Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yenidoğan Fare Yumurtalık Kültürü ve Tam Montaj Folikül Nicel Belirleme: Primordial Folikül Regülasyonu İçin Verimli In Vitro Yaklaşım

690 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69498

⸱

19 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Health, University of Missouri School of Medicine, 2Division of Biological Sciences, University of Missouri

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, doğum sonrası fare yumurtalıklarının membran insertlerinde kültürlenmesi ve tüm bir yumurtalıkta tüm montaj foliküllerinin nicelendirilmesi için protokolleri sunmaktadır. Sonuçlar, yumurtalık kültürü sırasında teknik kullanımın primordial folikül sayılarını önemli ölçüde etkilediğini gösterdi ve biyolojik olmayan varyasyonu en aza indirmek için tutarlılığı korumanın önemini vurguladı.

Özet

Dişi memelilerde, ilk foliküller fetal yumurtalık gelişimi sırasında oluşur ve yetişkin yumurtalık fonksiyonunu sürdürmek için tek kaynak olarak hizmet eder. İlkel foliküllerin nasıl bir arada toplandığı, uyku halinde kaldığı, foliküler gelişim için aktive olduğu ve hücre ölümü geçirdiği mekanizmalar, yumurtalık fizyolojisi ve patolojik durumları anlamak için önemlidir. Bu çalışma, yumurtalığın gelişim aşamasına bağlı olarak sağlam yumurtalıkların kültürü ve farmasötik tedavisini mümkün kılan membran insertlerinde doğum sonrası fare yumurtalıklarının kültürlenmesi ve farmasötik tedavisini mümkün kılan bir protokol sunmaktadır. Kültür koşullarındaki değişiklikler, kültürlenmiş yumurtalıkları içeren insertlerin bir plakadaki kuyular arasında taşınmasıyla sağlanabilir; böylece kültür sırasında dokulara fiziksel müdahale önlenir. P5 yumurtalıkları izole edilip 24 kuyruklu bir plakada 12 mm bir ekleme üzerinde kültürlendi. Her yumurtalık, %10 FBS, 3 mg/mL BSA, 10 mIU/mL FSH ve Antibiyotik-Antimikotik takviye edilmiş DMEM/F12 ortamından bir damla içinde ayrıldı ve zar girişinde nazikçe stabilize edildi. Medya her iki günde bir değiştirildi ve kültür toplamda beş gün boyunca korundu. Kültür sonrası, yumurtalıklar %4 paraformaldehit ile 2 saat sabitlendi ve oosit belirteci DDX4'ün tam montaj antikor boyaması için işlendi. Foliküller, oosit boyutu ve somatik folikül hücrelerinin nükleer morfolojisine göre aşamalandırıldı ve nicelendirildi. Sonuçlar, her yumurtalıktaki ilkel folikül sayısının, dokuların membran insertine doğru yerleştirilmesiyle önemli ölçüde etkilendiğini gösterdi. Ayrıca, her bir ekteki yumurtalık sayısındaki farklılıklar biyolojik olmayan farklılıklara yol açabilir ve kaçınılmalıdır.

Giriş

Oogenesis, olgun oositlerin üretimine yol açan son derece düzenlenmiş ve karmaşık bir süreçtir. Memelilerde oogenez, ilk germ hücrelerin (PGC) birincil oositlere ayrıldığı fetal yumurtalıklarda başlar. Her birincil oosit, primordial bir folikül oluşturan skuamöz pregranuloza hücrelerinden oluşan bir tabaka ile çevrilidir. Bu ilkel foliküllerin çoğu oluşumdan sonra uykuya geçer ve yumurtalık rezervi 1,2,3 olarak hizmet eder. Yetişkin yumurtalıkta, foliküler gelişim için primordial foliküllerin periyodik aktivasyonu, follikülogenez olarak bilinir ve olgun oositlerin ve yumurtalık steroid hormonlarının üretimini sürdürmek için gereklidir 4,5. Aktivasyon sinyalleri yoksa, insan ilkel folikülleri 50 yıla kadar hareketsiz kalabilir. Uzun süreli uyku süresi, oosit kalitesinin azalmasına ve yaşlanan yumurtalıklarda ilkel folikül kaybının artmasına katkıdabulunabilir 6. Belirli bir folikül havuzunun nasıl aktive olurken diğerlerinin nasıl hareketsiz kalıp periyodik hücre ölümü geçirdiği mekanizmaları açık soru işaretleri altındadır.

