ImageJUlusal Sağlık Enstitüleri (NIH)görüntü düzenleme, filtreleme, segmentasyon ve 3D görselleştirme için yazılım
IMOD sürüm 5.1Colorado Üniversitesigörüntü düzenleme, segmentasyon ve 3D görselleştirme yazılımı
Lapping e Parlatma MakinesiSouth Bay TeknolojisiModel 910
Düşük Hızlı Elmas Tekerlek Testere South Bay TeknolojisiModel 650
Düşük Viskoziteli Göme KitiEMS14300SPURR reçinesi için bir kit. Veri Sayfası spesifikasyonlarına göre hazırlanın 
Micro-CT Skyscan 1273 BrukerN/a
Mikroskop Jeol 2100F 200kV JeolN/a
Microscope Olympus BX51OlympusN/a
Microscope Tescan Lyra3TescanN/a
Microscope Zeiss AxioplanZeissN/aBirinci Derece Lambda Plakası ile donatılmış
Paraformaldehit, EM GradeSigmaP6148formaldehit çözeltisi için toz. %16 stok çözeltisi hazırla
Plastik kaydırakExakt41500
QuickStick 135 Montaj MumuSouth Bay TeknolojisiN/a
Zımpara kağıtları  Grit boyutları 1200N/aN/a
Zımpara kağıtları  Kum boyutları 2500N/aN/a
Zımpara kağıtları  Kum boyutları 4100N/aN/a
Süper YapıştırıcıLoctiteN/a
Suda Çözüneýän Soğutucu South Bay TeknolojisiN/a
Whatmann 1. sınıf filtre kağıdıSigmaWHA1001150

