Yöntem makalesi

Yapışkan veya Yapışmayan Hücreler Kullanılarak Mito Stres ve Glikoliz Stres Testlerinin Tek Plakalı Denemeleri

200 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69504

⸱

22 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Cancer Biology, Neuroscience and Pharmacology, School of Medicine, Meharry Medical College, 2Department of Biomedical Sciences, School of Graduate Studies, Meharry Medical College, 3Host-Tumor Interactions Research Program, Vanderbilt-Ingram Comprehensive Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Vanderbilt Institute for Infection, Immunology and Inflammation, Vanderbilt University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, Mito Stres ve Glikoliz Stres Testlerinin gerçek zamanlı metabolik analizini aynı plakada aynı anda yapmak için optimize edilmiş protokoller sunmaktadır. Prosedürler, hem yapışkan (BMDM) hem de yapışmayan (lenfositler) hücreler için özel olarak hazırlanmış olup, ilgilenilen hücrelerin mitokondriyal ve glikolitik fonksiyonlarının doğru, tekrarlanabilir ve paralel değerlendirilmesini sağlar.

Özet

Gerçek zamanlı metabolik analiz, mitokondriyal solunum ve glikolizin etiketsiz ölçümlerini sağlar; bu da araştırmacıların hücresel enerji metabolizmasını hastalık mekanizmaları ve çeşitli alanlardaki terapötik yanıtlarla ilişkilendirmesini sağlar. Farklı fareler, diğer hayvanlar, insanlar veya hücreler arasında farklı tedaviler altında enerji metabolizması karşılaştırılırken, doğru ve güvenilir sonuçlar için tek bir denemede ölçümler yapmak çok önemlidir. Ayrıca, deneysel tasarımda analiz edilen hücre tipini, örneğin kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM) gibi yapışkan olup olmadıklarını veya lenfositler gibi yapışkan olup olmadıklarını göz önünde bulundurmalıdır. Bu nedenle, testlerin farklı ilaç enjeksiyonları ve analitik programlar gerektirmesine rağmen, Mito Stres ve Glikoliz Stres testlerinin aynı plakada eşzamanlı yapılmasını sağlayan bir protokol geliştirildi. Ayrı işleme protokolleri, hem yüksek yapışkanlıklı hücrelerin (örneğin BMDM'ler) hem de yapışmayan "yüzen" hücrelerin (örneğin T hücreleri ve diğer lenfositler) analizi için optimize edildi. Burada, bu testlerin verimli ve tekrarlanabilir şekilde yapılması için ayrıntılı protokoller sunulmaktadır.

Giriş

Seahorse XF Analizörü, birçok hücre tipinde mitokondriyal solunum ve glikolizin gerçek zamanlı ölçümünü sağlayan benzersiz bir cihazdır. Aynı anda oksijen tüketim oranı (OCR) ve hücre dışı asitleşme oranını (ECAR) ölçerek, bu teknoloji fizyolojik veya stres koşullarında biyoenerjik yolların hassas diseksiyonunu sağlar. Çok yönlülüğü, kanser1, sinirbilim2, immünoloji3,yaşlanma 3,4,5 ve ilaçkeşfi 6 gibi çeşitli araştırma alanlarında vazgeçilmez hale gelmiştir; metabolik yeniden programlama hastalık ilerlemesi ve terapötik yanıtın ayırt edici özelliğidir. Fonksiyonel biyoenerjiği hücreselfenotipler 7,8 ile bağlayarak, analiz mekanizmaları ortaya çıkarmak, metabolik zayıflıkları belirlemek ve genetik veya farmakolojik müdahalelerin etkilerini değerlendirmek için güçlü bir platform sağlar.

Birçok disiplinde, ilaçların, küçük moleküllerin, sitokinlerin veya doğal bileşiklerin hücresel metabolizma üzerindeki anlık etkilerini karşılaştırmak en iyi şekilde aynı deneysel koşullarda, aynı plakada, kuluçka süresinde, çevresel parametrelerde ve günün saatinde yapılır. Buna göre, bu yaklaşım, farklı tedavilere veya genetik geçmişlere sahip hücreleri aynı plakada kaplamak ve aynı anda birden fazla metabolik parametre için analiz etmektir. Bu strateji, hücresel enerji metabolizmasındaki ilaç veya genetikle ilgili değişikliklerin en doğru karşılaştırmasını sağlar.

Birçok hücre tipi kültürde farklı davranır. Lenfositler askıda kalır ve plaka9'a hiç bağlanmaz, makrofajlar güçlü yapışır, bu da transferini zorlaştırır ve kanser hücreleri hızla çoğalır ancak çizgiye göre değişir. Bu farklılıklar, gerçek zamanlı metabolik analiz için zorluklar yaratır; bu nedenle, deneydeki her hücre tipi için özel bir protokol gereklidir.

Bu makale, bu testlerin gerçek zamanlı metabolik analiz kullanılarak uygulanması için adım adım protokoller sunarak verimlilik ve tekrarlanabilirliği garanti altına almaktadır. Bu protokoller, piyasadaki tüm analizör sürümlerine uygulanabilir.

Protokol

Fareler, Meharry Tıp Fakültesi'ndeki Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) protokolünde belirtilen prosedürlere uygun şekilde bakım gördü. Bu kurum, Laboratuvar Hayvanları Bakımı Uluslararası Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği tarafından akredite edilmiş olup, laboratuvar hayvanlarının patojensiz koşullarda tedavi ve kullanımı için Halk Sağlığı Hizmeti Politikası'na uygundur. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanların detayları Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hücre yoğunluğu için optimizasyon

NOT: Her hücre tipi benzersiz metabolik özellikler ve boyut açısından önemli farklılıklar sergiler. Her iki faktör, kuyu başına yüklenecek uygun hücre sayısının belirlenmesinde kritik öneme sahiptir ve en iyi sonuçların elde edilmesini sağlar. İlk deneysel test yapmadan önce, ilgili seçilmiş hücrelerin farklı yoğunluklarda kaplamalı olduğu bir test plakası hazırlayın ve çalıştırın.