Oogenez süreci memelilerde yüksek derecede korunmuştur; bu da fareleri memelioogenezi'nin incelenmesi için ideal bir model yapar 7. Farelerde, ilkel folikül oluşumu doğum sonrası 4. güne (P4) kadar tamamlanır. İlksel foliküllerin küçük bir kısmı, oluşumlarından hemen sonra foliküler gelişim geçirir. Folikül gelişimi sırasında, oosit, organogenez artması ve mRNA ile proteinsentezi 4 nedeniyle büyür. Skuamöz granüloza hücreleri kübisel granuloza hücrelerine geçiş yapar ve çoğaltıcıolur 8. Bu gelişen foliküller, dişi farelerin ergenliğe ulaştığı 21. gün civarında yumurtlama aşamasına ulaşır. Doğum sonrası yumurtalıklarda foliküler gelişimin bu aşaması genellikle 'birinci dalga follikülogenezi' olarak adlandırılır. Birinci dalga follikülogenezi, folikül gelişim sürecini yakından yansıttığından, doğum sonrası fare yumurtalıkları, ilkel folikül regülasyonu ve yumurtalık follikülogeneziniincelemek için ideal bir model sağlar 9.

Yumurtalık foliküllerinin sınıflandırılması öncelikle folikül somatik hücrelerin nükleer morfolojisine ve oositin boyutuna dayanır. Fare yumurtalıklarında, uykuda olan ilkel folikül, yaklaşık 20 μm çapındaki primer oositi kapsayan tek bir skuamöz pregranuloza hücre tabakası ile tanımlanır. Gelişen foliküller birinji, ikincil, üçüncül ve antral foliküller olarak kategorize edilebilir. Birincil folikül, genellikle çapı 25 μm'den fazla olan ve etrafında tek bir kübik granüloza hücre tabakası bulunan bir oosit içerir (Ek Şekil 1). İkincil folikül iki katmanlı granuloza hücresinden oluşurken, üçüncül folikül üç veya daha fazla granüloza hücre tabakasından oluşur. Antral folikül, üçüncül folikülden daha büyüktür, birden fazla granüloza hücre tabakası içerir ve antrum adı verilen sıvı dolu bir boşluğa sahiptir. Foliküller geliştikçe oositin boyutu büyür ve yumurtlama sırasında yaklaşık 80 μm'ye ulaşır. Ayrıca, gelişen foliküller, granulozahücrelerinin 10,11,12 dışında yer alan birkaç ince teka tabakasıyla çevrilidir.

Doğum sonrası fare yumurtalıklarının nispeten küçük boyutu, tüm yumurtalık kültürünü araştırma için pratik bir yaklaşım haline getirir. Bu yöntem, fiziksel ve fizyolojik mikro ortamları koruyarak çevredeki dokulardan gelen paraziti en aza indirerek yumurtalık ve folikül gelişiminin sağlam bir yumurtalıkta incelenmesini etkili bir şekilde mümkünkılar 12. Bu yaklaşım, in vivo modeller için zor deneyler yapılmasına olanak tanır. Örnekler arasında yumurtalık gelişiminin canlı görüntülemesi, zaman kontrollü çoklu ilaç tedavileri ve kültür ortamının protein profili ile yumurtalık salgısı aktivitesininanalizi yer alır 13,14. Ayrıca, bu yaklaşım, doğrudan hücre-hücre etkileşimi olmadan sekretör faktörlerin etkisini birlikte kültürleme deneyleriyle incelemek için de uygulanabilir. Bu deneylerde, farklı doku türleri paylaşılan bir ortam içinde ayrı membran insertlerineyerleştirilebilir 15. Ayrıca, koşullu gen etkisiyle fare yumurtalıklarının in vitro kullanılması, ilkel folikül aktivasyonu ve büyümesinde rol alan temel mekanizmaları aydınlatmaya yardımcı olabilir.