Kaynaklar

  1. Reznikov, N., Shahar, R., Weiner, S. Bone hierarchical structure in three dimensions. Acta Biomater. 10 (9), 3815-3826 (2014).
  2. Buss, D. J., Kröger, R., McKee, M. D., Reznikov, N. Hierarchical organization of bone in three dimensions: A twist of twists. J Str Biol: X. 6, (2022).
  3. Grandfield, K., Gustafsson, S., Palmquist, A. Where bone meets implant: The characterization of nano-osseointegration. Nanoscale. 5 (10), 4302-4308 (2013).
  4. Loi, F., Córdova, L. A., Pajarinen, J., Lin, T., Yao, Z., Goodman, S. B. Inflammation, fracture and bone repair. Bone. 86, 119-130 (2016).
  5. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
  6. Shah, F. A., Thomsen, P., Palmquist, A. Osseointegration and current interpretations of the bone-implant interface. Acta Biomater. 84, 1-15 (2019).
  7. Palmquist, A. A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration. J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).
  8. Sim, J. H., Yeo, I. S. Light Microscopy Analysis of Bone Response to Implant Surfaces. Microsc Today. 24 (4), 28-33 (2016).
  9. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  10. Müller, R. Hierarchical microimaging of bone structure and function. Nat Rev Rheumatol. 5 (7), 373-381 (2009).
  11. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  12. Buss, D. J., Reznikov, N., McKee, M. D. Crossfibrillar mineral tessellation in normal and Hyp mouse bone as revealed by 3D FIB-SEM microscopy. J Str Biol. 212 (2), 107603(2020).
  13. Binkley, D. M., Deering, J., Yuan, H., Gourrier, A., Grandfield, K. Ellipsoidal mesoscale mineralization pattern in human cortical bone revealed in 3D by plasma focused ion beam serial sectioning. J Str Biol. 212 (2), 107615(2020).
  14. Reznikov, N., Almany-Magal, R., Shahar, R., Weiner, S. Three-dimensional imaging of collagen fibril organization in rat circumferential lamellar bone using a dual beam electron microscope reveals ordered and disordered sub-lamellar structures. Bone. 52 (2), 676-683 (2013).
  15. Reznikov, N., Bilton, M., Lari, L., Stevens, M. M., Kröger, R. Fractal-like hierarchical organization of bone begins at the nanoscale. Science. 360 (6388), 2189(2018).
  16. Grandfield, K., Vuong, V., Schwarcz, H. P. Ultrastructure of Bone: Hierarchical Features from Nanometer to Micrometer Scale Revealed in Focused Ion Beam Sections in the TEM. Calcified Tissue Int. 103 (6), 606-616 (2018).
  17. Micheletti, C., et al. mineral organization at the mesoscale: A review of mineral ellipsoids in bone and at bone interfaces. Acta Biomater. 142, 1-13 (2022).
  18. Micheletti, C., Shah, F. A. Bone hierarchical organization through the lens of materials science: Present opportunities and future challenges. Bone Rep. 22, (2024).
  19. Shah, F. A., Ruscsák, K., Palmquist, A. 50 years of scanning electron microscopy of bone-a comprehensive overview of the important discoveries made and insights gained into bone material properties in health, disease, and taphonomy. Bone Res. 7 (1), (2019).
  20. Georgiadis, M., Müller, R., Schneider, P. Techniques to assess bone ultrastructure organization: Orientation and arrangement of mineralized collagen fibrils. J Royal Soc Interface. 13 (119), (2016).
  21. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  22. Keklikoglou, K., et al. Micro-computed tomography for natural history specimens: a handbook of best practice protocols. Eur J Taxonomy. (522), (2019).
  23. Peddie, C. J., et al. Volume electron microscopy. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 51(2022).
  24. Costa De-Moraes, S. L., et al. Histomorphometric and microtomographic evaluation of hydroxyapatite coated implants and L-PRF in over drilled bone sites in sheep. Sci Rep. 15 (1), 14761(2025).
  25. Liu, Y., Xie, D., Zhou, R., Zhang, Y. 3D X-ray micro-computed tomography imaging for the microarchitecture evaluation of porous metallic implants and scaffolds. Micron. 142, (2021).
  26. Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. Assessment of Bone Fracture Healing Using Micro-Computed Tomography. J Vis Exp. (190), e64262(2022).
  27. Ramezanzadehkoldeh, M., Skallerud, B. H. MicroCT-based finite element models as a tool for virtual testing of cortical bone. Med Eng Physics. 46, 12-20 (2017).
  28. Shefelbine, S. J., et al. Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis. Bone. 36 (3), 480-488 (2005).
  29. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).
  30. Morgan, E. F., et al. Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical. Bone. 44 (2), 335-344 (2009).
  31. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  32. Zaborowska, M., Shah, F. A., Trobos, M., Palmquist, A. Retrieval, sample processing, and analyses of bone-anchored implants. Bone Repair Biomater Regenerat Clin Appl Second Edition. , 447-466 (2018).
  33. Thorfve, A., Palmquist, A., Grandfield, K. Three-dimensional analytical techniques for evaluation of osseointegrated titanium implants. Mater Sci Technol. 31 (2), 174-179 (2015).
  34. Mastrogiacomo, M., Campi, G., Cancedda, R., Cedola, A. Synchrotron radiation techniques boost the research in bone tissue engineering. Acta Biomater. 89, 33-46 (2019).
  35. Raguin, E., Rechav, K., Shahar, R., Weiner, S. Focused ion beam-SEM 3D analysis of mineralized osteonal bone: lamellae and cement sheath structures. Acta Biomater. 121, 497-513 (2021).
  36. McMahon, G., Malis, T. Ultramicrotomy of nanocrystalline materials. Microscopy Res Tech. 31 (4), 267-274 (1995).
  37. Bassim, N. D., et al. Minimizing damage during FIB sample preparation of soft materials. J Microsc. 245 (3), 288-301 (2012).
  38. Witzke, K., et al. Comparative Sample Preparation Using Focused Ion Beam and Ultramicrotomy of Human Dental Enamel and Dentine for Multimicroscopic Imaging at Micro- and Nanoscale. Materials. 15 (9), 3084(2022).
  39. Carter, J. L. W., Karakulak Uz, T., Ibrahim, B., Pigott, J. S., Gordon, J. V. A comparison of energy dispersive spectroscopy in transmission scanning electron microscopy with scanning transmission electron microscopy. Ultramicroscopy. 270, 114106(2025).
  40. Grandfield, K., McNally, E. A., Palmquist, A., Botton, G. A., Thomsen, P., Engqvist, H. Visualizing biointerfaces in three dimensions: electron tomography of the bone-hydroxyapatite interface. J Royal Soc Interface. 7 (51), 1497-1501 (2010).
  41. Grandfield, K., Palmquist, A., Engqvist, H. Three-dimensional structure of laser-modified Ti6Al4V and bone interface revealed with STEM tomography. Ultramicroscopy. 127, 48-52 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Multimodal G r nt lemeKemik Onar mBiyomalzeme De erlendirmesiKemik Biyomalzeme Aray zPolarize I k MikroskobuTaramal Elektron MikroskobuTransmisyon Elektron MikroskobuEnerji Da l ml X I n

İlgili makaleler