  1. Yapışkan hücreler (örneğin, kanser hücreleri) için, tohumlama yoğunlukları 20.000–100.000 hücre arasında değişir. Yüksek metabolik ve/veya büyük hücreler (örneğin, insan kanser hücreleri veya fibroblastlar) için, yoğunluk optimizasyonu her kuyu başına 10.000 veya daha az hücre ile başlar.
  2. Yapışmayan hücreler (örneğin, lenfositler) için, tohumlama yoğunluğunu 100.000–500.000 hücre aralığında optimize edin. Tüm hücre tipleri için, optimal sonuçları elde etmek için tekhücreli tek hücreli monokatman hedefleyin (örneğin örneklerin plaka düzeni için Şekil 1'e bakınız).
  3. Mito Stres testini (aşağıda olduğu gibi) çalıştırın. Bu ön testten elde edilen veriler, ana deney için optimal hücre yoğunluğunu belirlemek için kullanılabilir. Test koşulları arasında en büyük farkı gösteren yoğunluğu seçin.
    NOT: Bu protokol, 3B örneklerin (örneğin, hücre sferoidleri, organoidler) analizine uygulanmaz. Ancak, örnek kalınlığı ve düzensiz yüzeyi hesaba katacak şekilde değiştirilebilir.

2. Teste hazırlık

  1. Testi yapmadan bir gün önce, sensör kartuşunu elektrik plakasından nazikçe çıkarın ve elektrik plakasının her kuyusuna 200 μL RNAaz/DNA içermeyen su ekleyin ve sensör kartuşunu elektrik plakasına indirerek sensörler tamamen suya batırılana kadar kullanın.
    NOT: Sensörlerin gece boyunca tamamen su altında kalmasını sağlamak için su seviyesi yeterince yüksek olmalıdır, çünkü sensör kartuş floroforları düzgün şekilde nemlendirilmezse çalışmaz. Kartuşu hidratlamak için XF Hydrobooster kullanılırsa, kartuş doğrudan kalibrant çözeltiye konabilir ve su hidratlama aşaması hariç tutulabilir.
  2. Hidratlı sensör kartuşu/yardımcı plakasını gece boyunca 37 °CCO2 olmayan bir kuluçka makinesine yerleştirin. Tabaktan buharlaşmayı önlemek için, ayrıca çift damıtılmış su içeren bir kapı inkubatöre yerleştirin.
  3. Test günü, sensör kartuşunu/yardımcı plakasını CO2 içermeyen kuluçka makinesinden çıkarın ve sensör kartuşunu nazikçe yardımcı plakadan çıkarın, kartuş sensör tarafı üst tarafta tezgaha yerleştirilin.
  4. Elektrik plakasından suyu atın ve gevşek damlacıkları silkeleyin, her kuyuya 200 μL XF Kalibrant Çözeltisi ekleyin.
  5. Sensör kartuşunu nazikçe elektrik plakasına geri yerleştirin ki sensörler tamamen kalibrant çözeltisine batırsın ve tekrar 37 °CCO2 olmayan kuluçka makinesine yerleştirin.

3. Analiz medya hazırlığı

  1. Mito Stres medya hazırlığı:
    1. 50 mL bir tüpte, 45 mL XF RPMI ortamına aşağıdakileri ekleyin: 500 μL 100x sodyum piruvat (nihai konsantrasyon: 1 mM), 500 μL 100x L-glutamin (son konsantrasyon: 2 mM) ve 550 μL %45 glikoz çözeltisi (nihai konsantrasyon: 25 mM)
  2. pH seviyesini 7.4'e ayarlayın. XF RPMI medium ile 50 mL nihai hacme kadar doldurun. Hazırlanan ortamı kullanmadan önce 37 °C su banyosu veya kuru banyoda tutun.
  3. Glikoliz testi ortam hazırlığı:
    1. 50 mL'lik bir tüpte, 45 mL XF RPMI ortamına 250 μL 100x L-glutamin ekleyin.
  4. pH değerini 7.4'e ayarlayın, ardından XF RPMI ortamıyla 50 mL nihai hacme kadar doldurun. Hazırlanmış ortamı kullanmadan önce 37 °C suda veya kuru banyoda tutun.
    NOT: Mito Stresi ve Glikoliz test ortamının pH'ı, pH değiştiren takviyeler eklendikten sonra 7.4'e yeniden ayarlanmalıdır, çünkü küçük sapmalar bile test sonuçlarını önemli ölçüde etkileyebilir.

4. Analiz öncesi hücrelerin yıkanması ve ortamın değiştirilmesi

NOT: XFe96/XF Pro Hücre Kültürü Mikroplakalarının yıkama adımı, yapışkan veya yapışmayan hücre tiplerinin kullanılmasına bağlı olarak değişecektir. Kullanılan hücre tipine göre en iyi yıkama yöntemini belirlemek için lütfen adım 9, Yapışkan (kanser hücreleri, birincil BMDM hücreleri) ve yapışmaz hücreler (T hücreleri ve diğer lenfositler) bölümlerine bakınız.

  1. Her kuyudan 160–180 μL büyüme ortamını, hücrelerin kurumasını önlemek için çoklu pipetör kullanarak her bir satır/sütun ile çıkarın. Kuyunun dibine dokunmaktan kaçının.
  2. Tek uçlu pipetman kullanarak, kalan 20–30 μL kuyulardan alın, kuyunun altındaki hücre tabakasına dokunmaktan kaçının.
  3. Her kuyuyu, Şekil 1'deki düzeni takip ederek her kuyuya 180 μL Glikoliz veya Mito Stres test ortamı (bkz. adım 3) ekleyin. Hücre tabakasını rahatsız etmemek için, tüm kuyular dolana kadar her kuyunun yan duvarı boyunca medyayı nazikçe dağıtın. Her iki test de aynı plakada.
    NOT: Hücre içermeyen ve kontrol kuyuları da analiz ortamlarıyla doldurulmalıdır.
  4. Mikroplakayı teste başlamadan önce 40–45 dakika boyunca 37 °CCO2 içermeyen bir kuluçka makinesine yerleştirin ve ilaçların hazırlanmasına başlayın.