Bu makalede, doğum sonrası fare yumurtalıklarının kültürlenmesi için membran insertleri ve tüm yumurtalıkta tam montaj folikül niceli ölçü yöntemlerini tanıtıyoruz (Şekil 1). Burada belirtilen teknikler arasında 1) neonatal fare yumurtalıklarının diseksiyonu, 2) yenidoğan fare yumurtalıklarının kültürü, 3) kültür sırasında ortam değişikliği, 4) doku fiksasiyonu ve tüm montaj antikor boyama, 5) doku görüntüleme ve folikül miktarı yer alır. Ayrıca, bu çalışma, doksorubisin kullanılarak primordial folikül kaybını deneysel olarak indüklemiş ve yumurtalık rezervinin azalmasının altında yatan mekanizmaları araştırmak için bir model sağlamıştır. Sonuçlar, bir ekteki yumurtalık sayısının ve kültür sırasında insert içindeki konumlarının ilkel folikül sayılarını etkilediğini gösterdi. Bu, deneysel sonuçlarda biyolojik olmayan değişiklikleri önlemek için tutarlı bir kültür düzeninin korunmasının önemini vurgular.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

CD-1 erkek ve dişi fareler, üreme çiftleri olarak 1:1 oranında birlikte barındırıldı. Yeni yavruların doğum tarihi doğum sonrası 0 gün olarak belirlendi. Tüm hayvan deneyleri, Missouri Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı (protokol numarası: 36647).

1. Reaktifler ve Kültür Medyası

  1. Bu çalışmada kullanılan tüm reaktifler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. Tüm malzemeleri ve ortamı yumurtalık kültüründen önce hazırlayın.
  2. Kültür medyası: ~5 mL DMEM/F-12 ortamı 3 mg/mL sığır serum albümini (BSA), %10 fetal sığır serumu (FBS) ve 10 mIU/mL foliküler uyarıcı hormon (FSH) ile takviye edin.
    NOT: Medya, DMEM/F-12 medyasına BSA (30 mg/mL), FBS ve FSH stokları (10 IU/mL) eklenerek taze hazırlanmalıdır. Medyayı bir petri kabında yaklaşık 30 dakika boyunca %5CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'de dengeleyin. Stokları -20 °C'de sakla ve hemen kullanmadan önce çöz. Aliquot stoklarının tekrar tekrar dondurulmasını ve çözülmesini önlemek için uygun hacimlerde stoklar üretir.

2. Yumurtalık kültürü

  1. P5 dişi fareleri kafasını keserek ötenazi yapın. Yumurtalıkları ve bağlı bursa dokusunu cerrahi makas ve pens kullanarak çıkarın. Yumurtalıkları, önceden soğutulmuş Dulbecco'nun fosfatla tamponlanmış tuzlu suyu (DPBS) içeren Antibiyotik-Antimikotik içeren 60 mm petri kabına yerleştirin (Şekil 2A,B).
  2. Bir çift insülin şırıngası (1 mL) kullanılarak, bursa dokusunu stereoskop altında yumurtalıktan disek ve çıkarın (Şekil 2C,D). Yumurtalıkları 1 mL pipet kullanarak 3 mL kültür ortamı içeren 30 mm petri kabına aktarın ve tabağı CO2 kuluçka makinesine yerleştirin.