5. İlaç hazırlığı ve kartuşun yüklenmesi

DIKKAT: Bazı ilaçlar (FCCP, Antimycin A/Rotenon, Oligomisin) tehlikelidir ve dikkatli ele alınmalıdır. Personeli korumak için uygun önlemler gereklidir; bunlar arasında eldiven ve diğer kişisel koruyucu ekipmanların (PPE) kullanımı ile malzemelerin kurum tarafından onaylanmış kimyasal atık kutusuna veya konteynerine atılması yer alır.

NOT: Optimal FCCP/oligomisin konsantrasyonu hücre tipine bağlıdır ve testten önce özellikle hassas hücrelerle çalışırken ampirik olarak titrlenir. İlaçların nihai konsantrasyonları hücre tipine göre değişebilir. Kullanım gününde ilaçları ve analiz medyasını taze hazırlayın. Dondurma veya tekrar kullanma. En iyi sonuçlar için bu 45 dakikalık süre içinde test ilaç hazırlığı tamamlanabilir.

  1. Aşama 3'ten önceden ısıtılmış Mito Stres ve Glikoliz Testi ortamı kullanılarak, bileşikler Tablo 1 ve/veya Tablo 2'ye göre her hücre tipine uygun konsantrasyonlara seyreltilir. Her bileşiği ayrı bir 15 mL tüpte hazırlayın (altı bileşiğin hepsi kullanılıyorsa, altı tüp gerekir).
  2. 37 °CCO2 olmayan kuluçka makinesinden sensör kartuşunu/yardımcı plakasını çıkarın ve kapağı çıkarın; kitle birlikte verilen XF yükleme kılavuzunu dikkatlice yerleştirin; enjektör portuna (Port A için Kılavuz A) karşılık gelen XF yükleme kılavuzu sensör kartuşunun üst kısmının üstüne güvenle yerleştirin ( bkz. Şekil 2).
  3. Her ilaç için çok kanallı pipetör ve reaktif rezervuarı kullanarak, gerekli hacmi ilgili porta yavaşça ekleyin (hacim için Tablo 1 ve Tablo 2'ye bakınız). İlaçları yüklerken pipetörü tamamen dik tutun (bkz. Şekil 2).
  4. Her port için (Port A, B, C ve D) yükleme kılavuzunu iyice durulayıp kuruttuktan sonra değiştirin veya tekrar kullanın ve her yüklemeden sonra pipet uçlarını atın.
    NOT: Pipet uçları kılavuz portuna sıkıca oturmalı, ancak çok sıkı oturmamalıdır, çünkü pipet uçları kılavuza sıkışabilir! Örneklerin yanlış yüklenmesini önlemek için kılavuzlarda kullanılan pipet uçlarını/pipetörü test etmek önerilir.
  5. Tüm bileşikleri ilgili portlara yükledikten sonra, kılavuzu çıkarın, tüm portların dolduğunu görsel olarak doğrulayın ve kartuşu kapağıyla sabitleyin. İlaçlar, aynı plakanın her bir parçasındaki teste karşılık gelmelidir (Şekil 1).
    NOT: Mito Stresi için önerilen nihai kuyu konsantrasyonları 1 μM oligomisin, 1 μM FCCP ve 0,5 μM Rotenon/Antimisin'dir; glikoliz için 10 mM glikoz, 1 μM oligomisin ve 50 mM 2-DG.

6. Seahorse XFe96 analizörünün kurulumu

  1. Analizörü açın ve WAVE yazılımını açın (bkz. Şekil 3).
  2. XF Mito Stres Testini seçin.
    NOT: Uygun analiz ortamı ve bileşikler kullanıldığı sürece, analizör aynı plakada hem mitokondriyal hem de glikoliz testlerini aynı anda XF Mito Stres Testi ile yapabilir.
  3. Plaka düzenine göre 'Gruplar' sayısını seçin ve her grubu etiketleyin. Plaka haritası için kuyular atamak üzere bir sonraki sekmeye geçin ( bkz. Şekil 3). Her iki test de aynı plakada yapılır.
  4. Her Grup için levhanın nasıl yüklendiğine göre kuyrukları vurgulayın.
  5. Programı hücre tipine ve deneysel amacına göre ayarlayın. Örneğin, kurulumda analiz öncesi önceden aktive edilmiş bir grup varsa veya koşu sırasında bir aktivatör eklenirse, her döngüde kuluçka süresini uzatarak aktivasyonun gerçekleşmesine izin verin.
  6. Sonraki sekme olan 'Analiz Çalıştır'ı seçin ve veri dosyasını kaydetmek için gerekli bilgileri doldurun.
  7. Başlatma için belirtildiğinde, önceden hidratlanmış kartuşu (5. adımdan itibaren) ilaçlarla makineye yükleyin. Başlatma adımı, sensörlerin doğru şekilde nemlendirilip çalışmadığını gösterir.
  8. Testi başlatın ve program sırasında gösterilen uyarılara göre plakaları yükleyip boşaltın.
    NOT: Kartuşu veya mikroplakayı analizöre yüklerken, tüm kapakların çıkarıldığından emin olun! Bazı analizör modellerde kapakları algılayabilen bir güvenlik özelliği bulunurken, önceki modellerde bu özellik yoktu. Plaka çalışması sırasında kapak sağlam kalırsa bu durum makineye zarar verebilir.

7. Normalizasyon yöntemleri: (SRB) ve nükleer sayım (DAPI boyama ve görüntüleme)

DIKKAT: SRB test setindeki bazı reaktifler aşındırıcı ve ciltle temas ettiğinde yanar. DAPI alerjik cilt reaksiyonuna neden olabilir. Eldiven ve diğer PPE'lerin kullanılması, malzemelerin kurum tarafından onaylanmış kimyasal atık kutusuna veya konteynerine atılması önerilmektedir.

NOT: Analiz edilen hücrelerin özellikleri ve ön tedavilerine göre normalizasyon yöntemini seçin. Her iki yöntem de farklı proliferasyon oranlarına sahip hücrelerin karşılaştırılmasında uygundur, çünkü her iki yöntem de bu tür farklılıkları hesaba katırır. Ancak, ilaç tedavileri yaşlanmayı tetikler, proliferasyonu durdurur ve hücre boyutunu artırırsa, DAPI boyama tercih edilen normalleştirme yöntemidir. DAPI, nükleer boyamanın görselleştirilmesi zor olduğu (örneğin, adipositler, eritrositler) veya hücrelerin çok çekirdekli olabileceği (örneğin, parenkimal hepatositler, miositler) hücre tipleri için uygun olmayabilir.

  1. Hücreleri SRB testi (Sulfohodamine B Hücre Sitoksisite Assay Kiti) kullanarak gerçek zamanlı metabolik analizden sonra normalleştirmek için, plakayı makineden çıkarın ve her kuyuya Fiksasyon Çözeltisinin ortam hacminin 1/4'ünü (örneğin, 200 μL kültür ortamında 50 μL) ekleyin.
    1. Oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapın.
    2. Çözeltiyi çıkarın ve hücre tabakasını rahatsız etmeden 200 μL RNase/DNase içermeyen suyla kuyuları üç kez nazikçe yıkayın. Kısa süreli depolama için (gerekirse), son yıkamayı PBS ile değiştirin ve 4 °C'de saklayın.
    3. SRB testi ile hemen normalleşme için yıkama çözeltisini çıkarın ve plakanın oda sıcaklığında tamamen hava kurumasına izin verin.
    4. Her kuyuya 25 μL SRB Çözeltisi ekleyip oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika boyanabilir veya kuluçka döneminde plakayı alüminyum folyoya sarar.
      NOT: SRB çözümü ışığa duyarlıdır ve deneyin bu kısmı düşük ışıklı bir alanda yapılmalıdır.
    5. Boyama çözeltisini çıkarın ve her kuyuyu 2–3 kez yıkamak için 100 μL 1x Yıkama Çözeltisi ekleyin.
    6. Ağartmayı önlemek için mümkün olduğunca hızlı yıkayın ve yıkama çözeltilerini vakum emmesiyle mümkün olduğunca çok temizleyin.
    7. Her kuyuya 100 μL 1x Solubilizasyon Çözeltisi ekleyin ve tabağı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıya koyun.
    8. Bir plaka okuyucuda 565 nm'de Optik Yoğunluğu (O.D.) ölçülüp renk doygunluğuna göre kuyu yoğunluğunu belirleyin (görsel referans için Şekil 3'e bakınız).
    9. O.D. değerleri verilerini Excel dosyası olarak dışa aktarın. Bu tablo, normalizasyon için WAVE yazılımına yapıştırılacak (adım 8).
      NOT: Hücre aşırı yüklenmesi nedeniyle yoğun renk (> O.D. 3.5) gözlemlenirse, ölçümleri tekrar cihazın doğrusal aralığına düşürmek için optimal olmayan bir dalga boyu (örneğin 490–530 nm) kullanılabilir. Sadece kültür ortamı (arka plan kontrol kuyusu) içeren kontrol cihazının O.D.'sini tüm örneklerin ölçümlerinden çıkararak arka planı düzeltmek.
  2. DAPI lekesi için, DAPI stok çözeltisini 1x PBS'de 300 nM'ye kadar seyreltin.
    1. Hücre plakasının her bir kuyusunu 200 μL 1x PBS ile 3 kez nazikçe yıkayın.
      NOT: Yapışmayan hücreler varsa, plakayı 200 x g ile 3 dakika boyunca santrifüjlen, her yıkama adımından sonra hücrelerin her kuyunun dibine asılı kaldığından emin olun.
    2. Hücreleri oda sıcaklığında 1x PBS ile 10–15 dakika boyunca seyreltilmiş %2–4 PFA ile sabitleyin.
    3. Hücre plakasının her bir kuyusunu 200 μL 1x PBS ile 3 kez nazikçe yıkayın.
    4. Her birine yaklaşık 150 μL bu seyreltilmiş DAPI boyama çözeltisi ekleyin, böylece hücrelerin her kuyunun tamamen kaplı olduğundan emin olun.
    5. Oda sıcaklığında düşük ışıklı bir alanda (veya alüminyum folyoda örtülü plaka) 1–5 dakika kuluçka yapın.
    6. Her kuyiden DAPI leke çözeltisi çıkarın.
    7. Hücre plakasının her bir kuyusunu 200 μL 1x PBS ile 3 kez nazikçe yıkayın.
    8. Kalan PBS'leri çıkarın.
    9. Hücreleri 358–461 nm arasında herhangi bir uyarılma/emisyonda veya herhangi bir DAPI filtre ayarında mikroskopta görüntüleyin.
    10. Emisyon değerlerini Excel dosyası olarak dışa aktarın. Bu tablo, normalizasyon için WAVE yazılımına yapıştırılacak (adım 8).

8. Verilerin analizi ve normalizasyonu

NOT: Veri analizi için "Wave" veya başka bir yazılım kullanılabilir. Sağlanan protokol Wave yazılımı için geçerlidir.

  1. Analizin sonuçlarını Wave'de açın (bkz. Şekil 3). Normalizasyon, SRB boyama sonrası mikroplaka okuyucu tarafından oluşturulan Excel dosyasından elde edilen değerler kullanılarak yapılır (adım 7).
  2. "Normalize et" seçeneğine tıklayın.
  3. Açık pencerede, normalizasyon aşamasında oluşturulan Excel elektronik tablosundan kopyalanan verileri yapıştırmak için "hepsini seç" ve ardından "yapıştır" seçeneğini seçin. "Başvur" seçeneğine tıklayın. Bu prosedür tüm deneysel verileri otomatik olarak normalleştirdi.
  4. Rapor oluşturmak için, sağda açılan panelde "Dışa Aktar" seçeneğine tıklayın ve "XF Cell Mito Stres Test Raporu Oluşturucu" seçeneğini seçin. Oluşturulan dosyayı kaydet. Analiz sırasında, yalnızca Mito Stres Testi'ne atanan kuyuları seçin ( bkz. Şekil 3).
  5. Rapor oluşturmak için, sağda açılan panelde "Dışa Aktar" seçeneğine tıklayın, "XF Hücre Glikoliz Stres Testi" Rapor Oluşturucu'nu seçin. Oluşturulan dosyayı kaydet. Analiz sırasında, yalnızca Glikoliz Stres Testi'ne atanmış kuyuları seçin (bkz. Şekil 3).