    NOT: Yumurtalıkları dürtmekten veya sıkmaktan kaçının. İnsülin şırıngalarıyla yumurtalığı serbest bırakmak için yumurtalık bursasından temiz ve eşit kesiler yapın. Pipet ucunu yaklaşık 50 μL madde ile önceden doldurun, pipet ucunu yumurtalığın yanına yerleştirin ve transfer için ucuna çekin.
  3. Laminar akış başlığının altında, her kuyuya 400 μL madde ve bir insert yerleştirerek plakayı hazırlayın (Şekil 2E,E'). Madde insertin dışındadır ve insertin zarı, ortam tarafından ıslandığında opak hale gelir.
  4. 24 saat Dox tedavisiyle kültür için, Dox stokunu (10 mg/mL) ile seyreltilerek 0.1 mg/mL konsantrasyonda Dox içeren ortamı taze hazırlayın.
    NOT: Dox içeren medya, biyogüvenlik ve çevre sağlığı ve güvenliği için kurumsal komitelerin yönergelerine uygun şekilde bertaraf edilmelidir.
  5. Stereoskop altında, 1 mL pipet kullanarak bir eke üç yumurtalığa kadar transfer edin (Şekil 2F,G). Inserte aktarılan medya miktarını en aza indirin ve transferden sonra hemen fazla medyayı çıkarın. Yumurtalıklar nazikçe inserte yerleştirildikten sonra, 200 μL pipet kullanarak yaklaşık 200 μL ortamı kuyunun içine aktarın, membranın tamamen maddeyle kaplı olduğundan emin olun. Maddeyi tekrar kuyuya aktarın ve yumurtalıkları zarın üzerine merkezleyin. Pipet ucunu kültür ortamıyla doldurun, böylece yumurtalık ortalanırken ucuna çekilmesini önleyin. Yumurtalıklar arasında yeterli boşluk bırakıldığından ve ortamda asılı kalmamak yerine membran insertinde stabil olduğundan emin olun (Şekil 2H). Yumurtalıkları ve zarı dürtmemeye dikkat edin.
  6. 5 günlük kültürde, her iki günde bir 200 μL (toplam miktarın yarısı) madde çıkarıp 200 μL taze kültür ortamı tekrar kuyuya ekleyerek (Şekil 2J) değiştirilir.
  7. 24 saat ilaç tedavisi ile yapılan kültür için, ilk 24 saat sonra yumurtalıklarla birlikte yeni bir kuyuya, ilk 24 saat sonra 400 μL taze kültür ortamı içeren yeni bir kuyuya aktarılır ve aşağıdaki adımlar uygulanır:
    1. Yumurtalıkları içeren iç kısmı bir çift forseps ile kuyulardan çıkarın.
    2. Insertin altını kısa bir süreliğine taze kültür ortamı olan 60 mm'lik bir kaba batırarak durulayın.
    3. Boş 60 mm'lik bir çanak üzerine insertin altına nazikçe dokunarak insert üzerindeki fazla ortamı çıkarın. Inserti taze kültür ortamıyla birlikte kuyuya yerleştirin.
      NOT: Madde değiştirdikten veya insert aktardıktan hemen sonra yumurtalıkların membranda stabil olduğundan emin olmak için fazla maddeyi insertten çıkarın.