9. Yapışkan ve yapışmayan hücreler

NOT: Yapışkan ve yapışmayan hücreler büyüme davranışları, yüzey tutunması ve kullanım gereksinimleri açısından farklılık gösterir. Yapışkan hücreler (örneğin, kanser hücreleri, BMDM'ler) kültür yüzeyine tutunur, bu nedenle kaplama ve yıkama özel önlemler gerektirmez. Yapışmayan hücreler (örneğin, T hücreleri, diğer lenfositler) askıda kalır ve farklı santrifüjleme, yeniden süspansiyon ve kaplama yöntemleri gerektirir. Bu farklılıkları anlamak, doğru hücre tohumlama, ilaç tedavisi ve analiz tutarlılığı için çok önemlidir.

  1. Deney için kullanılan tüm hücrelerin, test yapılmadan hemen önce tercih edilen bir ortam ve hücre kültürü kapında kültürlendiğinden emin olun, ancak ardından mikroplakaya aktarılarak testi yapılmasını sağlar.
    NOT: Bu protokolde tanımlanan hücre tipleri için XF RPMI ortamı önerilse de, diğer hücre tipleri için uygun ortamın kullanıldığından emin olmak üzere üreticiye danışın.
  2. Yapışkan hücreler (kanser hücreleri, BMDM hücreleri) için, hücreleri testten 4–5 saat önce, optimize hücre yoğunluğunda (bkz. adım 1) 200 μL medya hacminde XFe96/XF Pro Hücre Kültürü Mikroplakasına tohum ekin ve 37 °CCO2 kuluçka makinesine yerleştirin.
    NOT: BMDM hücreleri testten 24 saat önce plaka yapılabilir, çünkü çoğalmazlar ve aynı hücre yoğunluğunu korurlar. Kanser hücre hatları gibi hızlı büyüyen yapışkan hücreler için, ek tedavi gerekmiyorsa test gününde kaplama yapılması ve hücreler bağlanır bağlanmaz ekstra hücre büyümesinin önlenmesi için analiz edilmesi tavsiye edilir. Bu tasarım mümkün değilse, protein miktarı/iyi veya çekirdek sayısı/kuyu normalizasyonu gerekli bir adımdır.
  3. Mikroplakanın her dört köşesi için köşe kuyruklarının hücrelerden arınmış ancak ortamlarla dolu olduğundan emin olun; çünkü bu boşluk kontrol kuyuları olarak ölçülür.
  4. 3–5 saat kuluçkadan sonra, her kuyunun altındaki hücrelerin plakaya eşit bir seviyede bağlı olduğundan emin olmak için mikroplakayı gözlemleyin.
  5. Hücreler henüz bağlanmamışsa, plaka hücreler iyice bağlanana kadar ekstra süre için 37 °CCO2 kuluçka makinesine yerleştirilebilir.
  6. Sonra, 4. adımda belirtildiği gibi yapışkan hücrelerle mikroplakayı yıkama için hazırlayın ve teste geçin.
  7. Yapışmayan hücreler (T hücreleri ve diğer lenfositler) için, mikroplakayı plakaya eklemeden önce Poly-D-Lizin ile kaplayın.
    NOT: Bu protokolde Poly-D-Lizin kaplaması önerilse de, hücre tipine bağlı olarak başka bir plaka kaplama (örneğin, kollajen, fibronektin, jelatin) daha uygun olabilir. Alternatif bir kaplama kullanıyorsanız, lütfen üreticinin kullanım talimatlarına uyun.
  8. Mikroplakayı kaplamak için, 2.5 mL 20 μg/mL Poli-D-Lizin çözeltisi (1 mg/1 mL su çözeltisi 50 kez seyreltilmesi) 0.1 M sodyum bikarbonatta, pH 8.0'da hazırlanın (bikarbonat, yapışkan adsorpsiyon için optimum pH sağlar). Bu adım, testin yapılmasından önce veya işlem günü yapılabilir.
  9. Levhanın her kuyusuna 25 μL çözelti uygulayın ve oda sıcaklığında 20–30 dakika boyunca tezgah üzerinde veya plaka kaydırıcı üzerinde kuluçka yapın.
  10. Kalan çözeltiyi aspire edin veya pipetleyin ve her kuyuyu 200 μL RNAaz/DNAse içermeyen suyla iki kez yıkayın.
  11. Kuyular kuruyana kadar (1–2 saat) hücreleri mikroplakaya tohumlamadan önce bekleyin.
  12. Sonra, hücrelerin her kuyunun dibine askılı olduğundan emin olmak için plakayı 200 x g hassasiyetinde 3 dakika boyunca fren olmadan santrifüj ederek yıkama aşamasında mikroplakayı hazırlayın.
  13. 4. adıma geçin ve 5–7. adımlarda belirtildiği gibi testin kalanını devam edin.

Sonuçlar

Bu birleşik protokol, her iki testin aynı plakada yapılmasını sağlamak için geliştirilmiştir. Örneğin, bu yöntem,aktivasyon 10 sırasında CD8+ T hücrelerinin metabolik yetkinliği üzerinde mGluR1−TCR çapraz iletişim sinyallerini aydınlatmak için kullanıldı. Bu yöntem, mGluR1 inhibisyonunun glikolize geçişi ve mitokondriyal solunum değişiklikleri üzerindeki etkisini değerlendirmekti; bu süreçler T hücrelerinin optimal işleyişi için hayati öneme sahip ve her deneyde kullanılan T hücre sayısını en aza indirmekti. Aynı tek plaka tekniği, yapışkan kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM; Şekil 4 ve Şekil 5) ve yapışmaz hücrelere, örneğin insan periferik kan mononükleer hücrelerine (PMBC; Şekil 3). Aktive CD8+ T hücrelerinde mGluR1 sinyal blokajının mitokondriyal ve mitokondriyal olmayan enerji üretimini etkilediği gösterilmiştir. Buna karşılık, saf hücreler metabolik enerji profillerinde anlamlı bir değişiklik göstermedi (Şekil 6A,B). Aktive CD8+ T hücrelerinin Mito Stres testi, yüksek bazal ve maksimum solunum ile solunum rezerv kapasitesini gösterdi (Şekil 6C). CPCCOEt ile tedavi edilen T hücrelerinde, glutamat mGluR1'e bağlandığında aşağı akış sinyalini engelleyen rekabetçi olmayan bir antagonist olan T hücreleri, naif hücreler gibi oksijen tüketim oranlarının (OCR) azalmasına ve ATP üretiminin azalmasına yol açtı (Şekil 6C). Glikoliz testi ayrıca yalnızca tedavi edilmemiş aktive CD8+ T hücrelerinin glikoliz yoluyla ATP ürettiğini ve CPCCOE tedavisinin naif duruma benzer metabolik aktivite gösterdiğini gösterdi (Şekil 6D). Bu sonuçlar, aktivasyon sırasında doğru CD8⁺ T hücresi fonksiyonu için mGluR1 sinyalinin gerekli olduğunu doğrular.

figure-results-1
Şekil 1: Bu şekil, aynı plakada Mito Stresi ve Glikoliz Testini içeren mikroplakanın plaka düzeninin genel görünümünü göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: İlaç kartuşunu dolduruyor. (A) Kartuşun arka ve önündeki sensörlerin ve portların ayrıntılı haritası, hangi ilacın hangi porta yüklenmesi gerektiğini etiketlemek. (B) İlgili portların yüklenmesi için kartuşun üzerindeki kılavuzların önerilen yönü ve çok kanallı pipetörün kılavuzlar üzerinde kullanılması için önerilen konum. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: WAVE programının testi çalıştırıp analiz edilmesi. (A) Programın kurulumu süreci, analiz türünün seçilmesini, grupların atamasını, plaka haritasının oluşturulmasını ve ilaç portlarının programlanmasını içerir. (B) İlaçların ilgili portlara yüklenme sırası, örneğin Mito Stresi mi yoksa Glikoliz mi olduğuna bağlıdır. (C) Normalizasyonun son aşamasında SRB lekesinin yakın planı. (D) Normalizasyondan sonra, plaka verileri aynı plaka için hem Glikoliz hem de Mito Stres Testi olarak ayrı ayrı dışa aktarılabilir. (E) Mito Stresi için veri, yalnızca Mito Stresi örnekleri için mevcut seçimi düzenleyerek seçilebilir. (F) Glikoliz verileri, yalnızca Glikoliz örnekleri için mevcut seçim düzenlenerek seçilebilir. Bu şekilde kullanılan örnek veriler, insan periferik kan mononükleer hücrelerinin analizinden alınmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Mito Stres Treninin aynı plakada eşzamanlı performansı. 2 aylık WT ve Tusc2 KO farelerinden türetilen kemik iliği kökenli makrofajlar her iki analiz türüne de tabi tutuldu. Hücreler ya tedavi edilmedi (sahte) ya da kaplamadan önce 5 saat boyunca LPS (100 ng/mL) ile uyarıldı (30.000 hücre/kuyu). Mito Stres ve Glikoliz Stres Testleri, doğru karşılaştırma sağlamak için paralel olarak yapıldı; Şekil 1'de gösterildiği gibi. (A) Wave yazılımı kullanılarak oluşturulan farklı hücre tipleri (WT ve KO) ve koşullar (naif ve aktif) için Mito Stres profilleri. Normalizasyon, 7. adımda açıklandığı gibi SRB boyama ile gerçekleştirildi. (B) Her testte analiz edilen parametrelerin karşılaştırmalı çubuk grafikleri. ∗p ≤ 0.05, ∗∗p ≤ 0.005, Öğrencinin T-testi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Aynı plakada yapılan Glikoliz Stres testlerinin eşzamanlı performansı. 2 aylık WT ve Tusc2 KO farelerinden türetilen kemik iliği kökenli makrofajlar her iki analiz türüne de tabi tutuldu. Hücreler ya tedavi edilmedi (sahte) ya da kaplamadan önce 5 saat boyunca LPS (100 ng/mL) ile uyarıldı (30.000 hücre/kuyu). Mito Stres ve Glikoliz Stres Testleri, doğru karşılaştırma sağlamak için paralel olarak yapıldı; Şekil 1'de gösterildiği gibi. (A) Wave yazılımı kullanılarak oluşturulan farklı hücre tipleri (WT ve KO) ve koşullar (naif ve aktif) için glikoliz stresi profilleri. Normalizasyon, 7. adımda açıklandığı gibi SRB boyama ile gerçekleştirildi. (B) Her testte analiz edilen parametrelerin karşılaştırmalı çubuk grafikleri. ∗p ≤ 0.05, ∗∗p ≤ 0.005, Öğrencinin T-testi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Fare splenositlerinden arındırılmış CD8⁺ T hücreleri kullanılarak tek bir plaka üzerinde Mito Stres ve Glikoliz Stres Testleri. (A) Mitokondriyal Stres Testinin temsil eden profilleri; CD8+ T hücrelerinin naif, aktive ve aktive edilmiş + mGluR1 inhibitörü T hücre gruplarıyla yapılan ilaçlara bağlı Oksijen Tüketimi Oranı (OCR) değişikliklerini karşılaştırmak. (B) Saf, aktive ve aktive + mGluR1 inhibitör gruplarında yapılan CD8+ T hücrelerinin Hücre Dışı Asitlenme Oranı (ECAR) ilaca bağımlı değişiklikleri karşılaştıran Glikoliz Testinin temsilci profilleri. (C) Naif, aktive ve aktive + mGluR1 inhibitör gruplarında CD8+ T hücrelerinin mitokondriyal solunumunun farklı parametrelerindeki nicel değişiklikleri gösteren bar grafikler. Çubuklar, ortalama ± SEM'i temsil eder (n = 4). (D) Naif, aktive ve aktive + mGluR1 inhibitörü CD8+ T hücrelerinde glikolizin farklı parametrelerindeki nicel değişiklikleri gösteren bar grafikler. Çubuklar, ortalama ± SEM (n = 4) anlamına gelir. ∗p ≤ 0.05, ∗∗p ≤ 0.005, Öğrencinin T-Testi. Bu figür, Aquino ve ark.10'dan uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Son Kuyu (μM)Stok Çözeltisi Hacmi (μL)Medya Hacmi (uL)10x Port (μM)Porta eklenen hacim (μL)
Port A oligomisin0.51502850520
1.545025501520
2.563018902520
Port B FCCP0.12537.52962.51.2522
0.257529252.522
0.51502850522
130027001022
260024002022
Port C Rotenone/Antimycin0.53002700524

Tablo 1: Mito Stresi için XFe96 sensör kartuşlarının yüklenmesi için bileşik hazırlık.