3. Fiksasyon ve tam montaj immünboyama

  1. Kültürlenmiş yumurtalıkları sabitlemek için, penses kullanarak tabaktan inserti çıkarın ve 5 mL DPBS içeren 60 mm petri kabına yerleştirin. Yaklaşık 100 μL DPBS yumurtalıkların yanına aktarın ve 1 mL pipet kullanarak tekrar süzülür.
  2. 1 mL pipet kullanarak, yumurtalıkları insertten 1.5 mL Eppendorf tüpüne aktarın. Tüpten DPBS çıkarın ve %4 paraformaldehit 500 μL ekleyin. Yumurtalıkları 2 saat boyunca 4°C'de sabitleyin.
    NOT: Pipet ucunun ucu, yumurtalıklar içinden geçemeyecek kadar büyükse dokulara zarar vermemek için daha geniş kesilmesi gerekebilir.
  3. Sabit yumurtalıkları 1 mL PBST2 (PBS, %0,1 Tween [v/v], %0,5 Triton [v/v]) ile en az üç kez, her biri 1 saat boyunca döner bir silkeleyicide yıkayın. Antikor nüfuzunu artırmak için dokuların gece boyunca (12-16 saat) 4 °C'de PBST2 içinde bırakılması önerilir.
    NOT: Burası bir durak noktası olabilir; dokular, birincil antikor kuluçkasından üç gün önce PBST2'de depolanabilir.
  4. Yumurtalıkları, 100 μL antikor seyreltme tamponu (%1 BSA [w/v], %10 eşek serumu [v/v], 0,1 M glisin, %0,1 Tween ve %0,5 Triton PBS) ile anti-ölü kutu helikaz 4 (DDX4) ile 4 °C'de 12-16 saat boyunca 1/400 (2,3 μg/mL) seyreltme ile inkübe edin.
  5. Ertesi gün primer antikoru çıkarın ve tüpe 1 mL PBST2 ekleyin. Mendilleri en az üç kez, her biri 1 saat boyunca döner bir çalkalayıcıda yıka.
    NOT: Burası bir durak noktası olabilir; dokular, birincil antikor kuluçkasından sonra üç güne kadar PBST2'de kalabilir.
  6. İkincil antikor eşek anti-tavşan AF488'i PBST2 ile 1/500 seyreltme (1.5 μg/mL) ile seyreltin. Dokuyu en az 100 μL seyreltilmiş ikincil antikor ile 4 °C'de 12-16 saat boyunca kuluçka edin.
  7. Ertesi gün, dokuları PBST2'de en az üç kez, her biri 1 saat boyunca döner bir silkeleyicide iyice yıkayın. Arka planı azaltmak için mendillerin 8 saate kadar yıkanması önerilir. Bu adımdan sonra ışıktan korumak için tüpleri folyo ile kapattığınızdan emin olun.
  8. PBST2'yi çıkarın ve tüpte 1/1000 (1 μg/mL) seyreltme ile 100 μL DAPI ekleyin. Dokuları DAPI'de oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka altına alın.
  9. Yumurtalıkları PBST2 ile bir kez 30 dakika boyunca yıkayın ve mikroskobik bir slayta görüntüleme aralığı ile monte edin. Yumurtalıkları 1 mL pipet kullanarak ara parçanın ortasına aktarın ve fazlaPBST 2'yi çıkarın. Yaklaşık 5 μL antiifade montaj ortamı ekleyin ve aralığın üstüne bir mikroskop slaytı yerleştirin. Uzun süreli depolama için aralık kenarlarını şeffaf oje ile kapatın.
    NOT: Slaytları görüntülemeden önce, ojenin tamamen kuru olduğundan ve kapak kapağının dışında montaj ortamı olmadığından emin olun. Bu reaktifler mikroskobun amaçlarına zarar verebilir. Ayrıca, görüntüleme sırasında yumurtalıkların sabit kalması gerektiğinden fazla montaj ortamı kullanmaktan kaçının.
  10. Yumurtalıkları 10x büyütme ile 10 μm Z-adım boyutuyla konfokal mikroskopla görüntüleyin. Ayarları ayarlayın ve tüm yumurtalığı görüntülemek için Z-kompensasyonunu (uyarılma kazancı) kullanın. Bu aşağıdaki adımlarla yapılabilir:
    1. Histogram kullanarak sinyal doygunluğunu izleyerek uyarılma gücünü ve dedektör kazancını ayarlayın, çünkü dokular arasında değişiklik olabilir. Düşük lazer gücüyle başlayın ve gerektiğinde kademeli olarak artırın.
    2. Daha derin bölgeleri görüntülemek için, sinyal yoğunluğu derinlikle azalabileceği için kazanç dedektörünün Z-kompensasyonunu etkinleştirin. En az 10 ortalama olan bir kare kullanın ve 600 Hz hızda çift yönlü X-taramayı etkinleştirin.
      NOT: Bu ayarlarla, görüntüleme yumurtalık başına 10 dakikayı (~200 μm) geçmemelidir. Anti-DDX4 ile yumurtalıkların tam montajlı immunofluoresan boyama işlemi genellikle sağlamdır ve nadiren foto beyazlandırma içerir.