Son KuyuStok Çözeltisi Hacmi (μL)Medya Hacimi (μL)10x PortPorta eklenen hacim (μL)
Port A Glukoz250 mM100240020
Port B oligomisin0.5 μM15028505 uM22
1.5 μM450255015 uM22
2.5 μM630189025 uM22
C 2-DG portu50 mM30000500mM24

Tablo 2: Glikoliz için XFe96 sensör kartuşlarının yüklenmesi için bileşik hazırlığı.

Tartışma

Burada sunulan protokol, iki ana enerji üretme yolunun doğru ve güvenilir karşılaştırılmasını sağlar: oksidatif fosforilasyon (mitokondriyal ATP üretimi) ve anaerobik glikoliz (mitokondri dışında ATP üretimi, oksijen gerektirmez) ve tek bir çalışma içinde iki farklı stres testini mümkün kılar. Ayrıca, deneysel tasarım analiz edilen hücre türünü dikkate alır; böylece hücre metabolizması analizinin daha geniş bir anlaşılmasını sağlarken, kullanılan örnek ve reaktif miktarını en aza indirir.

Agilent, Inc. tarafından tasarlanıp satılan gerçek zamanlı metabolik analiz cihaz protokollerinde yapılan Mito Stres ve Glikoliz Stres testleri arasındaki farklar oldukça büyüktür. Bu iki test, farklı analiz ortamları, belirli ilaçlar ve farklı enstrüman programları gerektirir. Mito Stres Testi, glikoz, L-glutamin ve piruvat içeren analiz ortamı kullanırken, Glikoliz Stres Testi yalnızca L-glutamin ile takviye edilmiş glukozsuz ortam kullanır. Testler farklı bileşiklerle sorgulanır: Mito stres testi için Oligomisin → FCCP → Antimisin A + Rotenon ve Glikoliz Stres Testi için Oligomisin → Glukoz → 2-DG. Sonuç olarak, bu testler genellikle farklı zamanlarda ayrı plakalarda yapılır, çünkü gerçek zamanlı metabolik analizör aynı anda yalnızca bir plakayı barındırır.

Bu sınırlamaları gidermek için, önceki makalede Mito Stres Testi kurulumu kullanılarak her iki testin aynı plakada yapılmasını sağlayan birleşikbir protokol geliştirilmiştir 10. Bağışıklık hücreleri, kanser hücreleri, yapışkan hücreler ve süspansiyon hücreleri dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinin analizi için öneriler sunulmaktadır. Bu yönergeler tek tek veya kombinasyon halinde uygulanabilir ve deneycinin amaçlarına ve mevcut kaynaklara bağlı olarak esneklik sağlar.

SRB Testi veya DAPI ile hücrelerin normalizasyonu, farklı büyüme hızları/boyutu 9,11 olan birden fazla hücre tipi kullanıldığında daha fazla esneklik sağlar. Ayrıca, bu teknik iki test için yalnızca bir plaka gerektirdiğinden, metabolik süreçleri ölçmek için çeşitli örnek tipleriyle birleştirilebilir.

Yöntemin başarısını etkileyen faktörler: (1) kuyu başına optimal hücre sayısı; (2) verimli hücre bağlantısı; ve (3) fişeklerin dikkatli doldurulması, çünkü iki ayrı ilaç seti kartuşun ayrı bölümlerine yüklenmelidir.

Yöntemin bilimsel ve deneysel avantajları arasında aynı biyolojik bağlamda doğrudan karşılaştırma yer alır. Aynı hücrelerin aynı kültür koşullarında kullanılması, plakalar veya koşular arasındaki değişkenliği ortadan kaldırır ve aynı numunede mitokondriyal ve glikolitik fonksiyonların daha doğru karşılaştırılmasına olanak tanır. Ayrıca hücresel metabolizmaya entegre bir bakış açısı da içerir. Hem oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) hem de glikolizin paralel olarak ölçülmesi, bir hücrenin genel enerji metabolizmasının ve yollar arasında geçiş yapma esnekliğinin kapsamlı bir anlık görüntüsünü sağlar. Bu paralel test biyolojik değişkenliği de azaltır. Hücre kaplama yoğunluğu, geçiş sayısı veya çevresel koşullardaki farklar, her iki test aynı hücre popülasyonu üzerinde yapıldığı için en aza indirilir ve bu da tekrarlanabilirliği artırır. Her iki testi aynı anda yapmak, sensör kartuş kalibrasyonu, sıcaklık değişiklikleri veya reaktif hazırlığından kaynaklanan koşu-koşma değişkenliğini azaltır.

Bu tekniğin teknik faydaları arasında, testlerin birleştirilmesiyle artan verimlilik bulunur; bu da zaman, reaktifler ve plaka tüketim maddeleri tasarrufu sağlar; bu da büyük ölçekli veya yüksek verimli çalışmalar için önemli bir şey yapar. Bu, daha düşük örneklem gereksinimlerini sağlar. Sadece bir hücre plakası yeterlidir, bu da sınırlı veya nadir birincil hücrelerle (örneğin, lenfositler, beyin türeyi hücreler) çalışırken avantajlıdır. Her iki testin de aynı plaka kullanması ve normalizasyonun (örneğin, protein içeriği veya hücre numarası) daha tutarlı ve güvenilir olması nedeniyle testler arasında daha iyi normalizasyon sağlanır. Bu tutarlılıkla veri korelasyonu artırılır. Aynı örnekten mitokondriyal ve glikolitik parametrelerin doğrudan eşleştirilmesi, metabolik profilleme ve istatistiksel analizleri kolaylaştırır.

Bu tekniğin bilinen tek sınırlaması, iki protokolü tek bir plakada birleştirmenin mevcut kuyuyu çoğaltma sayısını azaltmasıdır. Her koşul için en az 8 kuyuyu çoğaltılması için plaka başına koşul sayısının sınırlandırılması önerilir.

Teşekkürler

Bu araştırma, A. Ivanova pilot projesi olan Ulusal Azınlık Sağlığı ve Sağlık Eşitsizlikleri Enstitüsü (NIMHD) tarafından finanse edilmiştir; NHGRI Genom Araştırmaları Çeşitlilik Merkezi UG3HG013248, Araştırma Projesi 2, PI-Ivanova ve Genprex Inc. tarafından da bazı destekler sağlandı.  Ayrıca, bu araştırma NIH Hibeleri MD007586, CA163069 ve S10RR025497 tarafından desteklenen Meharry Tıp Fakültesi Çekirdek Tesisleri'nde yürütülmüştür.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL santrifüj tüpleri, vida kapaklı torbalar, steril, 500 tüp/üniteGenesee Scientific21-408B
Biologix Pipet Uçları-200 μ l Genişletilmiş (Paket, Steril)Biologix USASKU 21-0200
BioTek Sinerjisi H1BIOSPX
BZ-X700 floresan mikroskobuKeyence
Corning  Costar Steril Tek Kullanımlık Reaktif RezervuarlarıFisher4873
D-(+)-Glikoz Çözeltisi %45 H20 içindeSigmaG9769
DAPI, hidroklorür Thermofisher ScientificD1306
Eppendorf Santrifüj 5810 REppendorf
GenClone Fetal Bovine Serum Isısı İnaktif EdildiGenesee Scientific25-514H
L-Glutamin 200 mM (100x)Gibco25030-081
Olympus Plastikler 22-284, Olympus 1.7ml mikrotüpler, şeffaf, steril polipropilen, kaynamaya dayanıklı, ster, 50/torba, 250 tüp/üniteGenesee Scientific22-284
Olympus Plastics 28-108, 50ml Konik Santrifüj Tüpleri, Polipropilen Toplu Kutu, Steril, 20 Torba 25 Tüp, 500/UnitGenesee Scientific28-108
Paraformaldehit 16% çözelti EM derecesiElektron Mikroskopi Bilimi15710
Poli-D-Lizin hidrobromid liyofilizeSigmaP6407
Precision 180 Su BanyosuHassas Bilimsel51221060
Precision Scientific GCA Model 26 Kuluçka MakinesiThelco51221091
QBI 120-095-671 Penisilin Karışımı, 100x Kalem/Streptomik Karışımı, 10 x 10 mL/UnitGenesee Scientific25-827
QBI PBS, 1x, Ca, Mg, Fenol Kırmızısı, 0.1um Steril FiltreliGenesee Scientific25-507B
RPMI 1640, L-Glutamin ileGenesee Scientific25-506
Seahorse XF RPMI ortamı, pH 7.4, 500 mLÇevik103576-100
Seahorse XFe96 AnalizörüÇevik
Seahorse XFe96/XF Pro FluxPakÇevik103792-10018 XFe96/XF Pro sensör kartuşu, 18 XFe96/XF Pro Hücre Kültürü Mikroplakası, 1 şişe Seahorse XF Kalibrasyon Çözeltisi 500mL ve 3 çift XF Yükleme Kılavuzu içerir
Sodyum BikarbonatSigmaS6014
Sodyum Piruvat (100mM) 100XGibco11360-070
SRB testi (Sülfürodamin B Analiz Kiti)AbcamAB235935
VWR İmzası Ergonomik Yüksek Performanslı Çok Kanallı PipettörAvantor89079-956
XF Hücre Mito Stres Test KitiÇevik103015-100
XF Glikolitik Oran Testi KitiÇevik103344-100

Kaynaklar

  1. Caines, J. K., Barnes, D. A., Berry, M. D. The use of Seahorse XF assays to interrogate real-time energy metabolism in cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 225-234 (2022).
  2. Marinangeli, C., Kluza, J., Marchetti, P., Buee, L., Vingtdeux, V. Study of ampk-regulated metabolic fluxes in neurons using the Seahorse XF Analyzer. Methods Mol Biol. 1732, 289-305 (2018).
  3. Tan, W. J. T., Santos-Sacchi, J., Tonello, J., Shanker, A., Ivanova, A. V. Pharmacological modulation of energy and metabolic pathways protects hearing in the fus1/tusc2 knockout model of mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Antioxidants (Basel). 12 (6), 1225(2023).
  4. Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40, 365-375 (2018).
  5. Hammoud, S., et al. Tubular CPT1a deletion minimally affects aging and chronic kidney injury. JCI Insight. 9 (6), e171961(2024).
  6. Wei, C., Heitmeier, M., Hruz, P. W., Shanmugam, M. Evaluating the efficacy of glut inhibitors using a Seahorse extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1713, 69-75 (2018).
  7. Zhu, Y., et al. The role of PKM2-mediated metabolic reprogramming in the osteogenic differentiation of BMSCs under diabetic periodontitis conditions. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 186(2025).
  8. Liu, J., Zhang, X., Fan, X. Liensinine reshapes the immune microenvironment and enhances immunotherapy by reprogramming metabolism through the AMPK-HIF-1α axis in hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 208(2025).
  9. Van Der Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113 (3), 3.16B.1-3.16B.14 (2016).
  10. Teresa P de Aquino, M., et al. Glutamate receptor–TCR signaling potentiates full CD8+ T cell activation and effector function in tumor immunity. iScience. 28 (10), 112772(2025).
  11. Hammoud, S., Kern, J., Mukherjee, S. Assays to enhance metabolic phenotyping in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 328 (4), 563-577 (2025).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mito Stres TestiGlikoliz Stres TestiGer ek Zamanl Metabolik AnalizH cresel Enerji MetabolizmasKemik li i MakrofajlarLenfosit MetabolizmasMitokondriyal RespirasyonGlikoliz l m

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.