4. Folikül niceliği

  1. Her yumurtalıktaki folikülleri nicelikle ölçmek için görüntüleri ImageJ yazılımıyla açın. Açıldığında, renk modunun renklendirilmiş olarak seçildiğinden ve ayrı pencerelere bölünme kutusunda bölünmüş kanalların işaretlendiğinden emin olun. İlgilendiğiniz görüntüyü seçin, ardından görüntü/dönüştürme/döndürme aracıyla yumurtalığı görüntüye simetrik olarak yerleştirin.
    NOT: Konfokal ile alınan görüntüler, Imaris yazılımı (Şekil 3A,B) veya ImageJyazılımı 16 kullanılarak 3D olarak görüntülenebilir ve analiz edilebilir.
  2. Yumurtalığı ızgaralara bölmek için analiz/tools/grid aracını kullanın (Şekil 3C,C').
  3. Yumurtalığı kapsayan tüm ızgaraları işaretlemek için eklentiler/analiz/hücre sayacı aracını kullanın (Şekil 3D,D', ızgaralar 4 ile işaretlenmiş). Bu ızgaralardan, folikül niceliği için her satırdaki diğer ızgaraları işaretleyin (Şekil 3E,E', ızgaralar 8 ile işaretlenmiştir). Yumurtalığın kenarındaki 10'dan az oosit içeren ızgaralar folikül ölçümü için dahil edilmez.
    NOT: Hücre sayacı başlatın ve okunması kolay olduğunu düşündüğünüz sayaç türlerini seçin.
  4. Oositler, DAPI için pozitif olan bir çekirdeği çevreleyen DDX4-pozitif halka şeklinde bir yapının varlığıyla tanımlanabilir. Primordial foliküller, yaklaşık 20 μm çapında oositlere sahiptir ve çevresinde skuamöz somatik hücrelerle çevrilidir. Gelişen foliküllerin oositleri çapı 25 μm'den büyük ve bir veya daha fazla kübisel granüloza hücre tabakasıyla çevrilidir (Ek Şekil 1).
  5. Her işaretli ızgaradaki ilkel folikülleri sayın (Şekil 3E,E'de Tip 8 sayacıyla görüldüğü gibi). Folikülleri ızgaradaki optik bölümler/yığınlar kullanarak inceleyin ve sırasıyla hücre sayacı aracıyla işaretleyin. İki ardışık optik kesit/yığın üzerinde ilkel folikülleri çift saymadığınızdan emin olun. Tip 4 sayacıyla işaretlenmiş tüm ızgaralarda gelişen folikülleri say.
    NOT: Yığınlar üzerinden oositleri görselleştirmek ve saymak için zoom seçeneğini kullanın.
  6. Tüm yumurtalıktaki ilkel folikül sayısını (nf) hesaplayın; bir ızgaradaki ortalama ilkel folikül sayısını (nfgrid) yumurtalığı kapsayan ızgaraların sayısıyla çarparak (ngridler). nf = nf ızgara × ngrids.
    NOT: İstatistiksel analizler yapıldı ve grafikler Prism 10.2.0 yazılımı (GraphPad Software, sürüm 10, Inc., CA) kullanılarak oluşturuldu. Gruplar arasındaki farklar, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak değerlendirildi ve ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi yapıldı. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05'te değerlendirildi. Veri, ortalama ± standart hata (SE) olarak sunulur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu makalede, yenidoğan yumurtalık kültürü, tam montajlı antikor boyama, konfokal görüntüleme ve folikül niceli ölçü yöntemlerini göstererek, kültür sırasında eklemdeki yumurtalıkların sayısı ve konumunun deneysel sonuçları, özellikle yumurtalıktaki folikül sayılarını etkileyip etkilemediğini değerlendiriyoruz. Yumurtalıkları şu düzenlemelerle kültürledik: stabilize kültür için her insert başına bir, iki veya üç yumurtalık, ve yüzen kültür için her insert başına üç yumurtalık. Yumurtalıklar iki koşulda kültürlendi: kontro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, neonatal fare yumurtalık kültürü ve tüm yumurtalık foliküllerinin nicelendirilmesi için yöntemler gösterdik. Kültür yaklaşımı, ilkel ve erken gelişen folikülleri in vitro sürdürebilir. Tüm montaj folikül nicel ölçme yöntemi, minimum doku işleme gerektirir; bu da zaman kazandırır ve doku bütünlüğünü korur ve doğru folikül ölçüsünü sağlar.

Kontrol grubunda gözlemlenen ilkel folikül sayısı, doğum sonrası 10. gün yumurtalıklarında literatürde bildiri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Açıklanacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü tarafından Ödül Numarası R35GM158131 altında desteklenmiştir. EADM, Lalor Vakfı tarafından desteklendi. Yazarlar, bu çalışmadaki destek ve yardımları için Missouri Üniversitesi İleri Işık Mikroskopisi Çekirdeği'ne minnettarlıkla teşekkür eder

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
24 kuyu hücre kültür plakalarıFisher scientific 09-761-146 
Alexa Fluor 488 Eşek Karşıtı TavşanJackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları711-546-152
Anti-Anti (100X)Gibco15240-062
Sığır Serum AlbüminiSigma-AldrichA1470-25G
CD-1 IGS FareCharles River Laboratuvarları 022Fareler
Hücre Kültürü InsertleriMilliporePICM01250
Comfort Point İğneli İnsülin Şırıngası 1cc 28G x 1/2Exel26027
DAPITermo Bilimsel62248
DDX4 Tavşan mAbabcamAB13840
DMEM/F12 (1:1) (1X)Gibco11320-033
Doksorubisin hidroklorür Sigma-AldrichPHR1789
DPBS (1X)Gibco14190-144
Fetal Sığır SerumuSigma-AldrichF0926-500ML
Fiji-ImageJNIH, ABD (https://imagej.net/ij/)ImageJ 1.52p
Fisherbrand Nutating Mikserleri - Değişken HızFisher scientific 88-861-043Shaker
Folikül Uyarıcı HormonSigma-AldrichF4021-10UG
Forma Steri-Cycle i160Termo Bilimsel ve Ticaret;i160CO2 Kuluçka Makinesi
GlisinFisher scientific BP381-500
Imaris Oxford Instruments (https://imaris.oxinst.com/)Imaris 10.2
Leica TCS SP8Leica MicrosystemsSN 8100001409Konfokal
Normal Eşek SerumuJackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları017-000-121
Olympus SZ61Olympus MikroskoplarıSZ61Stereoskop
Paraformaldehit Fisher scientific 15714
SecureSeal görüntüleme aralığıGrace Bio-Labs654002
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379-500ML
VECTASHIELD Antifade Montaj OrtamıVektör LaboratuvarlarıH-1000

Kaynaklar

  1. Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: Mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
  2. Ikami, K., Nuzhat, N., Lei, L. Organelle transport during mouse oocyte differentiation in germline cysts. Curr Opin Cell Biol. 44, 14-19 (2017).
  3. Pepling, M. E. Follicular assembly: Mechanisms of action. Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).
  4. Lintern-Moore, S., Moore, G. P. The initiation of follicle and oocyte growth in the mouse ovary. Biol Reprod. 20 (4), 773-778 (1979).
  5. Picton, H. M. Activation of follicle development: The primordial follicle. Theriogenology. 55 (6), 1193-1210 (2001).
  6. Smitz, J. E., Cortvrindt, R. G. The earliest stages of folliculogenesis in vitro. Reproduction. 123 (2), 185-202 (2002).
  7. Jagarlamudi, K., Rajkovic, A. Oogenesis: Transcriptional regulators and mouse models. Mol Cell Endocrinol. 356 (1-2), 31-39 (2012).
  8. Binelli, M., Murphy, B. D. Coordinated regulation of follicle development by germ and somatic cells. Reprod Fertil Dev. 22 (1), 1-12 (2010).
  9. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).
  10. Bristol-Gould, S. K., et al. Postnatal regulation of germ cells by activin: The establishment of the initial follicle pool. Dev Biol. 298 (1), 132-148 (2006).
  11. Pedersen, T., Peters, H. Proposal for a classification of oocytes and follicles in the mouse ovary. J Reprod Fertil. 17 (3), 555-557 (1968).
  12. Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biol Reprod. 54 (1), 197-207 (1996).
  13. Levy, E. W., Leite, I., Joyce, B. W., Shvartsman, S. Y., Posfai, E. A tug-of-war between germ cell motility and intercellular bridges controls germline cyst formation in mice. Curr Biol. 34 (24), 5728-5738 (2024).
  14. Nagamatsu, G., Shimamoto, S., Hamazaki, N., Nishimura, Y., Hayashi, K. Mechanical stress accompanied with nuclear rotation is involved in the dormant state of mouse oocytes. Sci Adv. 5 (6), eaav9960(2019).
  15. Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reprod Toxicol. 49, 117-135 (2014).
  16. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  17. Bristol-Gould, S. K., et al. Fate of the initial follicle pool: Empirical and mathematical evidence supporting its sufficiency for adult fertility. Dev Biol. 298 (1), 149-154 (2006).
  18. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  19. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  20. Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Sci Rep. 8 (1), 13499(2018).
  21. Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary. J Ovarian Res. 13 (1), 121(2020).
  22. Murphy, K., Carvajal, L., Medico, L., Pepling, M. Expression of Stat3 in germ cells of developing and adult mouse ovaries and testes. Gene Expr Patterns. 5 (4), 475-482 (2005).
  23. Luan, Y., Yu, S. Y., Abazarikia, A., Dong, R., Kim, S. Y. TAp63 determines the fate of oocytes against DNA damage. Sci Adv. 8 (51), eade1846(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Neonatal Over KültürüWhole-Mount KantifikasyonuFolikül EvrelemesiOosit Markörü DDX4Membran İnser KültürüOver FizyolojisiFolikül Aktivasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.